TW202342740A - 改良的批量aav生產系統和方法 - Google Patents

Abstract

本申請案提供改良的批式系統及方法，其等於病毒顆粒生產中使用灌流（例如強化的灌流）以增加生產力及／或細胞密度以實現高病毒顆粒（例如AAV）產量。

Description

改良的批量AAV生產系統和方法

本文之揭露內容係關於用於製造病毒載體（諸如腺相關病毒（AAV）載體）的改良的批式（例如強化的灌流）系統及方法，該等系統及方法能夠增加臨床及商業級AAV製造生產力。 相關申請案之交互參照

本申請案主張2022年3月7日提申的U.S.臨時申請案第63/317,298號、2022年8月16日提申的U.S.臨時申請案第63/398,355號、及2023年1月25日提申的U.S.臨時申請案第63/481,539號之利益及優先權，其等之各者之揭露內容特此以引用方式將其等之完整內容併入以用於所有目的。

腺相關病毒（AAV）係用於供許多人類疾病治療之用的基因遞送的尖端平台；然而，對於基於AAV的治療之高劑量需要及於AAV生產中的低批次產量已導致製造成本極高且供應有限而無法滿足患者需求。儘管於AAV製造有進展，包括可用於懸浮培養的哺乳動物生產細胞株之開發，對於以下者仍存在顯著需求：改善現有的AAV製造技術以實現耐用、高產量、可擴大、且有成本效益的方法以滿足患者供應需求及減低使用基於AAV的治療劑的治療之整體成本。單單於批次模式增加細胞密度並不足以增加AAV體積產量，且事實上可能導致產量減少超過100倍，例如當對於AAV生產使用接種密度之4倍增加時。因此，需要有新系統及方法以使更高產量的AAV生產成為可能以滿足臨床及治療性需求，以及以減低AAV治療開發和臨床及商業製造之成本。

本文之揭露內容藉由提供與懸浮培養中的哺乳動物生產細胞株相容、具有成本效益的可擴大AAV生產程序及系統來解決此等需求，從而減低與先前技術AAV製造平台相關的貨品成本。

本文之揭露內容提供用於AAV製造的改良的批式（例如強化的灌流）系統及方法，其等於AAV生產細胞培養（例如AAV生產細胞懸浮培養）中利用灌流。

本文之揭露內容提供用於AAV生產的使用灌流的改良的批式系統及方法。於一些方面，本文之揭露內容提供生產重組腺相關病毒（rAAV）之系統及方法，其等包含以下步驟：(a)在生長容器中使用灌流為培養物補充新鮮營養素及／或移除廢物來培養AAV生產宿主細胞至目標細胞密度，其中該等AAV生產宿主細胞包含編碼一或多種AAV組分的遺傳物質；(b)在步驟(a)之AAV生產宿主細胞中起始一或多種輔助病毒功能之表現以起始rAAV生產；及(c)在生產容器中使用灌流為培養物補充新鮮營養素及／或移除廢物來培養步驟(b)之AAV生產宿主細胞，從而生產該rAAV。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該等AAV生產宿主細胞係昆蟲細胞或哺乳動物細胞。於一些實施方式中，該等哺乳動物細胞係HeLa細胞、Cos-7細胞、HEK293細胞、A549細胞、BHK細胞、Vero細胞、RD細胞、或ARPE-19細胞。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該等AAV生產宿主細胞包含AAV生產細胞株（PCL）（例如哺乳動物或昆蟲PCL），該AAV PCL包含編碼一或多種AAV組分的遺傳物質，該遺傳物質穩定地併入該AAV生產宿主細胞之基因體中。於一些實施方式中，該AAV PCL可包含一或多個基因修改以降低一或多個基因及／或蛋白質之表現及／或活性以降低乳酸及／或氨之生產或堆積。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，步驟(a)中的目標細胞密度係至少約1E06個活細胞/mL（vc/mL）。例如，步驟(a)中的目標細胞密度可在1E06 vc/mL至5E07 vc/mL之間。於一些實施方式中，步驟(a)中的目標細胞密度係約1E06 vc/mL、約2E06 vc/mL、約3E06 vc/mL、約4E06 vc/mL、約5E06 vc/mL、約6E06 vc/mL、約7E06 vc/mL、約8E06 vc/mL、約9E06 vc/mL、約1E07 vc/mL、約1.1E07 vc/mL、約1.2E07 vc/mL、約1.3E07 vc/mL、約1.4E07 vc/mL、約1.5E07 vc/mL、約1.6E07 vc/mL、約1.7E07 vc/mL、約1.8E07 vc/mL、約1.9E07 vc/mL、或約2E07 vc/mL。於一些實施方式中，步驟(a)中的目標細胞密度係約3.15E06 vc/mL或約5.0E06 vc/mL。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該生產容器具有在1L至12000L之間的容量。例如，該生產容器可具有1L容量、2L容量、5L容量、10L容量、20L容量、50L容量、100L容量、150L容量、200L容量、250L容量、500L容量、1000L容量、1500L容量、2000L容量、2500L容量、3000L容量、3500L容量、4000L容量、4500L容量、5000L容量、5500L容量、6000L、或12000L容量。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該生長容器及該生產容器包含組合的生長／生產容器。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該一或多種AAV組分包含治療性有效負載（payload）或轉殖基因、一個反向末端重複序列（ITR）或二個ITR、一或多種由AAV rep基因編碼的AAV複製及／或包裝蛋白、及／或一或多種由AAV cap基因編碼的AAV結構殼體蛋白。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，步驟(b)包含以輔助病毒感染步驟(a)之細胞。於一些實施方式中，該輔助病毒係腺病毒。於一些實施方式中，該輔助病毒係Ad5。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，步驟(b)包含誘導一或多種由該等AAV生產宿主細胞中的遺傳物質編碼的輔助病毒功能之表現。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該灌流係以約3 mL/min/纖維至約15 mL/min/纖維的流率進行。例如，該灌流可以約3 mL/min/纖維、約4 mL/min/纖維、約5 mL/min/纖維、約6 mL/min/纖維、約7 mL/min/纖維、約8 mL/min/纖維、約9 mL/min/纖維、約10 mL/min/纖維、約11 mL/min/纖維、約12 mL/min/纖維、約13 mL/min/纖維、約14 mL/min/纖維、或約15 mL/min/纖維的流率進行。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該灌流係以約0.5容器容量/日（VVD）至約10 VVD的培養基交換率進行。例如，該灌流可以約0.5 VVD、約1 VVD、約1.5 VVD、約2 VVD、約2.5 VVD、約3 VVD、約3.5 VVD、約4 VVD、約4.5 VVD、約5 VVD、約5.5 VVD、約6 VVD、約6.5 VVD、約7 VVD、約7.5 VVD、約8 VVD、約8.5 VVD、約9 VVD、約9.5 VVD、或約10 VVD的培養基交換率進行。於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該灌流係以小於1 VVD的培養基交換率進行。例如，該灌流可以約0.1 VVD、約0.15 VVD、約0.2 VVD、約0.25 VVD、約0.3 VVD、約0.35 VVD、約0.4 VVD、約0.45 VVD、約0.5 VVD、約0.55 VVD、約0.6 VVD、約0.65 VVD、約0.7 VVD、約0.75 VVD、約0.8 VVD、約0.85 VVD、約0.9 VVD、或約0.95 VVD的培養基交換率進行。於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該灌流係以約150 pL/細胞/日至約2000 pL/細胞/日，諸如約150 pL/細胞/日至約750 pL/細胞/日的細胞專一性灌流率（CSPR）進行。於一些實施方式中，該灌流係以大於750 pL/細胞/日的CSPR進行。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該灌流係使用選自以下者的灌流系統進行：Xcellerex自動灌流系統（APS）（Cytiva）；KrosFlo® KPS TFF系統（Repligen）；XCellTM ATF系統，於2、4、6、8、或10 ATF單位模式（Repligen）；GEA Kytero®單次使用Pharma分離系統（GEA）；ProstakTM微過濾模組系統（Millipore）；Alfa Laval CultureOneTM系統（Alfa Laval）；CARR® Centritech分離系統CARR UniFuge®試驗或Centritech細胞8®系統（Pneumatic Scale Angelus）；Ksep® 6000S系統（Sartorius）；微流細胞滯留裝置；SciLog® SciPureTM系統（Parker）；聲音沉降系統；及EDO電系統（American Piezo）。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，步驟(a)包含在生長培養基中培養該等AAV生產宿主細胞；步驟(a)及步驟(c)包含在生長培養基中培養該等AAV生產宿主細胞；步驟(a)包含在生產培養基中培養該等AAV生產宿主細胞；或步驟(a)及(c)包含在生產培養基中培養該等AAV生產宿主細胞。於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，步驟(a)包含在生長培養基中培養該等AAV生產宿主細胞，且步驟(c)包含在生產培養基中培養該等AAV生產宿主細胞。於一些實施方式中，生產培養基係於以該輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞後灌流。於一些實施方式中，該生產培養基之灌流係於以該輔助病毒感染該等細胞後1個小時-6個小時（例如約1個小時-2個小時、約2個小時-3個小時、約3個小時-4個小時、約4個小時-5個小時、或約5個小時-6個小時）時起始。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，步驟(a)及步驟(c)包含在生長及生產培養基之混合物中培養該等AAV生產宿主細胞。例如，該生長及生產培養基之混合物可係生長及生產培養基之10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、或90/10混合物。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，步驟(a)包含在生長培養基中培養該等AAV生產宿主細胞直到步驟(b)前約24個小時時，接著轉換至生產培養基。該生長培養基可以約0.5 VVD至約1 VVD的速率灌流直到步驟(b)前至少約24個小時（例如約96個小時、約72個小時、約48個小時、或約24個小時）時。該生產培養基可於步驟(b)前約24個小時內（例如步驟(b)前24個小時或更短，包括步驟(b)前至多達約1個小時及步驟(b)前0個小時）開始以約1.5 VVD至約2.5 VVD的速率灌流。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，將該等AAV生產宿主細胞培養於生長期及／或生產期培養下係實施達約48個小時、及／或約2日至約14日。例如，培養該等AAV生產宿主細胞牽涉培養於生產期下達約48個小時、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、或約14日的持續期間。

灌流可於約48個小時、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、或約14日的生產期持續期間後停止。

本文中敘述的系統及方法可允許rAAV自該等AAV生產宿主細胞釋放至該生產培養基之上清液中。如此釋放可於整個該生產期中連續。於一些實施方式中，該rAAV主要於約48個小時的使用該輔助病毒的該等細胞之感染後開始被釋放。即，所生產的rAAV之大部分可於約48個小時的感染後被釋放至該上清液中。

於一些實施方式中，該rAAV主要在該生產培養基中於約48個小時的灌流後開始被釋放。即，所生產的rAAV之大部分可在該生產培養基中於約48個小時的灌流後被釋放至該上清液中。於一些實施方式中，停止灌流以將rAAV保留在該上清液中。於一些實施方式中，灌流係於感染後約48個小時時停止。

本文中敘述的系統及方法之一些實施方式進一步包含收穫該rAAV（例如於批次模式條件下，諸如於無灌流下）及／或該rAAV之下游處理。例如，該等系統及方法可進一步包含純化、澄清、及／或濃縮根據本文中敘述的方法生產的rAAV。該下游處理可包含過濾細胞殘渣、膠體、或聚集物。於一些實施方式中，該過濾移除大小超過1 µm的細胞殘渣、膠體、或聚集物之顆粒。一些實施方式包含使用陰離子交換（AEX）層析術純化該rAAV。

於其他方面，本文之揭露內容提供生產重組腺相關病毒（rAAV）之方法，其包含使用灌流系統培養AAV生產宿主細胞，其中該AAV生產宿主細胞之培養之目標細胞密度在1E06 vc/mL至5E07 vc/mL之間。

於一些實施方式中，該等AAV生產宿主細胞係昆蟲細胞或哺乳動物細胞。例如，該等哺乳動物細胞可係HeLa細胞、Cos-7細胞、HEK293細胞、A549細胞、BHK細胞、Vero細胞、RD細胞、或ARPE-19細胞。

於一些實施方式中，該等AAV生產宿主細胞包含AAV生產細胞株（PCL），該AAV PCL包含編碼一或多種AAV組分的遺傳物質，該遺傳物質穩定地併入該AAV生產宿主細胞之基因體中。於一些實施方式中，該AAV PCL可包含一或多個基因修改以降低一或多個基因及／或蛋白質之表現及／或活性以降低乳酸及／或氨之生產或堆積。

於一些實施方式中，該目標細胞密度係約5E06 vc/mL至約5E07 vc/mL。例如，該目標細胞密度可係約1E06 vc/mL、約2E06 vc/mL、約3E06 vc/mL、約4E06 vc/mL、約5E06 vc/mL、約6E06 vc/mL、約7E06 vc/mL、約8E06 vc/mL、約9E06 vc/mL、約1E07 vc/mL、約1.1E07 vc/mL、約1.2E07 vc/mL、約1.3E07 vc/mL、約1.4E07 vc/mL、約1.5E07 vc/mL、約1.6E07 vc/mL、約1.7E07 vc/mL、約1.8E07 vc/mL、約1.9E07 vc/mL、或約2E07 vc/mL。於某些實施方式中，該目標細胞密度係約3.15E06 vc/mL或約5.0E06 vc/mL。

於一些實施方式中，該等方法可在具有在1L至12000L之間的容量的生產容器中實施。例如，該生產容器可具有1L容量、2L容量、5L容量、10L容量、20L容量、50L容量、100L容量、150L容量、200L容量、250L容量、500L容量、1000L容量、1500L容量、2000L容量、2500L容量、3000L容量、3500L容量、4000L容量、4500L容量、5000L容量、5500L容量、6000L、或12000L容量。

於一些實施方式中，該等方法進一步包含在組合的生長／生產容器中使用該灌流系統生長該等AAV生產宿主細胞至該目標細胞密度。

於一些實施方式中，該一或多種AAV組分包含治療性有效負載或轉殖基因、一個反向末端重複序列（ITR）或二個ITR、一或多種由AAV rep基因編碼的AAV複製及／或包裝蛋白、及／或一或多種由AAV cap基因編碼的AAV結構殼體蛋白。

於一些實施方式中，該等AAV生產宿主細胞係於適用於生產rAAV的條件下以該目標細胞密度培養。適用於AAV生產的條件可包括以輔助病毒感染以起始AAV生產，諸如腺病毒（例如Ad5）、以AAV生產質體三重轉染、及／或誘導具有對於生產AAV而言所需的組分之穩定併入的可誘導生產細胞。於一些實施方式中，該等方法包含在該等AAV生產宿主細胞中起始一或多種輔助病毒功能之表現從而起始rAAV生產。於一些實施方式中，起始一或多種輔助病毒功能之表現包含以輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞。於一些實施方式中，起始一或多種輔助病毒功能之表現包含誘導一或多種由該等AAV生產宿主細胞中的遺傳物質編碼的輔助病毒功能之表現。於一些實施方式中，該輔助病毒係腺病毒。於一些實施方式中，該輔助病毒係Ad5。

於一些實施方式中，該灌流系統係以約3 mL/min/纖維至約15 mL/min/纖維的流率運作。例如，該灌流系統可以約3 mL/min/纖維、約4 mL/min/纖維、約5 mL/min/纖維、約6 mL/min/纖維、約7 mL/min/纖維、約8 mL/min/纖維、約9 mL/min/纖維、約10 mL/min/纖維、約11 mL/min/纖維、約12 mL/min/纖維、約13 mL/min/纖維、約14 mL/min/纖維、或約15 mL/min/纖維的流率運作。

於一些實施方式中，該灌流系統係以約0.5容器容量/日（VVD）至約10 VVD的培養基交換率運作。例如，該灌流系統可以約0.5 VVD、約1 VVD、約1.5 VVD、約2 VVD、約2.5 VVD、約3 VVD、約3.5 VVD、約4 VVD、約4.5 VVD、約5 VVD、約5.5 VVD、約6 VVD、約6.5 VVD、約7 VVD、約7.5 VVD、約8 VVD、約8.5 VVD、約9 VVD、約9.5 VVD、或約10 VVD的培養基交換率運作。於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該灌流係以小於1 VVD的培養基交換率進行。例如，該灌流可以約0.1 VVD、約0.15 VVD、約0.2 VVD、約0.25 VVD、約0.3 VVD、約0.35 VVD、約0.4 VVD、約0.45 VVD、約0.5 VVD、約0.55 VVD、約0.6 VVD、約0.65 VVD、約0.7 VVD、約0.75 VVD、約0.8 VVD、約0.85 VVD、約0.9 VVD、或約0.95 VVD的培養基交換率進行。

於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，該灌流係以約150 pL/細胞/日至約2000 pL/細胞/日，諸如約150 pL/細胞/日至約750 pL/細胞/日的細胞專一性灌流率（CSPR）進行。於一些實施方式中，該灌流係以大於750 pL/細胞/日的CSPR進行。

於一些實施方式中，該灌流系統可選自以下者：Xcellerex自動灌流系統（APS）（Cytiva）；KrosFlo® KPS TFF系統（Repligen）；XCellTM ATF系統，於2、4、6、8、或10 ATF單位模式（Repligen）；GEA Kytero®單次使用Pharma分離系統（GEA）；ProstakTM微過濾模組系統（Millipore）；Alfa Laval CultureOneTM系統（Alfa Laval）；CARR® Centritech分離系統CARR UniFuge®試驗或Centritech細胞8®系統（Pneumatic Scale Angelus）；Ksep® 6000S系統（Sartorius）；微流細胞滯留裝置；SciLog® SciPureTM系統（Parker）；聲音沉降系統；及EDO電系統（American Piezo）。

於一些實施方式中，該等AAV生產宿主細胞係在生長培養基中接著在生產培養基中培養。至該生產培養基的轉換可於以輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞前約0個小時至約48個小時內、或於感染前約24個小時時發生。該生長培養基可以約0.5 VVD至約1 VVD的速率灌流直到以輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞前約24個小時（例如前24個小時或更短，包括至多達前約1個小時及前0個小時）時。該生產培養基可於以輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞前約24個小時內開始以約1.5 VVD至約2.5 VVD的速率灌流。該等AAV生產宿主細胞可於在該生長培養基中的培養後且於在該生產培養基中的培養前以輔助病毒（例如Ad5）感染。於一些實施方式中，該生產培養基係於以輔助病毒感染該等細胞後1個小時-6個小時（例如約1個小時-2個小時、約2個小時-3個小時、約3個小時-4個小時、約4個小時-5個小時、或約5個小時-6個小時）時灌流。

於一些實施方式中，該AAV宿主生產細胞係在生長及生產培養基之混合物中以該目標細胞密度培養。例如，該生長及生產培養基之混合物可係生長及生產培養基之10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、或90/10混合物。

於一些實施方式中，該等方法包含以該目標細胞密度培養該等AAV生產宿主細胞達約48個小時、及／或約2日至約14日。例如，該等方法可包含以該目標細胞密度培養該等AAV生產宿主細胞達約48個小時、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、或約14日的持續期間。

本文中敘述的系統及方法可允許rAAV自該等AAV生產宿主細胞釋放至該生產培養基之上清液中。如此釋放可於整個該生產期中連續。於一些實施方式中，該rAAV主要於約48個小時的使用輔助病毒的該等細胞之感染後開始被釋放。即，所生產的rAAV之大部分可於約48個小時的使用輔助病毒的感染後被釋放至該上清液中。

於一些實施方式中，該rAAV主要在該生產培養基中於約48個小時的灌流後開始被釋放。即，所生產的rAAV之大部分可在該生產培養基中於約48個小時的灌流後被釋放至該上清液中。於一些實施方式中，停止灌流以將rAAV保留在該上清液中。於一些實施方式中，灌流係於約48個小時時停止。於一些實施方式中，灌流係於感染後約48個小時時停止。

於一些實施方式中，該等方法進一步包含收穫該rAAV（例如於批次模式條件下，諸如於無灌流下）及／或該rAAV之下游處理。例如，該下游處理可包含純化、澄清、及／或濃縮該rAAV。該下游處理可包含過濾細胞殘渣、膠體、或聚集物。於一些實施方式中，該過濾移除大小超過1 µm的細胞殘渣、膠體、或聚集物之顆粒。一些實施方式包含使用陰離子交換（AEX）層析術純化該rAAV。

本文之揭露內容之此等及其他方面及特徵係於本申請案之以下章節中敘述。

儘管有於改善AAV製造程序之生產力及可擴大性的最新進展，仍存在對於以下者的顯著需求：改善現有的AAV製造平台以實現耐用、高產量、可擴大、且有成本效益的方法。呈懸浮細胞培養的AAV生產面對種種對於高效率臨床及商業規模實施的挑戰。例如，已證實維持病毒載體產物之高細胞專一性生產力（且特別是於高細胞密度批式培養）係難以達成的。本發明之系統及方法於改良的批式程序中使用灌流（例如強化的灌流）以改善AAV生產效能來解決此等挑戰並降低整體貨品之成本。

