CN110945018A - 抗脱落酶的trem2变体 - Google Patents

Abstract

本文提供了与抗脱落酶切割的TREM2突变体例如与抗脱落酶切割的人TREM2突变体相关的方法和组合物，以及编码此类抗脱落酶切割的TREM2突变体的核酸。

Description

抗脱落酶的TREM2变体

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且所述序列表特此通过引用以其全文并入。所述ASCII副本创建于2018年7月20日，名称为PAT057836-WO-PCT_SL.txt并且大小为60,538字节。

技术领域

本发明提供了与抗脱落酶切割的TREM2突变体例如与抗脱落酶切割的人TREM2突变体相关的方法和组合物，以及编码此类抗脱落酶切割的TREM2突变体的核酸。

背景技术

髓系细胞触发受体蛋白或“TREM”是在不同类型的髓系细胞(例如肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)上表达的一组跨膜糖蛋白。TREM在其细胞外结构域中具有免疫球蛋白(Ig)型折叠，因此属于免疫球蛋白超家族(IgSF)。TREM受体含有短的细胞内结构域，但是缺少用于信号传导介质的对接基序(docking motif)，并且需要用于细胞激活的衔接蛋白，例如DAP12(12kDa的DNAX激活蛋白)。已报道两个TREM成员：TREM1和TREM2，两者都在免疫和炎症应答中起重要作用。

TREM2在巨噬细胞、树突细胞、破骨细胞、小神经胶质细胞、肺上皮细胞和肝癌细胞上表达，但是在血液中的髓系细胞中不存在。TREM2与DAP12物理相关联，DAP12充当TREM2和许多其他细胞表面受体的信号传导衔接蛋白。DAP12的细胞质结构域含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)(Wunderlich，J.Biol.Chem[生物化学杂志].288，33027-33036，2013)。相互作用受体激活后，DAP12通过Src激酶在两个保守性ITAM酪氨酸残基上经历磷酸化。随后的Syk蛋白激酶的募集和激活触发下游信号传导途径，包括丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和磷脂酶Cγ(PLCγ)的激活。

TREM2可以被以下激活：脂多糖(LPS)，热休克蛋白60，神经碎片，细菌和各种阴离子和两性离子脂质，例如磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂。TREM2激活增加小神经胶质细胞和巨噬细胞的吞噬能力，减少促炎细胞因子的释放并限制TLR信号传导。TREM2通过与CSF-1受体信号传导协同来维持小神经胶质细胞存活。此外，TREM2与调节细胞粘附和运动的丛蛋白-A1相互作用。TREM2信号传导促进摄入的捕获物的降解，并且对于脂质代谢、髓鞘质摄取和细胞内分解是至关重要的。

TREM2通过胞外结构域脱落和膜内蛋白水解进行顺序蛋白水解加工(Wunderlich，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]288，33027-33036，2013)。在胞外结构域脱落期间，TREM2的胞外结构域由蛋白酶释放，所述蛋白酶是例如ADAM(含有解整联蛋白和金属蛋白酶结构域的蛋白质)或BACE(b-位点APP切割酶)家族的成员(Kleinberger，Sci.Transl.Med.[科学转化医学]2014；6(243)：243ra86)。去除胞外结构域后，通过γ-分泌酶介导的膜内蛋白水解进一步处理剩余的膜保留片段。已经在树突细胞培养物的上清液以及来自患有非炎性神经疾病和多发性硬化的患者的血浆和CSF样品中观察到由胞外结构域脱落产生的TREM2的可溶性片段(sTREM2)(Kleinberger，2014)。人CSF中TREM2(sTREM2)的脱落的胞外结构域已经被评估为潜在的阿尔茨海默病(AD)生物标记物，并且已经显示在一般的衰老过程中增加(Suarez-Calvet，EMBO Molecular Medicine[欧洲分子生物学学会杂志之分子医学]8，466-476，2016)。在AD过程中的详细分析揭示，在AD痴呆中，sTREM2在临床症状出现之前在AD早期增加，在MCI-AD中达到峰值，并且保持升高的但是与MCI-AD阶段相比较低的水平(Suarez-Calvet，2016)。

发明内容

本文提供了抗脱落酶切割的人TREM2突变体(例如，抗ADAM17或ADAM10切割的人TREM2突变体)、编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸、以及含有此类核酸的载体和细胞。本文还提供了通过使用编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体或含有此类核酸的载体和细胞，增加受试者中TREM2表达的方法和治疗受试者中TREM2相关疾病或障碍的方法。

在一方面，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体(例如，抗DAM17或ADAM10切割的人TREM2突变体)的序列的核酸。

在一些实施例中，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQ ID NO：33-35中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33-35中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文提供了包含SEQ ID NO：67-74中任一个的核酸。在一些实施例中，本文提供了包含SEQ ID NO：67-69中任一个的核酸。在一些实施例中，本文提供了包含SEQ ID NO：67、70或74中任一个的核酸。在一些实施例中，本文提供了包含SEQ ID NO：67的核酸。

在一些实施例中，此类核酸可以包含启动子，例如组成型启动子、诱导型启动子、合成启动子或细胞类型特异性启动子。在一些实施例中，启动子是细胞类型特异性启动子。例如，所述启动子可以特异性地驱动在小神经胶质细胞、巨噬细胞或树突细胞中的核酸表达。在一些实施例中，此类核酸包含选自以下的启动子：TREM2启动子、TMEM119启动子、Hexb启动子、IBA1启动子、CD45启动子、CD11b启动子、Cst7启动子、Lpl启动子、Csf1启动子、Cs1R启动子、Itgax启动子、Clec7a启动子、Lilrb4启动子、Tyrobp启动子、Ctsb启动子、Ctsd启动子、B2m启动子、Lyz2启动子、Cx3cr1启动子、Cst3启动子、Ctss启动子、P2ry12启动子、Clqa启动子或Clqb启动子。在一些实施例中，此类核酸包含TREM2启动子。在一些实施例中，此类核酸可以包含聚腺苷酸化信号。

在一些实施例中，包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸可以进一步包含编码DAP12蛋白的第二序列。在一些实施例中，此类核酸包含第二序列上游的内部核糖体进入位点。在一些实施例中，此类核酸包含第二序列上游的2A序列，例如选自SEQ IDNO：52-66中任一个的2A序列。DAP12蛋白可以包含SEQ ID NO：49。在一些实施例中，DAP12蛋白由SEQ ID NO：49组成。

在另一方面，本文提供了载体(例如，表达载体)，所述载体包含含有编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸。此类载体可以是DNA载体、RNA载体、质粒、粘粒或病毒载体。在一些实施例中，所述载体是选自基于以下病毒中任何一种的载体的病毒载体：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、细小病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、辛德毕斯病毒、流感病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、塞内卡谷病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒、粘液瘤病毒或马拉巴病毒。在一些实施例中，所述载体是慢病毒载体。在一些实施例中，所述载体是AAV载体。在一些实施例中，所述载体进一步包含可选择标记物。

在另一方面，本文提供了包含核酸或载体的细胞，所述核酸或载体包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列。此类细胞可以是巨噬细胞、树突细胞或小神经胶质细胞。在一些实施例中，所述细胞可表达可检测标记物。

在另外的方面，本文提供了包含选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列的多肽。还提供了包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列的多肽。

在另外的方面，本文提供了通过向受试者施用本文所述的核酸、载体或细胞中的任一个来增加受试者(例如人)中TREM2表达的方法。所述受试者可以患有TREM2相关疾病或障碍。可以通过静脉内、颅内、鞘内、皮下或鼻内途径向受试者施用此类核酸、载体或细胞。所述方法可以进一步包括向受试者施用第二治疗剂。

在另外的方面，本文提供了在有需要的受试者(例如人)中治疗TREM2相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的核酸、载体或细胞中的任一个。可以通过静脉内、颅内、鞘内、皮下或鼻内途径向受试者施用此类核酸、载体或细胞。所述方法可以进一步包括向受试者施用第二治疗剂。

在一些实施例中，所述TREM2相关疾病或障碍是神经炎症或神经退行性疾病，所述神经炎症或神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、那须-哈科拉病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、抗NMDA受体脑炎、自闭症、脑狼疮(NP-SLE)、化疗引起的周围神经病变(CIPN)、带状疱疹后神经痛、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、癫痫、格林-巴利综合征(GBS)、包涵体肌炎、溶酶体贮积病、鞘磷脂沉积病(C型尼曼-皮克病)、粘多糖病II/IIIB、异染性脑白质营养不良、多灶性运动神经病、重症肌无力、神经白塞病、视神经脊髓炎(NMO)、视神经炎、多肌炎、皮肌炎、拉斯穆森脑炎、雷特综合征、中风、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、脊髓损伤、病毒性脑炎或细菌性脑膜炎。在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍是阿尔茨海默病。在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍是额颞叶痴呆。

在一些实施例中，本文所述的方法可以进一步包括测定从受试者获得的样品(例如，脑脊液样品)中的细胞表面人TREM2水平。样品中的细胞表面人TREM2水平可以通过选自以下的测定来确定：流式细胞术、免疫组织化学、蛋白质印迹、免疫荧光测定、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、均相时间分辨荧光(HTRF)或正电子发射断层扫描(PET)。

还包括本文所述的核酸、载体、细胞或多肽用于治疗受试者中TREM2相关疾病或障碍的用途。还考虑了本文所述的核酸、载体、细胞或多肽在制造用于治疗受试者中TREM2相关疾病或障碍的药物中的用途。

附图说明

图1A示出人TREM2同种型1(SEQ ID NO：1)、Cyno TREM2同种型1(SEQ ID NO：5)和小鼠TREM2同种型1(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列的示例性比对。TREM2的茎区包括浅灰色阴影的残基。TREM2的跨膜结构域包括带下划线的残基。图1B示出人TREM2同种型1(SEQ IDNO：1)、同种型2(SEQ ID NO：3)和同种型3(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列的示例性比对。图1C示出人TREM2同种型1(SEQ ID NO：89)、同种型2(SEQ ID NO：8)和同种型3(SEQ ID NO：9)的茎区的氨基酸序列的示例性比对。图1D示出人TREM2同种型1(SEQ ID NO：7)、Cyno TREM2同种型1(SEQ ID NO：10)和小鼠TREM2同种型1(SEQ ID NO：11)的茎区的氨基酸序列的示例性比对。图1E展示TREM2的结构及其与信号传导衔接蛋白DAP12的相互作用。成熟TREM2包括单个免疫球蛋白(IgSF)结构域、茎区、跨膜(TM)结构域和细胞质结构域。

图2A-2E示出ADAM17是用于在CHO-hDAP12-hTREM2细胞和人M2A巨噬细胞中切割TREM2胞外结构域的关键性脱落酶。图2A-2B示出在用ADAM抑制剂DPC333(黑色圆圈)或GI254023(向上三角形)处理后，在CHO-hDAP12-hTREM2中的TREM2细胞表面表达；在图2B中应用了另外的佛波醇-肉豆蔻酸酯-酸(PMA)处理。图2C-2D示出在用ADAM抑制剂DPC333(黑色圆圈)或G]254023(向上三角形)处理后，在人M2A巨噬细胞中的TREM2细胞表面表达；在图2D中应用了另外的PMA处理。将TREM2细胞表面染色以平均值±标准误差(n＝3)绘制为针对核染色校正的平均强度。示出了来自两个实验的代表性实验。图2E是示出在体外在pH 7.5的Hepes缓冲液中由DPC333和GI254023抑制重组ADAM10和ADAM17的线图。

