TW202325850A - Aadc、gdnf多核苷酸及其用於治療帕金森病 - Google Patents
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Abstract
本揭露關於AADC、GDNF多核苷酸及其用於治療帕金森病。具體地,本揭露提供以AAV作為載體的基因遞送系統,將芳族L-胺基酸脫羧酶(AADC)和神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)遞送到腦部特定區域,用於治療神經退行性疾病(如帕金森病)的方法和用途。
Description
本揭露要求2021年11月29日提交的中國專利申請(申請號CN202111434384.4)的優先權。
本揭露關於基因治療領域,特別關於用於治療帕金森病的基因治療醫藥組成物和治療方法。具體而言,本揭露關於以AAV作為載體的基因遞送系統,將芳族L-胺基酸脫羧酶(AADC)和神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)遞送到腦部特定區域,用於治療帕金森病。
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是中樞神經系統(CNS)的進行性神經變性性疾病,主要影響黑質(SN)中的多巴胺能(DA)神經元。PD在臨床上以靜止性震顫、運動遲緩、肌僵直和姿勢步態障礙為主要特徵,發病10到15年內可導致患者明顯殘障,嚴重影響患者生存質量。有關PD的病因迄今尚不明了,既往研究表明可能與諸多因素有關,包括年齡老化、遺傳因素、環境毒物、感染、氧化應激及自由基形成等。PD主要的運動症狀導因於中腦黑質細胞死亡,使患者相關腦區的多巴胺不足。
芳族L-胺基酸脫羧酶(Amino Acid Decorboxylase,AADC)是一種同源二聚體的磷酸吡哆醛依賴性的酶,其負責多巴胺和血清素的合成,能催化L-3,4-二羥基苯丙胺酸(L-DOPA或左旋多巴)脫羧為多巴胺。AADC缺陷會導致血清素和兒茶酚胺缺乏,神經遞質DOPA減少,從而引起嚴重的運動功能障礙和自主功能障礙(Nutt et al.2020;Pons et al.2004)。
膠質細胞源性神經營養因子(Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor,GDNF)在中樞神經系統的不同腦區均有表達,較為肯定的細胞來源有I型星狀膠質細胞、黑質-紋狀體系統和基底前腦的神經元等。在DA神經元投射區如基底節、嗅結節,與某些運動有關的神經結構如無名質、小腦蒲肯野細胞和三叉神經運動核,與某些感覺有關的結構如丘腦、三叉神經感覺核、脊髓後角和背根節以及藍斑核等,均有相當的GDNF mRNA表達(Golden et al.1998)。GDNF屬神經營養因子(NTFs),對DA神經元有高度的親和力,是DA神經元的一個高度特異性神經營養因子。GDNF的作用方式主要是靶源性的,另外可能還有旁分泌和自分泌的作用方式,作用力強且神經營養作用更為廣譜(Lin et al.1993)。研究顯示,GDNF對體外培養的胚胎中腦DA能神經元有明顯的營養,促存活與分化作用,使神經元胞體增大、軸突延長(Lin et al.1993);在體內,對黑質、紋狀體DA能系統亦有保護和修復作用(Wang et al.2002)。用MPTP處理小鼠,或用6-羥基多巴(6-OHDA)處理大鼠,處理之前或之後注射GDNF於黑質或紋狀體,能降低MPTP或6-OHDA對DA能神經元的損傷,阻止DA能神經元的退變,誘導殘存的DA能神經元長出新的突起,恢復其DA水平和DA能神經纖維的密度,動物的運動行為亦有明顯改善(Kearns et al.1997;D.Kirik et al.2001;D.Kirik,Rosenblad,and
Bjorklund 2000;Deniz Kirik,Georgievska,and Björklund 2004;Wang et al.2002)。
重組腺相關病毒(rAAV)源於非致病的野生型腺相關病毒,具有安全性好、宿主細胞範圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低,在體內表達外源基因時間長的特點,被視為最有前途的基因遞送載體之一,在世界範圍內的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用(Snyder 1999;Xiao,Lentz,and Samulski 2012)。
目前治療PD最成功的上市藥物是多巴胺類藥左旋多巴胺(L-DOPA)。但是,隨著治療時間的持續,由於多巴胺能神經元的進行性死亡和AADC活性的丟失,多巴胺療法的益處逐步丟失,進而導致長期服用藥物的劑量依賴性增加。而高劑量多巴胺的全身給藥伴隨著較強的副作用,如近期副作用(胃腸反應、心血管副作用、睡眠障礙和精神症狀差等),遠期副作用(異動症、運動波動、晨僵、起效延遲等)。因此,提供高安全性、長期有效的治療藥物是亟待解決的問題。本揭露提供了改進的多核苷酸構建體,藉由基因治療手段,利用AAV及其衍生載體,將AADC、GDNF等基因包裹在AAV外殼內,遞送到腦部的特定區域(例如紋狀體),用於治療PD。
本揭露提供了一種表達AADC蛋白和/或GDNF蛋白的多核苷酸、重組腺相關病毒(rAAV)顆粒,相關表達盒、質粒、載體、宿主細胞、醫藥組成物,及其用於治療、緩解或預防神經退行性疾病(例如帕金森病)的方法和相關製藥用途。
AADC和/或GDNF多核苷酸序列
本揭露提供一種核酸分子,其包含編碼AADC蛋白(該AADC蛋白的編碼胺基酸序列例如SEQ ID NO:1所示)的多核苷酸,該多核苷酸與SEQ ID NO:3具有至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%同一性(例如具有至少80.83%、至少81.21%、至少79.18%、至少79.63%或以上同一性),或與SEQ ID NO:4-7任一具有至少95%同一性。一些實施方案中,該AADC蛋白的編碼多核苷酸包含如SEQ ID NO:3-7任一所示的多核苷酸序列。
本揭露提供一種核酸分子,其包含編碼GDNF蛋白(該AADC蛋白的編碼胺基酸序列例如SEQ ID NO:2所示)的多核苷酸,該多核苷酸與SEQ ID NO:8具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%同一性(例如具有至少75.13%、至少73.99%、至少77.52%、至少77.83%或以上同一性),或與SEQ ID NO:9-12任一具有至少95%同一性。一些實施方案中,該GDNF蛋白的編碼多核苷酸包含如SEQ ID NO:8-12任一所示的多核苷酸序列。
本揭露的一些實施方案中,AADC蛋白、GDNF蛋白涵蓋其類似物。
本揭露提供一種核酸分子,其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸,其中,該第一多核苷酸包含編碼AADC蛋白(該AADC蛋白的編碼胺基酸序列例如SEQ ID NO:1所示)的多核苷酸,第二多核苷酸包含編碼GDNF蛋白(該AADC蛋白的編碼胺基酸序列例如SEQ ID NO:2所示)的多核苷酸。在一些實施方案中,該第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地連接,第一多核苷酸和第二多核苷酸可以位於同一條多核苷酸或同一質粒、同一表達盒中。在另外一些實施方案中,或該第一多核苷酸和第二多核苷
酸相互獨立地存在於兩條相互獨立存在的多核苷酸、或兩個相互獨立存在的不同的質粒、兩個不同的表達盒中。
一些實施方案中,該AADC蛋白的胺基酸序列包含或如SEQ ID NO:1所示,該GDNF蛋白的胺基酸序列包含或如SEQ ID NO:2所示。
一些實施方案中,該編碼AADC蛋白的第一多核苷酸序列和/或編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸序列是經密碼子優化的。例如,該編碼AADC蛋白的經密碼子優化的多核苷酸序列與SEQ ID NO:3具有至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%同一性;該編碼GDNF蛋白的經密碼子優化的多核苷酸序列與SEQ ID NO:8具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%同一性。
一些實施方案中,該編碼AADC蛋白的多核苷酸序列包含與SEQ ID NO:4-7任一具有至少95%同一性的序列,和/或該編碼GDNF蛋白的多核苷酸序列包含與SEQ ID NO:9-12任一具有至少95%同一性的序列。一些具體實施方案中,該編碼AADC的多核苷酸序列包含或如SEQ ID NO:3-7任一所示的多核苷酸序列;該編碼GDNF的多核苷酸序列包含或如SEQ ID NO:8-12任一所示的多核苷酸序列。
本揭露中,“至少95%同一性”意為涵蓋至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或以上同一性。
該表達AADC蛋白的經密碼子優化的多核苷酸(例如SEQ ID NO:4-7任一)較之野生型或非密碼子優化的多核苷酸(例如SEQ ID NO:3),使得AADC蛋白的表達量增加。該表達GDNF蛋白的經密碼子優化的多核苷酸(例如SEQ ID NO:9-12任一)較之野生型或非密碼子優化的多核苷酸(例如SEQ ID NO:8),使得GDNF蛋白的表達量增加。該增加是較
之野生型或非密碼子優化的多核苷酸具有至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少75%、至少100%、至少數倍(包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上)的蛋白表達量的增加。
一些實施方案中,本揭露提供的核酸分子進一步包含與第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地連接的同一表達控制序列,或者分別與該第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地連接的兩個相同或不同的表達控制序列。其中,該表達控制序列包含(c)啟動子和/或(d)增強子。
一些實施方案中,本揭露提供的核酸分子進一步包含如下的任意一種或任意組合:
(a)5’反向末端重複(5’ITR);
(b)3’反向末端重複(3’ITR);
(e)內含子(intron);
(f)轉錄後調控元件;
(g)多聚腺苷酸化信號(polyA);
(h)多選殖位點(MCS)。
一些具體實施方案中,(a)-(h)的任意組合能夠滿足使得目的基因(AADC和/或GDNF)表達的功能(例如在受試者大腦中(例如黑質、紋狀體)表達)的功能。
一些具體實施方案中,該(a)-(h)的任一項的多核苷酸或任意組合與該AADC蛋白的編碼多核苷酸和/或該GDNF蛋白的編碼多核苷酸可操作地連接。
一些具體實施方案中,該5’ITR和/或3’ITR源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、
AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ或AAV-DJ8;例如,源自AAV2、AAV9。
一些具體實施方案中,該啟動子選自CMV、CAG、CBh、EFS、EF1(例如EF-1α)、PGK、SV40、Ubi、RSV或其任意組合。
一些具體實施方案中,該增強子選自Ubi、CMV、RSV增強子或其任意組合。
一些具體實施方案中,該內含子選自MVM、SV40、β Globin、EF1(例如EF-1α)、雜合內含子,或其任意組合。
一些具體實施方案中,該polyA選自PA75 polyA、SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA、rbGlob polyA或其任意組合。
一些具體實施方案中,該轉錄後調控元件選自WPRE、HPRE或其組合。
一些實施方案中,該核酸分子包含編碼AADC蛋白的多核苷酸、CMV增強子(例如,CMV增強子1)和CBA啟動子,可選地,該第一多核苷酸還包含雜合內含子、polyA,該polyA選自SV40 polyA、hGH polyA;和/或該核酸分子包含編碼GDNF蛋白的多核苷酸、CMV增強子(例如,CMV增強子2)和CMV啟動子,可選地,該第二多核苷酸還包含β球蛋白內含子、polyA,該polyA選自PA75 polyA、SV40 polyA;其中,該CMV增強子1、CMV增強子2均為CMV增強子,兩者可以相同或者不同。
一些實施方案中,該多核苷酸中的AADC和GDNF可以單獨用不同表達框架或者藉由連接子(例如P2A序列)連接共用一個表達框架。
第一多核苷酸與第二多核苷酸可操作地連接,使AADC蛋白和GDNF蛋白在受試者的同一目標施用位置表達,可避免由於兩者施用位
置不一致導致影響兩者聯用的治療效果,並能降低某一蛋白向其他位置滲漏造成的副作用。參見本揭露實施例,第一多核苷酸與第二多核苷酸可操作地連接後施用於患病模型小鼠,結果發現可發揮顯著的治療效果。
一些實施方案中,第一多核苷酸和第二多核苷酸藉由第三多核苷酸連接,例如,該第三多核苷酸編碼具有連接子功能的胺基酸序列。連接順序可以是從5’端到3’端為第一多核苷酸-第三多核苷酸-第二多核苷酸,或從5’端到3’端為第二多核苷酸-第三多核苷酸-第一多核苷酸。一些具體實施方案中,該第三多核苷酸編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO:43-46任一所示,例如,該第三多核苷酸的序列如SEQ ID NO:47-50任一所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%同一性。
一些實施方案中,該編碼AADC蛋白的多核苷酸和編碼GDNF蛋白的多核苷酸為同一個調控元件調控表達,或分別為兩個不同的調控元件調控表達。該調控元件包括但不限於5’ITR、3’ITR、啟動子、增強子、內含子、polyA、轉錄後調控元件等。
一些實施方案中,該核酸分子從5’端至3’端包含:
a)CMV增強子、CBA啟動子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸和polyA;
在一些可選的實施方案中,在CBA啟動子和編碼AADC蛋白的第一多核苷酸之間還包含雜合內含子;
在一些可選的實施方案中,在編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列。
在一些具體的實施方案中,核酸分子包含:CMV增強子、CBA啟動子、雜合內含子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、WPRE序列和polyA。
b)CMV增強子、CBA啟動子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸和polyA;
在一些可選的實施方案中,在CBA啟動子和編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸之間還包含雜合內含子;
在一些可選的實施方案中,在編碼AADC蛋白的第一多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列。
在一些具體的實施方案中,核酸分子包含:CMV增強子、CBA啟動子、雜合內含子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、WPRE序列和polyA。
c)CMV增強子、CBA啟動子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、polyA、CMV增強子、CMV啟動子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸和polyA;
在一些可選的實施方案中,在CBA啟動子和編碼AADC蛋白的第一多核苷酸之間還包含雜合內含子;
在一些可選的實施方案中,在CMV啟動子和編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸之間還包含β球蛋白內含子;
在一些可選的實施方案中,在編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列。
在一些具體的實施方案中,核酸分子包含:
CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、polyA、CMV增強子2、CMV啟動子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸和polyA;或者,
CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、polyA、CMV增強子2、CMV啟動子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、WPRE序列和polyA;或者,
CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、polyA、CMV增強子2、CMV啟動子、β球蛋白內含子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸和polyA。