本文之揭露內容係針對基於灌流的AAV生產系統及方法，其等使高體積生產力成為可能，減低通常與以批次模式運作的AAV平台聯繫在一起的高貨品之成本；本文之揭露內容之系統及方法於本文通篇稱為「改良的批式」系統及方法。於某些實施方式中，該改良的批式系統係強化的灌流系統且用於AAV生產。本文中敘述對於現有的平台程序的改善，從而展示程序強化實現總體體積AAV產量之數倍增加。無意受限於理論，本文中敘述的改良的批式（例如強化的灌流）程序確保足以維持高細胞密度的營養素可用率及細胞培養廢物清除並使AAV生產力增加數倍（例如至大於或等於3E11個病毒基因體副本/毫升（GC/mL）（大於或等於3E14 GC/L））成為可能。此等改善以及優化的下游程序可產生適用於人類治療用途的高純度AAV產物。

AAV製造之技術領域中具有通常知識者會了解可改變本文中敘述的系統及方法之種種方面而不偏離本文之揭露內容之發明標的。可根據發明所屬技術領域中具有通常知識者所具有的知識改變或變化而不偏離本文揭露的發明的方面包括，但不限於：AAV生產規模（例如以公升計的AAV生產體積）、灌流率、AAV生產細胞密度、生長培養基、生產培養基、生產饋料、培養基比率、細胞類型、感染及／或轉染參數或試劑、操作參數，諸如pH、溫度、溶氧（DO）、等等、程序步驟之時機、程序步驟之持續期間、及培養基交換及／或灌流方法學（例如ATF、Wave Lilypad灌流、離心方法、TFF、KTF、Gea Kytero、Krosflow KPS系統、等等）、以及其他。 I. 定義

除非另加定義，本文中使用的所有技術及科學術語具有與本文之揭露內容所相關的技術領域中具有通常知識者所一般了解者相同的意義。除非另加注記，技術術語係根據發明所屬技術領域中具有通常知識者根據常規用法使用。分子生物學中的普通術語之定義可於以下者中找到：Benjamin Lewin, 基因V（Genes V）, 由Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編者), 分子生物學百科全書（The Encyclopedia of Molecular Biology）, 由Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A. Meyers (編者), 分子生物學及生物技術：詳盡書桌參考（Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference）, 由VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。

應留意，除非基於前後文很清楚並非如此，術語「一（「a」或「an」）實體係指一或多個／種該實體；例如應將「一胺基酸」理解成代表一或多個／種胺基酸。如此，本文中術語「一（「a」或「an」）」、「一或多」、及「至少一」可可互換地使用。

此外，應將術語「及／或」理解成所明確指出的二或多個特徵或組分之各者加上或不加上另一者或其他者之具體揭露。因此，本文中用於諸如「A及／或B」的片語中的術語「及／或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」（單獨）、及「B」（單獨）。同樣，用於諸如「A、B、及／或C」的片語中的術語「及／或」意欲涵蓋以下實施方式之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A（單獨）；B（單獨）；及C（單獨）.。

為了促進本文之揭露內容之種種實施方式之綜述，以下提供於本文之揭露內容通篇使用的特殊術語之以下解釋。

AAV效價、及類似者：術語「AAV效價」用於本文中係指病毒基因體副本數/毫升（GC/mL）或病毒基因體副本數/細胞（GC/細胞）。於某些實施方式中，GC/mL可藉由標準方法（包括但不限於經純化載體顆粒之直接定量PCR（qPCR）、螢光活化細胞分選（fluorescence activated cell sorting，FACS）、銀染色、等等）測定。於某些實施方式中，GC/細胞可藉由標準方法（例如包括但不限於墨點轉漬法、qPCR或微滴式數位PCR（ddPCR）、光譜法、或螢光測定法）測定。

約：用於本文中，術語「約」或「大約」當用於一或多個所關注的值時係指一與所陳述的參考值類似的值。於某些實施方式中，術語「大約」或「約」係指一範圍的值，其等於任一方向（大於或小於）落入所陳述的參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或更少內，除非另加陳述或自前後文明顯並非如此（除了當如此數會超過可能值之100%時）。

輔助病毒功能、及類似者：術語「輔助病毒功能」用於本文中涵蓋基因、組分、或功能（通常以反式提供），其等使宿主細胞中的AAV之生產成為可能。輔助病毒功能可（例如）藉由輔助病毒（諸如疱疹病毒或腺病毒，例如腺病毒血清型5（Ad5）病毒（例如野生型或經重組地工程改造的Ad5輔助病毒））之感染提供。輔助病毒功能可或者以順式提供，例如藉由將編碼輔助病毒功能的遺傳物質併入宿主細胞中。輔助病毒基因／功能包括但不限於E1a、E1b、E2a、E40rf6、及VA RNA基因/功能。

腺相關病毒（AAV）：一小型、複製缺陷型、無套膜病毒，其感染人類及一些其他靈長動物物種。尚未發現AAV會造成疾病且誘發很輕微的免疫反應。利用AAV的基因治療載體可感染分裂及靜止細胞兩者且可以染色體外狀態存留而不併入至宿主細胞之基因體中。此等特徵使AAV對於基因治療而言係有吸引力的病毒載體。存在至少13種已識別出的AAV之血清型（AAV1-AAV13）。

投予（Administration/administer）：通過任何有效途徑提供一個體或一個體之目標組織一藥劑或否則使一個體或一個體之目標組織暴露至一藥劑，該藥劑係諸如治療劑，例如重組AAV。例示性投予途徑包括（但不限於）注射（諸如皮下、肌肉內、皮內、腹膜內、鞘內、及靜脈內）、口服、管內、舌下、直腸、經皮、鼻內、陰道、及吸入途徑。

胺基酸：術語「胺基酸」用於本文中係指二十種標準胺基酸，即甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、及麩胺酸之任一者、其等之單一立體異構物、及其等之外消旋混合物。術語「胺基酸」亦可指已知的非標準胺基酸，例如任何二肽，諸如丙胺酸-麩醯胺酸二肽、4-羥基脯胺酸、e-V V A-三甲基離胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、O-磷絲胺酸、g-羧基麩胺酸、e-V-乙醯基離胺酸、co-V-甲基精胺酸、A-乙醯基絲胺酸、WA'-三甲基丙胺酸、A-甲醯基甲硫胺酸、g-胺基丁酸、組織胺、多巴胺、甲狀腺素、瓜胺酸、鳥胺酸、b-氰基丙胺酸、升半胱胺酸、偶氮絲胺酸、及S-腺苷基甲硫胺酸。於一些實施方式中，該胺基酸係麩胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、酪胺酸、或纈胺酸。於一些實施方式中，該胺基酸係麩胺酸或麩醯胺酸。

批式培養：術語「批式培養」用於本文中係指一培養細胞之方法，其中所有最終會用於培養細胞的組分（包括培養基以及細胞本身）皆於培養程序開始時提供。批式培養通常於某時間點停止且收穫並視需要純化培養基中的細胞及／或組分。

生物反應器：術語「生物反應器」或「培養容器」用於本文中係指任何用於細胞培養物（例如哺乳動物細胞培養物）之生長的容器。生物反應器可為任何大小只要其可用於細胞（例如哺乳動物細胞）之培養。

細胞培養物：術語「培養物」、「細胞培養物」、及「真核細胞培養物」用於本文中係指一真核細胞群體，無論是附著在表面上或呈懸浮形式，其於適用於該細胞群體之存活及／或生長的條件下維持或生長在培養基中。對於發明所屬技術領域中具有通常知識者而言很清楚，此等術語用於本文中可指包含真核細胞群體及該群體懸浮、維持、及／或生長在其中的培養基之組合。

細胞密度：術語「細胞密度」用於本文中係指給定體積的培養基中存在的細胞之數量。術語「目標細胞密度」用於本文中係指一體積的培養基中存在的細胞之數量，其於培養物之生長期期間達成且於用於rAAV之生產的生產期中使用。術語「AAV生產宿主細胞」用於本文中係指用於rAAV之生產的細胞。

細胞存活率：術語「細胞存活率」用於本文中係指細胞之於給定組的培養條件或實驗變化下在培養中存活的能力。此術語用於本文中亦指於一特定時間相對於於該時間在培養中的細胞（無論死活）之總數的活細胞之部分。

編碼序列：一「編碼序列」意味當與適當的調節序列可運作地連接時試管內或活體內編碼一多肽的核苷酸序列。編碼序列可或可不包括編碼區域之前或之後的區域，例如5’非轉譯（5’ UTR）及3’非轉譯（3’ UTR）序列、以及個別編碼節段（外顯子）之間的介入序列（內含子）。

經密碼子優化：「經密碼子優化」核酸係指一核酸序列，其已經改變以使得其密碼子對於在特定系統（諸如一特定物種或物種之群）中表現而言係最優的。例如，一核酸序列可針對在細胞（例如哺乳動物）中或在一特定物種（諸如人類細胞）中的表現作優化。密碼子優化不改變所編碼的蛋白質之胺基酸序列。

編碼：術語「編碼（encode）」及包括「編碼性（encoding及coding）」的類似術語用於本文中係指核酸分子攜帶遺傳訊息（即蛋白質編碼訊息）及／或生物功能的能力。因此，編碼治療性有效負載的核酸可含有能夠被轉譯成肽治療劑的基因序列及／或可攜帶調節肽治療劑之表現（轉錄或轉譯）的訊息及／或產生具有並非編碼肽的生物功能的核酸，諸如非編碼性RNA、反義寡核苷酸（ASO）、短小干擾RNA（siRNA）、微型RNA（miRNA）、適配體、長型非編碼性RNA（lncRNA）、及任何其他具有生物活性的非蛋白質編碼性核酸之物種。

強化子：一核酸序列，其藉由增加啟動子之活性來增加轉錄之速率。

饋料批式培養：術語「饋料批式培養」用於本文中係指一培養細胞之方法，其中外加組分係於培養程序開始後某個時間時提供至培養物。饋料批式培養可使用基礎培養基開始。外加組分於培養程序開始後某個時間時與其一起被提供至培養物的培養基係饋料培養基。所提供的組分通常包含於培養程序期間已耗盡的用於細胞的營養補充物。饋料批式培養通常於某時間點停止並收穫且視需要純化培養基中的細胞及／或組分。

生長期：細胞培養物之「生長期（growth phase或growth stage）」係指其中細胞一般快速分裂的指數細胞生長之時間段（對數生長期）。於此期期間，細胞被培養一段時間，例如至多達14日，及於細胞生長被最大化的條件下。宿主細胞之生長周期之確定可於無過度實驗下針對所預想的特定宿主細胞測定。「段時間及於細胞生長被最大化的條件下」及類似者係指對於特定細胞株而言經測定對於細胞生長及細胞分裂而言為最優的培養條件。於一些實施方式中，於生長期期間，細胞一般於約25°C-40°C下在經加濕受控氣氛中被培養在含有必需的添加物的營養素培養基中，以使得對於該特定細胞株實現最優生長。於某些實施方式中，將細胞維持於生長期達約在一日及七日之間（例如在二日至六日之間，例如六日）的期間。對於特定細胞而言的生長期之長度可於無過度實驗下測定。例如，生長期之長度會係足以允許該特定細胞繁殖至於若培養物被維持於生長條件下的最大可能vcd之約20%-80%的範圍內的活細胞密度（「vcd」）的時間段。於一些實施方式中，「最大生長速率」係指於特定細胞株／殖株指數生長期期間當該等細胞係在新鮮培養基中時測量（例如於當營養素係充足的且不存在導因於任何培養物中的組分的任何顯著生長抑制的培養期間的時間測量）的其生長速率。

內含子：基因內的一段DNA，其不含對於蛋白質的編碼訊息。RNA轉錄本被細胞機械加工以移除內含子以產生成熟經加工傳訊RNA。

反向末端重複序列（ITR）：對於高效率複製而言所需的腺相關病毒之基因體中的對稱核酸序列。ITR序列位於AAV DNA基因體之各端。ITR起用於病毒DNA合成的複製起點的作用且對於產生AAV併入性載體而言係必要的順式組分。

經分離：一「經分離」生物組分（諸如核酸分子、蛋白質、病毒、或細胞）已自該組分天然存在於其中的生物體之細胞或組織或生物體本身中的其他生物組分（諸如其他染色體及染色體外DNA及RNA、蛋白質、及細胞）實質上分離或純化出。已「經分離」的核酸分子及蛋白質包括藉由標準純化方法純化者。此術語亦包含藉由在宿主細胞中的重組表現製備的核酸分子及蛋白質以及化學合成的核酸分子及蛋白質。

培養基（media、medium）：術語「培養基（media、medium）」、「細胞培養基（cell culture medium）」、「培養基（culture medium）」、「組織培養基（tissue culture medium）」、「組織培養基（tissue culture media）」、及「生長培養基（growth medium）」用於本文中係指含有滋養生長中的所培養真核細胞的營養素的溶液。通常地，此等溶液提供細胞對於最小生長及／或存活所需的必須及非必須胺基酸、維生素、能量來源、脂質、及微量元素。此溶液亦可含有使生長及／或存活增長至高於最小速率的組分，包括激素及生長因子。此溶液被調配至對於細胞存活及增殖而言最優的pH及鹽濃度。培養基亦可係「界定培養基」或「化學性界定培養基」—一種無血清培養基，其不含源自動物的組分、水解產物、或組成未知的組分，且僅含有已知化學結構或特徵的組分。化學性界定培養基不含源自動物的組分且所有組分皆具有已知的化學結構。發明所屬技術領域中具有通常知識者了解化學性界定培養基可包含重組醣蛋白或蛋白質，例如（但不限於）激素、細胞介素、介白素、及其他傳訊分子。

N期、及類似者：術語「N期」、「N培養容器」、「第二培養容器」、「生產容器」、「生產培養容器」、「N容器」、「N生物反應器」、「第二生物反應器」、或「生產生物反應器」用於本文中係指於N-1生物反應器後且於AAV之生產中使用的生物反應器。此於本文之敘述通篇可或者稱為「生產期」培養。用於本文中，於「N期」培養的AAV生產細胞活躍地生產AAV產物。

N-期、及類似者：術語「N-」及「N-期」用於本文中係指N期生產起始前的任何AAV生產細胞培養期。

N-1期、及類似者：術語「N-1期」、「第一培養容器」、「N-1培養容器」、「N-1接種列隊（seed-train）培養容器」、「N-1容器」、「第一生物反應器」、「N-1生物反應器」、「生長容器」、或「N-1接種列隊生物反應器」用於本文中係指一培養容器，其緊接著N期培養容器（生產培養容器）之前且係用於使細胞培養物生長至高活細胞密度以用於隨後接種至N（生產期）培養容器。待於N-1培養容器中生長的細胞培養物可於N-1培養容器（諸如N-4、N-3、及N-2容器）前於在數個容器中培養細胞後獲得。N-1期於本文之敘述通篇可或者稱為「生長期」培養。用於本文中，「N-1期」培養物中的AAV生產細胞可於生長期。

營養素培養基、饋料培養基、及類似者：術語「營養素培養基」、「饋料培養基」、「饋料」、「總饋料」、及「總營養素培養基」用於本文中可係可互換地使用且包括用於生長、增殖、及將生質量加至細胞株的「完全」培養基。營養素培養基與本身不足以生長及增殖細胞株的物質或簡單培養基有區分。因此，例如，葡萄糖或單醣本身並非營養素培養基，其係因為於不存在其他所需營養素下，其等不足以生長及增殖細胞株。發明所屬技術領域中具有通常知識者可領會細胞可於不完全培養基之存在下持續生長、存活、及增殖，但會變得不穩定及／或大大減低其等之生長速率。因此，於一些實施方式中，術語「營養素培養基」包括足以生長、增殖、及將生質量加至細胞株而不喪失穩定性、生長速率、或減低任何其他細胞健康指標達至少2日、3日、4日、5日、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、或18週的期間的培養基。於一些實施方式中，術語「營養素培養基」包括可缺乏一或多種必要營養素但可持續生長、增殖、及將生質量加至細胞株而不喪失穩定性、生長速率、或減低任何其他細胞健康指標達至少2日、3日、4日、5日、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、或18週的期間的培養基。於一些實施方式中，該營養素培養基係細胞培養基。最優的細胞培養基組成物會根據被增殖的細胞培養物之類型改變。於一些實施方式中，該營養素培養基係可商購培養基。於一些實施方式中，該營養素培養基含有例如無機鹽、碳水化合物（例如糖，諸如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、或果糖）、胺基酸、維生素（例如B群維生素，例如B12、維生素A、維生素E、核黃素、硫胺素、及生物素）、脂肪酸及脂質（例如膽固醇及類固醇）、蛋白質及肽（例如白蛋白、運鐵蛋白、纖網蛋白、及胎球蛋白）、血清（例如包含白蛋白、生長因子、及生長抑制劑的組成物，諸如胎牛血清、新生牛犢血清、及馬血清）、微量元素（例如鋅、銅、硒、及三羧酸中間物）、水解產物（來自植物或動物來源的水解蛋白質）、及其等之組合。營養素培養基之實例包括（但不限於）基礎培養基（例如最低必須培養基（MEM）、Dulbecco氏改良eagle培養基（DMEM）、Glasgow最低必須培養基（GMEM）、複合培養基RPMI培養基（例如RPMI 1640）、Iscoves DMEM、Leibovitz L-15、Leibovitz L-15、TC 100）、無血清培養基（例如中國倉鼠卵巢（CHO）培養基、Ham氏F10及衍生物、Ham F12、DMEM/F12）。營養素培養基中找到的普通緩衝劑包括磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS）、Hank氏平衡鹽溶液（BSS）、Earle氏鹽（Earle氏鹽溶液）、Dulbecco氏磷酸鹽緩衝食鹽水（DPBS）、Hank氏BSS（HBSS）、及Earle氏BSS（EBSS）。用於培養哺乳動物細胞的培養基於技術領域中係眾所周知的且可得自例如Sigma-Aldrich Corporation（St. Louis, MO）、HyClone（Logan, UT）、Invitrogen Corporation（Carlsbad, CA）、Cambrex Corporation（E. Rutherford, NJ）、Irvine Scientific（Santa Ana, CA）、Gibco/ThermoFisher Scientific、及其他者。營養素培養基中找到的其他組分可包括抗壞血酸、檸檬酸、半胱胺酸／胱胺酸、麩醯胺酸、葉酸、麩胱甘肽、亞麻油酸、次亞麻油酸、類脂酸、油酸、棕櫚酸、吡哆醛／吡哆醇、核黃素、硒、硫胺素、及運鐵蛋白。發明所屬技術領域中具有通常知識者會認知到存在會落入本文揭露的系統及方法之範圍內的對於營養素培養基之修改。

灌流培養：術語「灌流培養」、「灌流系統」、「灌流」、及類似者用於本文中係指一培養細胞之方法，其中外加組分係於培養程序開始後連續或半連續地提供至培養物。所提供的組分通常包含已於培養程序期間耗盡的用於細胞的營養補充物。培養基中的細胞及／或組分之一部份通常以連續或半連續基礎收穫並視需要被純化。

醫藥上可接受的載劑：可用於本文之揭露內容的醫藥上可接受的載劑（媒介物）可係發明所屬技術領域中常規使用者。Remington氏製藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）, E. W. Martin所著, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 第l5版 (1975)敘述適用於醫藥遞送一或多種治療性化合物、分子、或藥劑的組成物及調配物。一般而言，載劑之性質會取決於所利用的特定投予模式。例如，非經腸調配物通常包含包括醫藥及生理上可接受的流體（諸如水、生理食鹽水、平衡鹽溶液、水性右旋糖、甘油、或類似者）作為媒介物的可注射流體。對於固體組成物（例如粉末、丸劑、錠劑、或膠囊形式），常規的非毒性固體載劑可包括（例如）醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、或硬脂酸鎂。除了生物中性載劑外，待投予的醫藥組成物可含有微量非毒性輔助物質，諸如潤濕或乳化劑、防腐劑、及pH緩衝劑、及類似者，例如醋酸鈉或山梨糖醇酐單月桂酸酯。