图3A-3D是示出ADAM17(而不是ADAM10)TREM2敲除的THP1细胞的条形图，示出增加的TREM2表达和脱落的TREM2(sTREM2)的减少。图3A示出在THP1 CRISPR细胞克隆中的TREM2细胞表面表达。图3B示出来自THP1 C CRISPR细胞克隆的上清液的sTREM2水平。作为平均值±标准误差(n＝2)绘制数据。*p＜0.01，与未处理的Ctrl gRNA克隆组的统计差异。#p＜0.01，与PMA处理的Ctrl gRNA克隆组的统计差异。CtrlgRNA是对照gRNA转染的克隆；AD10H4是ADAM10 CRISPR敲除克隆；AD17 G12是ADAM17 CRISPR敲除克隆。图3C示出在THP1ADAM10 H4 CRISPR克隆中缺乏ADAM10表达。左图对照克隆CtrlgRNA；右图AD10 H4克隆。图3D是THP1对照克隆CtrlgRNA(泳道1)和ADAM17 AD17 G12 CRISPR细胞(泳道2)的代表性蛋白质印迹分析，示出在THP1 ADAM17 G12 CISPR克隆中缺乏ADAM17表达。

图4A-4D示出在TREM2茎区的膜近侧部分中的氨基酸段对于脱落是重要的。图4A示出野生型或突变体人TREM2茎区的膜近侧部分的氨基酸序列。根据iProt Q9NZC2进行氨基酸编号。TM：跨膜区。缺口指示在对应突变体中缺失的氨基酸。粗体表示交换的氨基酸。带下划线的氨基酸指示用于生成TREM2胞外结构域C末端的主要脱落酶切割位点。如表4所示，WT：SEQ ID NO：12；TRUNC3(159-174缺失)：SEQ ID NO：13；TRUNC1：SEQ ID NO：14；T2del 3-8：SEQ ID NO：15；T2del 6-11：SEQ ID NO：16；T2del 11-16：SEQ ID NO：17；T2-YGG：SEQ IDNO：18；T2-WFR：SEQ ID NO：19；T2-双重：SEQ ID NO：20；T2-IPD：SEQ ID NO：21；T2-IPP：SEQID NO：22，T2-IDP：SEQ ID NO：23。图4B是示出在HEK293-FT细胞中瞬时表达的TREM2 WT和突变体的FACS分析的条形图。转染后48小时，将细胞用50ng/ml PMA或0.05％DMSO处理。将细胞解离，用AF1828抗血清标记，并且通过流式细胞术分析。将数据以平均值±标准误差(n＝3)针对每个突变体绘制为未处理与PMA处理的比率。与WT的统计差异是通过采用邓尼特多重比较检验的方差分析计算得出的。*P＜0.01。图4C是示出通过如图4A所示的TREM2-双重突变体进行的基因激活的条形图。TREM2-双重突变体在BWZ-lacZ-mDAP12细胞中稳定表达。将细胞接种在激活型单克隆抗体或同种型对照上，并且在16h后评估报告基因的活性。将数据以平均值±标准误差(n＝3)针对激活型/对照Ab绘制为RGA的比率。图4D是示出在脱落酶切割位点处的三个氨基酸的替代强烈地增加了TREM2细胞表面表达的条形图。在HEK293-FT细胞中瞬时表达的TREM2 WT和突变体的FACS分析。转染后48h，将细胞用50ng/mlPMA或0.05％DMSO处理。将细胞解离，用AF1828抗血清标记，并且通过流式细胞术分析。将数据以平均值±标准误差(n＝3)针对每个突变体绘制为未处理与PMA处理的比率。统计差异是通过采用邓尼特多重比较检验的方差分析计算得出的。*P＜0.01。

图5A-5E示出在体外ADAM17在H157-S158处切割TREM2茎区肽。图5A示出TREM2茎区衍生的合成肽的氨基酸序列，用于体外切割测定。所有获得的肽在C末端均具有N末端7-甲氧基香豆素(Mca)荧光标签。带下划线的氨基酸指示主要的脱落酶切割位点。AA112-171：SEQ ID NO：24；肽1：SEQ ID NO：25；肽2：SEQ ID NO：26；肽3：SEQ ID NO：27；肽1a：SEQ IDNO：28；肽2a：SEQ ID NO：29；肽4：SEQ ID NO：30；肽5：SEQ ID NO：31；肽6：SEQ ID NO：32。图5B示出通过ADAM17(31nM)切割肽3(10μM)1小时、5小时或24小时的HPLC分析。图5C示出通过ADAM17(31nM)切割肽3(10μM)48小时的HPLC分析，其中鉴定了主要产物和2种次要产物。图5C按出现的顺序分别披露了SEQ ID NO：83、51和84。图5D示出ADAM17切割肽1、肽2或肽3的时间过程(2个实验的平均值)。图5E示出ADAM17切割肽4、肽5或肽6的时间过程(2个实验的平均值)。

图6A示出从用WT或R47H人TREM2(SEQ ID NO：85)和DAP12瞬时转染的HEK-FT细胞脱落的TREM2胞外结构域的C末端的鉴定。3次带电[D137-H157]肽离子的离子提取物，m/z791.94-792.06。目的肽离子明显存在于所有四个脱落的TREM2胰蛋白酶消化物中(框中的离子提取物)。*代表以5次带电离子存在的未知肽，而**是同一肽的脱氨基形式。图6B示出肽D₁₃₇-H₁₅₇(SEQ ID NO：85)的解卷积MS^E谱。上图指示鉴定了哪些b和y碎片离子。此质谱来自TREM2 R47H PMA的胰蛋白酶消化物。

图7示出从用WT或突变体R47H hTREM2和hDAP12瞬时转染的HEK-FT细胞中对脱落的TREM2胞外结构域的鉴定。4个质谱图的解卷积质谱图：脱落的hTREM2[19-157]明显存在于所有四种细胞上清液提取物中。亲和纯化后，已经将细胞上清液用PNGase-F和唾液酸酶A处理，但是未还原。

图8A-8C示出对TREM2茎区内的一个或多个O-糖基化位点的测定。将TREM2-His首先用唾液酸酶A处理，然后还原，烷基化，然后用PNGase-F处理。然后将所得的样品用胰蛋白酶或Asp-和Glu-C酶消化。将消化物通过LC-MS^E分析。图8A：解卷积质谱，组合扫描：1926：2097(SEQ ID NO：86)。图8B：解卷积质谱，组合扫描：1566：1584(SEQ ID NO：87)。图8C：解卷积质谱，组合扫描：1373：1477(SEQ ID NO：88)。

具体实施方式

本文提供了抗脱落酶切割的人TREM2突变体(例如，抗ADAM17或ADAM10切割的人TREM2突变体)、编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸、以及含有此类核酸的载体和细胞。本文还提供了通过使用编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体或含有此类核酸的载体和细胞，增加受试者中TREM2表达的方法和治疗受试者中TREM2相关疾病或障碍的方法。

TREM-2介导细菌和垂死细胞的非炎性吞噬作用并抑制炎症应答。人TREM-2的纯合性功能丧失导致那须-哈科拉病(多囊性脂膜性骨发育不良伴硬化性脑白质病，“PLOSL”)或额颞痴呆(FTD)样综合征、以骨囊肿、神经炎症、进行性神经退行和早老性痴呆为特征的疾病。TREM-2的杂合性功能丧失突变R47H也是晚发性阿尔茨海默病(AD)的重要危险因素，其具有与载脂蛋白Eε4等位基因相似的效应大小。TREM-2在白质、海马和新皮质中发现的小神经胶质细胞中表达，这与AD脑中报道的病理特征部分地一致，支持TREM-2可能参与AD发病机制。除了AD之外，遗传筛查现还已将TREM2中的杂合错义突变鉴定为帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞痴呆(FTD)的危险因素(Kleinberger，Sci Transl Med.[科学转化医学]2014年7月2日；6(243)：243ra86)。因此，需要功能性TREM-2来预防与衰老相关的神经炎症和导致严重认知障碍和痴呆的神经退行性疾病。

由于选择性剪接，存在三种TREM2同种型，同种型1是最长的同种型。在图1B中比对了人TREM2同种型1(SEQ ID NO：1)、人TREM2同种型2(SEQ ID NO：3)和人TREM2同种型3(SEQID NO：4)的氨基酸序列。人TREM2同种型1(SEQ ID NO：89)、同种型2(SEQ ID NO：8)和同种型3(SEQ ID NO：9)的茎区的氨基酸序列的比对揭示了人TREM2同种型1的茎区与人TREM2同种型2或3的茎区共享约79％的序列同一性(图1C)。

在图1A中比对了人TREM2同种型1(SEQ ID NO：1)、Cyno TREM2同种型1(SEQ IDNO：5)和小鼠TREM2同种型1(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列。人TREM2同种型1(SEQ ID NO：7)、Cyno TREM2同种型1(SEQ ID NO：10)和小鼠TREM2同种型1(SEQ ID NO：11)的茎区的氨基酸序列的比对揭示了人TREM2同种型1茎区与Cyno TREM2同种型1茎区共享98％的序列同一性，与小鼠TREM2同种型1茎区共享69％的序列同一性(图1D)。图1E展示了TREM2的结构及其与信号传导衔接蛋白DAP12的相互作用。

定义

如在说明书和权利要求中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

所有数字指定，例如pH、温度、时间、浓度和分子量(包括范围)，都是近似值，其以0.1的增量变化(+)或(-)。应当理解，尽管并非总是明确说明，但是所有数字指定前面都有术语“约”。还应理解，尽管不总是明确说明，本文描述的试剂仅是实例并且其等效物为本领域所知。

如本文所用，“TREM2”(也称为“髓系细胞触发受体蛋白2”、TREM-2、TREM2a、TREM2b或TREM2c)是指由TREM2基因编码的糖蛋白。人TREM2属于免疫球蛋白超家族(IgSF)，并且包括信号肽、单个V型免疫球蛋白结构域(IgV)、茎区、跨膜结构域和细胞质尾。人TREM2基因映射于染色体位置6p21.1，并且人TREM2基因的基因组序列可以在GenBank中NC_000006.12处找到。由于选择性剪接，存在至少三种人TREM2同种型。术语“人TREM2”用于指人TREM2的任何同种型。最长的人TREM2同种型(同种型1)的蛋白质和mRNA序列是：

髓系细胞触发受体蛋白2前体同种型1前体[智人](NP_061838.1)

智人髓系细胞触发受体蛋白2(TREM2)，转录变体1，mRNA(NM_018965.3)

人TREM2同种型2(SEQ ID NO：3)和同种型3(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列示于图1B中。在一些实施例中，人TREM2蛋白还涵盖在其全长上与SEQ ID NO：1、3或4中的任一个具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的蛋白质，其中此类蛋白质仍然具有配体结合、细胞内信号传导、促进吞噬作用和吞噬物质的降解以及TREM2的其他调节功能。鼠、cyno和其他动物TREM2蛋白的序列是本领域已知的(例如，对于鼠TREM2蛋白为NP_112544.1和NP_001259007.1)。