d)CMV增強子、CMV啟動子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、polyA、CMV增強子、CBA啟動子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸和polyA;
在一些可選的實施方案中,在CMV啟動子和編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸之間還包含β球蛋白內含子或MVM內含子;
在一些可選的實施方案中,在CBA啟動子和編碼AADC蛋白的第一多核苷酸之間還包含雜合內含子;
在一些可選的實施方案中,在編碼AADC蛋白的第一多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;
在一些具體的實施方案中,核酸分子包含:
CMV增強子2、CMV啟動子、β球蛋白內含子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、polyA、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸和polyA;
CMV增強子2、CMV啟動子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、polyA、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、WPRE序列和polyA;或者,
CMV增強子2、CMV啟動子、MVM內含子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、polyA、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、WPRE序列和polyA。
e)CMV增強子、CBA啟動子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、第三多核苷酸、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸和polyA;
在一些可選的實施方案中,在CBA啟動子和編碼AADC蛋白的第一多核苷酸之間還包含雜合內含子;
在一些可選的實施方案中,在編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;
在一些具體的實施方案中,核酸分子包含:CMV增強子、CBA啟動子、雜合內含子、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、第三多核苷酸、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、WPRE序列和polyA。
f)CMV增強子、CBA啟動子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、第三多核苷酸、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸和polyA;
在一些可選的實施方案中,在CBA啟動子和編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸之間還包含雜合內含子;
在一些可選的實施方案中,在編碼AADC蛋白的第一多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;
在一些具體的實施方案中,核酸分子包含:CMV增強子、CBA啟動子、雜合內含子、編碼GDNF蛋白的第二多核苷酸、第三多核苷酸、編碼AADC蛋白的第一多核苷酸、WPRE序列和polyA。
g)CMV增強子、CBA啟動子、第一多核苷酸或第二多核苷酸,和polyA;
在一些可選地實施方案中,在CBA啟動子和第一多核苷酸之間還包含雜合內含子,或該CBA和該第二多核苷酸之間還包含雜合內含子;
在一些可選地實施方案中,在第一多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列,或者,在第二多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;
在一些具體的實施方案中,核酸分子包含:CMV增強子、CBA啟動子、雜合內含子、第一多核苷酸和polyA;
CMV增強子、CBA啟動子、雜合內含子、第二多核苷酸和polyA;
CMV增強子、CBA啟動子、雜合內含子、第一多核苷酸、WPRE序列和polyA;或者,
CMV增強子、CBA啟動子、雜合內含子、第二多核苷酸、WPRE序列和polyA。
在一些實施方案中,該polyA選自hGH polyA、PA75 polyA或SV40 polyA。
一些實施方案中,提供多核苷酸,該核酸分子從5’端至3’端包含:
(1)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼AADC的第一多核苷酸-第三多核苷酸-編碼GDNF的第二多核苷酸-WPRE-SV40 polyA;
(2)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼GDNF的第二多核苷酸-第三多核苷酸-編碼AADC的第一多核苷酸-WPRE-SV40 polyA;
(3)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼AADC的第一多核苷酸-SV40 polyA-CMV增強子-CMV啟動子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 polyA;
(4)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼AADC的第一多核苷酸-SV40 polyA-CMV增強子-CMV啟動子-編碼GDNF的第二多核苷酸-WPRE-PA75 polyA;
(5)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼AADC的第一多核苷酸-SV40 polyA-CMV增強子-CMV啟動子-β球蛋白內含子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 polyA;
(6)CMV增強子-CMV啟動子-β球蛋白內含子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 poly A-CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼AADC的第一多核苷酸-SV40 polyA;
(7)CMV增強子-CMV啟動子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 poly A-CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼AADC的第一多核苷酸-WPRE-SV40 polyA;或
(8)CMV增強子-CMV啟動子-MVM內含子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 poly A-CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼AADC的第一多核苷酸-WPRE-SV40 polyA。
一些實施方案中,提供多核苷酸,其從5’到3’方向包含如下的1)-13)或其任意組合:
1)5’ITR、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸或GDNF編碼多核苷酸、hGH polyA、3’ITR;
2)5’ITR、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸或GDNF編碼多核苷酸、SV40 polyA、3’ITR;
3)5’ITR、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸或GDNF編碼多核苷酸、WPRE、SV40 polyA、3’ITR;
4)5’ITR、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、P2A、GDNF編碼多核苷酸、WPRE、SV40 polyA、3’ITR;
5)5’ITR、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、GDNF編碼多核苷酸、P2A、AADC編碼多核苷酸、WPRE、SV40 polyA、3’ITR;
6)5’ITR、MCS、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、SV40 polyA、CMV增強子2、CMV啟動子、GDNF編碼多核苷酸、PA75 polyA、3’ITR;
7)5’ITR、MCS、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、SV40 polyA、CMV增強子2、CMV啟動子、GDNF編碼多核苷酸、WPRE、PA75 polyA、3’ITR;
8)5’ITR、MCS、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、SV40 polyA、CMV增強子2、CMV啟動子、β球蛋白內含子、GDNF編碼多核苷酸、PA75 polyA、3’ITR;
9)5’ITR、CMV增強子2、CMV啟動子、β球蛋白內含子、GDNF編碼多核苷酸、PA75 polyA、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、SV40 polyA、3’ITR;
10)5’ITR、CMV增強子2、CMV啟動子、GDNF編碼多核苷酸、PA75 polyA、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、WPRE、SV40 polyA、3’ITR;
11)5’ITR、CMV增強子2、CMV啟動子、MVM內含子、GDNF編碼多核苷酸、PA75 polyA、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、WPRE、SV40 polyA、3’ITR;
12)5’ITR、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、P2A、GDNF編碼多核苷酸、WPRE、SV40 polyA、3’ITR;
13)5’ITR、CMV增強子2、CMV啟動子、β球蛋白內含子、GDNF編碼多核苷酸、PA75 polyA、CMV增強子1、CBA啟動子、雜合內含子、AADC編碼多核苷酸、SV40 polyA、3’ITR。
一些具體實施方案中,
該CMV增強子1包含或如SEQ ID NO:27所示序列;
該CMV增強子2包含或如SEQ ID NO:37所示序列;
該CBA啟動子包含或如SEQ ID NO:28所示序列;
該CMV啟動子包含或如SEQ ID NO:35所示序列;
該β球蛋白內含子包含或如SEQ ID NO:38所示序列;
該雜合內含子包含或如SEQ ID NO:29所示序列;
該MVM內含子包含或如SEQ ID NO:39所示序列;
該PA75 polyA包含或如SEQ ID NO:36所示序列;
該SV40 polyA包含或如SEQ ID NO:32所示序列;
該hGH polyA包含或如SEQ ID NO:30所示序列;
該HPRE包含或如SEQ ID NO:33所示序列;
該WPRE包含或如SEQ ID NO:34所示序列;
該5’ITR包含或或如SEQ ID NO:26所示序列;
該3’ITR包含或如SEQ ID NO:31所示序列;
該MCS包含或如SEQ ID NO:40所示序列;和/或
該P2A包含或如SEQ ID NO:33所示序列。
一些實施方案中,提供核酸分子,其包含多核苷酸,該多核苷酸與SEQ ID NO:13-25任一所示序列具有至少95%同一性。一些實施方案中,該多核苷酸包含SEQ ID NO:13-25任一所示的序列。
一些實施方案中,該AADC蛋白(例如為SEQ ID NO:1所示的AADC蛋白)包含其變體(該變體例如與SEQ ID NO:1、NP_000781.2、NP_001076440.2、NP_001229815.2、NP_001229816.2、NP_001229817.2、NP_001229818.2、NP_001229819.2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90、至少95%或以上同一性)或片段,該變體或片段具有與AADC蛋白相同或相似的生物學活性或功能;該GDNF蛋白(例如為SEQ ID NO:2所示的GDNF蛋白)包含其變體(該變體例如與SEQ ID NO:2、NP_001177397.1、NP_001177398.1、NP_001265027.1、NP_954701.1具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或以上同一性)或片段,該變體或片段具有與GDNF蛋白相同或相似的生物學活性或功能。
一些實施方案中,該多核苷酸包括在細胞內部加工的前體分子。可以在質粒、載體、基因組或其他多核苷酸表達載體中編碼AADC和/或GDNF多核苷酸或其加工形式以遞送至細胞。
一些實施方案中,該載體包含完整的複製子,使得在例如經轉染、感染或轉化細胞後,能在該細胞中複製。一些實施方案中,該載體為或者衍生自逆轉錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、杆狀病毒、乳頭病毒或經修飾或改造的以上病毒。一些實施方案中,遞送該載體的方法包括但不限於直接遞送裸DNA或經陽離子或陰離子脂質體、經與陽離子聚合物絡合、經與蛋白質或多肽形成複合物遞送。
一些實施方案中,該多核苷酸被設計為AAV載體基因組(或病毒基因組)的組分,並包裝在rAAV顆粒中,該rAAV顆粒在細胞內加工以產生AADC和/或GDNF蛋白,該AADC和/或GDNF蛋白可以為野生型蛋白或其變體。
一些實施方案中,該多核苷酸可以是rAAV顆粒的有效負載。
AAV衣殼和AAV顆粒
本揭露前述任一項的多核苷酸均可以使用如下AAV衣殼進行包裹,以形成AAV顆粒。
該AAV衣殼包含或源自任何天然或重組AAV血清型,包括但不限於:PHP.B、PHP.A、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、
AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.68、AAVhu.14/9、AAVhu.t19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、
AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、綿羊AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAVShuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型(true type)AAV(ttAAV)、UPENNAAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAVCBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAVCBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-
E6、AAVCBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAVCHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAVCKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAVCSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、
AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、PHP.B(AAV-PHP.B)、PHP.A(AAV.PHP.A)、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5、AAVDJ8以及其變體。
一些實施方案中,該AAV衣殼可以是經修飾或突變的,例如含有Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F中的一個或多個突變;例如含有F129L、D418E、K531E、L584F、V598A和H642N中的一個或多個突變;例如在AAV2的252、272、444、500、700、704和730位Tyr殘基中的至少一個被例如Phe殘基取代;例如在AAV2衣殼中含有N587A、E548A或N708A突變;例如在AAV9衣殼中含有T446F突變;例如在AAV衣殼中含有V708K突變;例如該AAV衣殼是經由390-627位胺基酸(VP1編號)中具有突變的AAV9衣殼文庫產生的。