多肽、蛋白質：術語「多肽」或「蛋白質」用於本文中係指透過肽鍵連接在一起的胺基酸之連續鏈。此術語係用於指任何長度的胺基酸鏈，但發明所屬技術領域中具有通常知識者會了解到此術語不限於長鏈且可指包含透過肽鍵連接在一起的二個胺基酸的最小鏈。若單一多肽係獨立的功能單元且不需要與其他多肽永久物理連結以形成獨立的功能單元，術語「多肽」及「蛋白質」用於本文中係可互換地使用。若獨立的功能單元由超過一個彼此物理連結的多肽組成，術語「蛋白質」用於本文中係指物理連接並一起以該獨立的單元的形式發揮功能的多個多肽。術語「蛋白質」用於本文中意欲涵蓋單數「蛋白質」以及複數「蛋白質」。因此，用於本文中，包括但不限於「肽」、「多肽」、「胺基酸鏈」、或任何其他用於指一或多個胺基酸之鏈的術語的術語被包括於「蛋白質」之定義中，且術語「蛋白質」可替代此等術語之任何者使用或與此等術語之任何者可互換地使用。此術語進一步包括已經歷轉譯後修飾（例如醣基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知的保護／封端基團衍生化、蛋白質分解性切割、或藉由非天然產生的胺基酸修飾）的蛋白質。蛋白質亦包括形成多聚體（例如二聚體、三聚體、等等）的多肽。術語蛋白質亦包括融合蛋白質，例如透過其中一蛋白質（或一蛋白質之片段）係附著至一抗體（或一抗體之片段）的基因融合程序產生的蛋白質。

啟動子：一DNA之區域，其指揮／起始一核酸（例如一基因）之轉錄。啟動子包括靠近轉錄之起始位點的必需核酸序列。許多啟動子序列為發明所屬技術領域中具有通常知識者所知且甚至人工核酸分子中的不同啟動子序列之組合亦係可能的。用於本文中，基因專一性內源啟動子係指調節所關注的內源基因之表現的天然啟動子元件。於例示性實施方式中，治療性有效負載係人類的且啟動子係於天然背景下調節該人類基因之表現的基因專一性內源啟動子。

經純化：術語「經純化」不需絕對純度；相反地，其意欲作為相對術語。因此，例如，經純化肽、蛋白質、病毒、或其他活性化合物係自天然連結的蛋白質及其他汙染物完全或部分分離者。於某些實施方式中，術語「實質上經純化」係指已自細胞、細胞培養基、或其他粗製劑分離且經受份化（例如過濾）以移除初步製劑之種種組分（諸如蛋白質、細胞殘渣、及其他組分）的肽、蛋白質、病毒、或其他活性化合物。

重組：重組核酸分子係具有非天然產生的序列或具有藉由人工組合一或多個序列之二個否則分開的節段來製作的序列者。此人工組合可藉由化學合成或藉由人工操作核酸分子之經分離節段（諸如藉由基因工程改造技術）來完成。類似地，重組病毒係包含非天然產生的或藉由人工組合至少二個不同來源的序列來製作的序列（諸如基因體序列）的病毒。術語「重組」亦包括已僅藉由添加、取代、或缺失一部分的天然核酸分子、蛋白質、或病毒來改變的核酸、蛋白質、及病毒。用於本文中，「重組AAV」或「rAAV」可指其中重組核酸分子（諸如編碼治療性有效負載的重組核酸分子）已被包裝的AAV顆粒。

接種：術語「接種」用於本文中係指將細胞培養物提供至生物反應器或另一容器（例如生長容器或生產容器）的程序。於一實施方式中，該等細胞先前已在另一生物反應器或容器（例如生長容器或生產容器）中增殖。於另一實施方式中，該等細胞已經冷凍並於緊接著將其等提供至生物反應器或容器（例如生長容器或生產容器）之前解凍。此術語係指任何數量的細胞，包括單個細胞。

血清型：一群密切相關的微生物（諸如病毒），其等由一特有組的抗原區分。

填充序列：係指一核苷酸之序列，其包含在更大的核酸分子（諸如載體）內，其通常用於在二核酸特徵間（諸如在啟動子與編碼序列間）產生所欲的間隔，或用於延伸核酸分子以使其具有所欲的長度。填充序列不含蛋白質編碼訊息且可來自未知／合成來源及／或與在更大的核酸分子內的其他核酸序列無關。

個體（subject）：用於本文中，術語「個體」係指人類或任何非人類動物（例如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬、或靈長動物）。人類包括出生前及出生後形式。於許多實施方式中，個體係人類。個體可為患者，其指為了疾病之診斷或治療而去見醫療提供者的人類。術語「個體」於本文中可與「個體（individual）」或「患者」互換，除非前後文要求其他者。個體可患有一疾病或病況或易患有一疾病或病況但可或可未展現該疾病或病況之症狀。

非轉譯區域（UTR）：通常的mRNA含有分別位於編碼區域之上游及下游的5'非轉譯區域（5' UTR）及3'非轉譯區域（3' UTR）（參見Mignone, F., Gissi, C., Liuni, S.等人mRNA之非轉譯區域。（Untranslated regions of mRNAs.）Genome Biol 3, 綜述0004.1 (2002)）。

載體：載體係一核酸分子，其允許外來核酸之插入而不瓦解該載體複製及／或在宿主細胞中併入的能力。載體可包括允許其在宿主細胞中複製的核酸序列，諸如複製起點。載體亦可包括一或多個可篩選標記基因及其他基因元件。表現載體係含有必需調節序列以允許一或多個插入基因之轉錄及轉譯的載體。於本文中的一些實施方式中，該載體係AAV載體。取決於前後文，可應用術語「載體」之更寬的定義，其表示載劑或傳遞物，即通常係生物劑之生物載劑。

應進一步了解所有針對核酸或多肽給予的基本大小或胺基酸大小、及所有分子量或分子質量值係大約的，且係為了敘述而提供。雖然與本文中敘述者類似或等同的方法及材料可於本文之揭露內容之實施或測試中使用，適合的方法及材料係於以下敘述。本文中提及的所有出版品、專利申請案、專利、及其他參考文獻皆以其等之完整內容以引用方式併入。若有矛盾，應以本說明書（包括術語之解釋）為準。此外，材料、方法、及實例僅係說明性的而非意欲係限制性的。 II. 概述

本文之揭露內容係針對基於灌流的AAV生產系統及方法，其等使高體積生產力成為可能，減低通常與類似AAV平台（例如非強化AAV平台）聯繫在一起的高貨品之成本。本文之揭露內容之系統及方法可用於任何病毒顆粒（例如腺相關病毒顆粒）之製造，例如用於治療應用。本文中敘述的系統及方法可被併入至使用用於生產病毒顆粒的生產細胞株（例如哺乳動物生產細胞株）（例如呈懸浮形式的生產細胞株）的程序中，或可選地併入至實施多重（例如三重）轉染方法以產生病毒顆粒生產細胞的程序中。於一些實施方式中，本文中揭露的系統及方法併入根據（例如）US專利申請案公開第US20200124505A1號中敘述者的轉染主混合物。

因此，本文中提供者係生產病毒顆粒（例如AAV）之系統及方法。本文中敘述的改良的批式（例如強化的灌流）系統及方法減輕生物反應器生產領域中於批次模式及其他灌流培養系統（例如非強化）維持高專一性生產力的挑戰，該等挑戰於提高的細胞密度（例如約1E06個細胞/mL或更高）被強調。本文中敘述的系統及方法相較於用於AAV生產的現有的方法實現至多達五倍或更高的體積生產力增加，從而降低貨品之成本並改善AAV生產之效能。

本文之揭露內容提供種種待用於AAV製造的系統及方法。本文之揭露內容展示如何透過使用改良的批式系統（例如強化的灌流系統）及方法以及視需要於生產期期間於用於使培養基豐富並移除抑制性代謝物的條件下在生長期容器中使用增加的細胞密度來增加AAV生產。具體地，揭露系統及方法，其等使從生長期橫跨整個AAV生產期在單一容器（例如生物反應器）中培養AAV生產細胞（於一些實例中同時維持高細胞密度（例如於或大於1E06個細胞/mL））成為可能。本文中敘述的系統及方法相較於其他系統係獨特的，其等於生長期（於用於基因治療病毒的生產期之前）利用灌流以實現高密度培養且接著將高細胞團（cell mass）轉移至生產容器以用於批次模式運作。相反地，本文敘述的系統及方法使灌流生長及生產期（包括（於一些實施方式中）在相同的容器中）成為可能並允許於以輔助病毒感染之後或以輔助病毒組分轉染之後的細胞培養基交換以使培養基豐富並自培養基移除抑制性廢物，從而改善AAV生產力。當與於低細胞密度的批次模式運作以及於較高的細胞密度（例如大於1E06個細胞/mL）下的批次模式運作比較時，本文中敘述的系統及方法導致總體體積AAV生產力之顯著且多倍的增加同時維持細胞專一性生產力。

一般而言於批次模式AAV製造程序中，細胞擴增遵循生產細胞株（例如哺乳動物生產細胞株）解凍及在搖晃燒瓶中的擴增。經擴增生產細胞被轉移至中間規模生物反應器，之後於（例如）250L規模（例如比最終生產期小10x）轉移至N-1生長容器。可用於N-1生長期培養的系統係可商購的且包括（例如）Repligen Xcell ATF™ 6單次使用交替切向流過濾系統及類似系統。一般而言，此等系統可實現＞13E06個活細胞/毫升（vc/mL）的細胞密度。其次，將細胞團以大約1:10自在生長培養基中的N-（例如N-1）分至N期生產，其於（例如）2000L規模於大約1.3E06 vc/mL。通常地，此牽涉自生長期容器的新生產期容器分離且需要不同的生產培養基及饋料。於轉移至N期或生產期培養後，AAV生產藉由在90:10生產培養基及生長培養基混合物中的輔助病毒（例如腺病毒，諸如腺病毒血清型5（Ad5））感染起始並於生產培養物中輸送達約4日。最終，在生物反應器內實施收穫運作，例如核酸酶添加及預處理活性，隨後實施下游過濾澄清、AAV純化、及輔助病毒移除程序。

於本文中敘述的改良的批式（例如強化的灌流）系統及方法中，以大體上與於批次模式AAV製造程序中者相同的方式解凍細胞接種列隊細胞團並在搖晃燒瓶中擴增。生物反應器擴增期包括於（例如）250L規模（不使用交替切向流過濾）的另外的容器。重要地，於一些實施方式中，隨後的生長及生產期可（但非必須）在相同的（例如）2000L容器（生物反應器）中實施，而不需將高細胞密度接種列隊轉移至新的容器以用於生產期培養。對於於2000L規模的生長期，（例如）5E06 vc/mL – 50E06 vc/mL的最終高細胞密度目標可使用生長及生產培養基之混合物實現。一旦所欲的細胞團達到高細胞密度目標（例如5E06 vc/mL或更高），可停止灌流介導的或其他的培養基交換。接著藉由輔助病毒（例如腺病毒）感染或以輔助病毒組分轉染起始AAV生產並於約1個小時至約2個小時後添加饋料，且之後以適當的生產培養基及饋料再次起始灌流介導的或其他的培養基交換。於本文中敘述的系統及方法之一些實施方式中，於生產期培養中利用交替切向流（ATF）灌流。ATF運作可於以輔助病毒（例如腺病毒）感染或以輔助病毒組分轉染後保持進行達（例如）約1日至約2日以使培養基豐富及排除廢物之堆積。於約1日至約2日後，終止灌流介導的或其他的培養基交換以允許AAV顆粒在培養上清液中的累積。於一些實施方式中，ATF運作可於以輔助病毒感染或以輔助病毒組分轉染後保持進行達超過2日，例如至多達約14日AAV生產之誘導。AAV顆粒至上清液中的釋放於（例如）約12個小時後、約24個小時後、約36個小時後、約48個小時後、約60個小時後、約72個小時後、約84個小時、或約96個小時後發生，取決於（例如）所使用的生產細胞株。於以輔助病毒感染或以輔助病毒組分轉染後總共約4日至約6日後，進行AAV收穫程序以用於隨後的下游程序純化，諸如過濾澄清、AAV純化、及輔助病毒（例如腺病毒，諸如Ad5）移除。於一些實施方式中，輔助病毒移除程序包括熱失活程序，諸如於（例如）US專利申請案公開第US20190083554A1號敘述者。於一些實施方式中，可實施切向流深層過濾以將AAV收穫及澄清程序併入單一步驟中（參見Mendes, João P., 等人"藉由灌流生物反應及併入澄清來強化AAV程序。（AAV process intensification by perfusion bioreaction and integrated clarification.）"生物工程及生物技術之尖端（Frontiers in Bioengineering and Bio技術）10 (2022)）。

除了利用本文中敘述的使用灌流的改良的批式系統（例如強化的灌流）及方法外，可於所揭露的系統及方法中實施其他增加AAV生產及／或AAV效價的方法。例如，可進一步改進所揭露的系統及方法以包括：使用糖皮質素類似物，如於（例如）US專利申請案公開第US20190290710A1號中敘述的；使用選自由菸鹼醯胺、菸鹼酸、菸鹼酸甲酯、菸鹼醇、及其等之任何組合組成的群組的化合物，如於（例如）PCT公開第WO/2021/188449號中敘述的；優化的下游澄清程序，如於（例如）US專利申請案公開第US20200048641A1號中敘述的；使用張力劑，如於（例如）US專利申請案公開第US20210277416號中敘述；及／或共遞送Rep mRNA或HDAC抑制劑，如於（例如）US專利申請案公開第US20200032221A1號中敘述的。

於一些實施方式中，本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法相較於最優的批次模式或其他條件（例如非強化）增加感染密度約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、或大於5倍，導致AAV生產力增加至大於或等於（例如）3E11個基因體副本/毫升（GC/mL），即大於或等於3E14 GC/L。

本發明敘述的系統及方法與展示於生長期的灌流以實現高密度培養以用於轉移至生產容器以用於批次模式運作的先前方法有區別。雖然其他人已於暫時轉染系統中於AAV生產期期間及於基於HEK的細胞系統中於AAV生產期間展示灌流能力，無人已展示於使用（例如）HeLa生產細胞（例如借助使用輔助病毒（諸如腺病毒）的感染的HeLa生產細胞）的AAV生產期間使用灌流。一些本文中揭露的系統及方法之實施方式使以下者成為可能：高細胞密度生產，其利用灌流設備以將生長期及生產期生產組合成在同一容器中的單一步驟，從而增加總體體積生產力。於一些實施方式中，使用灌流技術使在生產容器中的高生產細胞密度（例如HeLa PCL密度）成為可能。隨後，於以輔助病毒感染後透過培養基-交換的生產培養基之改變使培養基豐富並移除抑制性廢物，導致AAV生產力增加。當與批次模式運作（例如於較低的細胞密度）以及於較高的密度（即大於約1E06個細胞/mL）的批次模式運作比較時，AAV生產起始後灌流之動作導致總體體積AAV生產力顯著成倍增加並將細胞專一性生產力維持在與於批次模式運作下看到者類似。

其系統、方法、試劑、及組分、及特徵現將於以下章節詳細敘述。 III. 病毒載體

此章節大體敘述病毒載體，包括AAV載體，其可藉由本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法生產。於一些方面，本文之揭露內容提供用於生產腺相關病毒（AAV）的系統及方法。於一些實施方式中，本文之揭露內容提供用於生產包含腺相關病毒（AAV）殼體、及其內包裝的重組載體基因體的重組腺相關病毒（rAAV）的系統及方法。

待生產的AAV（例如rAAV）可含有經包裝載體基因體，其包含（例如）AAV 5’-ITR、啟動子序列、治療性有效負載之部分或完整編碼序列、及AAV 3’-ITR。於一些實施方式中，該經包裝載體基因體可進一步包含強化子序列、內含子序列、一致Kozak序列、及／或多腺苷酸化訊號序列。於一些實施方式中，該經包裝載體基因體可進一步包括一或多種填充核酸序列。於一些實施方式中，使填充核酸序列坐落於內含子與治療性有效負載之部分或完整編碼序列之間。

於一些實施方式中，AAV載體係重組AAV載體（rAAV）。為了簡潔，術語「AAV載體」及類似者用於本文中包含亞屬rAAV，使得提及AAV載體時涵蓋AAV載體及rAAV。由本文之揭露內容之系統及方法生產的AAV載體可包含任何AAV血清型之殼體。例如，可使用所揭露的系統及方法以生產包含血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、rh10、hu37（即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAVhu37）、以及自人類及非人類靈長動物組織分離的超過100種變體之任一者之殼體的AAV。參見（例如）Choi等人, 2005, Curr Gene Ther. 5: 299-310, 2005；Gao等人, 2005, Curr Gene Ther.5: 285-297；及Drouin等人, Future Virol. 2013 Dec;8(12):1183-1199。除了以上提及的殼體外，可使用所揭露的系統及方法以生產包含已經過工程改造以帶有一或多種有益的治療性特性（例如改善選擇組織的靶向、增加逃脫免疫反應的能力、減低中和抗體之刺激、等等）的變體AAV殼體的AAV。如此經工程改造變體殼體的非限制性實例係於US專利第9,506,083、9,585,971、9,587,282、9,611,302、9,725,485、9,856,539、9,909,142、9,920,097、10,011,640、10,081,659、10,179,176、10,202,657、10,214,566、10,214,785、10,266,845、10,294,281、10,301,648、10,385,320、及10,392,632號及於PCT公開第WO/2017/165859、WO/2018/022905、WO/2018/156654、WO/2018/222503、及WO/2018/226602號中敘述。此等及其他AAV血清型變體同樣可藉由本文中的AAV生產之系統及方法生產。待生產的AAV血清型及／或變體之選擇會部分取決於待被AAV載體靶向（例如於基因治療應用中）的細胞類型。 A. 載體基因體組分

於一些實施方式中，由本文中敘述的系統及方法生產的AAV載體包含包裝在該AAV載體內的載體基因體。

於一些實施方式中，由本文中敘述的系統及方法生產的AAV載體包括包含AAV ITR序列的載體基因體，該AAV ITR序列起載體DNA複製起點及載體基因體之包裝訊號兩者的作用，即當AAV及腺病毒輔助病毒功能以反式提供時。此外，該ITR可起透過大型Rep蛋白的單股核酸內切酶缺口製造之目標的作用，自複製中間體解出個別基因體。

於一些實施方式中，由本文中敘述的系統及方法生產的AAV載體包括載體基因體，其包含啟動子序列，該啟動子序列幫助驅動及調節轉殖基因表現，例如治療性有效負載之表現。啟動子序列可係（或衍生自）普遍啟動子或組織專一性啟動子序列。於一些實施方式中，該啟動子序列可係雞貝他（β）-肌動蛋白（CBA）啟動子序列、細胞巨大病毒（CMV）早期立即基因啟動子序列、運甲狀腺素蛋白（TTR）啟動子序列、甲狀腺素結合球蛋白（TBG）啟動子序列、阿爾法-1抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子序列、CMV早期強化子／雞β肌動蛋白（CAG）啟動子序列、或治療性有效負載基因專一性內源啟動子序列。於一些實施方式中，該啟動子序列係位於強化子序列之下游。於一些實施方式中，該啟動子序列係位於內含子序列之上游。於一些實施方式中，該啟動子序列係位於所選5’-ITR序列及治療性有效負載編碼序列之間，包括任何5’-非轉譯區域（UTR）。

除了啟動子之外，經包裝基因體可含有其他適當的轉錄起始、終止、強化子序列、及高效率RNA處理訊號。如於以下進一步詳細敘述，如此序列包括剪接及多腺苷酸化（多A）訊號、增強表現的調節元件（即WPRE）、穩定細胞質mRNA的序列、增強轉譯效能的序列（即Kozak一致序列）、及增強蛋白質穩定性的序列。

於一些實施方式中，經包裝載體基因體進一步包含一致Kozak序列。於一些實施方式中，該一致Kozak序列係位於內含子序列之下游。於一實施方式中，該一致Kozak序列係GCCGCC。如發明所屬技術領域中具有通常知識者會了解的，該一致Kozak序列通常位於緊鄰編碼序列（諸如編碼治療性有效負載的序列）之上游處。如發明所屬技術領域中具有通常知識者會領會的，一致Kozak序列可視為共有對應於治療性有效負載多肽之起始密碼子的ATG殘基。

於一些實施方式中，經包裝載體基因體進一步包含5’-非轉譯區域（UTR）。5’ UTR可來自具有所欲表現特徵的內源基因專一性mRNA。已知5’ UTR於以下者扮演重要的角色：藉由與細胞轉錄本競爭轉譯起始因子及核糖體來優化轉殖基因生產、藉由最小化mRNA衰變或轉錄後基因靜默來增加mRNA半生期、及避免缺失的與調節性蛋白質或抑制性RNA二級結構的交互作用（參見Chiba, Y., 及Green, P. (2009). J. Plant Biol. 52, 114-124、Moore, M. J., 及Proudfoot, N. J. (2009). 細胞（Cell）136, 688-700、及Jackson, R. J., 等人(2010). Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 113-127）。

類似地，經包裝載體基因體可進一步包含3’ UTR。可使3’ UTR坐落於治療性有效負載之編碼序列之下游。已顯示3’ UTR於許多的調節程序（包括轉錄本切割、穩定性、及多腺苷酸化、轉譯、及mRNA定位）中涉及（參見Barrett, L.W., 等人(2012). Cell Mol Life Sci. Nov; 69(21): 3613— 3634）。