术语“细胞外结构域”是指跨膜蛋白的一部分，其暴露在细胞的脂质双层的细胞外侧。用于确定蛋白质的胞外结构域的方法是本领域已知的(Singer(1990)；High等人(1993)，和McVector软件，Oxford Molecular[牛津分子])。例如，人TREM2蛋白的细胞外结构域可以包括SEQ IDNO：1(同种型1)的氨基酸残基14至174、SEQ ID NO：3(同种型2)的氨基酸残基14至168或SEQ ID NO：4(同种型3)的氨基酸残基14至171。

术语TREM2的“胞外结构域”是指TREM2胞外结构域的一部分，其在脱落酶切割后释放。

术语TREM2的“茎区”是指TREM2的细胞外结构域的一部分，其连接V型免疫球蛋白(IgV)结构域和跨膜结构域。

术语“跨膜结构域”是指跨膜蛋白的一部分，其跨越细胞的脂质双层。用于确定蛋白质的跨膜结构域的方法是本领域已知的(Elofsson等人(2007)Annu.Rev.Biochem.[生物化学年度综述]76：125-140；Bernsel等人(2005)Protein Science[蛋白质科学]14：1723-1728)。

术语“细胞质结构域”和“细胞质尾”可互换使用并且是指跨膜蛋白的一部分，其位于细胞的脂质双层的细胞质侧。用于确定蛋白质的细胞质尾的方法是本领域已知的(Elofsson等人(2007)和Bernsel等人(2005))。

术语“抗切割的TREM2突变体”和“抗脱落酶切割的TREM2突变体”在本文中可互换使用，并且是指在切割野生型TREM2的脱落酶(例如ADAM17或ADAM10)的切割位点附近具有一个或多个突变的TREM2突变体，并且因此在相同条件下与野生型TREM2蛋白质相比，减少了脱落酶切割，例如少了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的脱落酶切割。“抗切割的TREM2突变体”可以具有减少的胞外结构域脱落，例如在相同条件下与野生型TREM2蛋白质相比，少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的脱落。这样的抗切割的TREM2突变体可以具有减少的脱落，同时保留关键的TREM2功能，例如，可以仍然具有配体结合、细胞内信号传导、促进吞噬作用和吞噬物质的降解以及TREM2的其他调节功能。

如本文所用，“DAP12”(也称为TYROBP；KARAP；PLOSL)是指跨膜信号传导多肽，这在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。最长的人DAP12同种型(同种型1)的蛋白质和mRNA序列是：

TYRO蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白同种型1前体[智人](NP_003323.1)

智人TYRO蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP)，转录物变体1，mRNA(NM_003332.3)

术语“治疗”(“treat”和“treatment”)是指治疗性治疗和预防性或防护性措施，其中目的是预防或减缓不期望的生理变化或障碍。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、降低疾病程度、疾病状态稳定(即，不恶化)、延迟或减缓疾病进展、疾病状态改善或缓和、以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。

术语“受试者”是指向其提供根据本发明的方法的治疗的动物、人、或非人。考虑了兽医应用和非兽医应用。所述术语包括但不限于哺乳动物，例如人、其他灵长类动物、猪、啮齿动物(如小鼠和大鼠、兔、豚鼠、仓鼠)、牛、马、猫、狗、绵羊和山羊。典型的受试者包括人、农场动物和家养宠物，如猫和狗。

“有效量”是指足以实现有益的或希望的结果的量。例如，治疗量为达到所需治疗效果的量。所述量可与预防性有效量相同或不同，所述预防性有效量是预防疾病或疾病症状的发作所需的量。可以将有效量以一次或多次施用、应用或给药来施用。治疗化合物的治疗有效量(即，有效剂量)取决于所选择的治疗化合物。可以将组合物以每天一次或多次至每周一次或多次来施用；包括每隔一天一次。本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和定时，这些因素包括但不限于，疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本文所述的治疗化合物对受试者进行的治疗可以包括单一治疗或一系列治疗。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则所述术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.[核酸研究]19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8：91-98(1994))。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质存在有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。

术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域中已知的标准技术将修饰引入抗体或抗体片段中，这些标准技术是如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有以下项的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在所述位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。可以通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性”的百分比，其中比较窗口中的氨基酸序列的片段可以包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(例如，空位或突出端)以使两个序列最佳比对。可以通过以下方法计算百分比：测定在这两个序列中出现相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。输出是主题序列关于查询序列的同一性百分比。

术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。“分离的抗体”基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异性结合TREM2的分离的抗体基本上不含特异性结合除TREM2以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合靶分子的分离的抗体可以与来自其他物种的相同抗原具有交叉反应性，例如，特异性结合TREM2的分离的抗体可以结合来自其他物种的TREM2分子。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学品。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本披露所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管可以使用与本文所述那些方法和材料类似或等同的方法和材料来实践本发明，但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入。在冲突存在的情况下，则以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。

抗脱落酶切割的TREM2突变体

TREM2通过胞外结构域脱落和膜内蛋白水解进行顺序蛋白水解加工(Wunderlich，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]288，33027-33036，2013)。在胞外结构域脱落期间，TREM2的胞外结构域由蛋白酶释放，所述蛋白酶是例如ADAM(含有解整联蛋白和金属蛋白酶结构域的蛋白质)或BACE(b-位点APP切割酶)家族的成员(Kleinberger，Sci.Transl.Med.[科学转化医学]2014年7月2日；6(243)：243ra86)。已经在树突细胞培养物的上清液以及来自患有非炎性神经疾病和多发性硬化的患者的血浆和CSF样品中观察到由胞外结构域脱落产生的TREM2的可溶性片段(sTREM2)(Kleinberger，2014)。在阿尔茨海默病(AD)过程中的详细分析揭示，在AD痴呆中，sTREM2在临床症状出现之前在AD早期增加，在MCI-AD中达到峰值，并且保持升高的但与MCI-AD阶段相比较低的水平(Suarez-Calvet，EMBO molecularmedicine[欧洲分子生物学学会杂志之分子医学]8，466-476，2016)。

此处呈现的数据鉴定出ADAM17是负责组成型脱落的主要脱落酶(实例2)。ADAM17消融减少了TREM2的组成型脱落并且增加了细胞表面TREM2(实例3)。在佛波醇-肉豆蔻酸酯-酸(PMA)处理之后，其他脱落机制开始起作用，其中一种可能涉及ADAM10(实例3)。鉴定了对PMA诱导的TREM2脱落重要的两个区域：在氨基酸169-172处的近侧膜和在氨基酸156-164区域中的远侧膜(实例4)。HPLC分析示出，TREM2中的H157-S158键是ADAM17的主要切割位点(实例5)。表征了从细胞脱落的TREM2胞外结构域，并且确认了在H157和S158之间的主要切割位点(实例6)。在接近切割位点的位置S160或S168处未鉴定出O-糖基化(实例7)。在脱落酶切割位点处具有突变的TREM2突变体显示出增加的细胞表面表达和对脱落酶切割的抗性(实例8)。

本文提供了抗脱落酶切割的TREM2突变体(或“抗切割的TREM2突变体”)，例如抗脱落酶切割的人TREM2突变体(或“抗切割的人TREM2突变体”)。在一些实施例中，抗切割的TREM2突变体是抗ADAM17或ADAM 10切割的。在一些实施例中，抗切割的TREM2突变体包含突变的茎区。例如，抗切割的TREM2突变体可以在脱落酶切割位点附近具有一个或多个突变。在一些实施例中，抗切割的TREM2突变体包含在H157和S158之间的ADAM17切割位点附近的一个或多个突变。

在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含表1中提供的氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQID NO：33-35中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33-35中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQ ID NO：33、36、40中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33、36、40中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含SEQ ID NO：33。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由SEQ ID NO：33组成。

表1.抗脱落酶切割的人TREM2突变体的茎区的示例性氨基酸序列

在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含选自表2中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体由选自SEQID NO：41-48中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-43中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体由选自SEQ ID NO：41-43中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41、44、48中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体由选自SEQ ID NO：41、44、48中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体包含SEQ ID NO：41。在一些实施例中，抗脱落酶切割的人TREM2突变体由SEQ ID NO：41组成。

本文还提供了包含选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，包含选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，由选自SEQ IDNO：41-48中任一个的氨基酸序列组成的多肽。在一些实施例中，包含选自SEQ ID NO：41-43中任一个的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，由选自SEQ ID NO：41-43中任一个的氨基酸序列组成的多肽。

表2.抗脱落酶切割的人TREM2突变体的示例性氨基酸序列

编码人TREM2突变体、载体和细胞的核酸

本披露还提供了编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸、用于表达抗脱落酶切割的人TREM2突变体的载体以及含有此类表达载体的细胞。在其他方面，本披露提供了编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列，以及包含这种多核苷酸的表达载体和宿主细胞。

在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含表1中提供的氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQ ID NO：33-35中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33-35中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQ ID NO：33、36、40中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33、36、40中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含SEQ ID NO：33。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由SEQ ID NO：33组成。

在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含选自表2中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体由选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-43中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体由选自SEQ ID NO：41-43中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41、44、48中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体由选自SEQ ID NO：41、44、48中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体包含SEQ ID NO：41。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，所述人TREM2突变体由SEQ ID NO：41组成。

在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，其中所述序列包含表3中提供的序列中的任一个。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，其中所述序列包含SEQ ID NO：67-74中的任一个。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，其中所述序列包含SEQ ID NO：67-69中的任一个。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，其中所述序列包含SEQ ID NO：67、70或74中的任一个。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的核酸，其中所述序列包含SEQ ID NO：67。

在一些实施例中，本文提供了包含SEQ ID NO：67-74中任一个的核酸。在一些实施例中，本文提供了包含SEQ ID NO：67-69中任一个的核酸。在一些实施例中，本文提供了包含SEQ ID NO：67、70或74中任一个的核酸。在一些实施例中，本文提供了包含SEQ ID NO：67的核酸。

表3.编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的茎区的示例性核酸序列

本文提供了可以用于表达抗脱落酶切割的人TREM2突变体的载体(例如，表达载体)。术语“表达载体”是指载体核酸分子，可以将所需的编码序列插入所述载体核酸分子中以引入可以表达所述编码序列的细胞中。表达载体可以是DNA载体、RNA载体、质粒、粘粒、或病毒载体、或人工染色体(参见，例如，Harrington等人，Nat Genet[自然遗传学]15：345，1997)。例如，用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A、B和C(英杰公司(Invitrogen)，圣地亚哥，加利福尼亚州)，MPSV载体，和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。在一些实施例中，表达载体能够自主复制，或者它可以整合到宿主DNA中。在一些实施例中，表达载体进一步包含可选择标记物。

有用的病毒载体包括但不限于基于以下任何病毒的载体：腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、细小病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、辛德毕斯病毒、流感病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、塞内卡谷病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒、粘液瘤病毒或马拉巴病毒。

在一些实施例中，表达载体是慢病毒载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复(LTR)、和目的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(例如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人，“Gammaretroviral Vectors：Biology，Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学、技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6)：677-713。

在一些实施例中，表达载体是腺相关病毒(AAV)载体，例如，重组AAV(rAAV)载体。“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可以用于指病毒本身或其衍生物。除非另有要求，所述术语覆盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式二者。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括例如，AAV1型(AAV1)、AAV2型(AAV2)、AAV3型(AAV3)、AAV4型(AAV4)、AAV 5型(AAV5)、AAV 6型(AAV6)、AAV7型(AAV7)、AAV 8型(AAV8)、AAV 9型(AAV9)、AAV 10型(AAV10，包括AAVrh10)、AAV12型(AAV12)、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和绵羊AAV。“灵长类AAV”是指感染灵长类的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV等。