本揭露全文引入WO2018232055(例如其表1)、WO2005033321、WO2015168666、WO2015121501、WO2015038958、WO2016065001、WO2016130589、WO2016049230、WO2016134375、WO2017100671、WO2017083722、WO2017015102、WO2017058892、WO2017066764、US9546112、US7198951、US9233131、US6156303、US9624274、US9475845、US8734809、US20130224836、US20140359799、US20150315612、US20150376240、US20150159173、US20150376607、US20150238550、US20160369298、US20160361439、US20170145405,以及NPulicherla等(MolecularTherapy19(6):1070-1078(2011))中的AAV衣殼。一些具體實施方案中,本揭露所使用的AAV衣殼是上述現有技術中的AAV2和AAV9衣殼。
一些實施方案中,該AAV衣殼是經工程化改造的,例如是來自兩種或更多種親本血清型的雜合AAV衣殼。例如,該AAV衣殼可以是AAV2G9,其包含來自AAV2和AAV9的序列。此處全文引入US20160017005中AAV2G9的序列。
一些實施方案中,該AAV衣殼是AAV2或AAV9衣殼,例如包含SEQ ID NO:41或42所示的胺基酸序列。
一些實施方案中,除編碼的異源有效負載外,AAV顆粒可以包含任何天然存在的和/或重組的AAV衣殼的核苷酸序列或變體的全部或部分載體基因組。
一些實施方案中,AAV顆粒可以是複製缺陷的(例如其在載體基因組中缺乏編碼功能性Rep和Cap蛋白的序列)。一些具體實施方案中,該複製缺陷性AAV顆粒可以缺乏大多數或全部親本編碼序列,並且基本上
僅攜帶一個或兩個AAV ITR序列以及用於遞送至細胞、組織、器官或生物體的感興趣的多核苷酸。
一些實施方案中,AAV顆粒可以是重組AAV(rAAV)顆粒。
一些實施方案中,AAV顆粒可以選自單鏈AAV顆粒(例如ssAAV)、自身互補AAV顆粒(例如scAAV)。藉由跳過第二鏈合成,scAAV在細胞中實現快速表達。
一些實施方案中,AAV顆粒包裹有多核苷酸,該多核苷酸與SEQ ID NO:13-25任一所示序列具有至少95%同一性。
一些實施方案中,AAV顆粒包裹有多核苷酸,該多核苷酸包含SEQ ID NO:13-25任一所示的序列。
調控元件
本揭露前述任一項的多核苷酸或AAV顆粒的載體基因組(或病毒基因組)包含至少一種調控元件,使得有效負載中的目的基因(例如AADC、GDNF)能夠複製、轉錄和翻譯。
一些實施方案中,該調控元件包括但不限於用於轉錄起始和/或終止的序列、啟動子和/或增強子序列、有效的RNA處理信號(例如剪接和聚腺苷酸化信號)、穩定細胞質mRNA的序列、增強翻譯效率的序列(例如,Kozak共有序列)、增強蛋白質穩定性的序列和/或增強蛋白質加工和/或分泌的序列。示例性調控元件包括但不限於啟動子、增強子、內含子、內源性miRNA、轉錄後調控元件(PRE)、聚腺苷酸化(PolyA)信號序列、上游增強子(USE)。
一些實施方案中,下述調控元件(例如啟動子)驅動有效負載在靶組織(例如受試者的大腦(例如紋狀體、黑質))中表達一段時間。例如,1、2、3、4、5、6、7天,1、2、3、4週,1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12個月,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60年或以上。又例如,1-2週、1-3週、1-4週、1-2個月、1-4個月、1-6個月、2-6個月、3-6個月、3-9個月、4-8個月、6-12個月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年、5-10年、10-20年、10-30年、20-40年、20-50年,或受試者終生。
反向末端重複(ITR)
本揭露前述任一項的多核苷酸或AAV顆粒的載體基因組(或病毒基因組)包含至少一個ITR,例如具有兩個ITR,分別位於5’和3’端的有效負載的側翼。
一些實施方案中,ITR具有複製起點功能。
一些實施方案中,ITR包含可以互補和對稱排列的序列區。
一些實施方案中,ITR可以由天然存在的多核苷酸序列或重組衍生的多核苷酸序列組成。
一些實施方案中,ITR可以源自與衣殼相同或不同的血清型。一些實施方案中,5’ITR和3’ITR可以源自相同的血清型,也可以源自不同的血清型。例如,5’ITR和3’ITR均來自AAV2,或均來自AAV9。又例如,5’ITR包含如SEQ ID NO:26所示的序列,和/或3’ITR包含如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列。
一些實施方案中,每個ITR的長度可以是約100至約150個核苷酸,例如,是100-105個核苷酸、106-110個核苷酸、111-115個核苷酸、116-120個核苷酸、121-125個核苷酸、126-130個核苷酸、131-135個核苷酸、136-140個核苷酸、141-145個核苷酸或146-150個核苷酸。在一個實施方案中,ITR的長度是140-142個核苷酸,例如是141個核苷酸。
ITR長度的非限制性實例是長度為102、140、141、142、145個核苷酸,以及與它們具有至少95%同一性的核苷酸。
啟動子
本揭露前述任一項的多核苷酸或AAV顆粒的載體基因組(或病毒基因組)包含至少一個啟動子,包括但不限於物種特異性、誘導型、組織特異性或細胞週期特異性的啟動子。
一些實施方案中,啟動子驅動在AAV顆粒的載體基因組的有效負載中編碼的蛋白或多肽(例如AADC和/或GDNF)的表達。
一些實施方案中,啟動子是靶組織特異性的或向性的,例如是能在神經組織中表達有效負載的啟動子。
一些實施方案中,啟動子可以是病毒啟動子、植物啟動子、哺乳動物啟動子、人啟動子。
一些實施方案中,啟動子包括但不限於CMV、CBA(包括衍生物CAG、CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、RSV、EFS、EF1、GUSB(hGBp)、UCOE(HNRPA2B1-CBX3的啟動子)、NSE、Synapsin、MeCP2、MeP418、MeP426、VMD2、MRHO、TRE、Ac5、Polyhedrin、CaMKIIa、Gall、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、GFAP或PKG啟動子,以及可選自神經絲輕(NFL)啟動子、神經絲重(NFH)啟動子、SCN8A啟動子、共濟蛋白(FXN)啟動子(或稱FRDA啟動子)、H1啟動子、RNA pol III啟動子(例如U6或H1)、小核RNA(ULB或ULA)啟動子。一些實施方案中,啟動子為肝臟或骨骼肌啟動子,肝啟動子例如為人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和甲狀腺素結合球蛋白(TBG),骨骼肌啟動子例如為結蛋白、MCK或合成的C5-12。
一些實施方案中,本揭露的AAV載體基因組包含兩個啟動子,例如是CMV和CBA啟動子,其序列分別為SEQ ID NO:35和28所
示;又例如是EF1α啟動子和CMV啟動子,或前述啟動子的任意兩兩組合。
一些實施方案中,啟動子為組織特異性表達元件,可將表達限制於某些細胞類型,包括不限於肌肉特異性啟動子、B細胞啟動子、單核細胞啟動子、白細胞啟動子、巨噬細胞啟動子、胰腺腺泡細胞啟動子、內皮細胞啟動子、肺組織啟動子、星形膠質細胞啟動子或神經系統啟動子,其可用於將表達限於神經元、星形膠質細胞或少突膠質細胞。
一些實施方案中,啟動子為神經元組織特異性表達元件,包括但不限於神經元特異性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、血小板衍生的生長因子B鏈(PDGF-β)、突觸蛋白(Syn)、甲基CpG結合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)、促代謝性谷胺酸受體2(mGluR2)、神經絲輕(NFL)或重(NFH)、β-珠蛋白小基因nβ2、前腦啡肽原(PPE)、腦啡肽(Enk)和興奮性胺基酸轉運蛋白2(EAAT2)啟動子。星形膠質細胞的組織特異性表達元件的非限制性實例包括神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)和EAAT2啟動子。少突膠質細胞的組織特異性表達元件子的非限制性實例包括髓磷脂鹼性蛋白(MBP)啟動子。
一些實施方案中,啟動子是前述啟動子的截短體或變體,長度小於1kb,例如為200-300、200-400、300-400、200-500、200-600或以上長度。
一些實施方案中,啟動子可以是相同或不同的起始或親本啟動子的兩種或更多種組分的組合,例如CMV和CBA。
增強子
本揭露前述任一項的多核苷酸或AAV顆粒的載體基因組(或病毒基因組)包含至少一個增強子,包括但不限於物種特異性、誘導型、組織特異性或細胞週期特異性的增強子。
一些實施方案中,增強子是靶組織特異性的或向性的,例如是能在神經組織中調控有效負載表達的增強子。
一些實施方案中,增強子可以是或源自病毒增強子、植物增強子、哺乳動物增強子、人增強子。
一些實施方案中,該增強子可位於啟動子的上游或下游,與啟動子可操作的連接。當該增強子存在時,較之該增強子不存在時,對目的基因(例如AADC和/或GDNF)的表達增強至少20%、至少50%、至少80%、至少100%、至少數倍(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或以上)。
一些實施方案中,該增強子包括但不限於EF-1α、Ubc、humanb-actin、CAG、TRE、Ac5、Polyhedrin、CaMKIIa、Gall、TEF1、GDS、ADH1、Ubi和α-1-antitrypsin(hAAT),或以上增強子的變體或片段。一些實施方案中,該增強子選自IRBP、RSV或CMV增強子,或其變體或片段。
一些實施方案中,該增強子包含或為SEQ ID NO:27或37所示的增強子或其變體或片段。
內含子
本揭露前述任一項的多核苷酸或AAV顆粒的載體基因組(或病毒基因組)中可以包含內含子或其部分,
一些實施方案中,該內含子包括但不限於MVM(67-97bp)、F.IX截短的內含子1(約300bp)、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈剪接受體
(約250bp)、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體(約500bp)、SV40晚期剪接供體/剪接受體(19S/16S)(180bp)和雜合腺病毒剪接供體/IgG剪接受體(約230bp)、hemoglobin內含子、雜合內含子、β-球蛋白(β-globin)內含子,或以上內含子的變體或片段。
一些實施方案中,該內含子的長度為100-800個核苷酸,例如約100、約200、約300、約400、約500、約600個核苷酸,又例如為200-250、200-300、100-200、300-500、500-600、400-600、100-200個核苷酸。
一些實施方案中,本揭露技術方案中的內含子選自hybrid intron、β-球蛋白intron,其序列分別如SEQ ID NO:29和38所示。
非翻譯區(UTR)
本揭露前述任一項的多核苷酸或AAV顆粒的載體基因組(或病毒基因組)中可以包含非翻譯區(UTR),該UTR選自5’UTR和/或3’UTR,以調節(例如,增減或降低)多核苷酸穩定性和蛋白質產生。通常情況下,5’UTR在轉錄起始位點開始並在起始密碼子處終止,3’UTR在終止密碼子後立即開始從到轉錄終止信號為止。該UTR可以是野生型、其變體或人工UTR。
一些實施方案中,5’UTR包括Kozak序列。另一些實施方案中,5’UTR不包括Kozak序列。
一些實施方案中,3’UTR富含AU。一些實施方案中,3’UTR選自:I類ARE,例如但不限於c-Myc和MyoD,在富含U的區域內包含數個AUUUA基序的分散拷貝;II類ARE,例如但不限於GM-CSF和TNF-a,擁有兩個或多個重疊的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚體;III類ARES,例如但不限於c-Jun和肌形成蛋白
一些實施方案中,3’UTR可以包括寡聚(dT)序列,用於模板化添加聚腺苷酸化序列(PolyA)。
聚腺苷酸化序列(PolyA)
本揭露前述任一項的多核苷酸或AAV顆粒的載體基因組(或病毒基因組)中可以包含編碼PolyA的序列,該PolyA可以是野生型、其變體或經修飾的PolyA,以進行蛋白質翻譯。
一些實施方案中,該編碼PolyA的序列位於有效負載編碼序列的3’端與3’ITR的5’端之間。
一些實施方案中,該編碼PolyA的序列長度為0-500個核苷酸,例如約75、約100、約110、約120、約150、約160、約200、約300個核苷酸,又例如50-100、50-150、50-160、50-200、60-100、60-150、60-160、60-200、70-100、70-150、70-160、70-200、80-100、80-150、80-160、80-200、90-100、90-150、90-160、90-200。
一些實施方案中,該編碼PolyA可以編碼連續的PolyA或不連續的PolyA。當編碼不連續的PolyA時,該編碼序列可被其他核苷酸中斷或分離開。例如,該polyA具有至少兩個60個腺苷酸的片段,該至少兩個60個腺苷酸片段被包含10-90個核苷酸的序列分離開。
一些實施方案中,本揭露技術方案中的編碼PolyA的序列或polyA選自β-球蛋白polyA、SV40 polyA、bGH polyA、PA75 polyA、MeCP2 polyA、RDH1 polyA、BGH polyA、SPA49 polyA、sNRP-TK65 polyA、sNRP polyA、TK65 polyA,或以上PolyA的變體或片段。
一些實施方案中,本揭露技術方案中的SEQ ID NO:32和36所示的polyA或其變體或片段。
此處全文引入WO2016005324、WO2016005004、WO2016091391、WO2019036513、WO2020074642中的polyA或其編碼序列,其均可用於本揭露技術方案中。
填充序列
本揭露前述任一項的多核苷酸或AAV顆粒的載體基因組(或病毒基因組)中可以包含填充序列,使得載體基因組的長度為包裝的最佳大小,例如使得載體基因組的長度為約2.3kb、約4.6kb、約4.7kb或約5.1kb。
一些實施方案中,該載體基因組為單鏈或雙鏈基因組,包裝後的AAV顆粒為ssAAV或scAAV。
一些實施方案中,一個載體基因組中可以含有一個或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)填充序列。
一些實施方案中,填充序列可以位於多個調控元件之間或之內,例如兩個內含子之間、5’ITR序列的3’處、5’ITR序列的5’處、3’ITR序列的5’處、3’ITR序列的3’處,以及啟動子、內含子、增強子、polyA、多選殖位點(MCS)區、外顯子等區域之前或之後。
rAAV顆粒的生產或製備方法
本揭露提供生產、製備和/或修飾rAAV顆粒的方法。此處全文引入WO200028004、WO200123001、WO2004112727、WO2005005610、WO2005072364、WO2013123503、WO2015191508和US20130195801中的rAAV顆粒生產、製備和/或修飾方法。該rAAV顆粒可以具有增強遞送效率的特性,能進行有效包裝,能以高頻率和最小的毒性成功地感染靶細胞(例如哺乳動物或人細胞)。
一些實施方案中,提供了rAAV顆粒的生產方法,包括將本揭露任意多核苷酸或載體基因組(或病毒基因組)或載體包裝至AAV衣殼
中。一些具體實施方案中,包括以下步驟:1)用杆狀病毒載體和病毒構建體載體和/或AAV有效負載構建體載體共轉染感受態細菌細胞,2)分離所得的病毒構建體表達載體和AAV有效負載構建表達載體並分別轉染病毒複製細胞,3)分離並純化所得的有效負載和包含病毒構建體表達載體或AAV有效負載構建體表達載體的病毒構建體顆粒,4)用AAV有效負載和包含病毒構建體表達載體或AAV有效負載構建體表達載體的病毒構建體顆粒兩者共感染病毒複製細胞,以及5)收穫和純化包含病毒基因組的AAV顆粒。
一些實施方案中,提供了rAAV顆粒的生產方法,包括以下步驟:
1)將本揭露任意多核苷酸或載體基因組(或病毒基因組)或載體,和表達Rep和Cap基因的構建體以及輔助構建體(以實現輔助功能)同時共轉染哺乳動物細胞(例如HEK293細胞);
2)收穫並純化包含病毒基因組的rAAV顆粒。
一些實施方案中,前述rAAV顆粒的病毒基因組視需要地編碼選擇標誌物。選擇標誌物可以包括細胞表面標誌物,例如在細胞表面上表達的任何蛋白質,包括但不限於受體CD標誌物、凝集素、整聯蛋白或其截短形式。