於一些實施方式中，治療性有效負載之編碼序列係治療性多肽或多核苷酸之部分或完整編碼序列。例示性治療性多肽可於PCT公開第WO/2021/067598號中找到且包括（例如）可用於治療哺乳動物（例如人類）的多肽，包括鳥胺酸胺甲醯基轉移酶（OTC）、葡萄糖6-磷酸酶（G6Pase）、因子VIII、因子IX、ATP7B、苯丙胺酸羥化酶（PAH）、精胺基琥珀酸合成酶、類週期蛋白依賴性激酶5（CDKL5）、丙醯基-CoA羧化酶次單元a（PCCA）及丙醯基-CoA羧化酶次單元b（PCCB）、存活運動神經元（SMN）、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（IDS）、阿爾法-1-艾杜糖醛酸酶（IDUA）、三肽基肽酶1（TPP1）、低密度脂蛋白受體（LDLR）、肌小管蛋白（myotubularin）1、酸式阿爾法-葡萄糖苷酶（GAA）、失養性肌強直-蛋白質激酶（DMPK）、N-磺酸基葡萄糖胺磺酸基水解酶（SGSH）、纖維母細胞生長因子-4（FGF-4）、rab護送蛋白1（REP1）、胺甲醯基合成酶1（CPS1）、精胺基琥珀酸裂解酶（ASL）、精胺酸酶、延胡索醯基醋酸酯水解酶、阿爾法-1抗胰蛋白酶、甲基丙二醯基CoA變位酶、囊腫纖維化跨膜傳導率調節子（CFTR）蛋白、及肌肉萎縮蛋白基因產物（例如迷你肌肉萎縮蛋白或微肌肉萎縮蛋白）。治療性有效負載之非限制性列表亦可在PCT公開第WO/2019/168961號中找到。該治療性有效負載可為蛋白質或多肽之野生型編碼序列、蛋白質或多肽之經密碼子優化編碼序列、或編碼功能性核苷酸物種（諸如非編碼性RNA）的序列、或其等之組合。適合作為治療性有效負載的功能性核苷酸物種之實例包括非編碼性RNA、反義寡核苷酸（ASO）、短小干擾RNA（siRNA）、微型RNA（miRNA）、適配體、長型非編碼性RNA（lncRNA）、及任何其他具有與疾病狀況有關的生物活性的非蛋白質編碼性核酸之物種。例如，該治療性有效負載可係N-啉基、連結肽的N-啉基、反義寡核苷酸（ASO）、磷醯二胺啉代寡核苷酸（PMO）、治療性轉殖基因、編碼治療性多肽或肽的多核苷酸、與肽複合的PMO、一或多種肽、一或多種編碼CRISPR-Cas蛋白的多核苷酸、嚮導RNA、或CRISPR-Cas蛋白及嚮導RNA兩者、包含CRISPR-Cas系統分子的核糖核蛋白、治療性轉殖基因RNA、或其他基因修飾性或治療性RNA及／或蛋白質、或其等之任何組合。用於本文中，術語「野生型」係指與天然存在的生物聚合物（例如多肽序列或多核苷酸序列）相同的生物聚合物（例如多肽序列或多核苷酸序列）。

於一些實施方式中，經包裝載體基因體進一步包含一或多種強化子序列。於一些實施方式中，該強化子序列係（或衍生自）細胞巨大病毒早期立即基因（CMV）強化子序列、運甲狀腺素蛋白強化子（enTTR）序列、雞貝他（β）-肌動蛋白（CBA）強化子序列、En34強化子序列、或脂蛋白元E（ApoE）強化子序列。

於一些實施方式中，經包裝載體基因體進一步包含一或多種內含子序列。內含子序列可係（或可衍生自）SV40小型T內含子序列、兔血紅素次單元貝他（rHBB）內含子序列、人類貝他球蛋白IVS2內含子序列、Promega嵌合內含子序列（β-球蛋白/IgG嵌合內含子序列）、或hFIX內含子序列。

於一些實施方式中，經包裝載體基因體進一步包含多腺苷酸化訊號序列。於一些實施方式中，該多腺苷酸化訊號序列係（或衍生自）牛生長激素（BGH）多腺苷酸化訊號序列、SV40多腺苷酸化訊號序列、兔貝他球蛋白多腺苷酸化訊號序列、基因專一性內源性多腺苷酸化訊號序列。 B.   AAV 殼體

本文之揭露內容提供用於生產包含任何AAV血清型之AAV殼體的AAV顆粒的系統及方法。於一些實施方式中，該AAV殼體來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、rh10、或hu37（即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、或AAVhu37）的AAV。於例示性實施方式中，該AAV殼體來自AAV血清型9（AAV9）載體、AAV9變體載體、AAV血清型8（AAV8）載體、AAV血清型2（AAV2）載體、或任何其他已知的AAV血清型載體或變體。國際專利申請案公開第WO2021041485A1號第[0115] – [0131]段提供了已知AAV血清型、變體、突變、及其等之衍生物之列表，其等之任何者皆可適用於使用本文中敘述的系統及方法的AAV生產。 C. 醫藥組成物

本文中提供的用於AAV生產的系統及方法可用於產生包含AAV載體的醫藥組成物。包含根據本文中揭露的方法生產的AAV載體的醫藥組成物可進一步包含醫藥上可接受的載劑。包含根據本文中揭露的方法生產的AAV載體的醫藥組成物可被進一步調配以用於投予至個體。適合的經調配以用於投予AAV的醫藥組成物可（例如）於U.S.專利申請案公開第2012/0219528號中找到。可用於AAV組成物中的醫藥上可接受的載劑（媒介物）係常規的。Remington氏製藥科學, E. W. Martin所著, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 第l5版(1975)敘述適用於醫藥遞送一或多種治療性化合物、分子、或藥劑（包括例如根據本文之揭露內容之系統及方法生產的AAV）的組成物及調配物。

本文之揭露內容於一些方面係關於包含根據本文揭露的方法生產的AAV的醫藥組成物。於一些實施方式中，該醫藥組成物包含醫藥上可接受的載劑或賦形劑。於一些實施方式中，該醫藥組成物經調配以用於皮下、肌肉內、皮內、腹膜內、或靜脈內投予。於例示性實施方式中，該醫藥組成物經調配以用於靜脈內投予。

於一些實施方式中，AAV係在適用於在人類個體中輸注的緩衝劑／載劑中調配。該緩衝劑／載劑可包括預防AAV黏在輸注管路上但不活體內干擾AAV結合活性的組分。種種適合的溶液可包括以下者之一或多種：緩衝食鹽水、界面活性劑、及調整至等於（例如）約100 mM氯化鈉（NaCl）至約250 mM氯化鈉的離子強度的生理上相容的鹽或鹽之混合物、或調整至相等離子濃度的生理上相容的鹽。經調配醫藥組成物之pH可於6.5至8.5、或7至8.5、或7.5至8的範圍。適合的界面活性劑或界面活性劑之組合可選自泊洛沙姆（Poloxamer），即由一中心疏水性聚氧丙烯10（聚(環氧丙烷)）鏈及兩側的二親水性聚氧乙烯（聚環氧乙烷)）鏈構成的非離子性三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15（聚乙烯二醇-l5羥基硬脂酸脂）、LABRASOL（聚氧辛酸甘油酯）、聚氧10油醚、TWEEN（聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯）、乙醇、及／或聚乙二醇。 IV. 生產 AAV 之方法

本文之揭露內容提供用於生產可用作為治療性有效負載（例如基因）遞送媒介物的腺相關病毒（AAV）之系統及方法。於一些實施方式中，本文中提供的系統及方法生產的AAV包含野生型或經工程改造（突變體或變體）AAV殼體，該AAV殼體包裝有經工程改造載體基因體，該經工程改造載體基因體包含（例如）轉殖基因，例如編碼治療性有效負載（例如治療性蛋白質）的轉殖基因。於一些實施方式中，可將如此經工程改造AAV投予至需要該治療性有效負載的個體，且於投予後，該治療性有效負載可立即於該個體自身之細胞中表現。本文中敘述的系統及方法可用於包含任何治療性有效負載的AAV。 A.   AAV 生產宿主細胞

本文中提供的系統及方法利用用於生產包括rAAV的AAV載體的宿主細胞。於一些實施方式中，該等宿主細胞包含本文中揭露的重組核酸分子、病毒載體，例如AAV載體、或rAAV。於特殊實施方式中，該等宿主細胞適用於增殖AAV。於特殊實施方式中，該等宿主細胞適用於生產AAV。於特殊實施方式中，該等宿主細胞適用於增殖及／或生產AAV。

可使用任何已知的AAV生產宿主細胞。已知的宿主細胞類型之實例包括細菌細胞、酵母菌細胞、昆蟲細胞（諸如Sf9細胞）、及哺乳動物細胞、等等。於一些實施方式中，該宿主細胞可係適用於生產AAV（例如rAAV）的細胞（或細胞株），例如HeLa細胞、Cos-7細胞、HEK293細胞（及HEK293衍生細胞株）、A549細胞、BHK細胞、Vero細胞、RD細胞、或ARPE-19細胞。於一些實施方式中，本文中敘述的系統及方法利用穩定可誘導AAV生產細胞株，諸如根據WO 2022/112218 A1中敘述者的去氧羥四環素可誘導性CAP細胞及HEK293細胞。本文之其他部分敘述另外的宿主細胞類型。

於一些實施方式中，重組核酸分子或載體可使用任何適合的發明所屬技術領域中已知的方法（例如基於轉染的方法）遞送至宿主細胞培養物中。於一些實施方式中，本文中提供的系統及方法中利用具有藉由轉染插入至其基因體中的重組核酸分子或載體的穩定的宿主細胞株。於將AAV載體轉染至宿主細胞後，該AAV載體至該宿主細胞之基因體中的併入可藉由種種方法分析，該等方法係諸如抗生素挑選、螢光活化細胞分選、南方墨點轉漬法、基於PCR的偵測、螢光原位雜合，如Nakai等人, 自然遺傳學（Nature Genetics）(2003) 34, 297-302；Philpott等人, 病毒學期刊（Journal of Virology）(2002) 76(11): 5411-5421、及Howden等人, J Gene Med 2008; 10:42-50敘述的。此外，穩定的細胞株可根據發明所屬技術領域中已知的步驟準則（諸如Clark, 腎臟國際（Kidney International）Vol 61 (2002):S9-Sl5及Yuan等人, 人類基因治療（Human Gene Therapy）2011 May;22(5):613-24中敘述者）建立及利用。

於一些實施方式中，用於AAV生產的宿主細胞經工程改造成AAV生產細胞。本文中敘述的系統及方法中因此可利用AAV生產細胞株（PCL）。

此處敘述本文之揭露內容之系統及方法中的培養AAV PCL之種種方面。例如，敘述PCL培養條件之參數，包括培養基交換技術、灌流、灌流率、細胞密度、培養基、培養基補充、細胞存活率、生長速率、pH、培養持續期間、培養體積、及接種密度、以及其他，其等可於本文揭露的系統及方法中選擇或利用。

對於AAV生產而言需要種種細胞／病毒組分。例如，用於AAV複製、載體基因體包裝、及殼體之結構組分的組分皆必須被生產以產生AAV顆粒。AAV rep基因編碼四個蛋白質，其等於包裝及複製中涉及，且cap基因編碼三個結構殼體蛋白（稱為VP1、VP2、及VP3）。野生型AAV係複製缺陷的且需要與輔助病毒（例如疱疹病毒或腺病毒，例如Ad5病毒）共感染細胞以複製。例如，Ad5病毒提供Ad5輔助病毒功能因子／基因，諸如Ela、Elb、E40rf6、E2a、及／或病毒相關（VA）RNA，其介導AAV複製。參見（例如）Nayak等人J Virol. 81.5(2007):2205-12。重組AAV載體允許所關注的基因或轉殖基因併入至病毒載體中以使得轉殖基因被病毒機械傳遞、編碼、及／或表現。於一些例子中，重組AAV載體包含反向末端重複序列（ITR），其起複製起點及／或包裝的作用。於一些實施方式中，該重組AAV載體包含兩側為ITR的轉殖基因（轉殖基因之各側各有一個ITR）。參見（例如）Carter B.用於基因遞送的腺相關病毒及AA V載體（Adeno- Associated Virus and AA V Vectors for Gene Delivery）, 於基因與細胞治療（Gene and Cell Therapy）, 第4版, N.S. Templeton, 編者. 2015, CRC Press。

可產生含有此等AAV生產所需要的組分之一或多者的AAV PCL。AAV組分之例示性列表包括(a)核酸序列，其包含轉殖基因，例如治療性有效負載；(b)核酸序列，其包含反向末端重複序列（ITR），例如一或二個ITR，例如其中該二個ITR在一或多個另外的AAV組分（例如轉殖基因）的兩側；(c)核酸序列，其編碼一或多種AAV複製及／或包裝蛋白（例如由AAV rep基因編碼）；(d)核酸序列，其編碼一或多種AAV結構殼體蛋白（例如由AAV cap基因編碼，例如VP1、VP2、或VP3蛋白）；(e)一或多種AAV複製及／或包裝蛋白；(f)一或多種AAV結構殼體蛋白；及／或(g)一或多種輔助病毒組分，例如Ad5輔助病毒組分（例如E1a、E1b、E40rf6、E2a、及／或VA RNA；或Ad5輔助病毒）。用於本文中，「AAV PCL」或「AAV生產細胞株」係指一細胞，例如本文中敘述的細胞，其包含以上(a)-(g)之一或多者且當以任何必需的輔助病毒組分補充時能夠於發明所屬技術領域中眾所周知的適合生產條件下生產AAV。

於一些實施方式中，AAV組分（例如以上(a)-(d)或(g)）之任何組合係在相同的核酸分子上或在分開的核酸分子上（例如在一個、二個、三個、或四個、或更多個分開的核酸分子上）提供。於一些實施方式中，轉殖基因兩側皆有ITR。

於一些實施方式中，PCL包含以上(a)-(g)之任何組合。於一些實施方式中，該PCL可包含重組AAV載體及／或Rep及／或cap基因，例如穩定併入容許宿主細胞中。於一些實施方式中，該PCL包含編碼轉殖基因的核酸序列及包含一或多個ITR的核酸序列，例如當該轉殖基因之任一側皆有一個ITR時。於其他實施方式中，PCL包含包裝細胞株，其包含rep及／或cap基因但不包含該載體／轉殖基因（且該載體／轉殖基因可由分開的病毒（例如重組腺病毒，例如Ad5）提供）。可製作包含AAV組分之其他組合的PCL。任何如此PCL及其他PCL之變體可聯接本文中敘述的系統及方法使用。於一些實例中，AAV生產可藉由以輔助病毒（諸如Ad5）感染誘導，例如於N培養中。

可使用任何適用於AAV生產的細胞株作為本文中敘述的系統及方法之AAV生產宿主細胞，包括適合的哺乳動物及昆蟲細胞株（包括Sf9細胞）。例如，可於本文中敘述的系統及方法之任何者中使用包含一或多種對於AAV生產而言所需要的組分的哺乳動物細胞株（例如衍生自任何哺乳動物細胞株的PCL）。於一些實施方式中，本文中敘述的系統及方法包含培養哺乳動物細胞，例如人類細胞或非人類哺乳動物細胞，例如哺乳動物PCL，例如人類PCL或非人類哺乳動物PCL。例示性細胞類型包括但不限於：BALB/c小鼠骨髓瘤細胞株（NSO/1，ECACC No: 85110503）；人類視網膜母細胞（PER.C6（CruCell, Leiden, 荷蘭））；經SV40轉形的猴腎臟CV1細胞株（COS-7，ATCC CRL 1651）；人類胚胎腎臟細胞株（293或293細胞，針對以懸浮培養形式生長次選殖，Graham et ah, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；乳倉鼠腎臟細胞（BHK，ATCC CCL 10）；中國倉鼠卵巢細胞+/-DHFR（CHO, Urlaub及Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；小鼠sertoli細胞（TM4，Mather, Biol. Reprod., 23 :243-251 (1980)）；猴腎臟細胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎臟細胞（VERO-76，ATCC CRL-1 587）；人類子宮頸癌細胞（HeLa，ATCC CCL 2或HeLa S3，ECACC目錄第87110901號）；犬腎臟細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；水牛鼠肝臟細胞（BRL 3 A，ATCC CRL 1442）；人類肺臟細胞（W138，ATCC CCL 75）；人類肝臟細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TR1細胞（Mather et ah, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；FS4細胞；人類肝腫瘤細胞株（Hep G2）；及／或本文中敘述的細胞類型之任何者之PCL版本。於一些實施方式中，本文中敘述的細胞類型之PCL版本包含已經工程改造以具有一或多種對於AAV生產而言所需要的組分的細胞類型。

於一些實施方式中，本文中敘述的系統及方法包含培養HeLa細胞（例如HeLa PCL）、CHO細胞（例如CHO PCL）、或HEK細胞（例如HEK PCL）。於一些實施方式中，本文中敘述的系統及方法包含培養HeLa細胞，例如HeLa PCL。

如以上談及的，於一些實例中細胞會經挑選或經工程改造以包括一或多種對於AAV生產而言必需的組分（例如被工程改造成PCL）。或者或此外，經工程改造PCL可包含基因修改以降低一或多個基因及／或蛋白質之表現及／或活性，該等修改增加AAV效價。例示性的可用於本文之揭露內容之系統及方法的經工程改造PCL包括於US專利申請案公開第US20200325455A1號中敘述者。

於一些實施方式中，經工程改造PCL可包含基因修改以降低一或多個基因及／或蛋白質之表現及／或活性，該等修改降低PCL中的廢物副產物之生產或堆積。作為以降低廢物副產物堆積為目標的基因之實例，Soo Min Noh等人顯示降低乳酸脫氫酶-A之表現的CHO生產細胞之shRNA處理改良所生產的單株抗體之生產及品質。（參見Noh, Soo Min, 等人"CHO細胞中透過組合麩醯胺酸合成酶挑選與乳酸脫氫酶-A之下調的氨與乳酸之減低。（Reduction of ammonia and lactate through the coupling of glutamine synthetase selection and downregulation of lactate dehydrogenase-A in CHO cells.）" 應用微生物學及生物技術（Applied microbiology and biotechnology）101(3) (2017): 1035-1045, 以引用方式將其完整內容併入本文中。）亦參見：Shen, Chun Fang, 等人"再評估影響腺病毒生產的培養基及重要代謝物。（Reassessing culture media and critical metabolites that affect adenovirus production.）"生物技術進展（Biotechnology progress）26(1) (2010): 200-207，其敘述廢物副產物量及其等之對於Ad5生產的影響；Khajah等人“乳酸脫氫酶A或B敲落試管內降低乳酸生產並抑制乳癌細胞移動性。（Lactate Dehydrogenase A or B Knockdown Reduces Lactate Production and Inhibits Breast Cancer Cell Motility in vitro.）” Front Pharmacol. 2021, 12: 747001，其顯示LDH-A或LDH-B之敲落可降低乳酸生產；及Prasad等人“乳酸之降低的生產及吸收對於WNT5A傳訊抑制乳癌細胞遷移及入侵之能力而言係必要的。（Reduced production and uptake of lactate are essential for the ability of WNT5A signaling to inhibit breast cancer cell migration and invasion.）” Oncotarget. 2017 Sep 22; 8(42): 71471-71488，其顯示PFKP敲落抑制乳酸生產。Shen等人、Khajah等人、及Prasad等人之各者皆以引用方式將其等之完整內容併入本文中。因此，本文之揭露內容將以下者視為可能：AAV PCL，其等經工程改造以上調或下調可減少廢物副產物（諸如乳酸或氨）之形成或堆積的代謝酵素之表現。

例如，本文之揭露內容將以下者視為可能：經工程改造AAV PCL，其表現麩醯胺酸合成酶以降低乳酸及氨堆積。如此AAV PCL可表現外源性麩醯胺酸合成酶（GS）。麩醯胺酸合成酶之表現可係組成性的或可係可誘導的。麩醯胺酸合成酶之表現可由啟動子、強化子、及／或其他表現調節元件驅動，其等經針對適當的表現水平作優化以於AAV生產期間減低廢物副產物堆積。

本文之揭露內容亦將以下者視為可能：經工程改造AAV PCL，其具有降低的乳酸脫氫酶之表現以降低乳酸堆積。於一些實施方式中，該等PCL可具有降低的乳酸脫氫酶-A（LDH-A）之表現。於一些實施方式中，該等PCL可具有降低的乳酸脫氫酶-B（LDH-B）之表現。於一些實施方式中，該等PCL可具有降低的解醣酵素磷酸果糖激酶血小板型（PFKP）之表現。

於一些實施方式中，PCL可具有增高的麩醯胺酸合成酶之表現及降低的乳酸脫氫酶之表現。

發明所屬技術領域中具有通常知識者會認識不同的用於調整PCL中的基因表現的方法學，且該等方法學包括（例如）US專利申請案公開第US20200325455A1號中闡明的方法。可用以在經工程改造以降低廢物副產物之生產或堆積的PCL中調節基因或基因產物之表現的方法學之實例包括使用核酸酶、雙股RNA（dsRNA）、短小干擾RNA（siRNA）、小型髮夾RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）、或反義RNA寡核苷酸（ASO）。核酸酶之實例包括鋅指核酸酶（ZFN）、大範圍核酸酶（meganuclease）、類轉錄活化子效應核酸酶（TALEN）、或規律間隔重複短迴文序列簇（CRISPR）相關蛋白。