AAV的各种血清型的基因组序列，以及天然反向末端重复(ITR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可以在文献中或在诸如GenBank的公共数据库中找到。参见，例如，GenBank登录号NC-002077(AAV1)、AF063497(AAV1)、NC-001401(AAV2)、AF043303(AAV2)、NC-001729(AAV3)、NC-001829(AAV4)、U89790(AAV4)、NC-006152(AAV5)、AF513851(AAV7)、AF513852(AAV8)和NC-006261(AAV8)；或在例如WO 2005033321(AAV1-9)的出版物中，其披露内容通过引用并入本文。还参见，例如，Srivistava等人，(1983)J.Virology[病毒学杂志]45：555；Chiorini等人，(1998)J.Virology[病毒学杂志]71：6823；Chiorini等人(1999)J.Virology[病毒学杂志]73：1309；Bantel-Schaal等人(1999)J.Virology[病毒学杂志]73：939；Xiao等人(1999)J.Virology[病毒学杂志]73：3994；Muramatsu等人(1996)Virology[病毒学]221：208；Shade等人，(1986)J.Virol.[病毒学杂志]58：921；Gao等人(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]99：11854；Moris等人(2004)Virology[病毒学]33：375-383；国际专利公开WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；以及美国专利号6,156,303。

如本文所用，“rAAV载体”是指包含非AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，所述多核苷酸序列通常是用于细胞遗传转化的目的序列。在一些实施例中，异源多核苷酸可以侧接至少一个(有时两个)AAV反向末端重复(ITR)序列。术语rAAV载体涵盖rAAV载体粒子和rAAV载体质粒二者。rAAV载体可以是单链的(ssAAV)或自身互补的(scAAV)。“AAV病毒”或“AAV病毒粒子”或“rAAV载体粒子”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(通常由野生型AAV的所有衣壳蛋白)和包衣壳的多核苷酸rAAV载体构成的病毒粒子。如果所述粒子包含异源多核苷酸(即，除了野生型AAV基因组之外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则所述粒子通常被称为“rAAV载体粒子”或简称为“rAAV载体”。因此，rAAV粒子的产生必然包括rAAV载体的产生，因为这样的载体被包含在rAAV粒子内。

在一些实施例中，表达载体可以是重组DNA分子，所述重组DNA分子含有编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸。如本文所用，“重组”意指载体、多核苷酸、多肽或细胞是克隆、限制或连接步骤(例如，涉及被包含于其中的多核苷酸或多肽)；和/或导致与自然界中发现的产物不同的构建体的其他过程的各种组合的产物。重组病毒或载体是包含重组多核苷酸的病毒粒子。所述术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制物和原始病毒构建体的子代。

重组表达载体通常包括与待表达的核酸序列可操作地连接的一个或多个调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调节序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的序列，以及组织特异性调节和/或诱导序列。表达载体还可以包括设计用于优化宿主细胞中信使RNA稳定性和可翻译性的元件、和/或用于建立表达人TREM2突变体的永久性稳定细胞克隆的药物选择标记物。表达载体的设计可以取决于诸如以下的此类因素：待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等。用于生成此类重组表达载体的通用方法可以在以下文献中发现：Sambrook和Russell编辑(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第3版；Ausubel等人编辑系列(2007年更新至2010年)Current Protocols in Molecular Biology[当代分子生物学实验指南]，以及本领域已知的其他方法。

“启动子”是控制序列，其是核酸序列的区域，在所述区域中控制转录的起始和速率。它可含有遗传元件，在这些遗传元件上调节性蛋白质和分子可结合如RNA聚合酶和其他转录因子。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“受控制”和“受转录控制”意指启动子处于与核酸序列相关的正确功能位置和/或取向以控制此序列的转录起始和/或表达。可以将启动子与“增强子”结合或不结合使用，所述“增强子”是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。

启动子可以是与基因或序列天然相关的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列而获得。这样的启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于此序列的下游或上游。可替代地，在重组或异源启动子的控制下通过将编码核酸区段定位，将获得某些优点，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子还指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在的”启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR^TM)与本文披露的组合物一起来产生序列(参见US 4683202、US 5928906，各自通过引用并入本文)。此外，考虑也可以使用在非核细胞器(例如线粒体、叶绿体等)中引导序列的转录和/或表达的控制序列。

所用的启动子可以是组成型的、诱导型的、合成的、组织或细胞特异性的，和/或在适当的条件下可用于引导所引入的DNA区段的高水平表达，例如有利于重组蛋白和/或肽的大规模生产。另外，还可以掺入其他调节元件以改善编码TREM2突变体蛋白质的表达，所述其他调节元件为例如增强子、核糖体结合位点、转录终止序列等。

在一些实施例中，使用组成型启动子以提供TREM2突变体蛋白质的恒定表达。组成型启动子的实例包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子以及人基因启动子(例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子)。

诱导型启动子也被考虑作为本披露的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，所述分子开关能够当需要所述启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

在一些实施例中，使用组织或细胞特异性启动子从而仅在特定组织或细胞中提供TREM2突变体蛋白质的表达。组织或细胞特异性启动子或元件的特性以及表征其活性的测定是本领域技术人员熟知的。实例包括人LIMK2基因(Nomoto等人，1999，Gene[基因]，236(2)：259-271)、生长激素抑制素受体2基因(Kraus等人，1998，FEES Lett.[FEES快报]，428(3)：165-170)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等人，1999，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，274(12)：8282-8290)、人CD4(Zhao-Emonet等人，1998，Biochirn.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]，1442(2-3)：109-119)、小鼠α2(XI)胶原(Tsumaki等人，1998，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，273(36)：22861-22864)、D1A多巴胺受体基因(Lee等人，1997，J.Auton.Nerv.Syst.[自主神经系统杂志]，74(2-3)：86-90)、胰岛素样生长因子II(Wu等人，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]，233(1)：221-226)、人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等人，1996，J.Immunol.[免疫学杂志]，157(12)：5411-5421)、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子(Wang等人，Gene Ther.[基因疗法]2008年11月；15(22)：1489-99)。

在一些实施例中，启动子是细胞类型特异性启动子。例如，可以使用启动子来特异性地驱动TREM2在巨噬细胞、树突细胞或小神经胶质细胞中的表达。在一些实施例中，采用特异性启动子以在小神经胶质细胞中提供TREM2蛋白质表达。可以引导TREM2蛋白在小神经胶质细胞中表达的启动子包括但不限于TREM2启动子、TMEM119启动子、Hexb启动子、IBA1启动子、CD45启动子、CD11b启动子、Cst7启动子、Lp1启动子、Csf1启动子、Cs1R启动子、Itgax启动子、Clec7a启动子、Lilrb4启动子、Tyrobp启动子、Ctsb启动子、Ctsd启动子、B2m启动子、Lyz2启动子、Cx3cr1启动子、Cst3启动子、Ctss启动子、P2ry12启动子、C1qa启动子、C1qb启动子、Ax1启动子、Timp2启动子、Cts1启动子、Gnas启动子、Cd9启动子、Fth1启动子、Tmsb4x启动子。在一些实施例中，表达载体包括选自以下的启动子：TREM2启动子、TMEM119启动子、Hexb启动子、IBA1启动子、CD45启动子、CD11b启动子、Cst7启动子、Lp1启动子、Csf1启动子、Cs1R启动子、Itgax启动子、Clec7a启动子、Lilrb4启动子、Tyrobp启动子、Ctsb启动子、Ctsd启动子、B2m启动子、Lyz2启动子、Cx3cr1启动子、Cst3启动子、Ctss启动子、P2ry12启动子、C1qa启动子或C1qb启动子。在一些实施例中，表达载体包括TREM2启动子。

在一些实施例中，使用合成启动子以提供TREM2突变体蛋白质的表达。合成启动子可以显著超过天然启动子的转录效力。例如，可以选择不被内源性细胞机器或因子关闭或降低活性的合成启动子。可以将其他元件(包括反式作用因子结合位点和增强子)插入合成启动子中以提高转录效率。合成启动子可以被合理设计和化学合成，以组合合成启动子和生物启动子的最佳特征。将合成的寡核苷酸退火并且通过若干过程连接以产生全长化学合成的启动子。合成启动子可以是诱导型或细胞型特异性启动子。例如，可以合理地设计和化学合成可以在巨噬细胞、树突细胞或小神经胶质细胞中特异性驱动TREM2表达的合成启动子。

为了高效地翻译编码序列，也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“同框(in-frame)”，以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过包含合适的转录增强子元件提高表达效率。

表达可以使用本领域已知的任何适当的宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。原核和真核表达系统都是广泛可用的。在一些实施例中，表达系统是哺乳动物细胞表达系统，例如CHO细胞表达系统。在一些实施例中，可以对核酸进行密码子优化以促进在所需宿主细胞中表达。重要的是使用启动子和/或增强子，所述启动子和/或增强子有效地引导DNA区段在被选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中表达。分子生物学领域的技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达，例如参见Sambrook等人(2001)，通过引用并入本文。

大多数转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物中去除内含子。含有基因组真核生物序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白质表达的转录物的正确加工(参见Chandler等人，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，94(8)：3596-601)。

本披露的载体或构建体通常包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与通过RNA聚合酶来特异性终止RNA转录物的DNA序列构成。因此，在某些实施例中，考虑了终止RNA转录物产生的终止信号。体内可能需要终止子以达到所需的信息水平。在真核系统中，终止子区还可以包含特定的DNA序列，所述特定的DNA序列允许新转录物的位点特异性切割，从而暴露聚腺苷酸化位点。这表示专门的内源聚合酶在转录物的3’末端添加一段约200个A残基(聚A)。用这种聚A尾修饰的RNA分子显现更稳定并且更高效地被翻译。因此，在涉及真核生物的其他实施例中，优选的是此终止子包含用于切割RNA的信号，并且更优选的是终止子信号促进信息的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可以用于增强信息水平和/或使从盒到其他序列的通读最小化。被考虑用于本披露的终止子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何已知转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列(例如像牛生长激素终止子)或病毒终止序列(例如像SV40终止子)。在某些实施例中，终止信号可以例如由于序列截短而缺乏可转录或可翻译的序列。

在表达中，特别是真核表达中，通常将包括聚腺苷酸化信号以实现转录物的适当聚腺苷酸化。不认为聚腺苷酸化信号的性质对于本披露的成功实践是至关重要的，和/或可以采用任何这样的序列。优选的实施例包括方便和/或已知在各种靶细胞中良好地起作用的SV40聚腺苷酸化信号和/或牛生长激素聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化可以增加转录物的稳定性或可以促进细胞质转运。

为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以含有一个或多个复制位点起点(通常称为“ori”)，所述起点是启动复制的特定核酸序列。可替代地，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(ARS)。

在本披露的某些实施例中，可以通过在表达载体中包括标记物，在体外或体内鉴定含有本披露的核酸构建体的细胞。此类标记物将赋予细胞可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。通常，可选择标记物是赋予允许选择的特性的标记物。阳性可选择标记物是其中标记物的存在允许其选择的标记物，而阴性可选择标记物是其存在阻止其选择的标记物。阳性可选择标记物的实例是药物抗性标记物。

通常，包含药物选择标记物有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素和组氨醇抗性的基因是有用的可选择标记物。除了赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标记物之外，还考虑了其他类型的标记物，包括可筛选的标记物例如GFP(基于比色分析)。可替代地，可以使用可筛选的酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还已知可能结合FACS分析如何使用免疫标记物。所使用的标记物不被认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。可选择和可筛选的标记物的其他实例是本领域技术人员熟知的。