一些實施方案中,提供AAV生產系統,用於生產本揭露中rAAV顆粒,其中,該生產系統包含:
1)編碼AAV衣殼的多核苷酸序列;
2)本揭露任意多核苷酸或載體基因組(或病毒基因組)或載體;和
3)足夠的AAV rep功能和輔助功能,以允許將(b)中的多核苷酸或載體基因組(或病毒基因組)或載體包裝到AAV衣殼中。
前述方案中,AAV衣殼選自前述本揭露任意的AAV衣殼,例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ或AAV-DJ8。
一些具體實施方案中,足夠的AAV rep功能和輔助功能藉由包裝細胞提供,該包裝細胞可以包含pHelper、pRC9、pGOI這三種質粒。
一些實施方案中,Rep基因編碼調節功能的非結構蛋白,例如AAV基因組的複製,可以選自Rep78、Rep68、Rep52、Rep40。Rep78和Rep68通常從p5啟動子轉錄,而Rep52和Rep40通常從p19啟動子轉錄。Cap基因編碼組裝形成病毒殼體殼體的結構蛋白VP1、VP2和/或VP3。Cap基因通常從p40啟動子轉錄。
一些實施方案中,提供上述AAV生產系統生產的rAAV顆粒。
細胞
本揭露提供能夠包裝AAV的細胞,該細胞為適於異源蛋白生產的任何細胞。
一些實施方案中,該細胞為哺乳動物細胞,包括但不限於HEK293、HELA、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、VERO、RD、BHK、HT 1080、A549、COS-7、ARPE-19和MRC-5。
一些實施方案中,該細胞為昆蟲細胞,可來自草地貪夜蛾、果蠅(Drosophila)細胞系,或蚊細胞系,如白紋伊蚊(Aedesalbopictus)衍生細胞系,包括但不限於Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5、HighFive(Invitrogen,CA,USA)、AO38和BM-N。
醫藥組成物
本揭露提供醫藥組成物,其含有預防或治療有效量的活性成分(例如上述任意的本揭露的多核苷酸(包括AADC多核苷酸和/或GDNF多核苷酸)或rAAV顆粒),以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
一些實施方案中,該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的多核苷酸(包括AADC多核苷酸和/或GDNF多核苷酸)或rAAV顆粒。另一些具體實施方案中,醫藥組成物單位劑量中含AADC基因拷貝量為0.1至10×1013,和/或GDNF基因拷貝量為0.1至10×1013。
一些實施方案中,該醫藥組成物含有配製劑,該配製劑包括但不限於生理鹽水、脂質體、脂質納米顆粒、聚合物、肽、蛋白質及其組合。該配製劑可以藉由藥理學領域中已知的或以後開發的任何方法來製備。
一些實施方案中,可以用rAAV顆粒轉染細胞用於轉移或移植入受試者。
一些實施方案中,醫藥組成物中含有rAAV顆粒,該rAAV顆粒包裹有多核苷酸,該多核苷酸與SEQ ID NO:13-25任一所示序列具有至少95%同一性,例如,該多核苷酸包含SEQ ID NO:13-25任一所示的序列。
治療疾病的方法和製藥用途
本揭露提供前述任意的本揭露的多核苷酸(包括AADC多核苷酸和/或GDNF多核苷酸)、rAAV顆粒、醫藥組成物用於治療、緩解或改善疾病或症狀的方法或用途。
本揭露提供前述任意多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物和左旋多巴聯合治療、緩解或改善前述神經學疾病或症狀的方法或用途。
一些實施方案中,提供前述本揭露任意多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物,該任意多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物與左旋多巴聯合施用。
一些實施方案中,提供左旋多巴,該左旋多巴與前述本揭露任意多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物聯合施用。
一些實施方案中,該疾病或症狀是AADC蛋白缺乏導致或相關的,和/或該疾病或症狀是GDNF蛋白缺乏導致或相關的。
一些實施方案中,該疾病或症狀是神經學疾病或症狀,例如中樞神經系統疾病或症狀。該中樞神經系統疾病或症狀可以是影響腦的任何部分(包括腦半球,間腦,腦幹和小腦)或脊髓的疾病或症狀。該神經學疾病或症狀包括但不限於神經肌肉疾病、溶酶體疾病、創傷、骨髓損傷、疼痛(包括神經性疼痛)、神經系統癌症、脫髓鞘疾病、神經系統自身免疫性病症、神經毒性綜合症、睡眠病症、遺傳性腦疾病和發育CNS病症為特徵的疾病或症狀。本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物可以緩解或減輕由有需要的受試者中的基因產物的水平和/或功能異常(例如、蛋白質的缺乏或缺陷)引起的症狀、或以其他方式對有需要的受試者中的CNS病症賦予益處。
一些實施方案中,該疾病或症狀是神經學疾病或症狀,包括但不限於阿爾茨海默氏病(AD)、肌萎縮性側索硬化症(ALS)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease,CJD)、亨廷頓氏病(HD)、弗裡德賴希共濟失調(FA)、帕金森病(PD)、多系統萎縮症(MSA)、脊髓性肌萎縮症(SMA),多發性硬化症(MS)、原發性進行性失語、進行性核上性麻痹(PSP)、癡呆、腦癌、變性性神經病症、腦炎、癲癇、導致神經變性的遺傳性腦病症、色素性視網膜炎(RP)、頭和腦畸形、腦積水、中風、朊病毒病、嬰兒神經元
蠟樣質脂褐質沉積症(INCL)(由溶酶體酶棕櫚醯蛋白硫酯酶-1(PPT1)的缺乏引起的兒童神經變性性疾病等)。
一些實施方案中,該疾病或症狀是中樞神經系統的生長和發育受損有關的疾病,即神經發育病症。在某些方面、此類神經發育病症可以是由遺傳突變引起的、包括但不限於脆性X綜合症(由FMR1基因突變引起)、唐氏綜合症(由21號染色體三體性引起)、Rett綜合症、威廉姆斯(Williams)綜合症、安格爾曼(Angelman)綜合症、Smith-Magenis綜合症、ATR-X綜合症、Barth綜合症、嬰兒時期的免疫功能障礙和/或傳染病、例如Sydenham舞蹈病、精神分裂症、先天性弓形蟲病、先天性風疹綜合症、代謝性病症(例如糖尿病和苯丙酮尿)、營養缺陷和/或腦外傷、自閉症和自閉症譜。
一些實施方案中,該疾病或症狀是中樞神經系統中的腫瘤,包括但不限於聽神經瘤、星形細胞瘤(I、II、III和IV級)、脊索瘤、CNS淋巴瘤、顱咽管瘤、神經膠質瘤(例如、腦幹神經膠質瘤、室管膜瘤、視神經神經膠質瘤、室管膜下瘤)、髓母細胞瘤、腦膜瘤、轉移性腦瘤、少突膠質細胞瘤、垂體瘤、原始神經外胚層(PNET)和許旺細胞瘤。
一些實施方案中,該疾病或症狀是具有運動和/或感覺症狀的功能性神經學病症,其在中樞神經系統中具有神經系統起源,包括但不限於慢性疼痛、癲癇發作、語言問題、不自主運動和睡眠障礙(sleep disorder)。
一些實施方案中,該疾病或症狀是白質病症(影響中樞神經系統中神經纖維的一組疾病),包括但不限於Pelizaeus-Merzbacher病、低髓鞘化伴有基底神經節和小腦萎縮、Aicardi-Goutières綜合症、巨腦性白質腦病(Megalencephalic leukoencephalopathy)伴皮層下囊腫、先天性肌營養不良、肌強直性營養不良、Wilson病、Lowe綜合症、綜合症、PIBD或Tay
綜合症、Cockayne病、腦腱黃瘤病、Zellweger綜合症、新生兒腎上腺腦白質營養不良、嬰兒雷夫敘姆病、Zellweger樣綜合症、假Zellweger樣綜合症、假新生兒腎上腺腦白質營養不良、雙功能蛋白缺乏症、X連鎖腎上腺腦白質營養不良和腎上腺脊髓神經病和Refsum病。
一些實施方案中,該疾病或症狀是可以是由中樞神經系統中的細胞不能分解代謝終產物而引起的溶酶體貯積症(LSD)、戈謝病(由β-葡糖腦苷脂酶(GBA)基因突變引起)、GM1/GM2神經節苷脂貯積病、黏多糖累積病病症、龐佩(Pompe)病、神經元蠟樣脂褐質沉積症,該LSD包括但不限於尼曼-皮克(Niemann-Pick)病、異染性腦白質營養不良(MLD)、球狀細胞腦白質營養不良症(Globoid-cellleukodystrophy,GLD)、法布裡病。
一些實施方案中,該疾病或症狀是弗裡德賴希共濟失調、肌萎縮性側索硬化(ALS)、亨廷頓氏病、脊髓性肌萎縮(SMA)。
一些實施方案中,提供前述任意的本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物用於治療、緩解或預防帕金森病或症狀的方法或用途。
一些實施方案中,在施用本文所述的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物之前,前患有帕金森病的受試者已經觀察到運動症狀例如震顫和運動的改變。震顫的非限制性實例包括單側或雙側輕度震顫,雙側或中線中度震顫或頑固性震顫。運動的非限制性實例包括輕度運動遲緩、中度運動遲緩、重度運動遲緩和早晨運動遲緩。
一些實施方案中,帕金森病受試者可以具有平衡的改變,例如但不限於平衡受損、翻正反射受損、明顯的平衡病症或摔倒。
一些實施方案中,帕金森病受試者可以有非運動症狀的改變,作為非限制性實例,在施用本文所述的組成物之前,受試者可以患有輕度
至中度的認知障礙;作為另一個非限制性實例,帕金森病受試者可以具有明顯的認知障礙,例如癡呆,其也可以包括行為障礙,例如幻覺。
一些實施方案中,帕金森病受試者可以具有運動波動,引起對一種或多種多巴胺能藥物的輕度至中度失能。
一些實施方案中,在施用本文所述的組成物之前,帕金森病受試者可以具有由“逐漸減弱(wearing off)”和/或左旋多巴誘導的運動失調組成的醫學上難治性運動波動,其引起明顯的失能。
一些實施方案中,受試者可以具有與帕金森氏病相關的輕度症狀,例如但不限於無認知損傷(在過去5年內診斷),對一種或多種多巴胺能藥物具有有限波動的令人滿意的響應,單側或雙側輕度震顫,對生活質量具有很少的影響或無影響,和/或無平衡損傷。
一些實施方案中,受試者可以具有與帕金森氏病有關的中度症狀,例如但不限於輕度至中度認知障礙,平衡受損和翻正反射的初步體徵,對一種或多種多巴胺能藥物引起輕度-中度失能的運動波動(在過去5到10年內診斷),雙側或中線中度震顫,中度運動遲緩和/或日常生活活動經歷一定限制的受試者。
一些實施方案中,受試者可以具有與帕金森氏病相關的晚期症狀,例如但不限於診斷患有帕金森氏病超過10年,中等難治性運動波動逐漸消失和/或左旋多巴誘導的運動障礙,引起重大失能,頑固性震顫,明顯的平衡病症和/或摔倒,明顯的認知障礙(例如患有或不患有行為障礙的癡呆),嚴重的運動遲緩,生活質量因疾病和/或早晨運動障礙而明顯降低。
一些實施方案中,帕金森氏病受試者與本揭露中多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物組合使用左旋多巴(例如DUOPATM)。作為非限制性實例,受試者可以藉由單獨使用左旋多巴(例如DUOPATM)獲得成功。作
為非限制性實例,單獨使用DUOPATM,受試者可以尚未獲得任何成功或獲得有限的成功。
一些實施方案中,在施用本揭露中多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物前,評估受試者的UPDRS-3(或UPDRS-III)藥物得分。一些實施方案中,施用本揭露中多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物後,受試者的UPDRS-3(或UPDRS-III)藥物得分降低。
一些實施方案中,施用本揭露中多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物後,受試者具有改善的運動功能,和/或受試者管理症狀所需要的左旋多巴藥物量的減少。
一些實施方案中,提供前述任意的本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物用於治療晝夜節律、覺醒週期相關疾病或症狀的方法或用途,包括但不限於睡眠病症(例如失眠)、抑鬱、雙相型障礙、季節性情感障礙、肥胖和糖尿病。
一些實施方案中,可以藉由任何導致治療有效結果的遞送途徑施用本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物,包括但不限於腸、腸胃、硬膜外、口服、透皮、腦內、腦室內(包括側腦室內)、表皮、皮內、皮下、鼻施用、靜脈內、靜脈內、動脈內、肌肉內、骨內輸注(包括進入骨髓)、鞘內(包括進入椎管)、實質內(進入腦組織)、腹膜內(輸注或注射入腹膜)、經皮(擴散藉由完整的皮膚、用於系統性分佈)、透黏膜、經氣管(藉由氣管壁)等。例如,經口內、經鼻內、經皮下、經肌肉內、經血管(例如靜脈)內、經鞘內、經腦和/或腦室內。
一些實施方案中,藉由注射到CSF途徑中來遞送或施用本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物。例如,遞送或施用至中樞神經系統(例如實質)的細胞。例如,遞送或施用到鞘內和腦室內。例如,遞送或施
用到黑質或紋狀體內,包括黑質緻密部(SNpc)和腹側被蓋區(VTA),或者可選地,紋狀體內(進入尾狀核和殼)或進入丘腦下核(STN)。例如,遞送或施用到DRG傷害感受神經元、小腦延髓池以及轉導脊髓運動神經元和/或星形膠質細胞。該遞送或施用可以是注射或直接輸注。
一些實施方案中,以允許多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物穿過血腦屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。
一些實施方案中,可以藉由單部位或多部位(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個部位)施用本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物。
一些實施方案中,可以藉由單劑量施用本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物。單劑量靜脈內遞送可為患有中樞神經系統(例如帕金森氏病)和/或相關症狀的受試者提供持久的緩解。緩解可持續數分鐘、數天、數週、數月(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月)、數年(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年或以上)。
前述多核苷酸包括本揭露任意的AADC多核苷酸和/或GDNF多核苷酸。
試劑盒和裝置
本揭露提供包含前述任意本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物的試劑盒和裝置。
一些實施方案中,試劑盒中含有容器裝置,通常將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器裝置,其中可以放置多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物。試劑盒通常還可以含有可以分開放置另外的組分的第二、第三或其他另外的容器,用於容納例如無菌的藥學上可接
受的緩衝液和/或其他稀釋劑。一些二實施方案中,試劑盒中包含藥品說明書。
一些實施方案中,本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物可以與裝置組合,塗布到裝置上或在裝置中包埋。裝置可以包括但不限於支架、泵和/或其他可植入治療裝置。另外,當受試者使用壓縮裝置,例如但不限於壓縮裝置以減少受試者中深靜脈血栓形成(DVT)的機會時,可以將該多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物遞送至受試者。
一些實施方案中,可以使用装置,包括但不限於支架、管(包括導管、管道、吸管)、基因槍遞送本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物。可以使用遞送系統將本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物施用於受試者,該遞送系統整合圖像引導療法並整合成像,包括但不限於激光、MRgFUS、內視鏡和機器人手術装置。可以使用自動遞送系統將本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物施用於受試者,作為非限制性實施例,此處全文引入US5865744中描述的装置,根據遞送系統收集的圖像,計算機將針施用調節為特定受試者的合適的深度。可以使用設備定位到受試者上的目標點、增強的遞送装置或MIR引導裝置來遞送本揭露的多核苷酸、rAAV顆粒、醫藥組成物,作為非限制性實施例,此處全文引入US8340743中描述的方法、系統和/或計算機程序。
定義
為了更容易理解本揭露,以下具體定義了某些技術和科學。除非在本揭露中另有明確定義,本揭露使用的所有其它技術和科學都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