在PCL培養中降低乳酸及／或氨堆積的替代方法包括由Freund及Croughan（Int. J. Sci. 2018 Feb; 19(2): 385）敘述者。此等包括pH之改變、乳酸-消耗表現型之株系選擇、及種種培養基補充方法。現進一步將以下者視為可能：以必要胺基酸（EAA）補充培養基可降低乳酸及其他廢物堆積並藉由促進蛋白質生產助長rAAV生產，此係基於以下觀察：饋料批式培養中EAA補充移動AAV生產細胞之代謝輪廓且特別是降低乳酸堆積（數據未顯示）。

發明所屬技術領域中具有通常知識者會領會到不同的細胞株可能具有不同的營養需求及／或可能需要不同的培養條件以用於最優的生長；發明所屬技術領域中具有通常知識者會能夠按需要修改條件。 B. 用於 AAV 生產的方法

此處敘述AAV製造之種種方面，包括所敘述的系統及方法之方面。 i.     用於AAV生產的批次模式程序

一般，於批次模式AAV生產中，將AAV PCL培養在N-1培養容器中以實現高活細胞密度。接著使用N-1培養細胞以特定接種密度接種N培養容器。在N培養容器中的所接種細胞可於允許AAV之生產的條件下培養。

圖 1顯示用於低密度批式（LDB）模式AAV生產的例示性程序，即例示性批次模式對照程序。例如，將AAV生產細胞株（諸如HeLa生產細胞株）（PCL）解凍並在搖晃燒瓶中擴增，轉移至中間規模生物反應器，接著在於（例如）2000L規模轉移至生產期生產容器前於（例如）250L規模轉移至N-1灌流生長容器。如於 圖 1中顯示的，此程序以將生長培養基泵至250L N-1期灌流生長容器中開始（步驟1），接著以在先的N-2期生產細胞接種物接種N-1期灌流生長容器（步驟2）。灌流交換生長培養基（步驟3）達（例如）4-6日，其係透過使用交替切向流（ATF）過濾系統或類似的培養基交換系統（例如Repligen Xcell ATF™ 6單次使用交替切向流過濾系統，於250L規模）以實現大於或等於13E06 vc/mL（活細胞/毫升）的目標細胞密度（步驟4）。對於於批次模式運作的生產期，以大約90%的最終容體積的生產培養基準備分開的2000L容器（步驟5）並以大約1:10的分流比將AAV生產細胞自N-1轉移至生產期反應器以使足夠的生長培養基至生產培養基的交換成為可能（步驟6）。於 圖 1中，分隔N-1期生長反應器及N-期生產反應器的實線指示此二期係在分開的容器中實施。以此方式，以高濃度細胞培養物（即大於13E06 vc/mL）接種2000L生產容器，目標為最終濃度大約大於1.3E06 vc/mL。於接種後，藉由輔助病毒（例如腺病毒，Ad5）感染起始AAV生產（步驟7），且接著為至生物反應器容器的大量生產饋料添加（步驟8）。於大約4-6個感染後日數（「dpi」）時，自培養上清液收穫AAV產物（步驟9）以用於隨後的純化及輔助病毒移除運作。例如，Ad5移除程序包括於（例如）US專利申請案公開第US20190083554A1號中敘述者。 ii.    用於AAV生產的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法

本文中敘述用於AAV生產的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式程序。 圖 2中顯示例示性程序。一般，改良的批式程序包含以用於AAV生產細胞生長期培養的生長培養基準備容器。於一些實施方式中，該容器可係意欲用於培養生長及生產期培養物兩者的單一容器，即「組合的生長／生產容器」。如此容器隨後係以AAV生產細胞接種。灌流可在經接種的生長或組合的生長／生產容器中起始以起始AAV生產細胞生長。一旦達到最終細胞密度目標，可起始生產期培養。於一些實施方式中，生產期起始包含以輔助病毒感染生長期培養物以起始AAV生產。AAV生產可藉由不依賴AAV輔助病毒感染的替代性方式起始。如此替代性方式包括（例如）使用三重轉染方法或使用具有生產AAV所需的組分（諸如腺病毒輔助病毒功能、AAV複製酶、及殼體基因）之穩定併入的生產細胞（例如ELEVECTA®（CEVEC）去氧羥四環素-可誘導AAV生產細胞、及類似的系統）。AAV生產期可（例如）藉由提供饋料、對於生產培養基交換培養基、及／或起始灌流以維持生產來維持。據此生產的AAV可使用任何適合的分離技術收穫並使用發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的標準下游處理步驟純化。

圖 3顯示本文中敘述的用於AAV生產系統及方法的例示性程序。於一些實施方式中，用於該改良的批式（例如強化的灌流）程序的初步步驟可與於批次模式AAV生產程序中利用的常規步驟類似。例如，可將細胞接種列隊細胞團以與於批次模式運作下者相同的方式解凍並在搖晃燒瓶中擴增。

可利用生物反應器擴增期以擴大規模至生長／生產培養。可於本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法利用任何適合的規模或可改動任何適合的規模以使其適用於本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法。於一些實施方式中，該生物反應器擴增期使用（例如）250L規模容器。於一些實施方式中，該生物反應器擴增期使用次公升培養體積。於一些實施方式中，該生物反應器擴增期使用自次公升至6000L規模或更大的任何適合的培養體積，包括至高達12000L規模。據此，本發明之系統及方法可於該生物反應器擴增期培養中利用次公升、1L、2L、5L、10L、20L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、5500L、或6000L容器。於一些實施方式中，該生物反應器擴增期使用具有大於6000L容量的容器。發明所屬技術領域中具有通常知識者會領會到較大規模的培養體積（諸如6000L或更大）可能需要特化的培養基處理系統／設備。據此，該生物反應器擴增期可利用適當的灌流設備，諸如交替切向流（ATF）過濾系統。該生物反應器擴增期培養可包含適用於針對該生物反應器擴增期挑選的培養體積的灌流設備，諸如Repligen Xcell ATF™ 6或其他灌流系統。於較大規模的培養體積（諸如6000L或更大），可利用多個如此設備，例如多個Repligen Xcell ATFTM 6或ATFTM 10系統。於一些實施方式中，該生物反應器擴增期不利用ATF過濾系統。

於一些實施方式中，最終灌流生產期係在生產容器中於（例如）2000L規模實施。該生產容器可係對於任何規模的AAV生產適用於任何培養體積的容器。例如，該生產容器可係次公升、1L、2L、5L、10L、20L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、5500L、6000L、6500L、7000L、7500L、8000L、8500L、9000L、9500L、10000L、10500L、11000L、11500L、12000L容器、或更大。

於一些實施方式中，將最終灌流生長及生產期組合至（例如）2000L規模的相同容器中，該容器於本文中稱為組合的生長／生產容器。該組合的生長／生產容器可係對於任何規模的AAV生產適用於任何培養體積的容器。例如，該組合的生長／生產容器可係次公升、1L、2L、5L、10L、20L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、5500L、6000L、6500L、7000L、7500L、8000L、8500L、9000L、9500L、10000L、10500L、11000L、11500L、12000L容器、或更大。於一些實施方式中，該組合的生長／生產容器使用具有大於6000L容量的容器。

發明所屬技術領域中具有通常知識者會領會到較大規模的培養體積（諸如6000L或更大）可能需要特化的培養基處理系統／設備。據此，生長、生產、及／或組合的生長／生產容器可利用適當的灌流設備，諸如交替切向流（ATF）過濾系統。生長、生產、及／或組合的生長／生產容器培養可包含適用於針對生物反應器期挑擇的培養體積的灌流設備，諸如Repligen Xcell ATF™ 6或其他灌流系統。於較大規模的培養體積（諸如6000L或更大），可利用多個如此設備，例如多個Repligen Xcell ATF ^TM6或ATF ^TM10系統或平板切向流過濾系統。例如，Repligen Xcell ATF ^TM6或類似的類似系統可用於（例如）50L – 500L規模，而ATF ^TM10或類似系統可用於更大的規模。於一些實施方式中，為支持增加的細胞密度，可使用多個ATF ^TM10系統或類似者。於一些實施方式中，該生長、生產、及／或組合的生長／生產容器不利用ATF過濾系統。

於一些實施方式中，於生長及／或生產期在組合的生長／生產容器中使用灌流系統，諸如ATF過濾系統，諸如Repligen Xcell ATF™ 10。適用於在該組合的生長／生產容器中使用的替代性灌流技術包括（但不限於）Xcellerex自動灌流系統（APS）（Cytiva）、KrosFlo® KPS TFF系統，例如KPS 700、或XCell ^TMATF 6（Repligen）、GEA Kytero®單次使用Pharma分離系統（GEA）、Prostak ^TM微過濾模組（Millipore）、Alfa Laval CultureOne ^TM（Alfa Laval）、CARR® Centritech分離系統，諸如CARR UniFuge®試驗或Centritech細胞8®（Pneumatic Scale Angelus）、Ksep® 6000S系統（Sartorius）、微流細胞滯留裝置（如於Kwon T.等人Sci Rep 7, 6703 (2017)中敘述的）、SciLog® SciPure ^TM系統（Parker）、聲音沉降系統（如於Coronel J.等人Front. Bioeng. Biotechnol., 2020年七月02日中敘述的）（Sonosep）、及／或EDO電系統（如於Wang, Zhaowei, "兩種用於灌流培養系統中的細胞滯留的方法（Two Approaches for Cell Retention in Perfusion Culture Systems）" (2009). ETD檔案. 304中敘述的）（American Piezo）。各種各樣的樣式可自以上灌流技術的供應商獲得且可適用於在本文中敘述的系統及方法中使用。例如，可使用Repligen ATF系統，於2、4、6、或10過濾單位樣式，取決於所欲的培養規模及細胞密度。亦可利用較小規模的灌流技術，諸如WAVE生物反應器（Cytiva）。可使用替代性培養基交換技術，包括切向流過濾（TFF）及／或基於離心的技術。

於一些實施方式中，N-期生長培養可以至少5E06 vc/mL的最終密度為目標。N-期生長可以任何適用於接種生產期AAV生物反應器的最終密度（包括（例如）1E06、2E06、3E06、4E06、5E06、6E06、7E06、8E06、9E06、10E06、20E06、30E06、40E06、或至多達50E6 vc/mL、或更高）為目標。

於一些實施方式中，生長期培養可使用（例如）於（例如）2-14日的期間灌流的生長及生產培養基之混合物以一最終密度為目標。於一些實施方式中，於生長期培養中使用單單生長培養基。於一些實施方式中，於生長期培養中使用單單生產培養基。於一些實施方式中，於生長期培養中使用生長及生產培養基之50/50混合物。於其他實施方式中，於生長期培養中使用生長及生產培養基之10/90、20/80、30/70、或40/60混合物。於又其他實施方式中，於生長期培養中使用生長及生產培養基之90/10、80/20、70/30、或60/40混合物。該生長培養基、生產培養基、或生長及生產培養基之混合物可於（例如）2-14日的期間灌流。於一些實施方式中，使用單單生長培養基直到達到最終密度目標，於該時間點於整個生產期的剩下部分使用單單生產培養基。

關於 圖 3中描繪的實例程序，因為於生長期中達到目標細胞密度，所以在組合的生長／生產容器中準備生長培養基（步驟1）。將AAV生產細胞（諸如任何適合的PCL，例如HeLa細胞（例如HeLa PCL））自在先的生物反應器擴增期以用於接種的目標最終密度接種（步驟2）。接著隨細胞團增加灌流率以維持固定的細胞專一性灌流率（CSPR）達約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、或大於6日的持續期間（步驟3）。於一些實施方式中，隨細胞團增加灌流率以維持固定的CSPR達約2日至約6日，諸如約2日至約3日、約2日至約4日、約2日至約5日、約2日至約6日、約3日至約4日、約3日至約5日、約3日至約6日、約4日至約5日、約4日至約6日、或約5日至約6日的持續期間。於一些實施方式中，維持固定的CSPR最小化營養素耗盡及廢物堆積。

於一些實施方式中，不論細胞密度為何皆利用固定的體積灌流率。

一旦達到用於AAV生產的目標細胞密度（例如5E06 vc/mL）（步驟4），可停止生長灌流交換。接著可藉由輔助病毒（例如腺病毒Ad5）感染起始AAV生產（步驟5）。於 圖 3中，分開生長期及生產期反應器的虛線指示兩期可（但非必須）在相同容器（例如2000L生產期生物反應器）中實施。於一些實施方式中，輔助病毒感染之後為大量饋料添加以支持生產期活性（步驟6）。於一些實施方式中，接著於（例如）ATF-10設置將生長培養基交換成生產培養基／饋料混合物（步驟7）。於一些實施方式中，於大約1個至2個感染後小時數（hpi）時再起始灌流（步驟8）。可維持灌流達1-2 dpi以使培養基豐富、降低廢物之堆積、並細胞內保留AAV產物。於一些實施方式中，AAV顆粒保持與細胞連結／為細胞內的直到大約48 hpi。如此，為最小化產物至廢物滲透流的損失，可於此時間前停止灌流。於大約1-2 dpi後，停止灌流以允許AAV顆粒在培養物上清液中的滯留及堆積（步驟9）。於約48個小時後，大部分的AAV產物被生產但保留在細胞內；但自2-6 dpi，AAV顆粒優先被釋放至細胞培養上清液中且可被收穫（步驟10）。於一些實施方式中，AAV產物可於大約2 dpi、大約3 dpi、大約4 dpi、大約5 dpi、大約6 dpi、或晚於6 dpi時開始收穫。例如，AAV產物可於約2 dpi至約3 dpi、約2 dpi至約4 dpi、約2 dpi至約5 dpi、約2 dpi至約6 dpi、約3 dpi至約4 dpi、約3 dpi至約5 dpi、約3 dpi至約6 dpi、約4 dpi至約5 dpi、約4 dpi至約6 dpi、或約5 dpi至約6 dpi時收穫以用於隨後的下游純化。

於一些實施方式中，Ad5移除程序包括於（例如）US專利申請案公開第US20190083554A1號中敘述者。

發明所屬技術領域中具有通常知識者會領會到於批次模式運作及於本文中敘述的改良的批次模式運作（例如強化的灌流）兩者，優化生長及生產培養條件以改善AAV生產產量會係重要的。溫度、pH、滲透壓、鹽濃度、培養基及饋料組成、氧飽和度、攪拌率、起始葡萄糖／麩醯胺酸濃度、廢物續存量、分流比、培養物齡、細胞生長／同期化之狀態、輔助病毒類型或突變／弱化、及感染複數之各者可於特定系統或程序中影響AAV生產力。進一步，對於高產量高細胞密度AAV生產程序可能需要優化廢物或代謝物生產／消耗率及培養基交換率。

本申請案之實施例章節展示本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法之例示性實施方式，其於AAV生產時相較於現有的最優低密度批式（LDB）程序一致地增加感染密度大約4倍，以實現大於或等於3E11 GC/mL（基因體副本/毫升）或大於或等於3E14 GC/L的AAV體積生產力之2.5倍至3倍增加。

本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法已在二種不同的HeLa生產細胞株系統中評估，該等系統利用不同的生長培養基、不同的用於治療性有效負載的所關注基因、及不同的殼體，且相較於對應的低密度批次模式運作條件已實現類似的生產力之倍數改善。此等結果展示可橫跨多種AAV生產細胞系統、於不同的培養基條件下、使用不同的所關注基因、及不同的AAV殼體實施本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法以實現AAV產量利益。

以下章節a. – j.提供可於本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法之種種實施方式中利用的種種AAV培養參數之實例。 a.    培養基交換、灌流

於一些實施方式中，在於本文中揭露的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法中培養AAV PCL包含在生長期及／或生產期培養容器中（例如）藉由使用灌流（例如交替切向流（ATF）灌流）自培養基移除廢物及／或以營養素補充培養基。可利用灌流以建立細胞團，例如於生長期培養中、及／或以於生產期培養中維持細胞團。

ATF利用提供用於以下者的方法的過濾系統：連續或半連續地交換細胞培養基，例如藉由連續地／半連續地以新鮮培養基補充培養物同時移除廢物，例如透過大量中空纖維。ATF流率表明細胞培養物以多快的速度循環通過各中空纖維。於一些實施方式中，各纖維之直徑係約0.5 mm至約1.5 mm，例如約0.5 mm、約1 mm、或約1.5 mm。無意受限於理論，咸相信較高的流率傾向增加對細胞的剪應力之量。且，過低的流率可能增加(1)細胞培養物被長時間暴露至低氧環境的風險及（2）導因於不足的反沖的過濾器垢積之可能性。本文中敘述的方法包含以一流率進行ATF灌流，該流率最小化對細胞的剪應力但向細胞提供足夠的氧。於一些實施方式中，該ATF灌流係以約3 mL/min/纖維至約15 mL/min/纖維的流率進行，例如約5 mL/min/纖維至約10 mL/min/纖維、約5 mL/min/纖維至約8 mL/min/纖維、約7 mL/min/纖維至約10 mL/min/纖維、或約8 mL/min/纖維至約10 mL/min/纖維。於一些實施方式中，該ATF灌流係以約3 mL/min/纖維、約4 mL/min/纖維、約5 mL/min/纖維、約6 mL/min/纖維、約7 mL/min/纖維、約8 mL/min/纖維、約9 mL/min/纖維、約10 mL/min/纖維、約11 mL/min/纖維、約12 mL/min/纖維、約13 mL/min/纖維、約14 mL/min/纖維、或約15 mL/min/纖維的流率進行。於其他實施方式中，該ATF灌流係以約50公尺/s至約320公尺/s，例如約50公尺/s至約250公尺/s、約50公尺/s至約200公尺/s、約100公尺/s至約320公尺/s、約100公尺/s至約250公尺/s、約200公尺/s至約320公尺/s、或約200公尺/s至約275公尺/s的每纖維流率進行。

於一些實施方式中，可優化灌流率以維持剪率以增加AAV產物釋放。由灌流引入的對細胞的剪應力可導致細胞破裂及／或AAV顆粒釋放。據此，可優化灌流率以維持一剪率，該剪率導致灌流培養物中AAV產物之穩定釋放。可於生產期期間於種種時間點收集或不斷收集以此方式在培養物中釋放的AAV，例如自滲透物呈通過灌流膜的自由AAV顆粒的形式。

於AAV生產之首12個小時、24個小時、36個小時、48個小時、60個小時、72個小時、84個小時、或96個小時，培養基交換可使用任何適合的基於灌流的或其他的培養基交換技術（包括ATF，如以上敘述的）完成。適於在本文中敘述的系統及方法之種種實施方式中使用的替代性灌流技術包括Xcellerex自動灌流系統（APS）（Cytiva）、KrosFlo® KPS TFF系統，例如KPS 700、或XCell ^TMATF 6（Repligen）、GEA Kytero®單次使用Pharma分離系統（GEA）、Prostak ^TM微過濾模組（Millipore）、Alfa Laval CultureOne ^TM（Alfa Laval）、CARR® Centritech分離系統，諸如CARR UniFuge®試驗或Centritech細胞8®（Pneumatic Scale Angelus）、Ksep® 6000S系統（Sartorius）、微流細胞滯留裝置（如於Kwon T.等人Sci Rep 7, 6703 (2017)中敘述的）、SciLog® SciPureTM系統（Parker）、聲音沉降系統（如於Coronel J.等人Front. Bioeng. Biotechnol., 2020年七月02日中敘述的）（Sonosep）、及／或EDO電系統（如於Wang, Zhaowei, "兩種用於灌流培養系統中的細胞滯留的方法（Two Approaches for Cell Retention in Perfusion Culture Systems）" (2009). ETD檔案. 304中敘述的）（American Piezo）。例如，可使用於2、4、6、或10過濾單位樣式的Repligen ATF系統，取決於規模及細胞密度。可使用替代性培養基交換技術，包括切向流過濾（TFF）及／或基於離心的技術。