在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割(例如ADAM17或ADAM10切割)的人TREM2突变体的序列的表达载体。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的表达载体，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQID NO：33-40中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码人TREM2突变体的序列的表达载体，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文提供了包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列的表达载体，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQ ID NO：33-35中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码人TREM2突变体的序列的表达载体，所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQ ID NO：33-35中任一个的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文提供了包含编码人TREM2突变体的序列的表达载体，所述人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了包含编码人TREM2突变体的序列的表达载体，所述人TREM2突变体由选自SEQID NO：41-48中任一个的氨基酸序列组成。

在一些实施例中，表达载体包含在巨噬细胞、树突细胞或小神经胶质细胞中提供TREM2蛋白质表达的启动子。在一些实施例中，表达载体包含选自以下的启动子：TREM2启动子、TMEM119启动子、Hexb启动子、IBA1启动子、CD45启动子、CD11b启动子、Cst7启动子、Lp1启动子、Csf1启动子、Cs1R启动子、Itgax启动子、Clec7a启动子、Lilrb4启动子、Tyrobp启动子、Ctsb启动子、Ctsd启动子、B2m启动子、Lyz2启动子、Cx3cr1启动子、Cst3启动子、Ctss启动子、P2ry12启动子、C1qa启动子或C1qb启动子。在一些实施例中，表达载体包含TREM2启动子。

在一些实施例中，表达载体包含聚腺苷酸化信号。在一些实施例中，表达载体包含可选择标记物。

在一些实施例中，表达载体进一步包含编码DAP12蛋白的第二序列。在一些实施例中，DAP12蛋白包含SEQ ID NO：49。在一些实施例中，DAP12蛋白由SEQ ID NO：49组成。

在一些实施例中，用于表达TREM2多肽和DAP12多肽两者的表达载体可以包含在DAP12编码序列上游的内部核糖体进入位点(IRES)。IRES元件能够绕过5′-甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并且在内部位点处开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988，Nature[自然]，334：320-325)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)、以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991，Nature[自然]，353：90-94，1991)。IRES元件可以与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框可以一起转录，每个都由IRES分隔，这创建了多顺反子信息。凭借IRES元件，核糖体可以接近每个开放阅读框以进行高效翻译。可以使用单个启动子/增强子以转录单个信息来高效表达多种基因(参见美国专利5925565和5935819，通过引用并入本文)。

在一些实施例中，用于表达TREM2多肽和DAP12多肽两者的表达载体包含在DAP12编码序列上游的2A序列。2A寡肽序列首先从正链RNA小核糖核酸病毒口蹄疫病毒(FMDV)中表征；并且显示FMDV 2A或F2A介导FMDV多蛋白的上游(衣壳蛋白)和下游(RNA复制蛋白)结构域之间的共翻译“切割”(Ryan MD，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]1994；134：928-933；Ryan MD，J Gen Virol[普通病毒学杂志]1991；72：2727-2732；Donnelly MLL，J GenVirol[普通病毒学杂志]1997；78：13-21；Donnelly MLL，J Gen Virol[普通病毒学杂志]2001；82：1013-1025)。活跃的2A序列的特征在于来自小核糖核酸病毒其他属的病毒的基因组，加上在一系列不同RNA病毒和非LTR逆转录转座子的基因组中发现的“2A样”序列(Donnelly MLL，J Gen Virol[普通病毒学杂志]2001；82：1027-1041；Heras SR，Cell MolLife Sci[细胞与分子生命科学]2006；63：1449-1460；Luke GA，J Gen Virol[普通病毒学杂志]2008；89：1036-1042；Odon V，Mol Biol Evol[分子生物与进化]2013；30：1955-1965；Luke GA，Mob Gen Elements[可移动的遗传元件]2014；3：e27525)。显示这些2A或“2A样”寡肽序列介导翻译“重新编码”事件，称为“核糖体跳过(ribosomal skipping)”、“停止继续操作(stop carry-on)”或“断断续续的(stop-go)”翻译(Atkins JF，RNA 2007；13：1-8)。

如本文所用，“2A序列”是指编码2A或“2A样”寡肽的任何核酸序列，所述寡肽用作两个蛋白质之间的接头，允许多蛋白的自主核糖体内自我加工(参见例如，deFelipe.Genetic Vaccines and Ther.[基因疫苗与疗法]2：13(2004)；deFelipe等人Traffic[运输]5：616-626(2004))。这些寡肽允许从单一载体共表达多种蛋白质。许多2A元件是本领域已知的。例如，病毒2A序列已经描述于美国专利号9175311、8865881、7939059、7947493中，将其全部通过引用并入本文。例如，病毒2A序列可以是小核糖核酸病毒2A序列、四病毒2A序列或其组合。小核糖核酸病毒2A序列可以选自以下任一种：肠道病毒2A序列、鼻病毒2A序列、心病毒2A序列、口蹄疫病毒2A序列、肝病毒2A序列、马鼻炎病毒2A序列、嵴病毒2A序列、捷申病毒2A序列和副肠孤病毒2A序列。四病毒2A序列可以选自β四病毒2A序列或ω四病毒2A序列中的任一种。可用于本文披露的方法和系统的2A序列的实例包括但不限于来自口蹄疫病毒的2A序列(F2A)、来自马甲型鼻炎病毒的2A序列(E2A)、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的2A序列(T2A)和来自猪捷申病毒-1的2A序列(P2A)。在一些实施例中，2A序列编码选自以下的病毒2A寡肽：T2A(EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：52)或GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：53))、P2A(ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：54)或GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：55))、E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：56)或GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：57))、或F2A(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQID NO：58)或GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：59))。

非病毒2A序列已经描述于美国专利号8945876中，将其通过引用并入本文。例如，非病毒2A序列可以是海胆(紫色球海胆(Strongylocentrotus purpuratus))2A序列(DGFCILYLLLILLMRSGDVETNPGP)(SEQ ID NO：60)；海绵(大堡礁海绵(Amphimedonqueenslandica))2A序列(LLCFMLLLLLSGDVELNPGP(SEQ ID NO：61)或HHFMFLLLLLAGDIELNPGP(SEQ ID NO：62))；柱头虫(囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii))2A序列(WFLVLLSFILSGDIEVNPGP(SEQ ID NO：63))；或文昌鱼(佛罗里达文昌鱼(Branchiostoma floridae))2A序列(KNCAMYMLLLSGDVETNPGP(SEQ ID NO：64)或MVISQLMLKLAGDVEENPGP(SEQ ID NO：65))。在一些实施例中，2A序列是天然存在的或合成的序列，其包括2A共有序列D-X-E-X-NPGP(SEQ ID NO：66)，其中X是任何氨基酸残基。

在一些实施例中，表达载体包含编码选自SEQ ID NO：52-66中任一个的2A寡肽的2A序列。

在一些实施例中，编码人TREM2突变体的核酸还可以包括编码分泌信号序列的序列，使得多肽从宿主细胞中分泌。这种序列可以由载体提供，或作为载体中存在的TREM2核酸的一部分提供。

表达载体的产生可以利用包括多克隆位点(MCS)的载体，所述多克隆位点是含有多个限制性酶切位点的核酸区域，其中的任何位点都可以与标准重组技术结合使用以消化载体。参见Carbonelli等人，1999；Levenson等人，1998；和Cocea，1997，通过引用并入本文。“限制性酶切消化”是指用仅在核酸分子中的特定位置处起作用的酶催化切割核酸分子。许多这些限制性酶是可商购的。本领域技术人员广泛理解此类酶的用途。通常，使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，以使外源序列可与载体连接。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，这些核酸片段可以彼此邻接或不邻接。涉及限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员所熟知的。

用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主(通常参见Sambrook等人，同上)。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸露的DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合、药剂增强的对DNA的摄取、和离体转导。对于重组蛋白的长期高产量生产，通常需要稳定的表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和可选择标记物基因的表达载体来制备稳定表达多肽的细胞系。

本文还提供了包含本文所述的任何表达载体的细胞。在一些实施例中，包含用于表达抗脱落酶切割的人TREM2突变体的表达载体的此类细胞。在一些实施例中，包含用于表达人TREM2突变体和人DAP12蛋白二者的表达载体的此类细胞。在一些实施例中，包含用于表达人TREM2突变体的表达载体和用于表达人DAP12蛋白的第二表达载体的此类细胞。此类细胞可以是宿主细胞或治疗细胞。

在一些实施例中，本披露的特征在于包括本文所述的核酸分子的宿主细胞。宿主细胞可以用于产生或表达本文所述的抗脱落酶切割的人TREM2突变体。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用，其不仅是指特定的受试细胞，而且指这种细胞的子代或潜在子代。因为某些变化可以在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如本文所用的术语范围内。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，蛋白质可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞(例如COS-7细胞)、CV-1起源SV40细胞；Gluzman(1981)Cell[细胞]23：175-182)中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

宿主细胞可以用于产生或表达本文所述的人TREM2突变体。因此，本披露的特征还在于用于使用宿主细胞产生人TREM2突变体的方法。在一个实施例中，所述方法包括在合适的培养基中培养宿主细胞(在所述宿主细胞中已经引入编码蛋白质的重组表达载体)，使得产生人TREM2突变体。在另一个实施例中，所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞中分离人TREM2突变体。

在一些实施例中，本披露的特征在于包括本文所述的核酸分子的治疗细胞。如本文所用，术语“治疗细胞”是指已经在遗传上工程化以表达抗脱落酶切割的人TREM2突变体的细胞。这种治疗细胞可以是人细胞，例如巨噬细胞、树突细胞或小神经胶质细胞。

在一些实施例中，这种治疗细胞表达可检测标记物，例如荧光分子(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、发光分子(例如，萤光素酶)、放射性分子(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)或量热标记(如胶体金或彩色珠)。表达可检测标记物的细胞可以通过适当的检测方法(如显微镜检查、放射自显影和/或本领域已知的其他成像方法)来追踪或可视化。

治疗方法和治疗用途

本文提供了通过向受试者施用如本文披露的编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸，或包含这种核酸的载体或细胞来增加受试者(例如人)中TREM2表达的方法。所述受试者可以患有TREM2相关疾病或障碍。由于细胞表面人TREM2缺乏或TREM2过度脱落与人神经炎症和神经退行性病变相关，因此使用本文所述方法增加抗切割的人TREM2突变体的表达可以用于治疗或预防这种神经炎症或神经退行性疾病。编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸或包含此类核酸的载体或细胞也适用于治疗或预防由TREM2的广泛蛋白水解切割介导或与之相关的自身免疫障碍、炎性障碍或恶性障碍。

可以通过使用体外细胞测定、无细胞测定和/或体内动物模型筛选候选核酸或载体来鉴定可以增加TREM2表达水平的核酸或载体。例如，可以用候选核酸或载体转染或感染细胞。可以监测细胞表面上的TREM2水平(所述TREM2水平可以是具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的TREM2多肽或其片段的水平)，以确定与未处理细胞或用对照核酸或载体处理的细胞中TREM2多肽的水平相比，TREM2水平是否有所增加。样品中的细胞表面人TREM2水平可以通过本领域已知的测定来确定，例如通过流式细胞术、免疫组织化学、蛋白质印迹、免疫荧光测定、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、均相时间分辨荧光(HTRF)、或正电子发射断层扫描(PET)、或用针对人TREM2蛋白的抗体或抗体片段的任何其他免疫检测。