除非上下文另外清楚要求,否則在整個說明書和申請專利範圍中,應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義,而不是排他性或窮舉性意義;也即,“包括但不僅限於”的意義。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
“芳族L-胺基酸脫羧酶”、“芳香族胺基酸多巴脫羧酶”或“AADC(Amino Acid Decorboxylase)”是一種同源二聚體的磷酸吡哆醛依賴性的酶,負責多巴胺和血清素的合成。AADC催化L-3,4-二羥基苯丙胺酸(L-DOPA或左旋多巴)脫羧為多巴胺,催化L-5-羥基色胺酸脫羧為血清素,以及催化L-色胺酸脫羧為色胺。本揭露中的AADC蛋白及其編碼多核苷酸涵蓋野生型AADC蛋白、其變體及相關編碼多核苷酸。示例性的AADC蛋白序列及其編碼多核苷酸序列如本揭露的SEQ ID NO:1和3所示。野生型AADC蛋白可以是來自多巴羧化酶(DDC)基因的任何天然存在的同種型或變體,已經鑑定出編碼AADC的不同同種型的多個可變剪接的轉錄變體。具體來說,DDC基因產生七個轉錄物變體,其編碼六個不同的同等型。DDC轉錄物變體1和2均編碼AADC同等型1。在一些實施方案中,AADC多核苷酸編碼DDC轉錄物變體2,從而編碼天然AADC同等型1(NCBI數據庫:NP_000781.1)。本揭露也全文引入WO2018232055A中的AADC作為示例性AADC。“AADC多核苷酸”是編碼AADC蛋白並且當存在於載體、質粒或可翻譯的構建體中時在細胞、組織、器官或生物體中表達此類AADC蛋白的任何多核苷酸聚合物。
“神經膠質細胞源性神經營養因子”或“GDNF(Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor)”是一種神經營養因子,可支持周圍交感神經、副交感神經、腸神經和感覺神經的神經元以及中腦多巴胺神經元
和運動神經元的發育和存活,本揭露中的GDNF蛋白及其編碼多核苷酸涵蓋野生型GDNF蛋白、其變體及相關編碼多核苷酸。已知存在pre-(α)pro-GDNF(先前稱為GDNFα)和pre-(β)pro-GDNF(先前稱為GDNFβ)這兩種GDNF剪接變體(Suter-Crazzolara and Unsicker;1994),其是藉由GDNF mRNA的不同剪接產生的。這兩種剪接變體產生的成熟GDNF蛋白非常可能是一樣的,成熟GDNF由134個胺基酸組成,含有兩個推測的N-糖基化位點和7個保守半胱胺酸,這些半胱胺酸與TGF-β蛋白家族的其他成員處於同樣的相對間距,生物活性的成熟GDNF二聚體是藉由單體中未配對的半胱胺酸之間的共價二硫鍵形成的(Lin et al.,1993;Eigenbrot and Gerber,1997;Chang et al.,2002)。示例性的GDNF蛋白序列及其編碼多核苷酸序列如本揭露的SEQ ID NO:2和8所示。本揭露也全文引入US6362319中的(α)pro-GDNF蛋白、US6184200中的截短形式的GDNF、WO2009053536A中的GDNF作為示例性GDNF。“GDNF多核苷酸”是編碼GDNF蛋白並且當存在於載體、質粒或可翻譯的構建體中時在細胞、組織、器官或生物體中表達此類GDNF蛋白的任何多核苷酸聚合物。
“腺相關病毒(AAV)”涵蓋“重組腺相關病毒(rAAV)”,其是一種複製缺陷的無包膜病毒,是依賴性病毒(Dependovirus)屬細小病毒科的成員。“AAV顆粒”或“rAAV顆粒”由至少兩種組分組成,包括殼體和包裹在內的多核苷酸。AAV顆粒可以源自本揭露所述或本領域已知的任何血清型,包括血清型的組合(即“假型化”AAV)或各種基因組(例如單鏈或自身互補)。另外,AAV顆粒可以是複製缺陷的和/或靶向的。本揭露的AAV涵蓋變體,該變體可以在多核苷酸(基因組或衣殼)和胺基酸水平(衣殼)上具有顯著同源性的序列,以產生構建體,該構建體通常為物理和功能等同物,藉由相似的機制複製,並藉由相似的機制組裝。
“多肽”、“蛋白”或“蛋白質”可互換使用,指胺基酸殘基的聚合物,適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明,否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體。
“多肽變體”或“蛋白變體”是指與天然或起始序列相比其胺基酸序列具有一些差異的分子。該變體可以在胺基酸序列內的某些位置具有取代、缺失和/或插入。“天然”或“起始”序列不應與野生型序列混淆。如本揭露所用,天然或起始序列是相對術語,是指可以與之進行比較的原始分子。“天然”或“起始”序列或分子可以代表野生型(在自然界中發現的序列),但不必是野生型序列。通常,變體與天然序列具有至少約70%的同一性,較佳具有至少約80%,更佳至少約90%的同一性。
“類似物”是指包括相差一個或多個胺基酸改變(例如,胺基酸殘基的取代、添加或缺失),且仍保持親本多肽的性質的多肽變體。類似物可經由對親本多肽的保守取代獲得,這種保守取代的方法是本領域所常規使用的。
“保守取代”當在蛋白或多肽中時,是指取代為具有與原始胺基酸殘基相似的特性的另一個胺基酸殘基。例如,賴胺酸、精胺酸和組胺酸具有相似的特性,在於它們具有鹼性側鏈,並且天冬胺酸和谷胺酸具有相似的特性,在於它們具有酸性側鏈。此外,甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸和色胺酸具有相似的特性,在於它們具有不帶電荷極性側鏈,並且丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸和甲硫胺酸具有相似的特性,在於它們具有非極性側鏈。另外,酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和組胺酸具有相似的特性,在於它們具有芳族側鏈。因此,所屬技術領域具有通常知識者將顯而易見,
甚至當取代如上文所述的顯示相似特性的組中的胺基酸殘基時,它將不顯示特性的特定變化。
“連接子”、“Linker”或“接頭”指連接兩個多肽片段或其編碼多核苷酸的連接單元,通常具有一定的柔性,接頭的使用不會使蛋白質結構域原有的功能喪失。連接子可以是肽連接子或其編碼多核苷酸,其包含一個或多個胺基酸(典型的約1-30個、2-24個或3-15個胺基酸)或其編碼多核苷酸。應用於本揭露的連接子可以是相同或不同的。
“融合”或“連接”是指部件(例如兩個目的基因的編碼多核苷酸或其編碼獲得的蛋白或多肽)直接地或經由一個或多個連接子而藉由共價鍵連接。當連接子是肽連接子時,該共價鍵是肽鍵。
“多核苷酸”、“多核苷酸”可互換使用,是指呈線性或環狀構象並且呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。本揭露中,該術語不被解釋為具有長度限制性的。該術語可涵蓋天然核苷酸的已知類似物,以及在鹼基、糖和/或磷酸部分(例如,硫代磷酸主鏈)中被修飾的核苷酸。一般來說,具體核苷酸的類似物具有相同的鹼基配對特異性,例如,A的類似物將與T鹼基配對。當將多核苷酸與另一個多核苷酸序列置於功能關係中時,多核苷酸是“有效連接的”。例如,如果表達控制序列(例如啟動子或增強子)影響目的基因的轉錄,那麼表達控制序列有效地連接至該目的基因。
“RNA”、“核糖多核苷酸”是指核糖核苷酸的聚合物。“DNA”、“脫氧核糖多核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA可以天然地合成(例如分別藉由DNA複製和DNA轉錄)或藉由化學合成。DNA和RNA可以是單鏈的(即,分別為ssRNA或ssDNA)或多鏈的(例如,雙鏈,
即分別為dsRNA和dsDNA)。“mRNA”或“信使RNA”是指編碼一條或多條多肽鏈的胺基酸序列的單鏈RNA。
“可操作地連接”是指兩個或更多個分子、構建體、轉錄物、實體,部分等之間的功能連接,涵蓋表達控制序列與目的基因相鄰以及表達控制序列反式或遠距離起作用以控制目的基因表達的兩種情況。
“多核苷酸與表達控制序列可操作地連接”是指該多核苷酸在該表達控制序列的調控下進行表達。兩個或更多個多核苷酸可以在同一表達控制序列的調控下進行表達;也可以在兩個相同或不同的表達控制序列的調控下進行表達。
本文所用的“表達控制序列”涵蓋控制編碼序列表達的任何多核苷酸,包括但不限於啟動子、增強子等。
“序列”是指任何長度的胺基酸序列或多核苷酸序列,當為多核苷酸序列時,可以是DNA或RNA;可以是線性的、環狀的或分支的,並且可以是單鏈的或雙鏈的。
“同源性”、“同一性”或“序列同一性”是指聚合物(例如寡核苷酸、多核苷酸或多肽)分子之間的整體相關性。例如,可以藉由比對兩條多核苷酸序列來對兩者的同一性百分比進行計算。由於計算中引入的缺口和罰分,同一性的數值可能不同,但可以選擇最佳的方式(例如,可以在比對的兩個序列中的一條或兩條中引入缺口以實現最佳比對,並且可以忽略不同的序列以實現比較,該兩個序列一條為被比對的目的序列,另一條為參考序列)。一些實施方案中,被比對的目的序列的長度可以為參考序列長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%,然後比較相應核苷酸位置處的核苷酸。當被比對的目的序列中的位置被與參考序列中的相應位置相同的核苷酸佔據
時,則兩者在該位置處是相同的。兩個序列之間的同一性百分比為考慮到缺口的數量和每個缺口的長度,序列共享的相同位置的數目的函數,該缺口需要被引入以實現兩個序列的最佳比對。序列的比較和兩個序列之間同一性百分比的確定可以使用數學算法來完成。例如,兩條多核苷酸序列之間的同一性百分數可以使用方法,諸如以下中描述的那些方法測定:Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.編,Academic Press,New York,1993;Sequence Analysisin Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Computer Analysis ofSequence Data,PartI,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.編,Humana Press,New Jersey,1994;和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.編,M StocktonPress,New York,1991(均全文併入本揭露)。例如,可以使用已經併入ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)算法,使用PAM120權重殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4,測定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比。或者,可以使用NWSgapdna.CMP矩陣,使用GCG軟件包中的GAP程序測定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比。通常用於測定序列之間的同一性百分比的方法包括但不限於Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073。
“保守的”指多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或胺基酸殘基,其是在比較的兩條或多個序列的相同位置中不變的那些。相對保守的核苷酸或胺基酸是與序列中其他位置出現的核苷酸或胺基酸相比更相關序列中保守的核苷酸或胺基酸。一些實施方案中,如果兩個或多個序列彼此100%相同,則為“完全保守”;如果兩個或多個序列彼此至少70%、75%、
80%、90%、95%或以上相同,則為“高度保守”;如果兩個或多個序列彼此至少30%、40%、50%、60%或以上相同,則為“保守”。序列的保守性可以應用於寡核苷酸、多核苷酸或多肽的全長,或者可以應用於其一部分或區域。保守序列可以是不連續的,所屬技術領域具有通常知識者能夠理解當序列之間存在連續比對中的缺口時如何實現比對,以及如何在不容忍存在的插入或缺失的情況下比對相應的殘基。
“基因表達”是指將基因中所含的信息轉換為基因產物,例如多核苷酸經歷成功轉錄並且在大多數情況下翻譯以產生蛋白質或肽的過程。基因產物可以是基因的直接轉錄產物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結構RNA或任何其它類型的RNA)或藉由mRNA翻譯產生的蛋白質。基因產物還包括藉由諸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和編輯等過程修飾的RNA,以及藉由例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻化和糖基化修飾的蛋白質。基因表達的“調節”是指基因活性的變化,表達的調節可包括但不限於基因活化、基因優化和基因阻遏。基因組編輯(例如,裂解、改變、滅活、隨機突變)可用於調節表達。當提及“基因表達”的測量時,應理解為意指測量可以是轉錄的多核苷酸產物,例如RNA或mRNA,或翻譯的胺基酸產物,例如多肽或肽。測量RNA、mRNA、多肽和肽的量或水平的方法是本領域公知的。
“轉染”是指將外源多核苷酸導入細胞中的方法。轉染的方法包括但不限於化學方法、物理處理和陽離子脂質或混合物。
“有效負載”是指由病毒基因組編碼或在病毒基因組內編碼的一種或多種多核苷酸或多核苷酸區域或者此類多核苷酸或多核苷酸區域的表達產物,例如轉基因、編碼多肽的多核苷酸或調控多核苷酸。本揭露的一些實施方案中,有效負載編碼或表達目的基因,該目的基因例如是AADC
和/或GDNF。“有效負載構建體”是編碼或包含在一側或兩側側翼有反向末端重複(ITR)序列的有效負載的一個或多個多核苷酸區域,有效負載構建體是在病毒生產細胞中複製以產生病毒基因組的模板。“有效負載構建體載體”是編碼或包含有效負載構建體以及用於在細菌、細胞中複製和表達的調節區的載體。“有效負載構建體表達載體”是編碼或包含有效負載構建體,並且還包含一個或多個編碼或包含用於病毒複製細胞中病毒表達的組分的多核苷酸區域的載體。
“載體”是運輸、轉導或以其他方式用作異源分子的構建體,例如,能夠在宿主細胞中遞送並且表達一種或多種目的基因的構建體。載體的例子包括但不限於病毒載體、裸露DNA或RNA表達載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子聚合物結合的DNA或RNA表達載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表達載體。一些實施方案中,載體可以藉由重組產生,可以基於AAV親本或參考序列產生,也可以包含AAV親本或參考序列。該親本或參考AAV序列可以充當工程化改造載體的原始或後續序列。該親本或參考AAV序列可包含表達目的基因的多核苷酸序列(編碼目的蛋白、多肽或其部分)、調控原件(例如啟動子、增強子)的多核苷酸序列,該序列可以是野生型的或經修飾的或經突變的。
“載體基因組”是包含編碼至少一個反向末端重複(ITR)、至少一個調控序列和至少一個有效負載的多核苷酸。藉由從有效負載構建體表達載體複製有效負載構建體來衍生載體基因組。載體基因組編碼有效負載構建體的至少一個拷貝。
“病毒構建體載體”是包含一個或多個編碼或包含Rep和/或Cap蛋白的多核苷酸區域的載體。“病毒構建體表達載體”是包含一個或多
個編碼或包含Rep和或Cap的多核苷酸區域的載體,其還包含一個或多個編碼或包含用於在病毒複製細胞中病毒表達的組分的多核苷酸區域。
“修飾的”是指與親本或參照分子或實體相比,分子或實體的改變的狀態或結構,可以以多種方式,包括在化學、結構和功能上修飾。在一些實施方案中,藉由引入非天然胺基酸或非天然核苷酸來修飾本揭露的多核苷酸、多肽、載體、構建體、衣殼等。
“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物,其可為或已是用於摻入多核苷酸插入片段的載體的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代,並且由於天然、偶然或有意的突變,子代可不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本揭露的多核苷酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用,並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是,由於故意或非有意的突變,所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。宿主細胞可包括微生物(例如細菌)、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員,例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株;芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、NS0細胞、293細胞。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本揭露所述rAAV與其他化學組分的混合物,以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫
藥組成物的目的是促進對生物體的給藥,利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
“藥學可接受的載體”或“藥學可接受的賦形劑”包括當與活性成分組合時,允許該成分保留生物學活性並且不與受試者的免疫系統反應的任何材料。例子包括但不限於任何標準藥物載體,例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑如油/水乳劑、和各種類型的潤濕劑。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時,是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸,例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸,以及試劑與流體的接觸,其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。當應用於人、獸醫學或研究受試者時,是指治療處理、預防或預防性措施,研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑,諸如包含本揭露的任一種多核苷酸或其編碼多肽、含有該多核苷酸的rAAV或相關醫藥組成物作為治療劑,該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種神經退行性疾病或其症狀,而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常,在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑,無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床能測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化,例如受試者的疾病狀態、年齡和體重,以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法,可評價疾病症狀
是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效,但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定,其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“組合施用”是指將兩種或更多種藥劑(例如,rAAV顆粒)同時或在一定間隔內施用於受試者,使得可以有每種藥物對患者和/或受試者在某個時間點同時暴露於兩者的作用的重疊。在一些實施方案中,它們在彼此約60、30、15、10、5或1分鐘內或在至少一劑一種或多種其他藥劑的約24小時、12小時、6小時、3小時內施用。
“遞送”是指對靶物遞送化合物,諸如細小病毒、例如AAV和/或AAV化合物、物質、實體、部分、貨物或有效負載的動作或方式。此類靶物可以是細胞、組織、器官、生物體或系統。
“改善”指減輕狀況或疾病的至少一種指標的嚴重性。例如,在神經變性疾病的背景下,改善包括減少神經元損失。
“有效量”包含治癒、緩解、改善一種或多種醫學病症的症狀或病症本身的量,以在臨床結果中實現有益或期望的結果。“有效量”取決於其應用的環境,用於受試者的有效量可依據以下因素而變化:如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。例如,在施用治療帕金森病的醫藥組成物的情況下,與未施用該醫藥組成物的情況下獲得的響應相比,有效量是例如足以實現如本揭露所定義的帕金森病治療的量。
“包裹”是指包封、圍繞或包圍,例如使用AAV衣殼包封、圍繞或包圍載體。
“遞送”是指對靶物遞送化合物,諸如細小病毒、例如AAV和/或AAV化合物、物質、實體、部分、貨物或有效負載的動作或方式。此類靶物可以是細胞、組織、器官、生物體或系統(無論是生物學還是生產)。“遞送劑”是指至少部分促進多核苷酸和/或一種或多種物質(包括但不限於本發明的化合物和/或組成物,例如病毒顆粒或表達載體)對靶定細胞的體內和/或體外遞送的任何藥劑或物質。
“可選”、“視需要”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生,該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
“受試者”、“患者”意指哺乳動物,尤其靈長類動物,尤其是人。
“約”、“大約”是指數值在由所屬技術領域具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內,該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如,“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者,“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍,例如1%至15%之間、在1%至10%之間、在1%至5%之間、在0.5%至5%之間、在0.5%至1%之間變化,本揭露中,數字或數值範圍之前有術語“約”的每種情況也包括給定數的實施方案。除非另外說明,否則當具體值在本申請和請求項中出現時,“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
圖1為本揭露表達AADC和/或GDNF的多核苷酸結構示意圖。
圖2A為質粒轉染SHSY5Y細胞並給與L-DOPA處理後HPLC檢測DOPA的濃度;圖2B為質粒轉染SHSY5Y細胞後ELISA檢測GDNF的濃度。
圖3A為AADC密碼子優化後的各個AAV質粒表達AADC蛋白量;圖3B為GDNF密碼子優化後的各個AAV質粒表達GDNF蛋白量。
圖4A為AAV2和AAV9血清型轉染後小鼠紋狀體AADC的免疫螢光信號;圖4B為AAV2和AAV9血清型轉染後小鼠紋狀體AADC的免疫螢光覆蓋面積。
圖5A為AAV2-02A和AAV9-02A注射後紋狀體AADC的表達量;圖5B為AAV2-02A和AAV9-02A注射後紋狀體GDNF的表達量。
圖6A為HRPDAAV02-AI(即,02AI,下同)和HRPDAAV03-DI(即,03DI,下同)藥物注射後小鼠對L-DOPA應答情況(逆時針旋轉);圖6B為HRPDAAV02-AI和HRPDAAV03-DI藥物注射後小鼠對L-DOPA應答情況(對側前肢利用率)。
圖7A為HRPDAAV02-AI和HRPDAAV03-DI藥物注射後小鼠對L-DOPA應答情況(非給藥側DOPA濃度);圖7B為HRPDAAV02-AI和HRPDAAV03-DI藥物注射後小鼠對L-DOPA應答情況(給藥側DOPA濃度);圖7C為HRPDAAV02-AI和HRPDAAV03-DI藥物注射後小鼠對L-DOPA應答情況(血液內DOPA濃度);圖7D為HRPDAAV02-AI和HRPDAAV03-DI藥物注射後小鼠對多巴胺神經元的保護情況,對多巴胺神經末梢免疫螢光信號密度進行統計。
圖8A為6-OHDA造模後各組動物對阿撲嗎啡的應答情況;圖8B為HRPDAAV02-AI和HRPDAAV03-DI藥物注射後大鼠對L-DOPA的應答情況(旋轉測試);圖8C為建立圓筒測試實驗的大鼠模型的檢測結果;圖8D為HRPDAAV02-IA和HRPDAAV03-DI藥物注射後大鼠對L-DOPA的應答情況(對側前肢利用率);8E為HRPDAAV02-IA和HRPDAAV03-DI給藥後紋狀體對L-DOPA的代謝能力檢測結果(患側/健側的DOPA比值);8F為HRPDAAV-03DI給藥後對DA神經元保護作用。
在本揭露中,****代表p<0.0001,***代表p在0.0001至0.001之間,兩者均表示極其顯著的統計學差異;**代表p在0.001至0.01之間,表示十分顯著的統計學差異;*代表p在0.01至0.05之間,表示顯著的統計學差異。
以下結合實施例用於進一步描述本揭露,但這些實施例並非限制本揭露的範圍。
本揭露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等,分子選殖,實驗室手冊,冷泉港實驗室;當代分子生物學方法,Ausubel等著,Greene出版協會,Wiley Interscience,NY。未註明具體來源的試劑,為市場購買的常規試劑。
實施例1. AADC、GDNF多核苷酸結構設計
本實施例對AADC、GDNF的編碼多核苷酸進行序列設計和工程改造,以用於轉導細胞,或用於人、動物的體內轉導。該序列可插入
到質粒、慢病毒、腺病毒、mRNA-LNP、腺相關病毒(AAV)載體中,例如藉由重組腺相關病毒(rAAV)實現體內、體外轉導。該rAAV質粒結構ITR之間的具體序列參見表2,所使用的增強子例如可包括CMV增強子,啟動子例如可包括CMV啟動子、CBA啟動子。表2中的序列均為未經密碼子優化。結構示意圖參見圖1。
實施例2. AADC/GDNF多核苷酸在體外表達驗證AADC對L-DOPA的轉化效率和GDNF的表達
DOPA主要在中腦黑質區域產生,信號通路如下:
SHSY5Y細胞是一種人類神經母細胞瘤細胞系。本實施例將含有AADC/GDNF的rAAV載體質粒轉導入SHSY5Y細胞(ATCC),在培養基中添加左旋多巴(L-DOPA),後取上清。
1、藉由HPLC檢測多巴胺(DOPA)的濃度,以觀察rAAV載體將L-DOPA轉化為DOPA的轉化效率。
方法如下:第0天,在6孔板內鋪板2E+5至6E+5個SHSY5Y細胞/孔,以使24h後轉染時細胞密度達到60%~80%。第1天,分別配置HRPDAAV01-A~HRPDAAV03-F的轉染體系,包括A管(rAAV質粒2.5μg,Opti-MEM(GIBCO,31985088)250μL,Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific,L3000001)5μL)和B管(Opti-MEM 250μL,Lipofectamine 3000 7.5μL),將A管和B管分別配置好後,混勻後靜置2~3min,然後將A管溶液緩慢加入B管內,輕輕吹打後混勻,靜置10~15min。轉染前細胞換液1.5mL(DMEM/F12(GIBCO,31331093)+15% FBS(GIBCO,26140079)),然後逐滴加入配置好的轉染體系;轉染後6h,更換培養基3mL(DMEM/F12+15%FBS);轉染後24h,更換含有L-DOPA(Sigma-Aldrich,D9628)(2mMol)的培養基(DMEM/F12+15%FBS)3mL;轉染後48h,取上清,藉由HPLC檢測DOPA濃度,以檢測AADC的表達和功能。
HPLC步驟如下:裂解組織時加入預冷的PBS(1mg組織:10μLPBS),使用預冷的組織研磨儀充分勻漿樣品後取100μL勻漿液用作HPLC實驗。等體積加入預冷的樣品處理液(0.2M高氯酸,0.2mM焦亞硫酸鈉0.01%EDTA 2Na),同時含有0.6μM DHBA作為內標,4℃預冷的離心機中10000g離心20min,取上清,用0.22μm水相微孔濾膜加壓過濾。20℃保存。樣品使用HPLC EDC系統檢測。流動相為16%甲醇水溶液(含
有40mM乙酸鈉、15mM檸檬酸、0.25mM辛烷磺酸鈉、0.2mM EDTA 2Na PH為4.3)。使用英譜色譜數據工作站軟件V5.0對色譜峰進行分析,以DHBA為內標對峰面積進行校正。藉由標準品進樣結果擬合標準曲線,計算樣品中多巴胺的含量,用“ng多巴胺/mg組織”表示結果。
2、藉由ELISA檢測GDNF濃度,以觀察rAAV載體表達GDNF的效率。
ELISA實驗嚴格按照試劑盒(RayBiotech,ELH-DDC)說明書進行,具體實驗步驟如下:裂解組織時加入預冷的PBS(1mg組織:10μL PBS),使用預冷的組織研磨儀充分勻漿樣品後,離心取上清,作ELISA實驗備用。在試劑盒(RayBiotech,ELH-DDC)上每個孔添加100μL標準品或樣品,室溫孵育2.5h;每個孔添加100μL biotin抗體,室溫孵育1h;每個孔添加100μL Streptavidin溶液,室溫孵育45min;每個孔添加100μL TMB,室溫孵育30min。每個孔添加50μL終止液。立即在450nm光譜讀數。
檢測結果參見圖2A和圖2B,顯示HRPDAAV02-A和HRPDAAV03-D在AADC和GDNF的表達和功能上相對較強。
實施例3. AADC和GDNF的密碼子優化
本實施例針對AADC和GDNF分別設計了4條密碼子優化的多核苷酸序列。AADC的野生型多核苷酸序列參見SEQ ID NO:3,密碼子優化序列AADC01、AADC02、AADC03、AADC04分別參見SEQ ID NO:4-7,SEQ ID NO:4-7與SEQ ID NO:3的序列同一性分別為80.83%、81.21%、79.18%、79.63%。GDNF的野生型多核苷酸序列參見SEQ ID NO:8,密碼子優化序列GDNF01、GDNF02、GDNF03、GDNF04分別
參見SEQ ID NO:9-12,SEQ ID NO:9-12與SEQ ID NO:8的序列同一性分別為75.13%、73.99%、77.52%、77.83%。
將AADC01、AADC02、AADC03、AADC04分別替換HRPDAAV02-A中的AADC序列,獲得HRPDAAV02-A(AADC01)、HRPDAAV02-A(AADC02)、HRPDAAV02-A(AADC03)、HRPDAAV02-A(AADC04),在圖式中分別對應02A(AADC01)、02A(AADC02)、02A(AADC03)、02A(AADC04)。將GDNF 01、GDNF 02、GDNF 03、GDNF 04分別替換HRPDAAV02-A中的GDNF序列,HRPDAAV02-A(GDNF01)、HRPDAAV02-A(GDNF02)、HRPDAAV02-A(GDNF03)、HRPDAAV02-A(GDNF04),在圖式中分別對應02A(GDNF01)、02A(GDNF02)、02A(GDNF03)、02A(GDNF04)。然後重複實施例2的篩選,得到表達和功能最強的AADC、GDNF密碼子優化序列AADC01、GDNF04,結果參見圖3A和圖3B。
將HRPDAAV02-A和HRPDAAV03-D中的AADC和GDNF替換成AADC01(SEQ ID NO:3)和GDNF04(SEQ ID NO:12)後得到HRPDAAV02-AI(SEQ ID NO:24)和HRPDAAV03-DI(SEQ ID NO:25)。HRPDAAV02-AI和HRPDAAV03-DI在附圖中分別對應02AI和03DI。兩者結構如表3。
實施例4. AAV血清型篩選
將HRPDAAV-02A分別用AAV2血清型(胺基酸序列參見SEQ ID NO:41)和AAV9血清型(胺基酸序列參見SEQ ID NO:42)進行包裝和純化,獲得AAV2-02A和AAV9-02A。
病毒包裝過程如下:
將包裝細胞(viral production cell,Thermo A3152801)以0.5×106vc/mL密度接種到裝有1L培養基(Irvine 91165)的3L搖瓶中;CO2搖床培養3天後,用新鮮培養基將細胞稀釋到3.0×106vc/mL;
將共4μg三種包裝質粒(pHelper、pRC9、pGOI)加入25mL新鮮培養基中,混勻;將PEIpro(Polyplus 115-100)加入另一份25mL新鮮培養基中,混勻;然後將PEIpro稀釋液倒入質粒稀釋液,迅速混勻;室溫靜置15min後,將轉染複合物加入包裝細胞;
CO2搖床培養3天後,加入50mL細胞裂解液(0.5M hepes,40mM MgCl2,10% tween-20)和200μLBenzonase(Merck 1.01697.0010),放回CO2搖床裂解4小時,即為收穫液。
病毒純化過程如下:
收穫液藉由深層濾器(科百特)過濾去除細胞碎片,然後使用100kDa中空纖維管柱(瑞普利金,D06-E100-05-N)濃縮10倍並且取代到PBS中(5倍體積);
將換液後的料液上樣至PBS平衡過的親和層析管柱(Thermo A36652),以5倍管柱體積的PBS漂洗,然後用100mM glycine,pH 3.0進行沖提,收集沖提液後儘快加入適當體積的1M BTP,pH 10.0調節pH至7.0左右;
加入30倍體積IEX平衡緩衝液(25mM BTP,pH 9.5)對沖提中和液進行稀釋,上樣至緩衝液平衡過的陰離子交換管柱(BIA 311.5113-2),以10倍管柱體積的IEX平衡緩衝液漂洗,然後進行NaCl鹽濃度梯度沖提,根據UV 260/280收集實心峰;
沖提液藉由超濾離心管(Merck,UFC810008)濃縮到1mL並且取代到PBS+0.01% Pluronic F-68中,使用0.22μm針式濾器過濾後即為純化病毒。將AAV2-02A和AAV9-02A進行大鼠(SD品系,雄性,購自上海傑思捷實驗動物有限公司)紋狀體腦立體定位注射,注射後4週和8週取部分大鼠的紋狀體,藉由EILSA檢測AADC和GDNF表達,注射後8週進行AADC免疫螢光切片。
方法如下:
取SD雄性大鼠,先用50mg/kg舒泰(i.p.)麻醉,將動物綁定於腦立體定位儀,沿顱頂正中矢狀切開皮膚,暴露前囟(Bregma),定位於右側紋狀體區位置1:AP-0.0mm,ML-2.6mm,DV-4.7mm;位置2:AP0.0mm,ML-2.6mm,DV-4.7mm。牙科鑽開顱骨顱後插入微量注射器每個位點用微量蠕動泵自動注入2μL受試藥物(0.2μL/min)。注射完畢留針10min後緩慢退出繼而縫合傷口。每隻大鼠皮下注射左氧氟沙星注射液0.3mL防止感染。手術後繼續飼養8週。
1)大鼠4%多聚甲醛心臟灌流後取腦,後固定24h以上,將樣本轉入30%的蔗糖溶液中充分沉底脫水。使用冰凍切片機進行紋狀體冠狀連續切片切片厚度為30μm切片置於凍存液中放於4℃冰箱保存。將腦切片在PBS中洗滌三次,用0.3%TritonX100處理10min,在含10%山羊血清的PBS中封閉1h,一抗為兔抗AADC抗體(Absin,abs110350)(1:1000),4℃孵育過夜。第二天,切片用PBS洗3次,每次5min,室溫孵育
驢抗兔IgGAlexaFluor488抗體(1:1500)和細胞核染料DAPI(1:15000)1h,PBS洗3次,用Dako抗螢光淬滅封片劑封片。奧林巴斯螢光顯微鏡下觀察拍照,如圖4A和圖4B所示,染色結果顯示,與AAV2-02A相比,注射AAV9-02A後AADC的螢光面積明顯更大(P<0.01,AAV2-02A vs AAV9-02A),證明AAV9比AAV2在紋狀體區域有更高的表達效率。
2)大鼠腦定位手術後飼養4週或8週後直接斷頭提取注射側紋狀體組織。組織稱重後置於-80℃冰箱凍存。裂解組織時加入預冷的PBS(1mg組織:10μL PBS),使用預冷的組織研磨儀充分勻漿樣品後,取100μL勻漿液用作HPLC實驗,取40μL勻漿液用作組織DNA提取以及qPCR實驗,剩餘體積的勻漿液用作ELISA實驗。
藉由ELISA檢測AADC和GDNF濃度。ELISA實驗嚴格按照試劑盒(RayBiotech,ELH-DDC)說明書進行,具體實驗步驟如下:
用於檢測AADC的方法為:在試劑盒(RayBiotech,ELH-DDC)上每個孔添加100μL溶解好的標準品或樣品,室溫孵育2.5h,甩乾、清洗;每個孔添加100μL biotin抗體,室溫孵育1h,甩乾、清洗;每個孔添加100μL Streptavidin溶液,室溫孵育45min,甩乾、清洗;每個孔添加100μL TMB,室溫孵育30min,甩乾、清洗。每個孔添加50μL終止液。立即在450nm光譜讀數。
用於檢測GDNF的方法為:在試劑盒(R&D,DY212)上每個孔添加100μL溶解好的標準品或樣品,室溫孵育2h,甩乾、清洗;每個孔添加100μL檢測抗體,室溫孵育2h,甩乾、清洗;每個孔添加100μL Streptavidin-HRP溶液,室溫孵育20min,甩乾、清洗;每個孔添加100μL受質溶液,室溫孵育20min。每個孔添加50μL終止液。立即在450nm光譜讀數。
如圖5A和圖5B所示,目的基因表達水平檢測結果顯示,AAV9-02A比AAV2-02A組紋狀體內AADC和GDNF的表達量均明顯增高,證明AAV9比AAV2在紋狀體區域具有更高的轉導效率。
實施例5. MPTP誘導的小鼠PD模型內藥效驗證
本實施例選擇1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)建立小鼠帕金森病模型。MPTP有高度的脂溶性並易透過血-腦脊液屏障,進入腦內後可在膠質細胞單胺氧化酶B的作用下轉化為甲基-苯基吡啶離子(MPP+),MPP+被DA轉運體主動攝取到多巴胺(dopamine,DA)能神經元線粒體內,導致DA能神經元變性、死亡,該過程很好的模擬PD的症狀和發病過程。在成年的雄性小鼠中,連續5天腹腔注射MPTP,可以誘發DA神經元凋亡,導致小鼠出現帕金森病樣症狀。
方法如下:將小鼠分為四組,分別為假手術對照組(即正常對照)、模型對照組(即MPTP模型對照,下同)、02AI組(即HRPDAAV-02AI)、03DI組(即HRPDAAV-03DI)。在8週的雄性小鼠單側紋狀體中注射HRPDAAV-02AI,HRPDAAV-03DI,均使用AAV9衣殼。假手術對照組和模型對照組進行假手術。取C57BL/6N雄性小鼠,採用1%戊巴比妥鈉(劑量為35~50mg/kg)腹腔注射對小鼠進行麻醉後,確認小鼠進入麻醉狀態後,小鼠俯臥位固定於立體定位儀(瑞沃德,型號68018),器械常規消毒後切開頭皮,鈍性剝開軟組織、骨外膜,暴露右頂骨,在前囟前方向0.8mm(AP=+0.8mm)、中線旁1.8mm(ML=1.8mm)處鑽一骨窗。用微量注射器(規格:1μL,外徑:0.55mm)注射AAV藥物,進針速度為1mm/min,進針至硬膜下3mm(DV=-3mm),退針至2.8mm(DV=-2.8mm),以0.2uL/min的速度勻速注射液體,注射完畢後留針3min,退針速度為1mm/min。
模型對照組和給藥組小鼠在進行紋狀體注射給藥28天後,腹腔注射30mg/kg的MPTP,注射體積為10mL/kg,假手術組小鼠腹腔注射給予10mL/kg的生理鹽水。造模5天後休息3天,進行行為學檢測。
1)旋轉實驗(Rotation test)
為驗證HRPDAAV-02AI,HRPDAAV-03DI藥物遞送的AADC在單側紋狀體表達後對L-DOPA的應答情況,進行旋轉實驗。對各組實驗小鼠灌胃給藥左旋多巴(L-DOPA)(20mg/kg)+苄絲肼(6mg/kg)。小鼠給予左旋多巴後即放入測試環境中適應,給藥後45min之後開始記錄小鼠的旋轉次數,檢測小鼠30min內的健側旋轉(左側旋轉)。
結果參見圖6A和表4,相比假手術對照組和模型對照組,HRPDAAV-02AI和HRPDAAV-03DI給藥組在L-DOPA給藥後旋轉次數明顯增多("02AI組vs.模型對照組",p=0.07;"03DI組vs.模型對照組",p=0.01),證明了AAV遞送表達的AADC對L-DOPA有很好的應答效果。
2)圓筒測試實驗(Cylinder test)
為檢測本底狀態下小鼠前肢利用偏好,進行圓筒測試實驗。在末次MPTP注射小鼠後4天,灌胃給藥L-DOPA(10mg/kg)+苄絲肼
(3mg/kg),將小鼠放置在透明圓筒(直徑10cm、高度45cm)內,觀察並記錄5min內小鼠左、右前肢、雙側前肢觸壁的次數,小鼠以後肢為支點、一側或雙側前肢觸壁後返回筒底,記一次(小鼠一側肢體先觸壁,另外一側肢體隨後觸壁,記為雙側觸壁)。每隻小鼠實驗後用酒精擦拭圓筒。分析小鼠的左前肢利用情況:左前肢使用率(%)=(左側+0.5雙側)/(右側+左側+雙側)×100。
結果參見圖6B和表5,顯示L-DOPA給藥後,HRPDAAV-02AI和HRPDAAV-03DI給藥組的對側前肢利用率較模型對照組增多,02AI組較模型對照組增加20.4%,03DI組較模型對照組增加8.2%。再次證明了AAV遞送表達的AADC對L-DOPA的應答效果。
3)紋狀體和血液中多巴胺檢測
行為學試驗結束後,取各組小鼠,灌胃給藥L-DOPA(20mg/kg,5mL/kg)和苄絲肼(5mg/kg,5mL/kg)。給藥結束後1h後處死小鼠;處死前取外周血,進行血液多巴胺檢測。處死後分別取健側和患側紋狀體。DOPA採用UPLC-MS/MS法進行檢測。
參見圖7A和表6-1,左側紋狀體(非給藥側)DOPA檢測發現模型對照組和給藥組相比假手術對照組DOPA均明顯下降。證明了MPTP造模的成功。
參見圖7B和表6-2,右側紋狀體(給藥側)DOPA檢測發現HRPDAAV-02AI和HRPDAAV-03DI給藥組相比模型對照組DOPA均明顯上升。DOPA水平恢復至假手術對照組水平。
參見圖7C和表6-3,血漿DOPA檢測發現各組差異不大,證明HRPDAAV-02AI和HRPDAAV-03DI發揮作用主要局限於腦部紋狀體,未發生明顯洩露。
4)腦組織免疫組織化學檢測
對各組小鼠進行心臟灌注取腦組織進行螢光免疫組織化學檢測,具體方法為實驗小鼠進行大體觀察後,游離胸腔的心臟組織,從左心室插入靜脈輸液針並固定,剪開右心耳,採用預冷的PBS進行灌注至右心耳流出透明的液體,後採用4%多聚甲醛經心臟進行灌注,切取腦組織,並放在固定劑(4%多聚甲醛溶液)中將固定好的組織使用石蠟切片進行酪胺酸脫氫酶TH染色。
參見圖7D和表7,藉由螢光免疫組織化學分析,發現假手術對照組和模型對照組兩側TH螢光強度相當,而HRPDAAV-02AI和HRPDAAV-03DI給藥組右側紋狀體(給藥側)相比於左側紋狀體(非給藥側)TH螢光強度明顯增加。證明HRPDAAV-02AI和HRPDAAV-03DI藥物對小鼠的多巴胺神經元有很好的保護作用。
實施例6. 6-OHDA誘導的大鼠PD模型內藥效驗證
本實施例使用6-OHDA建立大鼠PD模型。6-OHDA是一種神經毒素,由於結構與多巴胺(DA)類似,常被誤作為遞質攝入到DA能神經元內,藉由形成羥自由基、抑制線粒體氧化呼吸鏈複合物,干擾ATP合成,選擇性引起DA能神經元死亡。損毀側紋狀體DA含量下降,導致大鼠出現與人類PD類似的症狀,模型具有可靠穩定,不可逆轉的特點,且可以直觀的對其行為缺損進行定量分析,被廣泛的用於對抗帕金森藥物尤其是對DA及其受體有效果的藥物進行評價,因此本實施例採用單側MFB注射6-OHDA誘導帕金森模型,對HRPDAAV-02AI,HRPDAAV-03DI治療帕金森效果進行評價。
方法如下:將SD大鼠分為6個實驗組,分別為假手術對照組(即正常對照組)、模型對照組、02AI高劑量組(1E+10 vg/dose)、02AI低劑量組(2E+9 vg/dose)、03DI高劑量組(1E+10 vg/dose)、03DI低劑量組(2E+9 vg/dose),均使用AAV9衣殼。採用3%戊巴比妥鈉(劑量為50~60mg/kg)腹腔注射對大鼠進行麻醉後,大鼠俯臥位固定,器械常規消毒後切開頭皮,鈍性剝開軟組織、骨外膜,暴露右頂骨,除去中線附近的結締組織,確定矢狀縫、前囟和人字點,將抽好造模試劑的微量注射器(規格:10μL,外徑:0.5mm)固定在立體定位儀上進行坐標定位,紋狀體以前囟作為定位中心點,定位在大鼠右側,在前囟前方向0.0mm(AP=+0.0mm)、中線旁3mm(ML=3mm)處鑽一骨窗。進針速度為1mm/min,進針至硬膜下6mm(DV=-6mm),退針至5.8mm(DV=-5.8mm),以0.6μL/min的速度勻速注射液體2μL,注射完畢後退針至3.8mm(DV=-3.8mm),以0.6μL/min的速度勻速注射液體2μL,完成兩點注射後留針3min,退針速度
為2mm/min,將頭皮縫合並消毒,置於37℃加熱墊上直到大鼠蘇醒,術後連續三天注射青黴素鈉(8萬單位/天)及灌胃布洛芬口服液。
紋狀體注射藥物3週後進行造模,採用3%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉,注射劑量為60mg/kg,注射體積為2mL/kg。經過麻醉誘導的大鼠轉移至操作臺上,取俯臥體位固定於腦立體定位儀,保證顱腦處於水平面上,觀察大鼠眼瞼反射和痛覺反應,在眼瞼反射反應及四肢和尾部痛覺反應消失後方可開始手術。使用最小號鑽頭垂直鑽孔,注意不要打偏和傷及腦組織。定位在大鼠右側(給藥側),在前囟後方向2.0mm(AP=-2.0mm)、中線旁2mm(ML=2mm)處鑽一骨窗。進針速度6mm/min,進針至硬膜下8.8mm(DV=-8.8mm),退針至8.5mm(-8.5mm),以0.6μL/min的速度勻速注射6-OHDA,每隻大鼠注射4μL6-OHDA(5μg/μL),注射完畢後留針3min,退針速度2mm/min。將頭皮縫合並消毒,置於37℃加熱墊上直到大鼠蘇醒,術後連續三天注射青黴素鈉(8萬單位/天)及灌胃布洛芬口服液。
造模三週後,檢測大鼠對阿撲嗎啡藥物的應答情況。大鼠腹腔注射給予阿撲嗎啡(0.5mg/kg),10min後將大鼠放入測試環境中開始記錄大鼠30min內的旋轉次數。
參見圖8A,6-OHDA造模的大鼠相比假手術對照組均有明顯增多的旋轉次數,證明該造模實驗是成功的。
1)旋轉實驗(Rotation test)
為檢測紋狀體中外源表達的AADC對外源L-DOPA的應答,檢測大鼠灌胃給予L-DOPA後的健側旋轉(左側旋轉)。大鼠經口灌胃給予L-DOPA(20mg/kg,5mL/kg)+苄絲肼(5mg/kg,5mL/kg),45min後將大鼠放入測試環境中開始記錄大鼠30min內的旋轉次數。
參見圖8B,模型對照組相比假手術對照組旋轉次數沒有明顯增多,而HRPDAAV-02AI,HRPDAAV-03DI高低劑量給藥組相比模型對照組均有明顯增多,說明AAV遞送至紋狀體表達的AADC對外源L-DOPA藥物有很好的應答效果。
2)圓筒測試實驗(Cylinder test)
為檢測本底狀態下大鼠前肢利用偏好,進行圓筒測試實驗。將各組大鼠分別放入一個直徑20cm的透明圓筒內,觀察並記錄10min內大鼠左、右前肢、雙側前肢觸壁的次數。大鼠以後肢為支點、一側或雙側前肢觸壁後返回筒底,記一次(大鼠一側肢體先觸壁,另外一側肢體隨後觸壁,記為雙側觸壁)。計算大鼠左前肢的使用率:左前肢使用率(%)=(左側+0.5雙側)/(右側+左側+雙側)×100。
參見圖8C,模型鼠和給藥組的左前肢利用率較空白對照組均有所下降。再一次驗證了模型的有效性。
為檢測AAV藥物處理的大鼠對L-DOPA的利用情況,大鼠經口灌胃給予L-DOPA(5mg/kg,5mL/kg)和苄絲肼(2.5mg/kg,5mL/kg),30min後將大鼠放入一個直徑20cm的透明圓筒內,觀察並記錄10min內大鼠左、右前肢、雙側前肢觸壁的次數。
參見圖8D,補充L-DOPA後的模型對照組左前肢利用率沒有明顯改善,而HRPDAAV-02AI、HRPDAAV-03DI組左前肢利用率相比模型對照組有明顯提高,證明給藥後大鼠對L-DOPA的利用率明顯提高。再次證明AAV遞送至紋狀體表達的AADC對外源L-DOPA藥物有很好的應答效果。
3)檢測HRPDAAV-02AI、HRPDAAV-03DI給藥後紋狀體對L-DOPA的代謝能力
行為學試驗結束後,取各組大鼠,灌胃給藥L-DOPA(20mg/kg,5mL/kg)和苄絲肼(5mg/kg,5mL/kg)。給藥結束後1h後處死大鼠。處死後分別取健側和患側紋狀體。DOPA採用UPLC-MS/MS法進行檢測。
參見圖8E和表8,檢測患側/健側的DOPA比值,發現模型對照組和給藥組相比,模型對照組患側DOPA明顯下降。證明了6-OHDA造模的成功。
給藥側紋狀體(患側)DOPA檢測發現HRPDAAV-02AI和HRPDAAV-03DI給藥組相比模型對照組DOPA均明顯上升。與模型對照組相比,各給藥組的患側/健側的DOPA比值,均有明顯提升。證明HRPDAAV-02AI、HRPDAAV-03DI給藥後紋狀體對L-DOPA藥物代謝能力明顯提升。
4)檢測HRPDAAV-03DI給藥後對DA神經元保護作用
對各組大鼠進行心臟灌注取腦組織進行螢光免疫組織化學檢測,具體方法為實驗大鼠進行大體觀察後,游離胸腔的心臟組織,從左心室插入靜脈輸液針並固定,剪開右心耳,採用預冷的PBS進行灌注至右心耳流出透明的液體,後採用4%多聚甲醛經心臟進行灌注,切取腦組織,並
放在固定劑(4%多聚甲醛溶液)中將固定好的組織使用石蠟切片進行酪胺酸脫氫酶TH染色。
參見圖8F,藉由螢光免疫組織化學分析患側/對側的TH陽性細胞比值,發現實驗模型對照組與假手術組相比,患側的TH細胞存活率不足15%,表明6-OHDA造模成功
而HRPDAAV-03DI低劑量給藥組患側相比於健側TH螢光強度比值與模型對照組相比,明顯上升。證明HRPDAAV-03DI藥物對大鼠的多巴胺神經元有很好的保護作用,提高了TH細胞的存活率。
本揭露所使用的序列如下:
>AADC的胺基酸序列(SEQ ID NO:1)
>GDNF的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)
>AADC野生型DNA(SEQ ID NO:3)
>AADC01 DNA(SEQ ID NO:4)
>AADC02 DNA(SEQ ID NO:5)
>AADC03 DNA(SEQ ID NO:6)
>AADC04 DNA(SEQ ID NO:7)
>GDNF野生型DNA(SEQ ID NO:8)
>GDNF01 DNA(SEQ ID NO:9)
>GDNF02 DNA(SEQ ID NO:10)
>GDNF03 DNA(SEQ ID NO:11)
>GDNF04 DNA(SEQ ID NO:12)
>HRPDAAV01-A(SEQ ID NO:13)
>HRPDAAV01-B(SEQ ID NO:14)
>HRPDAAV01-C(SEQ ID NO:15)
>HRPDAAV02-A(SEQ ID NO:16)
>HRPDAAV02-B(SEQ ID NO:17)
>HRPDAAV03-A(SEQ ID NO:18)
>HRPDAAV03-B(SEQ ID NO:19)
>HRPDAAV03-C(SEQ ID NO:20)
>HRPDAAV03-D(SEQ ID NO:21)
>HRPDAAV03-E(SEQ ID NO:22)
>HRPDAAV03-F(SEQ ID NO:23)
>HRPDAAV02-AI(SEQ ID NO:24)
>HRPDAAV03-DI(SEQ ID NO:25)
>5’ITR(SEQ ID NO:26)
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct
>CMV增強子1(SEQ ID NO:27)
>CBA啟動子(SEQ ID NO:28)
>hybrid intron內含子(SEQ ID NO:29)
>hGH poly(A)(SEQ ID NO:30)
>3’ITR(SEQ ID NO:31)
Aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg
>SV40 poly(A)(SEQ ID NO:32)
Taagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagtt
>HPRE(SEQ ID NO:33)
>WPRE(SEQ ID NO:34)
>CMV啟動子(SEQ ID NO:35)
Gtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagct
>PA75 polyA(SEQ ID NO:36)
>CMV增強子2(SEQ ID NO:37)
>β-球蛋白內含子(SEQ ID NO:38)
>MVM intron(SEQ ID NO:39)
aagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttgg
>MCS(SEQ ID NO:40)
atcgatatccgttaca
>AAV2衣殼(SEQ ID NO:41)
>AAV9衣殼(SEQ ID NO:42)
>T2A胺基酸序列(SEQ ID NO:43)
EGRGSLLTCGDVEENPGP
>P2A胺基酸序列(SEQ ID NO:44)
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
>E2A胺基酸序列(SEQ ID NO:45)
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
>F2A胺基酸序列(SEQ ID NO:46)
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
>T2A核苷酸序列(SEQ ID NO:47)
gagggcagaggcagtctgctgacatgcggtgacgtggaagagaatcccggccct
>P2A核苷酸序列(SEQ ID NO:48)
gccaccaacttctccctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggcccc
>E2A核苷酸序列(SEQ ID NO:49)
cagtgcaccaactacgccctgctgaagctggccggcgatgtggagagcaaccccgggccc
>F2A核苷酸序列(SEQ ID NO:50)
gtgaaacagactttgaattttgaccttctcaagttggcgggagacgtggagtccaaccctggacct
TW202325850A_111145716_SEQL.xml
Claims (23)
- 一種核酸分子,其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸,其中,該第一多核苷酸編碼芳族L-胺基酸脫羧酶(AADC)蛋白,該第二多核苷酸編碼神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)蛋白。
- 如請求項1所述的核酸分子,其中,該AADC蛋白包含如SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列,和/或該GDNF蛋白包含如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
- 如請求項1或2所述的核酸分子,其中,該第一多核苷酸包含與SEQ ID NO:3具有至少75%同一性的序列或與SEQ ID NO:4-7任一具有至少95%同一性的序列,和/或該第二多核苷酸包含與SEQ ID NO:8具有至少70%同一性的序列或與SEQ ID NO:9-12任一具有至少95%同一性的序列;較佳地,該第一多核苷酸包含如SEQ ID NO:3-7任一所示的序列;較佳地,該第二多核苷酸包含如SEQ ID NO:8-12任一所示的序列。
- 如請求項1至3中任一項所述的核酸分子,其中,第一多核苷酸和第二多核苷酸藉由第三多核苷酸連接;較佳地,該第三多核苷酸編碼具有連接子功能的胺基酸序列,更佳地,該第三多核苷酸編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO:43-46任一所示,最佳地,該第三多核苷酸的序列如SEQ ID NO:47-50任一所示或與之具有至少95%同一性。
- 如請求項1至4中任一項所述的核酸分子,其中,該核酸分子進一步包含與第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地連接的同一表達控制序列,或者分別與該第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地連接的兩個相同或不同的表達控制序列;該表達控制序列包含啟動子和/或增強子。
- 如請求項1至5中任一項所述的核酸分子,其中,該核酸分子進一步包含5’反向末端重複(5’ITR)、3’反向末端重複(3’ITR)、內含子(intron)、轉錄後調控元件、多聚腺苷酸化信號(polyA)和多選殖位點(MCS)中的任意一個或任意組合。
- 如請求項6所述的核酸分子,其中,該5’ITR和/或3’ITR源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ或AAV-DJ8;較佳源自AAV2或AAV9;該啟動子選自CMV、CAG、CBA、CBh、EFS、EF1、PGK、SV40、Ubi、RSV啟動子或其任意組合;該增強子選自Ubi、CMV、RSV增強子或其任意組合;該內含子選自MVM、SV40、β球蛋白、EF-1α、雜合內含子或其任意組合;該polyA選自PA75 polyA、SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA、rbGlob polyA或其任意組合;和/或該轉錄後調控元件選自WPRE、HPRE或其組合。
- 如請求項1至7中任一項所述的核酸分子,其中,該核酸分子從5’端至3’端包含:a)CMV增強子、CBA啟動子、第一多核苷酸、第二多核苷酸和polyA;可選地,在CBA啟動子和第一多核苷酸之間還包含雜合內含子;可選地,在第二多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;b)CMV增強子、CBA啟動子、第二多核苷酸、第一多核苷酸和polyA;可選地,在CBA啟動子和第二多核苷酸之間還包含雜合內含子;可選地,在第一多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;c)CMV增強子、CBA啟動子、第一多核苷酸、polyA、CMV增強子、CMV啟動子、第二多核苷酸和polyA;可選地,在CBA啟動子和第一多核苷酸之間還包含雜合內含子;可選地,在CMV啟動子和第二多核苷酸之間還包含β球蛋白內含子;可選地,在第二多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;d)CMV增強子、CMV啟動子、第二多核苷酸、polyA、CMV增強子、CBA啟動子、第一多核苷酸和polyA;可選地,在CMV啟動子和第二多核苷酸之間還包含β球蛋白內含子或MVM內含子;可選地,在CBA啟動子和第一多核苷酸之間還包含雜合內含子;可選地,在第一多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;e)CMV增強子、CBA啟動子、第一多核苷酸、第三多核苷酸、第二多核苷酸和polyA;可選地,在CBA啟動子和第一多核苷酸之間還包含雜合內含子;可選地,在第二多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;或,f)CMV增強子、CBA啟動子、第二多核苷酸、第三多核苷酸、第一多核苷酸和polyA;可選地,在CBA啟動子和第二多核苷酸之間還包含雜合內含子;可選地,在第一多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列;較佳地,該polyA選自hGH polyA、PA75 polyA或SV40 polyA。
- 如請求項6至8中任一項所述的核酸分子,其中,該CMV增強子包含如SEQ ID NO:27或37所示序列;該CBA啟動子包含如SEQ ID NO:28所示序列;該CMV啟動子包含如SEQ ID NO:35所示序列;該β球蛋白內含子包含如SEQ ID NO:38所示序列;該雜合內含子包含如SEQ ID NO:29所示序列;該MVM內含子包含如SEQ ID NO:39所示序列;該PA75 polyA包含如SEQ ID NO:36所示序列;該SV40 polyA包含如SEQ ID NO:32所示序列;該hGH polyA包含如SEQ ID NO:30所示序列;該WPRE序列如SEQ ID NO:34所示;該5’ITR包含如SEQ ID NO:26所示序列;和/或該3’ITR包含如SEQ ID NO:31所示序列。
- 如請求項1至9中任一項所述的核酸分子,其中,該核酸分子從5’端至3’端包含:(1)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-第一多核苷酸-第三多核苷酸-編碼GDNF的第二多核苷酸-WPRE-SV40 polyA;(2)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-編碼GDNF的第二多核苷酸-第三多核苷酸-第一多核苷酸-WPRE-SV40 polyA;(3)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-第一多核苷酸-SV40 polyA-CMV增強子-CMV啟動子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 polyA;(4)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-第一多核苷酸-SV40 polyA-CMV增強子-CMV啟動子-編碼GDNF的第二多核苷酸-WPRE-PA75 polyA;(5)CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-第一多核苷酸-SV40 polyA-CMV增強子-CMV啟動子-β球蛋白內含子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 polyA;(6)CMV增強子-CMV啟動子-β球蛋白內含子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 poly A-CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-第一多核苷酸-SV40 polyA;(7)CMV增強子-CMV啟動子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 poly A-CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-第一多核苷酸-WPRE-SV40 polyA;或(8)CMV增強子-CMV啟動子-MVM內含子-編碼GDNF的第二多核苷酸-PA75 poly A-CMV增強子-CBA啟動子-雜合內含子-第一多核苷酸-WPRE-SV40 polyA。
- 如請求項1至10中任一項所述的核酸分子,其包含如SEQ ID NO:13-25任一所示序列或與SEQ ID NO:13-25任一具有至少95%的序列同一性的序列。
- 一種核酸分子,其包含編碼AADC蛋白的多核苷酸,其包含如SEQ ID NO:4-7中任一所示序列,或與SEQ ID NO:4-7中的任一具有至少95%的序列同一性的序列。
- 一種核酸分子,其包含編碼GDNF蛋白的多核苷酸,其包含如SEQ ID NO:9-12中任一所示序列,或與SEQ ID NO:9-12中的任一具有至少95%的序列同一性的序列。
- 如請求項12或13所述的核酸分子,其進一步包含5’ITR、3’ITR、啟動子、增強子、內含子(intron)、轉錄後調控元件、多聚腺苷酸化信號(polyA)和多選殖位點(MCS);較佳地,該5’ITR和/或3’ITR源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ或AAV-DJ8, 該啟動子選自CMV、CAG、CBA、CBh、EFS、EF1、PGK、SV40、Ubi、RSV啟動子或其任意組合,該增強子選自Ubi、CMV、RSV增強子或其任意組合,該內含子選自MVM、SV40、β球蛋白、EF-1α、雜合內含子或其任意組合,該polyA選自PA75 polyA、SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA、rbGlob polyA或其任意組合,和/或該轉錄後調控元件選自WPRE、HPRE或其組合;更較佳地,該CMV增強子包含如SEQ ID NO:27或37所示序列,該CBA啟動子包含如SEQ ID NO:28所示序列,該CMV啟動子包含如SEQ ID NO:35所示序列,該β球蛋白內含子包含如SEQ ID NO:38所示序列,該雜合內含子包含如SEQ ID NO:29所示序列,該MVM內含子包含如SEQ ID NO:39所示序列,該PA75 polyA包含如SEQ ID NO:36所示序列,該SV40 polyA包含如SEQ ID NO:32所示序列,該hGH polyA包含如SEQ ID NO:30所示序列,該WPRE序列如SEQ ID NO:34所示,該5’ITR包含如SEQ ID NO:26所示序列,和/或該3’ITR包含如SEQ ID NO:31所示序列;較佳地,該核酸分子從5’端向3’端包含:g)CMV增強子、CBA啟動子、第一多核苷酸或第二多核苷酸,和polyA;可選地,在CBA啟動子和第一多核苷酸之間還包含雜合內含子,或該CBA和該第二多核苷酸之間還 包含雜合內含子;可選地,在第一多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列,或者,在第二多核苷酸和polyA之間還包含WPRE序列。
- 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒,其包含如請求項1至14中任一項所述的核酸分子和AAV衣殼。
- 如請求項15所述的rAAV顆粒,其中AAV衣殼選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVPHP.B,AAVrh74、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ或AAV-DJ8,較佳為AAV2、AAV9,更佳為AAV9。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項1至14中任一項所述的核酸分子或如請求項15或16所述的rAAV顆粒,和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
- 一種載體,含有如請求項1至14中任一項所述的核酸分子,較佳地,該載體選自質粒、慢病毒、腺病毒、mRNA-LNP、腺相關病毒(AAV)載體和重組腺相關病毒(rAAV)載體。
- 一種細胞,其包含或表達如請求項1至14中任一項所述的核酸分子,或如請求項18所述的載體,或包裝產生如請求項15或16所述的重組rAAV顆粒。
- 一種rAAV生產系統,用於生產如請求項15或16所述的重組rAAV顆粒,其中,該生產系統包含:(a)編碼AAV衣殼的胺基酸序列的多核苷酸序列;(b)如請求項1至14中任一項的核酸分子或如請求項18所述的載體;和(c)足夠的AAV rep功能和輔助功能,以允許將如請求項1至14中任一項的核酸分子或如請求項18所述的載體包裝到該AAV衣殼中;其中AAV衣殼選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ或AAV-DJ8,較佳為AAV2、AAV9,更佳為AAV9。
- 如請求項20所述的rAAV生產系統,其中,足夠的AAV rep功能和輔助功能藉由包裝細胞提供,該包裝細胞較佳包含pHelper、pRC9、pGOI三種質粒。
- 一種生產請求項15或16所述的rAAV顆粒的方法,包括使用包裝細胞將如請求項1至14中任一項所述的多核苷酸或如請求項18所述的載體包裝至AAV衣殼中,該AAV衣殼選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ或AAV-DJ8,較佳為AAV2、AAV9,更佳為AAV9。
- 一種治療、緩解或預防中樞神經系統疾病或症狀的方法,包括向有需要的受試者的腦內施用治療、緩解有效量的如請求項1至14中任一項所述的多核苷酸、或如請求項15或16所述的rAAV顆粒、如請求項17所述的醫藥組成物或如請求項18所述的載體,以使得AADC蛋白和GDNF蛋白在該受試者的腦內表達;較佳地,該AADC蛋白和GDNF蛋白在受試者的紋狀體表達;較佳地,該中樞神經系統疾病或症狀為神經退行性疾病或症狀,更佳為運動障礙、睡眠障礙,最佳為帕金森病。
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