較高的細胞密度可能需要較高的灌流、培養基交換、及／或廢物移除速率以維持某種細胞生長速率或存活率。細胞培養物中的細胞密度可隨時間改變。因此，於本文中敘述的系統及方法中可利用細胞專一性灌流率，其為一參數，其基於培養物之細胞密度定量灌流率。於一些實施方式中，本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法包含於生長期及／或生產期培養以約0.02 nL/細胞/日至約0.1 nL/細胞/日，例如約0.02 nL/細胞/日至約0.08 nL/細胞/日、約0.02 nL/細胞/日至約0.06 nL/細胞/日、約0.03 nL/細胞/日至約0.08 nL/細胞/日、約0.03 nL/細胞/日至約0.06 nL/細胞/日，例如約0.03 nL/細胞/日、約0.04 nL/細胞/日、約0.05 nL/細胞/日、或約0.06 nL/細胞/日的細胞專一性灌流率（CSPR）進行灌流。於一些實施方式中，本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法包含於生長期及／或生產期培養以約100 pL/細胞/日至約2000 pL/細胞/日的CSPR進行灌流，該範圍包括於100 pL/細胞/日至2000 pL/細胞/日中以及之間的所有整數。例如，該CSPR可係約100 pL/細胞/日至約1500 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約1000 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約900 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約800 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約700 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約600 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約500 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約400 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約300 pL/細胞/日、約100 pL/細胞/日至約200 pL/細胞/日。於一些實施方式中，該CSPR可係約150 pL/細胞/日至約750 pL/細胞/日，諸如約150 pL/細胞/日、約200 pL/細胞/日、約250 pL/細胞/日、約300 pL/細胞/日、約350 pL/細胞/日、約400 pL/細胞/日、約450 pL/細胞/日、約500 pL/細胞/日、約550 pL/細胞/日、約600 pL/細胞/日、約650 pL/細胞/日、約700 pL/細胞/日、或約750 pL/細胞/日。應了解給定系統中的CSPR會基於包括（例如）細胞密度的種種參數而改變。

於一些實施方式中，本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法包含於生長期及／或生產期培養以固定的灌流率進行灌流，無論細胞密度為何。 b.    細胞培養基及補充

本文中敘述的細胞培養物可在任何適用於正在培養的特定細胞的培養基中製備。於一些實施方式中，該培養基含有（例如）無機鹽、碳水化合物（例如糖，諸如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、或果糖）、胺基酸、維生素（例如B群維生素（例如B 12）、維生素A、維生素E、核黃素、硫胺素、及生物素）、脂肪酸及脂質（例如膽固醇及類固醇）、蛋白質及肽（例如白蛋白、運鐵蛋白、纖網蛋白、及胎球蛋白）、血清（例如包含白蛋白、生長因子、及生長抑制劑的組成物，諸如胎牛血清、新生牛犢血清、及馬血清）、微量元素（例如鋅、銅、硒、及三羧酸中間物）、水解產物（來自植物或動物來源的水解蛋白質）、及其等之組合。例示性適合細胞培養基包括最低必須培養基（MEM），諸如Eagle氏培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基（DMEM）、最低必須培養基阿爾法（MEM-阿爾法）、間質細胞基礎培養基（MSCBM）、Ham氏F-12培養基及Ham氏F-10培養基、DMEM/F12培養基、William式培養基E、RPMI-1640培養基、MCDB培養基、培養基199、Fisher氏培養基、Iscove氏改良Dulbecco氏培養基（IMDM）、及McCoy氏改良培養基。此外，可使用Ham R., McKeehan W., (1979) Meth. Enzymol, 58:44-93；Barnes及Sato, (1980) Anal. Biochem., 102 (2):255-70；U.S.專利第4,657,866、4,767,704、4,927,762、5,122,469、及4,560,655號；或國際公開第WO 90/03430及WO 87/00195號中敘述的培養基之任何者作為本文揭露的系統及方法中的培養基。此等培養基之任何者需要時可以以下者補充：激素及／或其他生長因子（諸如胰島素、運鐵蛋白、或表皮生長因子）、鹽（諸如氯化鈉、鈣、鎂、及磷酸鹽）、緩衝劑（諸如HEPES）、核苷（諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸如健他黴素）、微量元素（定義為通常以於微莫耳濃度範圍的最終濃度存在的無機化合物）、脂質（諸如亞麻油酸或其他脂肪酸）及其等之適合載劑、及葡萄糖或等效的能量來源。於一些實施方式中，該營養素培養基係無血清培養基、無蛋白質培養基、或化學性界定培養基。亦可以適當的濃度包括任何其他的必需補充物，其會是發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的。

於一些實施方式中，在生長期及／或生產期培養容器（或組合的生長／生產容器）中培養AAV PCL包含以營養素補充，例如使用饋料批式培養程序，其包含定期以補充物（例如新鮮培養基、胺基酸、及／或葡萄糖）補充培養物。於一些實施方式中，該補充至少每二日一次發生，例如一日一次、一日二次、一日三次、一日四次日、或更多次。於進一步實施方式中，該補充約一日一次發生。於一些實施方式中，該補充物包含胺基酸，例如一或多種胺基酸之混合物。於一些實施方式中，該補充物包含麩醯胺酸。於一些實施方式中，該補充物包含葡萄糖。於一些實施方式中，該補充物包含葡萄糖及麩醯胺酸。於一些實施方式中，每次添加的補充物之濃度係基於活細胞密度（例如於補充物添加時或緊接著補充物添加前測定的活細胞密度）決定。於一些實施方式中，該補充物之量（例如體積及／或濃度）基於積分細胞生長（ICG）（例如於生長期及／或生產期培養）決定。ICG可如（例如）於國際專利申請案公開第WO2020/154607號中敘述地計算。

於一些實施方式中，補充物包含約50 mM至約2 M的總胺基酸濃度。於某些實施方式中，該補充物包含至少50 mM的總胺基酸濃度。於一些實施方式中，該補充物包含約75 mM至約500 mM的總胺基酸濃度。於一些實施方式中，該補充物包含約50 mM至約1 M、約50 mM至約500 mM、約50 mM至約100 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM、約100 mM、約110 mM、約120 mM、約130 mM、約140 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、約200 mM、約250 mM、約300 mM、約350 mM、約400 mM、約500 mM、約750 mM、約800 mM、約1 M、約1.5 M、或約2 M的總胺基酸濃度。

於一些實施方式中，將營養素濃度維持於所欲的水平及／或將廢物維持於低水平，例如於生長期培養期間，例如於生長期培養之任何日期間，或於生產期培養期間。於一些實施方式中，將N-1培養中的葡萄糖、麩醯胺酸、麩胺酸、總胺基酸、乳酸、及／或氨之濃度維持於在於生長期及／或生產期培養之第0日的濃度之10倍內（例如在10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、或更少內）的水平。於一些實施方式中，此等分子之任何者之濃度係（例如）於培養之任何日時（例如）使用標準方法測量。 c.    容器容量/日

於一些實施方式中，本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法包含於生長期及／或生產期期間以一培養基交換率培養細胞，該培養基交換率以容器容量的培養基/日（VVD）表現。生長期培養可以大約1 VVD至約10 VVD的培養基交換率實施。例如，該生長期培養可以1 VVD、1.5 VVD、2 VVD、2.5 VVD、3 VVD、3.5 VVD、4 VVD、4.5 VVD、5 VVD、5.5 VVD、6 VVD、6.5 VVD、7 VVD、7.5 VVD、8 VVD、8.5 VVD、9 VVD、9.5 VVD、或10 VVD的培養基交換率實施。同樣，生產期培養可以大約1 VVD至約10 VVD的培養基交換率實施。例如，該生產期培養可以1 VVD、1.5 VVD、2 VVD、2.5 VVD、3 VVD、3.5 VVD、4 VVD、4.5 VVD、5 VVD、5.5 VVD、6 VVD、6.5 VVD、7 VVD、7.5 VVD、8 VVD、8.5 VVD、9 VVD、9.5 VVD、或10 VVD的培養基交換率實施。於一些實施方式中，該（等）生長及生產期培養係以在1 VVD、1.5 VVD、2 VVD、2.5 VVD、3 VVD、3.5 VVD、4 VVD、4.5 VVD、5 VVD、5.5 VVD、6 VVD、6.5 VVD、7 VVD、7.5 VVD、8 VVD、8.5 VVD、9 VVD、9.5 VVD、或10 VVD之間的培養基交換率實施。 d.細胞密度及存活率

於一些實施方式中，本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法包含培養細胞至至少1E06個活細胞/mL（vc/mL）、至少1E07 vc/mL、至少約1E08 vc/mL、或至少約1E09 vc/mL的目標細胞密度（例如以活細胞密度表現）。於一些實施方式中，本文中敘述的方法包含於生長期培養中培養該等細胞至約1E06 vc/mL至約50E06 vc/mL，例如約1E06 vc/mL、約2E06 vc/mL、約3E06 vc/mL、約4E06 vc/mL、約5E06 vc/mL、6E06 vc/mL、7E06 vc/mL、8E06 vc/mL、9E06 vc/mL、10E06 vc/mL、20E06 vc/mL、30E06 vc/mL、40E06 vc/mL、或50E06 vc/mL的目標細胞密度。於一些實施方式中，本文中敘述的方法包含於該生長期培養中培養該等細胞至約1E06 vc/mL、約1.1E06 vc/mL、約1.2E06 vc/mL、約1.3E06 vc/mL、約1.4E06 vc/mL、約1.5E06 vc/mL、約1.6E06 vc/mL、約1.7E06 vc/mL、約1.8E06 vc/mL、約1.9E06 vc/mL、約2E06 vc/mL、約2.1E06 vc/mL、約2.2E06 vc/mL、約2.3E06 vc/mL、約2.4E06 vc/mL、約2.5E06 vc/mL、約2.6E06 vc/mL、約2.7E06 vc/mL、約2.8E06 vc/mL、約2.9E06 vc/mL、約3E06 vc/mL、約3.1E06 vc/mL、約3.2E06 vc/mL、約3.3E06 vc/mL、約3.4E06 vc/mL、約3.5E06 vc/mL、約3.6E06 vc/mL、約3.7E06 vc/mL、約3.8E06 vc/mL、約3.9E06 vc/mL、約4E06 vc/mL、約4.1E06 vc/mL、約4.2E06 vc/mL、約4.3E06 vc/mL、約4.4E06 vc/mL、約4.5E06 vc/mL、約4.6E06 vc/mL、約4.7E06 vc/mL、約4.8E06 vc/mL、約4.9E06 vc/mL、約5E06 vc/mL、或大於5E06 vc/mL的目標細胞密度。於一些實施方式中，本文中敘述的方法包含於該生長期培養中培養該等細胞至約1E06 vc/mL至約1E07 vc/mL、約1E07 vc/mL至約1E08 vc/mL、或約1E08 vc/mL至約1E09 vc/mL的目標細胞密度。於一些實施方式中，本文中敘述的方法包含於該生長期培養中培養該等細胞至約1E06 vc/mL至約1.5E06 vc/mL、約1.5E06 vc/mL至約2E06 vc/mL、約2E06 vc/mL至約2.5E06 vc/mL、約2.5E06 vc/mL至約3E06 vc/mL、約3E06 vc/mL至約3.5E06 vc/mL、約3.5E06 vc/mL至約4E06 vc/mL、約4E06 vc/mL至約4.5E06 vc/mL、或約4.5E06 vc/mL至約5E06 vc/mL的目標細胞密度。

於一些實施方式中，本文中敘述的方法包含定期測定活細胞密度，例如至少每3日一次、每2日一次、一日一次、一日二次、或更頻繁，例如每分鐘一次、每分鐘二次、每分鐘三次、每分鐘四至十次、每小時一次、每小時二次、每小時三次、每小時四至十次、每秒一次、每秒二次、每秒三次、每秒四次、每秒五次、每秒六次、每秒七次、每秒八次、每秒九次、或每秒十次。 e.    細胞生長速率

於一些實施方式中，將細胞生長速率維持於接近正在培養的細胞株／殖株之最大生長速率的生長速率。本文中敘述的系統及方法可實現在正在培養的細胞株／殖株之最大生長速率之15%內（例如在15%、12.5%、10%、7.5%、5%、2.5%、1%、或更少內）的生長速率。

於一些實施方式中，最大生長速率係於在新鮮培養基中時及於其指數生長期期間測量的（例如於當營養素係足夠的且在培養物中無組分正造成顯著的生長抑制的時間點測量的）特定細胞株／殖株之生長速率。於一些實施方式中，總體生長速率取決於正在培養的特定細胞類型／殖株。於一些實施方式中，該細胞之總體生長速率係約0.2/日至約1/日，例如約0.3/日至約0.8/日、約0.4/日至約0.7/日、約0.5/日至約0.7/日、約0.4/日至約0.6/日、約0.2/日至約0.8/日、或約0.5/日至約1/日。於一些實施方式中，該總體生長速率係基於於培養之第零日時的細胞密度測定的。 f.    pH

於本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法之一些實施方式中，將生長期及／或生產期培養之pH維持於（例如）5及約9之間，例如約6.4至約8.2。例如，於一些實施方式中，將該生長期培養之pH維持於約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、或約8.2。於一些實施方式中，將該生產期培養之pH維持於約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、或約8.2。 g.    溶氧

於本文中敘述的使用灌流（例如強化的灌流）的改良的批式系統及方法之一些實施方式中，於生長期及／或生產期培養維持溶氧（DO）量以用於最優生長及或AAV生產。例如，可將DO量維持於10%至100%，例如於維持的50%設定點。 h.    培養持續期間

於一些實施方式中，將AAV生產細胞培養於生長期及／或生產期培養達4日至12日，例如4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、或13日。於一些實施方式中，維持該生產期培養達2或更多日的持續期間，例如2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、或14日。

於一些實施方式中，將生產期培養維持於允許AAV之生產的條件下。於一些實施方式中，在生產期培養物中添加AAV之一或多種組分以使得於該生產期培養的細胞係複製勝任的且可生產AAV。於一些實施方式中，於該生產期培養物中添加輔助病毒，例如腺病毒（例如Ad5輔助病毒）或疱疹病毒。

於某些實施方式中，方法包含於生產期培養中培養細胞達小於一週，例如小於7日，例如小於6日，例如5日、4日、3日、2日、1日、或更少，例如2-5日，例如2、3、4、或5日。 i.     培養體積

於一些實施方式中，生長期培養係以任何對於AAV生產細胞生長期而言適當的規模實施。例如，該生長期培養可以次公升至6000L規模實施。據此，本發明之系統及方法可在用於生長期培養的生物反應器中利用次公升、1L、2L、5L、10L、20L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、5500L、或6000L容器。

於一些實施方式中，任何生產期前培養係以任何對於AAV生產細胞生長期而言適當的規模實施。例如，任何生產期前培養可以次公升至6000L規模實施。據此，本發明之系統及方法可在用於生產前或生長期培養的生物反應器中利用次公升、1L、2L、5L、10L、20L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、5500L、或6000L容器。

於一些實施方式中，生產期培養係以任何對於AAV生產而言適當的規模實施。例如，該生產期培養可以次公升至6000L規模實施。據此，本發明之系統及方法可在用於生產期培養的生物反應器中利用次公升、1L、2L、5L、10L、20L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、5500L、或6000L容器。

於一些實施方式中，生長及生產期培養係在組合的生長／生產容器中以任何對於AAV生長及生產而言適當的規模實施。例如，該生長／生產期培養可在相同的組合的生長／生產容器以次公升至6000L規模實施。據此，本發明之系統及方法可在用於生產期培養的生物反應器中利用次公升、1L、2L、5L、10L、20L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、5500L、或6000L容器。 j.     下游程序

於一些實施方式中，本文中敘述的方法進一步包含自生產期培養物收集或收穫AAV產物。可使用收集或分離病毒顆粒之標準方法，例如包括但不限於過濾或離心。可利用進一步下游純化程序以純化所收集的AAV產物。

根據本文中敘述的方法，可測定AAV效價（例如於N培養），例如對任何一或多日的N培養。例示性AAV效價測量係載體基因體副本/細胞（GC/細胞）。GC/細胞可藉由發明所屬技術領域中的標準方法測定，例如包括但不限於墨點轉漬法、定量性PCR或ddPCR、光譜法、或螢光測定法。參見（例如）Dorange等人細胞基因治療洞悉（Cell Gene Therapy Insights）4.2(2018): 119-129。

於一些實施方式中，本文中敘述的方法能夠生產以下AAV效價（例如於生產期培養）：至少約1E09 vg/mL、至少約2E09 vg/mL、至少約3E09 vg/mL、至少約4E09 vg/mL、至少約5E09 vg/mL、至少約6E09 vg/mL、至少約7E09 vg/mL、至少約8E09 vg/mL、至少約9E09 vg/mL、至少約1E10 vg/mL、至少約2E10 vg/mL、至少約3E10 vg/mL、至少約4E10 vg/mL、至少約5E10 vg/mL、至少約6E10 vg/mL、至少約7E10 vg/mL、至少約8E10 vg/mL、至少約9E10 vg/mL、至少約1E11 vg/mL、至少約2E11 vg/mL、至少約3E11 vg/mL、至少約4E11 vg/mL、至少約5E11 vg/mL、至少約6E11 vg/mL、至少約7E11 vg/mL、至少約8E11 vg/mL、至少約9E11 vg/mL、至少約1E12 vg/mL、至少約2E12 vg/mL、至少約3E12 vg/mL、至少約4E12 vg/mL、至少約5E12 vg/mL、或更大。

於本文之揭露內容中，當指出一元件或組分係包括在所詳述的元件或組分之列表中及／或選自所詳述的元件或組分之列表時，應了解該元件或組分可係所詳述的元件或組分之任一者，或該元件或組分可選自由所詳述的元件或組分之二或多者組成的群組。

進一步，應了解本文中敘述的組成物、系統、或方法之元件及／或特徵可以各種各樣的方式組合而不偏離本文之揭露內容之精神及範圍，無論於本文中明確指出或未明確指出。例如，當提及特定化合物或系統組分時，該化合物或系統組分可用於本文之揭露內容之組成物／系統之種種實施方式中及／或本文之揭露內容之方法中，除非基於前後文應以另外的方式理解。換言之，於本文之揭露內容中，已以使寫出並畫出清楚且明確的揭露內容成為可能的方式敘述及描繪實施方式，但意欲使且應領會到實施方式可以種種方式組合或分離而不偏離本文之教示內容。例如，應領會到本文中敘述及描繪的所有特徵可應用於本文中敘述及描繪的發明之所有方面。

應理解表現方式「之至少一」包括該表現方式後所詳述的目標之個別各者及所詳述的目標之二或多者之種種組合，除非基於前後文及使用應以另外的方式理解。應將組合二或多個所詳述的目標的表現方式「及／或」理解成具有相同的意義，除非基於前後文應以另外的方式理解。

使用術語「包括（include、includes、或including）」、「具有（have、has、或having）」、或「含有（contain、contains、或containing）」（包括其等之文法相等物）應被一般地理解成開放式的而非限制性的，例如不排除另外的未詳述元件或步驟，除非另加具體陳述或基於前後文應以另外的方式理解。

應了解在一系統或程序中的步驟之順序或進行某些行動之順序係無關緊要的，只要本文之揭露內容之目標仍可實行。此外，本文中敘述的系統及方法之許多實施方式中可同時實施二或多個步驟或行動。

於本文中，任何及所有實例或例示性語言（例如「諸如」或「包括」）之使用僅意欲用於更好地說明本文揭露的發明而非限制該等發明之範圍，除非聲言。不應將本說明書之任何語言理解成表明任何未聲言的元件對於實施本文揭露的用於AAV生產的系統及方法而言係必要的。 實施例

參照以下實施例可更輕易地了解現正在一般性地敘述的本發明之系統及方法，該等實施例僅為了說明本文之揭露內容之某些方面及實施方式之目的而包括，而非意欲限制本文之揭露內容。 材料及方法

於AAV生產細胞培養中，代謝物（葡萄糖、L-麩醯胺酸、氨、及乳酸）係藉由Nova生物-輪廓Flex2（Nova Biomedical）評估。於AAV生產細胞培養中，細胞密度係藉由Vi-細胞XR（Beckman-Coulter）評估。AAV效價係藉由DNA酶抗性顆粒（DRP）分析藉由針對特定AAV基因治療產物的定量性DNA聚合酶連鎖反應（qPCR）來定量。腺病毒副產物亦藉由針對特定腺病毒基因（例如E2A）的DRP-qPCR來評估。 實施例 1 ：單獨於批次模式下增加細胞密度不足以增加 AAV 體積產量

於批式AAV生產模式下測試高細胞密度生產以確定增加細胞密度是否可改善AAV體積產量。確定了於批次模式運作下增加細胞密度負面地影響AAV生產力。

將HeLa生產細胞以1.3E06個活細胞/毫升（vc/mL）、3.15E06 vc/mL、或5.0E06 vc/mL接種在生物反應器（2L w.v.）中並以第5型腺病毒（Ad5）感染其以於批次模式運作下起始用於基因治療產品的AAV生產。AAV殼體係一演化支E殼體，AAV hu37。此程序中的批次模式條件利用1.3E06 vc/mL目標接種密度。增加細胞密度2倍及4倍（至3.15E06及5E06 vc/mL）分別導致體積rAAV產量之大約10倍及100倍減低（ 圖 4）及細胞專一性rAAV生產力之大約10倍及100倍減低（ 圖 5）。