还可以通过在非人哺乳动物(例如，TREM2转基因或TREM2敲除的非人哺乳动物)中筛选候选核酸、载体或细胞来鉴定可以增加TREM表达水平的核酸、载体或细胞。例如，可以在施用了核酸、载体或细胞的一组非人哺乳动物中评估TREM2表达水平，并且与未治疗的对照哺乳动物相比较以确定施用核酸、载体或细胞是否导致TREM2水平升高。非人哺乳动物包括例如啮齿动物，例如大鼠、豚鼠和小鼠，以及农场动物，例如猪、绵羊、山羊、马和牛。还可以将非人哺乳动物设计成缺乏编码TREM2多肽的内源核酸或含有截短或破坏的内源TREM2核酸(例如敲除的动物)。

本文还提供了通过向受试者施用如本文披露的编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸，或包含这种核酸的载体或细胞来治疗受试者(例如人)的TREM2相关疾病或障碍的方法。

在一些实施例中，所述TREM2相关疾病或障碍是神经炎症或神经退行性疾病，所述神经炎症或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、那须-哈科拉病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、抗NMDA受体脑炎、自闭症、脑狼疮(NP-SLE)、化疗引起的周围神经病变(CIPN)、带状疱疹后神经痛、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、癫痫、格林-巴利综合征(GBS)、包涵体肌炎、溶酶体贮积病(例如鞘磷脂沉积病(C型尼曼-皮克病)、以及粘多糖病II/IIIB)、异染性脑白质营养不良、多灶性运动神经病、重症肌无力、神经白塞病、视神经脊髓炎(NMO)、视神经炎、多肌炎、皮肌炎、拉斯穆森脑炎、雷特综合征、中风、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、脊髓损伤、病毒性脑炎或细菌性脑膜炎。

在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍包括CNS相关疾病、PNS相关疾病、全身性炎症和其他与炎症有关的疾病、疼痛和由于滥用化学物质引起的戒断症状，与CNS相关的疾病或障碍包括广泛性焦虑障碍、认知障碍、学习和记忆缺陷和功能障碍、阿尔茨海默病(轻度、中度和重度)、注意力缺陷和多动障碍、帕金森病、帕金森病痴呆、亨延顿病、ALS、朊蛋白性神经退行性障碍(如克-雅病(Creutzfeld-Jacob disease)和库鲁病(kuru disease))、抽动秽语综合征、精神病、抑郁症和抑郁障碍、躁狂症、躁狂抑郁症、精神分裂症、精神分裂症的认知缺陷、强迫症、恐慌症、饮食障碍、发作性睡病、伤害感受、AIDS-痴呆、老年性痴呆、与年龄相关的轻度认知障碍(MCI)、年龄相关记忆障碍、孤独症、阅读障碍、迟发性运动障碍、癫痫和惊厥性疾患、创伤后应激障碍、短暂性缺氧、假性痴呆、月经前期综合征、黄体晚期综合征、慢性疲劳综合征和时差综合征。

TREM2相关疾病或障碍还包括：免疫障碍，尤其涉及炎性障碍(如细菌感染、真菌感染、病毒感染、原生动物或其他寄生虫感染、银屑病、败血症、脑型疟疾、炎性肠病、关节炎(如类风湿性关节炎)、毛囊炎、脓疱疮、肉芽肿、类脂性肺炎、血管炎和骨关节炎)，自身免疫障碍(如类风湿性关节炎、甲状腺炎(如桥本氏甲状腺炎和格雷夫斯病)、胰岛素抗性糖尿病、恶性贫血、艾迪生氏病、天疱疮、白癜风、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、合格伦综合征、多发性硬化、皮肌炎、混合性结缔组织病、硬皮病、多肌炎、移植排斥(如同种异体移植排斥))，T细胞障碍(如AIDS)，过敏性炎性障碍(如皮肤和/或粘膜过敏，如过敏性鼻炎、哮喘、银屑病)，神经障碍，眼障碍，胚胎障碍，或与异常TREM2活性和/或表达直接或间接相关的任何其他障碍(如肿瘤、癌症、白血病、髓系疾病和创伤)。

在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍是由TREM2的广泛蛋白水解切割或表达TREM2受体异常或突变变体的细胞介导的或与之相关的自身免疫障碍、炎性障碍或恶性障碍。自身免疫疾病的实例包括但不限于关节炎(例如类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎和畸形性关节炎)和风湿性疾病，包括炎性病症和涉及骨损失的风湿性疾病、炎性疼痛、脊柱关节病(包括强直性脊柱炎)、莱特尔综合征、反应性关节炎、银屑病性关节炎和肠病性关节炎(enterophathis arthritis)、超敏反应(包括气道超敏反应和皮肤超敏反应)和过敏症。自身免疫疾病包括自身免疫性血障液碍(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血和特发性血小板减少症)、系统性红斑狼疮、炎性肌障碍、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、史蒂芬强森综合征、特发性口炎性腹泻、内分泌性眼病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎(前部和后部)、干燥性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎、间质性肺纤维化、银屑病性关节炎和肾小球肾炎(伴有和不伴有肾病综合征，例如包括痛风、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、特发性肾病综合征或微小病变肾病)、肿瘤、皮肤和角膜炎性疾病、肌炎、骨植入物松动、代谢障碍(如动脉粥样硬化、糖尿病和血脂异常)。

在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍选自哮喘、支气管炎、肺尘埃沉着病、肺气肿、气道的其他阻塞性或炎性疾病，包括特发性肺纤维化或COPD。

在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍是造血或肝源性细胞恶性障碍，例如急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生性障碍、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、范可尼贫血(fanconi anemi)、重型地中海贫血症、威-奥二氏综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、嗜血淋巴组织细胞瘤病。

在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍选自哮喘、脑炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏障碍、败血性休克、肺纤维化、未分化的脊柱关节炎、未分化的关节病、关节炎、炎症性骨质溶解、或由慢性病毒性或细菌性感染所致的慢性炎症。

在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍选自痴呆、额颞叶痴呆、阿尔茨海默病、血管性痴呆、混合性痴呆、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、正常压力脑积水、肌萎缩侧索硬化、亨延顿病、tau蛋白病、那须-哈科拉病、中风、急性创伤、慢性创伤、狼疮、急慢性结肠炎、伤口愈合、克罗恩病、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、肥胖、疟疾、特发性震颤、中枢神经系统狼疮、白塞氏病、帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩、多系统萎缩综合征(Shy-Drager syndrome)、进行性核上性麻痹、皮质基底神经节变性、急性播散性脑脊髓炎、肉芽肿性疾病、结节病、衰老疾病、癫痫、脊髓损伤、创伤性脑损伤、年龄相关性黄斑变性、青光眼、色素性视网膜炎、视网膜变性、呼吸道感染、败血症、眼感染、全身性感染、狼疮、关节炎、多发性硬化、低骨密度、骨质疏松症、骨生成、骨硬化病(osteopetrotic disease)、佩吉特骨病(Paget’s disease of bone)和癌症。

在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍选自痴呆、额颞叶痴呆、阿尔茨海默病、那须-哈科拉病和多发性硬化。在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍是痴呆，例如额颞叶痴呆、阿尔茨海默病、血管性痴呆、语义性痴呆或路易体痴呆。在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍是阿尔茨海默病。在一些实施例中，TREM2相关疾病或障碍是额颞叶痴呆。

在一些实施例中，通过静脉内、颅内、鞘内、皮下或鼻内途径向受试者施用核酸、载体或细胞。

在一些实施例中，此类方法还包括在从受试者获得的样品中(例如，脑脊液样品)测定细胞表面人TREM2水平。样品中的细胞表面人TREM2水平可以通过本领域已知的测定来确定，例如通过流式细胞术、免疫组织化学、蛋白质印迹、免疫荧光测定、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、均相时间分辨荧光(HTRF)、或正电子发射断层扫描(PET)、或用针对人TREM2蛋白的抗体或抗体片段的任何其他免疫检测。

本文还提供了如本文披露的编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸或包含这种核酸的载体或细胞用于治疗受试者中TREM2相关疾病或障碍的用途。还包括如本文披露的编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸或包含这种核酸的载体或细胞在制造用于治疗TREM2相关疾病或障碍的药物中的用途。

组合疗法

上述各种治疗可以与其他治疗配伍组合，例如TREM2相关疾病或障碍的当前护理标准，例如，阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、肌萎缩侧索硬化或那须-哈科拉病的当前护理标准。例如，如本文所述的编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的核酸或含有此类核酸的载体或细胞可以与BACE抑制剂、抗Tau抗体、抗淀粉样蛋白β抗体、FTY720、BG12、干扰素β或那他珠单抗(tysabri)中的一种或多种组合。因此，本文所述的治疗TREM2相关疾病或障碍的方法可以进一步包括向需要治疗的受试者施用第二药剂。

术语“组合”是指呈一个剂量单位形式的固定组合；或组合施用，其中本发明的化合物与组合配偶物(partner)(例如下文所解释的另一种药物，也称为“治疗剂”或“共药剂(co-agent)”)可以在同一时间独立地施用或在时间间隔内分开地施用，特别是在这些时间间隔允许组合配偶物显示协作(例如协同)效应的情况下。单个组分可以包装在一个试剂盒中或分开包装。可在施用之前将一种或两种组分(例如粉末或液体)重构或稀释至所需剂量。如本文所用，术语“共同施用”或“组合施用”等意指涵盖向有需要的单个受试者(例如患者)施用所选择的组合配偶物，并且旨在包括其中药剂不一定通过相同的施用途径施用或同时施用的治疗方案。如本文所用，术语“药物组合”意指由多于一种治疗剂的混合或组合所产生的产品，并且包括治疗剂的固定和非固定组合两者。术语“固定组合”意指治疗剂(例如，本发明的化合物和组合配偶物)以单一实体或剂量的形式同时地向患者施用。术语“非固定组合”意指治疗剂(例如，本发明的化合物和组合配偶物)作为分开的实体同时地、并行地或依序地向患者施用(没有特定的时间限制)，其中这种施用在患者体内提供治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如三种或更多种治疗剂的施用。

如本文所用，术语“药物组合”是指呈一个剂量单位形式的固定组合；或用于组合给予的非固定组合或成套试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以在同一时间独立地给予或在时间间隔内分开给予，尤其是其中这些时间间隔允许组合配偶物显示合作性例如协同效应。

术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗在本披露中描述的所治疗的病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，如以具有固定比率的活性成分的单个胶囊施用。可替代地，这种施用涵盖以对于每种活性成分的多个或分开的容器(例如，片剂、胶囊、粉末和液体)共同施用。可以在施用之前将粉末和/或液体重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以依序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。

样品制备

可以使用本领域已知的任何方法(例如通过活检或手术)从受试者获得本文所述的方法中使用的样品。例如，可以通过腰椎穿刺获得包含脑脊液的样品，其中将附接到注射器的细针插入腰部区域中的椎管中并且产生真空以使得脑脊液可以通过针吸入并且收集在注射器中。CT成像、超声波或内窥镜可以用于指导此类手术。可以将样品快速冷冻并且储存于-80℃以备后用。也可以将样品用固定剂(例如甲醛、多聚甲醛或乙酸/乙醇)固定。可以从新鲜、冷冻或固定的样品中提取RNA或蛋白质用于分析。

药物组合物、剂量和施用方法

本文还提供了组合物，例如药物组合物，其包含如本文所述的编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的一种或多种核酸、或含有此类核酸的载体或细胞。此类组合物可以进一步包含另一种药剂，例如针对待治疗疾病的当前护理标准。

药物组合物典型地包含药学上可接受的载体。如本文所用，表述“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、涂料、抗细菌的和抗真菌的药剂、等渗剂和吸收延迟剂等。典型地，药物组合物配被制成与预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、动脉内、腹膜内)、口服、颅内、鞘内或鼻内(例如吸入)、真皮内、皮下或透粘膜施用。在一些实施例中，配制药物组合物以递送TREM2结合分子以穿过血脑屏障。

在一些实施例中，这些药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体，包括例如，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇、和羊毛脂。

配制适合的药物组合物的方法在本领域中是已知的，参见，例如，Remington：TheScience and Practice of Pharmacy.[雷明顿：药物科学与实践]第21版，2005；以及在Drugs and the Pharmaceutical Sciences：a Series of Textbooks and Monographs[药物与药物科学：一系列教科书和专著](Dekker，NY)系列中的书籍。例如，用于肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的药剂如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适合于注射使用的药物组合物可以包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(巴斯夫公司(BASF)，帕西波尼(Parsippany)，新泽西州(NJ))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且应具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下应稳定并且必须抗诸如细菌和真菌的微生物污染作用而保存。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。例如，可以通过使用涂层(如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶延长可注射组合物的吸收。

无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量，根据需要，与上文所列举成分中的一种或这些成分的组合掺入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌。

总体上，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上所列举那些成分的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。

肠胃外配制品可以是单次推注剂量、输注或加载推注剂量，然后是维持剂量。可以按具体的固定或可变的间隔，例如每天一次，或“按需”施用这些组合物。

用于注射的合适的药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选的稳定剂(例如，人白蛋白)等。外周施用的制剂包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括例如水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在一些实施例中，药物组合物包含0.01-0.1M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常见肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。出于口服治疗性施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊(例如明胶胶囊)的形式使用。口服组合物还可以使用用作嗽口水的液体载体来制备。可以包括药学上相容的粘合剂、和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、普拉莫胶(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品。

对于通过吸入施用，可以从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或喷雾器以气溶胶喷雾形式递送化合物。此类方法包括描述于美国专利号6,468,798中的那些方法。如本文所述的治疗化合物的全身施用也可以通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在配制品中使用对有待渗透的屏障适当的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如就经粘膜给药而言，洗涤剂、胆盐、以及梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷剂或栓剂来完成。对于透皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。

在一个实施例中，将治疗化合物与载体(其保护治疗化合物免于从体内快速消除)一起制备，例如控释配制品，包括植入物和微囊化的递送系统。

药物组合物可以与施用的说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。

在非限制性实例中，将包含至少一种药剂的药物组合物配制成液体(例如，热固性液体)，配制成固体的组分(例如，粉末或可生物降解的生物相容性聚合物(例如，阳离子可生物降解的生物相容性聚合物))，或配制成凝胶的组分(例如，可生物降解的生物相容性聚合物)。在一些实施例中，将包含至少一种药剂的至少组合物配制成选自以下项的组的凝胶：海藻酸盐凝胶(例如，海藻酸钠)、纤维素基凝胶(例如，羧甲基纤维素或羧乙基纤维素)、或壳聚糖基凝胶(例如，壳聚糖甘油磷酸盐)。可用于配制本文描述的任何药物组合物的药物洗脱聚合物的另外的非限制性实例包括角叉菜胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、与聚乙烯醇组合的葡聚糖、与聚丙烯酸组合的葡聚糖、聚半乳糖醛酸、半乳糖醛酸多糖、polysalactic酸、聚乙醇酸、罗望子胶、黄原胶、纤维素胶、瓜尔胶(羧甲基瓜尔胶)、果胶、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、N-异丙基聚丙烯酰胺(N-isopropylpolyacrylomide)、聚氧乙烯、聚氧丙烯、普朗尼克酸(pluronic acid)、聚乳酸、环糊精、环状直链淀粉、节肢弹性蛋白(resilin)、聚丁二烯、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HP MA)共聚物、马来酸酐-烷基乙烯基醚、聚缩肽(polydepsipeptide)、聚羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二噁烷酮、聚乙二醇、聚有机膦腈、聚原酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚酸酐、polysilamine、聚N-乙烯基己内酰胺、和结冷胶。

治疗化合物的剂量、毒性与治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但是应小心设计将此类化合物靶向至受累组织的位点的递送系统，从而将对未感染的细胞的潜在损伤最小化，并且由此减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于在人中使用的剂量。优选此类化合物的剂量处于包括ED50在内的有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。所述剂量可以根据所使用的剂型和所用的施用途径在此范围内变化。对于用于本文披露方法的任何化合物，均可根据细胞培养测定初步估计治疗有效剂量。剂量可以在动物模型中被配制以达到在细胞培养中确定的循环血浆浓度范围，所述范围包括IC50(即，所述测试化合物完成半最大症状的抑制的浓度)。此类信息可用于更准确地确定在人中有用的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。

试剂盒

本文还提供了试剂盒，其包含如本文所述的编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的一种或多种核酸、或含有此类核酸的载体或细胞以及使用说明书。使用说明书可以包括用于诊断或治疗TREM2相关疾病或障碍的说明。如本文提供的试剂盒可以根据本文所述的任何方法使用。本领域技术人员将意识到本文提供的试剂盒的其他合适用途，并且将能够使用所述试剂盒用于此类用途。本文提供的试剂盒还可以包括邮寄物(例如，邮资支付信封或邮寄包)，其可以用于将用于分析的样品返回到例如实验室。试剂盒可以包括一个或多个用于样品的容器，或样品可以在标准血液收集小瓶中。试剂盒还可以包括以下的一种或多种：知情同意书、测试申请表和关于如何在本文所述方法中使用试剂盒的说明书。本文还包括使用此类试剂盒的方法。可以对一个或多个表格(例如，测试申请表)和装有样品的容器例如用条形码(用于鉴定提供样品的受试者)进行编码。

本领域技术人员将认识到与本文所述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料可以用于本发明的实践中。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。

实例

在以下实例中进一步描述了本发明，所述实例不限制权利要求中所述的本发明的范围。

实例1：材料和方法

化合物.

GI254023((2R，3S)-3-(甲酰基-羟氨基)-2-(3-苯基-1-丙基)丁酸[(1S)-2，2-二甲基-1-甲基氨基甲酰基-1-丙基]酰胺)是如Hundhausen等人，Blood.[血液]2003；102：1186-1195)中所描述的合成。DPC333((2R)-2-((3R)-3-氨基-3{4-[2-甲基-4-喹啉基)甲氧基]苯基}-2-氧代吡咯烷基)-N-羟基-4-甲基戊酰胺))是如Qian等人，Drug metabolismand disposition：the biological fate of chemicals[药物代谢与处置：化学品的生物命运]35，1916-1925，2007中所描述的合成。

细胞培养.

在含有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％pen/strep和10μg/ml杀稻瘟素(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))的RPMI培养基中培养稳定共表达Cas9和通过慢病毒递送的杀稻瘟素抗性基因的THP1细胞。将细胞在37℃下在5％CO₂气氛中培养。

ADAM17和ADAM10敲除系的产生.

将THP1-Cas9细胞用表达嘌呤霉素抗性基因和靶向ADAM10(GTAATGTGAGAGACTTTGGG，SEQ ID NO：75)或ADAM17(CCGAAGCCCGGGTCATCCGG，SEQ ID NO：76)的sgRNA的慢病毒感染(对于载体设计，参见Hoffman，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America[美国国家科学院院刊]111，3128-3133，2014)。如前所述，在HEK293T细胞中进行慢病毒包装。简而言之，将30μL慢病毒sgRNA上清液添加到在含有5μg/ml聚凝胺(西格玛(Sigma))的2ml培养基中的1x10⁶个THP1-Cas9细胞中，并且在6孔板中以300g离心90分钟。24小时后，将细胞离心并且重悬于含有1.5μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基中。每周更换培养基持续4周后，使用Quick-gDNA miniprep试剂盒(兹莫研究公司(Zymo Research))分离基因组DNA，以通过下一代测序(NGS)评估在池中存在的插入缺失(indel)。为了分离仅含有移码插入缺失的克隆，将细胞以有限稀释法铺板到96孔板中。克隆扩增后，将它们通过NGS分析，并且选择仅含有移码等位基因的克隆进行下游测定。

NGS插入缺失分析.

为了制备用于NGS的工程化细胞，使用基因座特异性引物扩增每个靶标。进行了两轮PCR。第一轮利用基因座特异性引物来扩增经编辑的区域。用于ADAM10的引物是ATTAGACAATACTTACTGGGGATCC(SEQ ID NO：77)和GGAAGCTCTGGAGGAATATGTG(SEQ ID NO：78)，并且用于ADAM17的引物是CCCCCAAACACCTGATAGAC(SEQ ID NO：79)和CCAGAGAGGTGGAGTCGGTA(SEQ ID NO：80)。然后将在第一轮期间形成的产物用作第二轮PCR的模板，以添加与Illumina系统相容的双指标。用于两个靶区域的Illumina Nextera衔接子序列是TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：81)和GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：82)。将文库通过qRT-PCR进行定量，并且后续在IlluminaMiSeq系统上测序。对于序列分析，将原始读段与参考序列进行比对，然后基于基因型进行计算。最后，计算的基因型可归入以下三类之一：野生型、框内和移码。

突变的TREM2在HEK293细胞中的细胞表面表达.

使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)生成人TREM2突变体，并且通过序列分析确认。根据制造商的建议，使用Lipofectamine LTX试剂(赛默飞世尔(Thermofischer))在HEK-FT细胞中以1∶1的hDAP12和TREM2的比率进行互补DNA(cDNA)构建体的转染。转染后48h，将细胞用50ng/ml PMA或0.05％DMSO处理30min，并且用细胞解离溶液Accutase(西格玛)解离，并且用山羊抗人TREM2抗体AF1828(研发系统公司(R&DSystems))或同种型对照染色，然后与Alexa Fluor 488缀合的二抗(分子探针公司(Molecular Probes))孵育。使用BD FACSCanto II(BD生物科学公司(BD biosciences))进行采集。

在人类巨噬细胞和CHO细胞中的TREM2表达

根据制造商的建议，使用Lipofectamine LTX试剂(赛默飞世尔)转染CHO细胞以共表达hDAP12和hTREM2。选择一个阳性克隆，并且将其设计为CHO-hDAP12-hTREM2。使用针对单核细胞的阴性分离试剂盒(干细胞技术公司(Stem cell technologies))从血沉棕黄层中获得人M2A巨噬细胞，并且在RPMI1640培养基中分化5天，所述培养基具有Glutamax(Gibco公司)，补充有10％FBS(Gibco公司)、PenStrep(Gibco公司)、1％丙酮酸钠(Gibco公司)、0.025M HEPES缓冲液(Gibco公司)、0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco公司)、M-CSF(40ng/ml)和IL-4(50ng/ml)。如上所述，通过FACS检测细胞表面TREM2。

活细胞成像.