觀察到營養素（諸如葡萄糖及L-麩醯胺酸）之快速耗盡及廢物副產物（諸如乳酸及氨）之顯著增加。因此假設營養素耗盡及／或廢物堆積導致AAV生產力減低（數據未顯示）。

此實施例展示批式AAV生產方法於較高的細胞密度下無法支持AAV生產。確實，對於AAV生產，於批次模式下使用接種密度之4倍增加來增加細胞密度導致AAV產量之超過100倍的減低。 實施例 2 ：於批次模式下於較高的細胞密度下減低 pH 增加 AAV 生產力

嘗試於批次模式下於較高的密度下（例如高於約1E06 vc/mL）改善AAV生產力。確定了於批次模式下於較高的細胞密度下減低pH增加AAV生產力並減低廢物堆積。於批次模式運作下使用pH 7.4、7.6、或7.8的pH設定點，將HeLa生產細胞以1.3E06 vc/mL或3.15E06 vc/mL接種在生物反應器（2L w.v.）中並以Ad5感染其以起始AAV生產。於批次模式下於1.3E06 vc/mL下，7.6至7.8的pH顯示最高的rAAV產量（雖然相較於在pH 7.4看到的產量並未顯著不同）（ 圖 6及 圖 7，實心長條）；然而，於3.15E06 vc/mL的細胞密度下，7.4的pH顯示較高的AAV體積（ 圖 6，空心長條）及專一性生產力（ 圖 7）產量。於較高的細胞密度（3.15E06 vc/mL）及低pH（7.4）下，AAV生產力增加，其與廢物副產物堆積減低（乳酸）重合（ 圖 8）。此暗示AAV生產力可能受廢物副產物堆積抑制。減低廢物副產物之堆積（例如降低pH以降低乳酸量）及／或增加營養素利用的程序及培養基／饋料改良可於較高細胞密度的培養中導致AAV生產能力改善。 實施例 3 ： AAV 及腺病毒細胞釋放動力學使灌流能力成為可能

於以腺病毒感染後於數個2L生物反應器（AAV，n=17及Ad5，n=25）批次模式試驗中隨時間監視AAV及Ad5效價及細胞存活率。已知使用腺病毒的細胞感染會透過E1A、E3、及E4基因誘導細胞凋亡，導致細胞胞溶（參見（例如）Jiang, Hong, 等人J. Virology 85.10 (2011): 4720-4729及Chinnadurai, G.病毒學研討會（Seminars in VIROLOGY）. Vol. 8. No. 5. Academic Press, 1998）。作圖%病毒釋放vs.感染後日數，觀察到對於感染後首2日，大部分的AAV及腺病毒維持與細胞內級分連接在一起（ 圖 9A）。自第2日至第3日至第4日，觀察到非細胞連結的（即自由的）AAV及腺病毒顆粒/日之大約30%增加。作圖rAAV效價vs.感染後日數（ 圖 9B）闡明感染後rAAV之至上清液中的釋放之起始。此外，觀察到於生產期間AAV及Ad5釋放與細胞死亡之強相關性（ 圖 10），此暗示病毒釋放源自細胞胞溶。AAV及腺病毒釋放動力學對於了解何時起始灌流及維持灌流多久以最大化產物產量及回收而言很重要。基於來自HeLa生產細胞的以上發現（實施例1及2），確認於不同密度下基於腺病毒細胞吸收的最優灌流起始時間點大約在1至2 hpi之間（數據未顯示）。此外，維持灌流達至多48 hpi以避免導因於灌流培養基交換的顯著產物損失，因為於以輔助病毒感染後首2日大部分的AAV維持在細胞內。

此等結果亦展示可將最優收穫延長至超過4日以支持最大的自培養上清液的產物回收，因為於感染後4日後僅70%-80%的AAV被釋放且將收穫延長至5日、6日、7日、等等、或更長可能很重要，取決於特定的經優化培養AAV動力學。 實施例 4 ：培養基交換率之灌流程序優化

於批次模式運作下，基於營養素消耗及廢物堆積速率（數據未顯示），發現於3E06 vc/mL及5E06 vc/mL下的細胞專一性灌流率（CSPR）係在0.5 nL/細胞/日至0.6 nL/細胞/日之間。為於增加的細胞密度下針對改良的批式AAV生產評估灌流模式運作，將HeLa生產細胞以5E06 vc/mL接種在具有XCell交替切向流2（Repligen、ATF ^TM2）系統的2L生物反應器中並以腺病毒輔助病毒感染其以起始AAV生產。感染後二個小時時，以0、1容器容量/日、或2.5容器容量/日（VVD）的生產培養基／饋料混合物灌流培養基交換率起始灌流達感染後48個小時並與批次模式對照程序作比較。觀察到隨VVD增加rAAV體積產量增加（ 圖 11A）且專一性生產力增加（ 圖 12）。相較於批次模式對照程序，於2.5 VVD下觀察到最高水平，其中體積產量增加大約3倍且細胞專一性生產力係大約60%。因此，測試至多達10 VVD的較高的VVD條件。具體言之，於10 VVD下以12E06個細胞/mL至13E06個細胞/mL的細胞密度評估體積生產力。相較於2.5 VVD條件，體積生產力於增加的灌流率及細胞密度條件下增加（ 圖 11B），且於第2日至第5日之各者相較於2.5 VVD條件觀察到細胞外rAAV產物增加。

於灌流交換期間於0或1VVD的高細胞密度培養下葡萄糖及麩醯胺酸量快速耗盡但於2.5 VVD下被維持達48個小時，此與批次模式對照程序類似（ 圖 13，左二子圖）。乳酸量於0 VVD條件下顯著增加，但於1及2.5 VVD條件下與批次模式對照組相當（ 圖 13，右上子圖）。相較於0及1 VVD條件，於高密度灌流條件下的所有銨濃度皆較高但於2.5 VVD條件下維持較低（ 圖 13，右下子圖），此表明藉由透過灌流培養基交換減低廢物堆積及營養素耗盡，在2-48 hpi之間，該改良的批式程序可於使用HeLa生產細胞及輔助病毒的AAV生產系統中使高細胞密度生產條件成為可能。

此等數據顯示增加灌流培養基交換率於高密度下改善細胞專一性AAV生產力且增加rAAV體積產量。 實施例 5 ：改良的批式程序之至 50L 的規模擴大

使用改良的批式程序，於2L規模下使用ATF2且於50L規模下使用ATF6，於擴大的操作參數下進行AAV生產，並與於2L規模下的批次模式對照程序比較生產力。於2L及50L規模下使用該改良的批式程序維持AAV體積生產力且相較於批次模式對照組實現體積產量之大約2.3倍改善（ 圖 14）（使用改良的批式程序的3.3E11 GC/mL vs.使用批次模式程序的1.4E11 GC/mL），且相較於批次模式程序細胞專一性生產力係大約60%（ 圖 15）。

此等數據展示該用於AAV生產的改良的批式程序係可擴大的且一致地產生體積產量之成倍改善，儘管專一性生產力有不多的減低。

如於 圖 16中顯示的，相較於批次模式對照程序，於改良的批式程序中於生產期期間於1、2、3、及4 dpi時活細胞密度（VCD）增加。相較於批次模式對照程序，細胞存活率輪廓於2L及50L改良的批式程序中係類似的（ 圖 17）。

代謝物分析展示相較於批次模式對照程序該改良的批式程序維持類似的營養素及廢物量。例如，相較於批式程序，葡萄糖及L-麩醯胺酸量於整個2 dpi維持類似量（ 圖 18），且乳酸及銨之堆積與批式程序類似（ 圖 19）。此等數據展示該改良的批式程序使以下者成為可能：相較於批次模式對照程序，透過維持關鍵營養素消耗及廢物堆積速率以可擴大的方式增加活細胞密度，導致較高的AAV生產力/體積。

進一步，如於 圖 20A中顯示的，發現總經測定含有完整載體基因體的殼體之百分比（由AUC分析評估）於2L與經擴大的改良的批式程序中係一致的，此顯示該改良的批式程序不降低AAV包裝效能。事實上，進一步分析展示利用本文中敘述的改良的批式程序的包裝效能隨VVD增加而改善。如於 圖 20B中顯示的，相較於對照組批式生產程序，使用該改良的批式程序，中間體對比完整AAV顆粒之比例隨VVD增加而降低。所觀察到的隨VVD增加的完整物種之豐富化及中間體物種之減少暗示額外的廢物移除／營養素豐富化對於AAV產物品質係有益的。 實施例 6 ：改良的批式 AAV 生產程序 係通用的且可以不同的培養基、所關注的載體基因體／基因、及 AAV 殼體血清型實施

使用計劃A、培養基組成物A、及殼體A（一演化支E殼體，AAV hu37）開發及優化該改良的批式程序並比較其與不同的所關注的基因（計劃B）及不同的殼體血清型B（演化支E，AAV8）及不同的培養基組成物B。於此二程序（A及B）中皆觀察到AAV體積生產力之2.3倍-3倍促升（ 圖 21A，左子圖），此表明吾人之技術可通用地應用於其他AAV程序、培養基及培養條件、及其他殼體血清型。相較於批次模式對照組，使用程序A，觀察到大約60%細胞專一性生產力，而使用程序B，觀察到大約80%細胞專一性生產力（ 圖 21A，右子圖），此表明程序參數及培養基組成物之優化可導致與批次模式AAV細胞專一性生產速率更密切相似的較高的生產性生產條件。

使用不同的計劃（計劃C）進一步測試該改良的批式程序，該計劃具有與計劃A及B不同的所關注的基因、與計劃A及B不同的培養基組成物、及與計劃A及B不同的殼體（一演化支F殼體，AAV9）；結果係與批次模式程序作比較。使用該改良的批式程序，感染之起始細胞密度自1.17E6個細胞/mL增加至4.5E6個細胞/mL。使用本文中敘述的改良的批式程序，於收穫時，產量自7.1E10 GC/mL增加至3.1E11 GC/mL，其為大約4倍增加（ 圖 21B）。細胞健康及代謝物輪廓（數據未顯示）與於使用該改良的批式程序的其他試驗中看到者類似。

此等數據顯示該改良的批式方法學（例如強化的灌流）可使用不同的培養基條件、所關注的載體基因體／基因、及AAV殼體血清型應用於廣大範圍的產物、程序、及生產條件。 實施例 7 ：乳酸及氨廢物副產物抑制 AAV 生產

如於實施例1中敘述的，於批次模式AAV生產中高細胞密度導致包括乳酸及氨／銨的廢物副產物形成顯著增加。為測定此等廢物副產物之對AAV生產的影響，於批式AAV生產模式下使用不同量的氨、乳酸、或兩者測試生產。 圖 22 顯示增加的乳酸（30 mM）（於 圖 22中以「高Lac」表示）或增加的氨（3 mM）（於 圖 22中以「高NH4」表示）減低rAAV產量至對照組rAAV收穫產量條件之大約60%，而加入增加的乳酸及氨兩者（於 圖 22中以「兩者」表示）減低rAAV產量至對照組rAAV收穫產量條件之大約35%。此實施例確認高細胞密度AAV生產方法需要有效的廢物副產物移除或減低以實現最優產量。 實施例 8 ：專一性生產力隨 CSPR 增加而增加

如於 圖 23中顯示的，將細胞專一性灌流率自150 pL/細胞/日增加至750 pL/細胞/日導致專一性生產力增加（以基因體副本（GC）/細胞測量）。觀察到至多達大約750 pL/細胞/日的AAV細胞專一性產量（GC/細胞）與CSPR（pL/細胞/日）之強線性相關性，R ²= 0.91。未觀察到隨灌流率增加細胞專一性生產力有明顯上限（或高原期），此暗示於吾人之系統內大於750 pL/細胞/日的CSPR速率之額外增加會持續增加AAV生產力。此等數據展示迄今測試的條件未顯露細胞專一性生產力之高原期，闡明本文中敘述的改良的批式程序可實現細胞專一性生產力之進一步增加，可能超過使用批次模式AAV生產程序看到者。 實施例 9 ：改良的批式 AAV 生產程序可顯著降低貨品之成本

貨品之成本（COG）預估展示藉由使用本文中敘述的改良的批式（例如強化的灌流）生產程序降低與AAV生產聯繫在一起的成本的潛力。如於 圖 24A– 圖 24C中顯示的，即使導致較高的每AAV生產批次的前期成本，預估每體積的生產力之獲利會大於運作該改良的批式程序所需的材料及運作成本之增加。因此，使用本文中敘述的改良的批式程序可實現更少的生產批次、更短的產生材料所需的時段、及更低的總體COG。圖24A顯示相較於批式生產，於該改良的批式程序中每AAV產量所需的大約預估COG降低。圖24B顯示相較於批式生產，於該改良的批式程序中每AAV產量所需的大約生產批次數降低。圖24C顯示相較於批式生產，於該改良的批式程序中每數量的生產批次所需的大約預估COG降低。於 圖 24A至 圖 24C中，菱形或圓形代表本文中敘述的改良的批式系統，而正方形代表批式運作條件。 實施例 10 ：取代混合的生長培養基的轉換灌流排程

於N-生長期中使用混合的生長及生產培養基以擴大細胞密度及平衡細胞之生長及生產需求。然而，使用混合的培養基有缺點，包括缺少混合的培養基之穩定性數據、混合的培養基之製備所需時間及總可用率、及於生長期期間較高的培養基消耗。為確定定時自生長轉換成生產培養基是否可避免對於混合的培養基的需要，感染前24 hr以2.5 VVD將生產培養基灌流至反應器。在轉換成生產培養基對比利用混合的培養基之間未觀察到rAAV效價之顯著差異，無論是在經釋放rAAV或細胞內rAAV方面皆如此（ 圖 25），此顯示於感染前轉換成灌流培養基可取代對於混合的培養基的需要。

儘管有於rAAV生產力的獲利，基於灌流的生產程序所需的大體積的培養基仍為一主要限制。例如，基於灌流的生產可能每輪需要8.5或更大容器容量的灌流培養基，或於2,000 L生產規模下17,000 L的培養基。因此，為研究限制培養基消耗的方法，使用轉換灌流排程測試於生長期中減低灌流之速率。 圖 26顯示可將於生長期期間的灌流率減低至約0.5 VVD（自約1 VVD）且可將於轉換期期間的灌流率減低至約1.5 VVD（自約2.5 VVD），此代表每批次節省約3,000 L的培養基，而不損失效價。於圖26中，VVD條件1係於生長期中1 VVD接著於轉換期中2.5 VVD；條件2係於生長期中1 VVD且於轉換期中1.5 VVD；條件3係於生長期中0.5 VVD且於轉換期中2.5 VVD；且條件4係於生長期中0.5 VVD且於轉換期中1.5 VVD。 實施例 11 ：改良的批式程序之至 250L 規模的規模擴大

實施例5顯示該改良的批式程序之至50L規模的成功的規模擴大。為進一步評估該改良的批式rAAV生產程序之可擴大性，於250L下使用ATF6以擴大的操作參數進行測試試驗性規模試驗並與於2L規模下的批次模式對照程序（於 圖 27中以「批式」表示）、於2L下的該改良的批式程序（於 圖 27中以「MB-2L」表示）、於50L下的該改良的批式程序（於 圖 27中以「MB-50L」表示）、及於250L下的該改良的批式程序（於 圖 27中以「MB-250L」表示）比較生產力。於50L試驗中，於生長期中使用混合的生長及生產培養基。於250L試驗中，對於生長期使用1 VVD灌流率且對於轉換期使用2.5 VVD。收穫時的rAAV效價顯示使用增加大約3至4倍的活細胞密度（VCD）實現了體積產量之大約3至4倍增加。如於 圖 27中顯示的，對比於批式程序（＜2E11 GC/mL），該改良的批式程序（於 圖 27及 圖 28中縮寫成「MB」）於250L規模下（大約5E11 GC/mL）維持類似於2L規模的產量獲利。如於 圖 28中顯示的，於250L規模下維持與於50L及2L規模下看到者類似的細胞專一性生產力。

此等數據進一步確認該用於AAV生產的改良的批式程序係可擴大的且一致地產生體積產量之成倍改善，儘管專一性生產力有不多的減低。

無

本文揭露的系統及方法之以上及其他目標、特徵、及優點基於以下較佳實施方式之敘述會變得很明顯，如所附圖式闡明的。於相對應的圖式中符號類似的元件識別共同的特徵。

[ 圖 1]係用於AAV生產的實例批次模式程序（即「批次模式對照程序」）之示意圖。

[ 圖 2]係根據本文中敘述的使用灌流的改良的批式系統及方法的用於AAV生產的實例程序之程序流程圖。

[ 圖 3]係根據本文中敘述的使用灌流的改良的批式系統及方法的用於AAV生產的實例程序之示意圖。

[ 圖 4]係批次模式對照程序中的體積rAAV產量之長條圖表現。此長條圖顯示批次模式對照程序中體積rAAV產量隨著接種密度增加而減低。

[ 圖 5]係批次模式對照程序中的細胞專一性生產力之長條圖表現。此長條圖顯示批次模式對照程序中細胞專一性生產力隨著接種密度增加而減低。

[ 圖 6]係批次模式對照程序中的pH之對體積rAAV產量的功效之長條圖表現。此長條圖顯示於批次模式對照程序中於1.3E06（圖例中以「1.3」顯示）及3.15E06（圖例中以「3.15」顯示）接種密度下pH之對體積rAAV產量的功效。

[ 圖 7]係批次模式對照程序中的pH之對細胞專一性生產力的功效之長條圖表現。此長條圖顯示於批次模式對照程序中於1.3E06（圖例中以「1.3」顯示）及3.15E06（圖例中以「3.15」顯示）接種密度下pH之對細胞專一性生產力的功效。

[ 圖 8]係顯示批次模式對照程序中的於1.3E06及3.15E06接種密度下pH之對乳酸之堆積的功效的圖。（於圖例中使用的縮寫：1.3E06接種密度及pH 7.4係以「1.3, 7.4」表示；1.3E06接種密度及pH 7.6係以「1.3, 7.6」表示；1.3E06接種密度及pH 7.8係以「1.3, 7.8」表示；3.15E06接種密度及pH 7.4係以「3.15, 7.4」表示；3.15E06接種密度及pH 7.6係以「3.15, 7.6」表示；3.15E06接種密度及pH 7.8係以「1.3, 7.8」表示）。

[ 圖 9A]係顯示批次模式對照程序中的隨時間的病毒釋放（AAV及輔助病毒）之百分比的長條圖。 [ 圖 9B]係顯示感染後至上清液中的rAAV釋放的長條圖。

[ 圖 10]係顯示批次模式對照程序中的相較於培養物中死細胞之百分比的病毒釋放（AAV及輔助病毒）之百分比的圖。

[ 圖 11A]係該改良的批式AAV製造程序及批次模式對照程序中的rAAV體積產量之長條圖表現。此圖顯示相較於批次模式對照程序該改良的批式AAV製造程序中rAAV體積產量隨VVD增加而增加。 [ 圖 11B]係比較低灌流率對比高灌流率程序的rAAV體積產量之長條圖表現。此圖顯示rAAV體積產量隨著VVD及細胞密度進一步增加而進一步增加。

[ 圖 12]係該改良的批式AAV製造程序中細胞專一性生產力之長條圖表現。此圖顯示該改良的批式AAV製造程序中細胞專一性生產力隨著VVD增加而增加。

[ 圖 13]係顯示使用於0、1、及2.5 VVD的培養基交換率的改良的批式程序中營養素量（葡萄糖及麩醯胺酸，左上及左下子圖）以及廢物量（乳酸及銨，右上及右下子圖）的長條圖。

[ 圖 14]係顯示相較於2L批次模式對照程序使用於2L及擴大的培養體積的改良的批式程序的體積rAAV產量的長條圖。

[ 圖 15]係顯示相較於2L批次模式對照程序使用於2L及擴大的培養體積的改良的批式程序的細胞專一性生產力的長條圖。

[ 圖 16]係顯示相較於2L批次模式對照程序使用於2L及擴大的培養體積的改良的批式程序的活細胞密度（VCD）的圖。

[ 圖 17]係顯示相較於2L批次模式對照程序使用於2L及擴大的培養體積的改良的批式程序的細胞存活率的圖。

[ 圖 18]係顯示相較於2L批次模式對照程序於2L及擴大的培養體積的改良的批式程序中營養素量（葡萄糖，左圖及麩醯胺酸，右圖）的圖。

[ 圖 19]係顯示相較於2L批次模式對照程序於2L及擴大的培養體積的改良的批式程序中廢物量（乳酸，左圖及銨，右圖）的圖。

[ 圖 20A]係顯示相較於2L批次模式對照程序於2L及擴大的培養體積的改良的批式程序中藉由分析性超離心（AUC）分析評估的完整AAV殼體之百分比的圖。 [ 圖 20B]係顯示使用不同的容器容量/日（VVD）條件的中間體對比完整的AAV顆粒之比率的圖。

[ 圖 21A]及 [ 圖 21B]顯示利用不同的所關注培養基組成物、殼體血清型、及載體基因體／基因的該改良的批式程序之使用。 [ 圖 21A]係顯示於不同計劃、培養基、及殼體條件（A及B）下使用批次模式對照程序（「批式」）對比改良的批式程序（「Perf」）的標準化體積rAAV產量（左圖）及專一性生產力（右圖）的圖。兩圖中的圖例表示以1E6 GC/mL計的rAAV效價（左圖之y軸以0.00 GC/mL起始至3.50E6 GC/mL且右圖之y軸以0.00 GC/mL起始至1.40E06 GC/mL）。 [ 圖 21B]係顯示使用另外的計劃、培養基、及殼體條件（「程序C」）的批次模式與該改良的批式程序（圖中縮寫成「HDI」）間的收穫產量的圖。

[ 圖 22]係顯示標準化rAAV收穫產量的圖。此圖顯示AAV生產中乳酸及／或氨之存在減低rAAV收穫產量。

[ 圖 23]係顯示隨著至多達大約750 pL/細胞/日的細胞專一性灌流率（CSPR（pL/細胞/日））的AAV細胞專一性產量（GC/細胞）之R ²分析的圖。

[ 圖 24A]至 [ 圖 24C]顯示本文中敘述的改良的批式程序（例如強化的灌流）降低rAAV貨品之生產成本（COG）預估。 [ 圖 24A]係顯示每AAV產量（以基因體副本數/毫升（GC/mL）計）所需的大約預估COG（每患者劑量銷售的貨品之成本）的圖。 [ 圖 24B]係顯示每AAV產量（GC/mL）所需的大約生產批次數的圖。 [ 圖 24C]係顯示每生產批次數所需的大約預估COG的圖。於 [ 圖 24A]至 [ 圖 24C]中，菱形或圓形代表本文中敘述的改良的批式系統（例如強化的灌流），而正方形代表批式運作條件。

[ 圖 25]係顯示使用混合的培養基對比排定培養基轉換的rAAV效價比較的圖。此圖中的實線代表釋放至上清液中的rAAV且此圖中的虛線代表細胞內rAAV。

[ 圖 26]係顯示於不同的排定培養基轉換條件（VVD條件1-4）下的收穫效價比較的圖。此圖顯示於不同的排定培養基轉換條件下收穫效價比較被維持同時培養基消耗率減低。

[ 圖 27]係批式及HDI程序之收穫rAAV產量之圖表現。此圖比較於批次模式下於2L對比使用該改良的批式程序（此圖之標題中縮寫成「HDI」）於2L（此圖中以MB-2L表示）、50L（此圖中以MB-50L表示）、及250L（此圖中以MB-250L表示）的收穫rAAV產量。

[ 圖 28]係批式及HDI程序之細胞專一性rAAV生產力之圖表現。此圖比較於批次模式下於2L對比使用該改良的批式程序（此圖之標題中縮寫成「HDI」）於2L（此圖中以MB-2L表示）、50L（此圖中以MB-50L表示）、及250L（此圖中以MB-250L表示）的細胞專一性rAAV生產力。

無

Claims (96)

1. 一種生產重組腺相關病毒（rAAV）之方法，其包含：  (a)    在生長容器中使用灌流為培養物補充新鮮營養素及／或移除廢物來培養AAV生產宿主細胞至目標細胞密度，其中該等AAV生產宿主細胞包含編碼一或多種AAV組分的遺傳物質； (b)   在步驟(a)之AAV生產宿主細胞中起始一或多種輔助病毒功能之表現以起始rAAV生產；及 (c)    在生產容器中使用灌流為培養物補充新鮮營養素及／或移除廢物來培養步驟(b)之AAV生產宿主細胞， 從而生產該rAAV。
2. 如請求項1之方法，其中該等AAV生產宿主細胞係昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
3. 如請求項2之方法，其中該等AAV生產宿主細胞係哺乳動物細胞。
4. 如請求項3之方法，其中該等哺乳動物細胞係HeLa細胞、Cos-7細胞、HEK293細胞、A549細胞、BHK細胞、Vero細胞、RD細胞、或ARPE-19細胞。
5. 如請求項1-4中任一項之方法，其中該等AAV生產宿主細胞包含AAV生產細胞株（PCL），該AAV PCL包含編碼一或多種AAV組分的遺傳物質，該遺傳物質穩定地併入該AAV生產宿主細胞之基因體中。
6. 如請求項1-5中任一項之方法，其中該AAV PCL包含一或多個基因修改以降低一或多個基因及／或蛋白質之表現及／或活性以降低乳酸及／或氨之生產或堆積。
7. 如請求項1-6中任一項之方法，其中步驟(a)中的目標細胞密度係至少約1E06個活細胞/mL（vc/mL）。
8. 如請求項1-7中任一項之方法，其中步驟(a)中的目標細胞密度係在1E06 vc/mL至5E07 vc/mL之間。
9. 如請求項1-7中任一項之方法，其中步驟(a)中的目標細胞密度係約1E06 vc/mL、約2E06 vc/mL、約3E06 vc/mL、約4E06 vc/mL、約5E06 vc/mL、約6E06 vc/mL、約7E06 vc/mL、約8E06 vc/mL、約9E06 vc/mL、約1E07 vc/mL、約1.1E07 vc/mL、約1.2E07 vc/mL、約1.3E07 vc/mL、約1.4E07 vc/mL、約1.5E07 vc/mL、約1.6E07 vc/mL、約1.7E07 vc/mL、約1.8E07 vc/mL、約1.9E07 vc/mL、或約2E07 vc/mL。
10. 如請求項1-9中任一項之方法，其中步驟(a)中的目標細胞密度係約3.15E06 vc/mL或約5.0E06 vc/mL。
11. 如請求項1-10中任一項之方法，其中該生產容器具有在1L至12000L之間的容量。
12. 如請求項1-11中任一項之方法，其中該生產容器具有1L容量、2L容量、5L容量、10L容量、20L容量、50L容量、100L容量、150L容量、200L容量、250L容量、500L容量、1000L容量、1500L容量、2000L容量、2500L容量、3000L容量、3500L容量、4000L容量、4500L容量、5000L容量、5500L容量、6000L、或12000L容量。
13. 如請求項1-12中任一項之方法，其中該生長容器及該生產容器係組合的生長／生產容器。
14. 如請求項1-13中任一項之方法，其中該一或多種AAV組分包含治療性有效負載（payload）或轉殖基因、一個反向末端重複序列（ITR）或二個ITR、一或多種由AAV rep基因編碼的AAV複製及／或包裝蛋白、及／或一或多種由AAV cap基因編碼的AAV結構殼體蛋白。
15. 如請求項1-14中任一項之方法，其中步驟(b)包含以輔助病毒感染步驟(a)之細胞。
16. 如請求項1-14中任一項之方法，其中步驟(b)包含誘導一或多種由該等AAV生產宿主細胞中的遺傳物質編碼的輔助病毒功能之表現。
17. 如請求項15之方法，其中該輔助病毒係腺病毒。
18. 如請求項17之方法，其中該輔助病毒係Ad5。
19. 如請求項1-18中任一項之方法，其中該灌流係以約3 mL/min/纖維至約15 mL/min/纖維的流率進行。
20. 如請求項1-19中任一項之方法，其中該灌流係以約3 mL/min/纖維、約4 mL/min/纖維、約5 mL/min/纖維、約6 mL/min/纖維、約7 mL/min/纖維、約8 mL/min/纖維、約9 mL/min/纖維、約10 mL/min/纖維、約11 mL/min/纖維、約12 mL/min/纖維、約13 mL/min/纖維、約14 mL/min/纖維、或約15 mL/min/纖維的流率進行。
21. 如請求項1-20中任一項之方法，其中該灌流係以約0.5容器容量/日（VVD）至約10 VVD的培養基交換率進行。
22. 如請求項1-21中任一項之方法，其中該灌流係以約0.5 VVD、約1 VVD、約1.5 VVD、約2 VVD、約2.5 VVD、約3 VVD、約3.5 VVD、約4 VVD、約4.5 VVD、約5 VVD、約5.5 VVD、約6 VVD、約6.5 VVD、約7 VVD、約7.5 VVD、約8 VVD、約8.5 VVD、約9 VVD、約9.5 VVD、或約10 VVD的培養基交換率進行。
23. 如請求項1-22中任一項之方法，其中該灌流係以約150 pL/細胞/日至約2000 pL/細胞/日的細胞專一性灌流率（CSPR）進行。
24. 如請求項1-22中任一項之方法，其中該灌流係以約150 pL/細胞/日至約750 pL/細胞/日的CSPR進行。
25. 如請求項1-22中任一項之方法，其中該灌流係以大於750 pL/細胞/日的CSPR進行。
26. 如請求項1-25中任一項之方法，其中該灌流係使用選自以下者的灌流系統進行：Xcellerex自動灌流系統（APS）（Cytiva）；KrosFlo® KPS TFF系統（Repligen）；XCell ^TMATF系統，於2、4、6、8、或10 ATF單位模式（Repligen）；GEA Kytero®單次使用Pharma分離系統（GEA）；Prostak ^TM微過濾模組系統（Millipore）；Alfa Laval CultureOne ^TM系統（Alfa Laval）；CARR® Centritech分離系統CARR UniFuge®試驗或Centritech細胞8®系統（Pneumatic Scale Angelus）；Ksep® 6000S系統（Sartorius）；微流細胞滯留裝置；SciLog® SciPure ^TM系統（Parker）；聲音沉降系統；及EDO電系統（American Piezo）。
27. 如請求項1-26中任一項之方法，其中步驟(a)包含在生長培養基中培養該等AAV生產宿主細胞。
28. 如請求項1-27中任一項之方法，其中步驟(a)及步驟(c)包含在生長培養基中培養該等AAV生產宿主細胞。
29. 如請求項1-26中任一項之方法，其中步驟(a)包含在生產培養基中培養該等AAV生產宿主細胞。
30. 如請求項29之方法，其中步驟(a)及(c)包含在生產培養基中培養該等AAV生產宿主細胞。
31. 如請求項15-26中任一項之方法，其中步驟(a)包含在生長培養基中培養該等AAV生產宿主細胞，且步驟(c)包含在生產培養基中培養該等AAV生產宿主細胞。
32. 如請求項31之方法，其中該生產培養基之灌流係於以該輔助病毒感染該等細胞後約1個小時-6個小時時起始。
33. 如請求項1-26中任一項之方法，其中步驟(a)及步驟(c)包含在生長及生產培養基之混合物中培養該等AAV生產宿主細胞。
34. 如請求項33之方法，其中該生長及生產培養基之混合物係生長及生產培養基之10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、或90/10混合物。
35. 如請求項1-26中任一項之方法，其中步驟(a)包含在生長培養基中培養該等AAV生產宿主細胞直到步驟(b)前約24個小時時，接著轉換至生產培養基。
36. 如請求項35之方法，其中該生長培養基係以約0.5 VVD至約1 VVD的速率灌流直到步驟(b)前約24個小時內。
37. 如請求項35或36之方法，其中該生產培養基係於步驟(b)前約24個小時內開始以約1.5 VVD至約2.5 VVD的速率灌流。
38. 如請求項1-37中任一項之方法，其包含將該等AAV生產宿主細胞培養於生長期及／或生產期培養下達約48個小時、及／或約2日至約14日。
39. 如請求項38之方法，其包含將該等AAV生產宿主細胞培養於生產期下達約48個小時、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、或約14日的持續期間。
40. 如請求項38或39之方法，其進一步包含於約48個小時、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、或約14日的生產期持續期間後停止灌流。
41. 如請求項38-40中任一項之方法，其中該rAAV係自該等AAV生產宿主細胞釋放至該生產培養基之上清液中。
42. 如請求項41之方法，其中該rAAV主要於約48個小時的使用該輔助病毒的該等細胞之感染後開始被釋放。
43. 如請求項42之方法，其中該灌流係於感染後約48個小時時停止。
44. 如請求項43之方法，其進一步包含收穫該rAAV。
45. 如請求項44之方法，其中收穫該rAAV係於批次模式條件下進行。
46. 如請求項1-45中任一項之方法，其進一步包含該rAAV之下游處理。
47. 如請求項46之方法，其中該下游處理包含純化、澄清、及／或濃縮該rAAV。
48. 如請求項47之方法，其中該下游處理包含過濾細胞殘渣、膠體、或聚集物。
49. 如請求項48之方法，其中該過濾移除大小超過1 µm的細胞殘渣、膠體、或聚集物之顆粒。
50. 如請求項46-49中任一項之方法，其包含使用陰離子交換（AEX）層析術純化該rAAV。
51. 一種生產重組腺相關病毒（rAAV）之方法，其包含使用灌流系統培養AAV生產宿主細胞，其中該AAV生產宿主細胞之培養之目標細胞密度在1E06 vc/mL至5E07 vc/mL之間。
52. 如請求項51之方法，其中該等AAV生產宿主細胞係昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
53. 如請求項52之方法，其中該等AAV生產宿主細胞係哺乳動物細胞。
54. 如請求項53之方法，其中該等哺乳動物細胞係HeLa細胞、Cos-7細胞、HEK293細胞、A549細胞、BHK細胞、Vero細胞、RD細胞、或ARPE-19細胞。
55. 如請求項51-54中任一項之方法，其中該等AAV生產宿主細胞包含AAV生產細胞株（PCL），該AAV PCL包含編碼一或多種AAV組分的遺傳物質，該遺傳物質穩定地併入該AAV生產宿主細胞之基因體中。
56. 如請求項51-55中任一項之方法，其中該AAV PCL包含一或多個基因修改以降低一或多個基因及／或蛋白質之表現及／或活性以降低乳酸及／或氨之生產或堆積。
57. 如請求項51-56中任一項之方法，其中該目標細胞密度係約5E06 vc/mL至約5E07 vc/mL。
58. 如請求項51-57中任一項之方法，其中該目標細胞密度係約1E06、約2E06、約3E06、約4E06、約5E06、約6E06、約7E06、約8E06、約9E06、約1E07、約1.1E07、約1.2E07、約1.3E07、約1.4E07、約1.5E07、約1.6E07、約1.7E07、約1.8E07、約1.9E07、或約2E07 vc/mL。
59. 如請求項51-58中任一項之方法，其中該目標細胞密度係約3.15E06 vc/mL或約5.0E06 vc/mL。
60. 如請求項51-59中任一項之方法，其中該方法係在具有在1L至12000L之間的容量的生產容器中實施。
61. 如請求項51-60中任一項之方法，其中該方法係在具有1L容量、2L容量、5L容量、10L容量、20L容量、50L容量、100L容量、150L容量、200L容量、250L容量、500L容量、1000L容量、1500L容量、2000L容量、2500L容量、3000L容量、3500L容量、4000L容量、4500L容量、5000L容量、5500L容量、6000L、或12000L容量的生產容器中實施。
62. 如請求項51-61中任一項之方法，其進一步包含在組合的生長／生產容器中使用該灌流系統生長該等AAV生產宿主細胞至該目標細胞密度。
63. 如請求項51-62中任一項之方法，其中該一或多種AAV組分包含治療性有效負載或轉殖基因、一個反向末端重複序列（ITR）或二個ITR、一或多種由AAV rep基因編碼的AAV複製及／或包裝蛋白、及／或一或多種由AAV cap基因編碼的AAV結構殼體蛋白。
64. 如請求項51-63中任一項之方法，其進一步包含在該等AAV生產宿主細胞中起始一或多種輔助病毒功能之表現從而起始rAAV生產。
65. 如請求項64之方法，其中起始一或多種輔助病毒功能之表現包含以輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞。
66. 如請求項64之方法，其中起始一或多種輔助病毒功能之表現包含誘導一或多種由該等AAV生產宿主細胞中的遺傳物質編碼的輔助病毒功能之表現。
67. 如請求項65之方法，其中該輔助病毒係腺病毒。
68. 如請求項67之方法，其中該輔助病毒係Ad5。
69. 如請求項51-68中任一項之方法，其中該等AAV生產宿主細胞係於適用於生產rAAV的條件下以該目標細胞密度培養。
70. 如請求項51-68中任一項之方法，其中該灌流系統係以約3 mL/min/纖維至約15 mL/min/纖維的流率運作。
71. 如請求項51-70中任一項之方法，其中該灌流系統係以約3 mL/min/纖維、約4 mL/min/纖維、約5 mL/min/纖維、約6 mL/min/纖維、約7 mL/min/纖維、約8 mL/min/纖維、約9 mL/min/纖維、約10 mL/min/纖維、約11 mL/min/纖維、約12 mL/min/纖維、約13 mL/min/纖維、約14 mL/min/纖維、或約15 mL/min/纖維的流率運作。
72. 如請求項51-71中任一項之方法，其中該灌流系統係以約0.5容器容量/日（VVD）至約10 VVD的培養基交換率運作。
73. 如請求項51-72中任一項之方法，其中該灌流系統係以約0.5 VVD、約1 VVD、約1.5 VVD、約2 VVD、約2.5 VVD、約3 VVD、約3.5 VVD、約4 VVD、約4.5 VVD、約5 VVD、約5.5 VVD、約6 VVD、約6.5 VVD、約7 VVD、約7.5 VVD、約8 VVD、約8.5 VVD、約9 VVD、約9.5 VVD、或約10 VVD的培養基交換率運作。
74. 如請求項51-73中任一項之方法，其中該灌流係以約150 pL/細胞/日至約2000 pL/細胞/日的細胞專一性灌流率（CSPR）進行。
75. 如請求項51-73中任一項之方法，其中該灌流係以約150 pL/細胞/日至約750 pL/細胞/日的CSPR進行。
76. 如請求項51-73中任一項之方法，其中該灌流係以大於750 pL/細胞/日的CSPR進行。
77. 如請求項51-76中任一項之方法，其中該灌流系統係選自以下者：Xcellerex自動灌流系統（APS）（Cytiva）；KrosFlo® KPS TFF系統（Repligen）；XCell ^TMATF系統，於2、4、6、8、或10 ATF單位模式（Repligen）；GEA Kytero®單次使用Pharma分離系統（GEA）；Prostak ^TM微過濾模組系統（Millipore）；Alfa Laval CultureOne ^TM系統（Alfa Laval）；CARR® Centritech分離系統CARR UniFuge®試驗或Centritech細胞8®系統（Pneumatic Scale Angelus）；Ksep® 6000S系統（Sartorius）；微流細胞滯留裝置；SciLog® SciPure ^TM系統（Parker）；聲音沉降系統；及EDO電系統（American Piezo）。
78. 如請求項51-77中任一項之方法，其中該等AAV生產宿主細胞係培養在生長培養基中接著在生產培養基中。
79. 如請求項78之方法，其中至該生產培養基的轉換於以輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞前約24個小時時發生。
80. 如請求項78或79之方法，其中該生長培養基係以約0.5 VVD至約1 VVD的速率灌流直到以該輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞前約24個小時內。
81. 如請求項78-80中任一項之方法，其中該生產培養基係於以輔助病毒感染該等AAV生產宿主細胞前約24個小時內開始以約1.5 VVD至約2.5 VVD的速率灌流。
82. 如請求項78之方法，其中該等AAV生產宿主細胞係於在該生長培養基中的培養後且於在該生產培養基中的培養前以輔助病毒感染，其中該生產培養基係於以該輔助病毒感染該等細胞後灌流1個小時-6個小時 。
83. 如請求項51-77中任一項之方法，其中該等AAV宿主生產細胞係在生長及生產培養基之混合物中以該目標細胞密度培養。
84. 如請求項83之方法，其中該生長及生產培養基之混合物係生長及生產培養基之10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、或90/10混合物。
85. 如請求項51-84中任一項之方法，其包含以該目標細胞密度培養該等AAV生產宿主細胞達約48個小時、及／或約2日至約14日。
86. 如請求項85之方法，其包含以該目標細胞密度培養該等AAV生產宿主細胞達約48個小時、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、或約14日的持續期間。
87. 如請求項85或86之方法，其中該rAAV係自該等AAV生產宿主細胞釋放至該生產培養基之上清液中。
88. 如請求項82之方法，其中該rAAV主要於約48個小時的使用該輔助病毒的該等細胞之感染後開始被釋放。
89. 如請求項88之方法，其中該灌流係於感染後約48個小時時停止。
90. 如請求項51-89中任一項之方法，其進一步包含收穫該rAAV。
91. 如請求項90之方法，其中收穫該rAAV係於批次模式條件下進行。
92. 如請求項51-91中任一項之方法，其進一步包含該rAAV之下游處理。
93. 如請求項92之方法，其中該下游處理包含純化、澄清、及／或濃縮該rAAV。
94. 如請求項93之方法，其中該下游處理包含過濾細胞殘渣、膠體、或聚集物。
95. 如請求項94之方法，其中該過濾移除大小超過1 µm的細胞殘渣、膠體、或聚集物之顆粒。
96. 如請求項93-95中任一項之方法，其包含使用陰離子交換（AEX）層析術純化該rAAV。