将人M2A巨噬细胞或CHO-hDAP12-hTREM2接种于384孔板(格莱恩公司(Greiner))上，并且以图中所指示的浓度用ADAM抑制剂DPC333或GI254023处理。16h后，将细胞用PMA(50ng/ml)处理30分钟或用0.1％DMSO处理30分钟。将板置于冰上，并且用山羊抗人TREM2抗体AF1828(研发系统公司)或同种型对照染色，以及Hoechst染色，然后与Alexa Fluor488缀合的抗山羊二抗(分子探针公司)一起孵育。使用InCell2000分析仪(通用医疗(GEHealthcare))采集图像。对于图像定量，应用了免费的开源软件CellProfiler。

BWZ细胞中的报告基因测定

将BWZ胸腺瘤报告细胞(在激活T细胞核因子的启动子的控制下表达lacZ(NFAT，Hsieh等人，Journal of Neurochemistry[神经化学杂志]109，1144-1156，2009))转染以共表达mDAP12和WT hTREM2或T2双重TREM2。在预先涂有大鼠抗小鼠/人TREM2 mAb(R&D，MAB17291)或同种型对照的高结合微量滴定板(格莱恩公司)上，将细胞接种于不含酚红并且补充有2％FBS和1％非必需氨基酸的RPMI中。将细胞继续培养16h。使用Envision 2104多标记读取仪(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))，根据制造商的建议，用Beta-glo测定系统(普洛麦格公司(Promega))评估了报告基因的活性。

免疫纯化.

通过微尺度免疫纯化从细胞上清液中纯化脱落的TREM2。这是在MEA平台(菲尼克斯公司(PhyNexus))上进行的，并且已经使用链霉亲和素涂覆的吸头(PTR 92-05-05，菲尼克斯公司)。首先，用PBS平衡吸头，然后以.25mL/min的速度将200μL生物素化的抗TREM2抗体(0.55pmol/μL，来自研发系统公司的BAF1828)加载到链霉亲和素μ柱(5μL床体积)上，并且传代8代。用PBS洗涤后，以25mL/min的速度从细胞上清液(200μL)中捕获脱落的TREM2，并且传代12代。随后进行PBS洗涤，并且用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱(2x4遍)，终体积为2x60μL。将后者溶液通过添加1M Tris-HCl pH 10(5μl)中和，然后干燥(真空离心浓缩器(Speedvac))，并且用8M脲(5μL，Fluka)和0.4M NH₄CO₃(30μL，Fluka)进行再水化。然后将样品还原(2μL的1M DTT，在50℃下30min)，烷基化(6μl的1M IAA(西格玛)，在黑暗中在室温下30min)，并且通过添加1M DTT(2μL)和0.4M NH₄CO₃(30μl)终止反应。将所得的样品通过胰蛋白酶或Asp-/G1u-C酶(+1μl的胰蛋白酶(普洛麦格公司)或Asp-/Glu C(罗氏公司(Roche))，1μg/μl，pH8，在37℃下孵育过夜)消化。最终，将消化的样品用HCOOH(1μL，Fluka)酸化，并且将25μL所得的消化物注射到LC-MS平台。

质谱.

通过肽图鉴定切割位点：使用联接UPLC(ACQUITYI类，沃特世)的SYNAPT G2S QTOF质谱仪(沃特世(WATERS))进行LC-MSE分析。使用BEH C18 UPLC柱(1.7μm，1×100mm，沃特世)进行肽分离。使用以下程序产生具有流动相A(在水中的0.1％HCOOH)和流动相B(在乙腈中的0.1％HCOOH)的洗脱梯度：1)在2％B等度持续3min；2)从3到90min从2％到30％B的线性梯度；3)从90到95min从30％到100％B的线性梯度；4)从95到105min在100％B等度；5)从105到105.5min从100％到2％B的线性梯度；以及最后6)从105.5到120min在2％B等度。质谱仪通过锁定喷雾系统(P14R肽，m/z767.433，以5μL/min以250fmol注入，切换频率是每20sec，每次扫描0.5sec，平均3次扫描)用自动质量校正以正分辨率模式工作。采集了2个MS迹线，一个MS，一个MSE。两者均在质量范围m/z 50-2000、扫描时间0.5sec、毛细管电压3kV、锥孔电压40V下采集到。在MSE模式下，每次扫描的阱电压从20V升高到40V。此外，在214nm的波长下采集了UV迹线。

通过完整质量测量来鉴定切割位点.

使用联接UPLC(ACQUITY I类，沃特世)的SYNAPT G1 QTOF质谱仪(沃特世)进行LC-MS分析。使用BEH C4 UPLC柱(1.7μm，1×100mm，沃特世)进行蛋白质分离。使用以下程序产生具有流动相A(在水中的0.1％HCOOH)和流动相B(在乙腈中的0.1％HCOOH)的洗脱梯度：1)在5％B等度持续1.5min；2)从1.5到2min从5％到25％B的线性梯度；3)从2到12min从25％至35％B的线性梯度；4)从12到13min从35％到95％B的线性梯度；5)从13到15min在95％B等度；5)从15到15.5min从95％到5％B的线性梯度；以及最后6)从15.5到20min在5％B等度。质谱仪以正分辨率模式工作，并且用NaI 2mg/mL校准。在质量范围m/z 600-4500、扫描时间0.5sec、毛细管电压3kV、锥孔电压40V、去溶剂化温度200℃、锥孔气流量50L/h下采集MS迹线。另外，在214nm的波长下采集UV迹线。

O-连接的糖基化的鉴定.

使用联接UPLC(ACQUITY H类，沃特世)的QTOF Premier质谱仪(沃特世)进行LC-MSE分析。使用BEH C18UPLC柱(1.7μm，1×100mm，沃特世)进行肽分离。使用以下程序产生具有流动相A(在98％水和2％乙腈中的0.1％HCOOH)和流动相B(在乙腈中的0.1％HCOOH)的洗脱梯度：1)在2％B等度持续3min；2)从3到90min从2％到30％B的线性梯度；3)从90到95min从30％到100％B的线性梯度；4)从95到105min在100％B等度；5)从105到105.5min从100％到2％B的线性梯度；以及最后6)从105.5到120min在2％B等度。质谱仪用锁定喷雾系统(P14R肽，以10μL/min以1pmol注入，切换频率是每20sec，每次扫描0.5sec，平均3次扫描)以正性正常模式工作。在用PLGS(沃特世)进行数据处理期间，通过应用锁定质量(2+，767.433Da)进行质量校正。采集了2个MS迹线，一个MS，一个MSE。两者均在质量范围m/z 50-2000、扫描时间0.5sec、毛细管电压3kV、锥孔电压40V下采集到。在MSE模式下，每次扫描的阱电压从20V升高到40V。此外，在214nm的波长下采集了UV迹线。

统计分析.

在适当的情况下，使用Prism软件(GraphPad，圣地亚哥，加利福尼亚州)，使用ANOVA和学生t检验来进行统计分析。认为＜0.05的p值是显著的。

实例2：ADAM17抑制剂在细胞表面稳定TREM2

髓系细胞触发受体蛋白(TREM2)是I型跨膜糖蛋白和免疫球蛋白(Ig)受体超家族成员(Bouchon等人，The Journal of Experimental Medicine[实验医学杂志]194，1111-1122，2001)。已经在巨噬细胞、树突细胞、小神经胶质细胞和破骨细胞中显示了TREM2表达，并且表达似乎受到时间和空间调控(Lue等人，Neuroscience[神经科学]302，138-150，2015；Schmid等人，Journal of Neurochemistry[神经化学杂志]83，1309-1320，2002；Sessa等人，The European Journal of Neuroscience[欧洲神经科学杂志]20，2617-2628，2004)。在巨噬细胞中，在炎症的过程中TREM2表达上调，例如，在腹膜炎的鼠模型中，在巯基乙醇酸盐激发后2-3天表达达到峰值(Turnbull等人，Journal of Immunology[免疫学杂志]177，3520-3524，2006)。TREM2还富集在接触Aβ斑块或神经元碎片的那些小神经胶质细胞表面区域(Yuan等人，Neuron[神经元]90，724-739，2016)。最近已经鉴定了在这种环境中由TREM2感测的一些配体，例如磷脂和髓鞘质脂质(Poliani等人，The Journal ofClinical Investigation[临床调查杂志]125，2161-2170，2015)以及ApoE(Atagi等人，TheJournal of Biological Chemistry[生物化学杂志]290，26043-26050，2015；Bailey等人，The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]290，26033-26042，2015)。其他配体可以是Aβ和斑块相关的神经元碎片，因为TREM2有助于将Aβ摄取到小神经胶质细胞中(Xiang等人，EMBO Molecular Medicine[欧洲分子生物学学会杂志之分子医学]8，992-1004，2016)。

这与早期的全基因组关联研究非常吻合，所述研究显示编码R47H变体的TREM2SNP(rs75932628-T)使得晚发性阿尔茨海默病(LOAD)的风险显著增加，具有5.05的优势比(Guerreiro等人，The New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志]368，117-127，2013)和2.92的优势比(Jonsson等人，The New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志]368，107-116，2013)。这些优势比与确立已久的AD风险基因APOE4的优势比具有可比性(Neumann和Daly，The New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志]368，182-184，2013)。值得注意的是，R47H突变的TREM2与WT TREM2的细胞表面表达几乎相同(Kleinberger，2014)，但是功能受损：TREM2中的R47H突变降低脂质配体(Wang等人，Cell[细胞]160，1061-1071，2015)和ApoE(Atagi，2015；Bailey，2015)的结合。所述突变还降低了吞噬能力(Kleinberger，2014)，并且阻碍了经由逆向囊泡转运复合物(retromercomplex)中的Vps35再循环TREM2(Yin等人，Traffic 17，1286-1296，2016)。已经表征了一些不患有AD的人R47H携带者，并且这些个体的脑容量比非携带者失去更快(Rajagopalan等人，The New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志]369，1565-1567，2013)，具有比年龄匹配对照者差的认知功能(Jonsson等人，The New England Journal ofMedicine[新英格兰医学杂志]368，107-116，2013)，并且显示促炎症细胞因子(例如RANTES，INFγ)的上调和保护性标记物(例如IL-4，ApoA1；参见Roussos等人，Alzheimer′s&Dementia：the Journal of the Alzheimer′s Association[阿尔茨海默病和痴呆：阿尔茨海默病协会杂志]11，1163-1170，2015)的下调。

为了确定ADAM10或ADAM17对TREM2胞外结构域脱落的贡献，鉴定了选择性抑制剂：DPC333(Qian等人，Drug Metabolism and Disposition：the Biological Fate ofChemicals[药物代谢与处置：化学品的生物命运]35，1916-1925，2007)和GI254023(Hundhausen等人，Blood.[血液]2003；102：1186-1195)。DPC333和GI254023的特征在于对ADAM10和ADAM17的抑制选择性。图2E示出了DPC333是对ADAM17(IC₅₀＜0.6nM)比对ADAM10(IC₅₀＝5.3nM)更有力的抑制剂，并且显示GI254023针对ADAM17(IC₅₀＝196nM)的选择性超过针对ADAM10(IC₅₀ 1.5nM)的选择性。使用活细胞成像，在条件式脱落条件下将细胞用两种ADAM抑制剂过夜处理后(图2A)或将细胞用PMA处理细胞后(图2B)，在CHO-hDAP12-hTREM2细胞中评估了hTREM2的细胞表面表达。在两种条件下，ADAM17选择性抑制剂DPC333剂量依赖性地增加TREM2细胞表面水平。对于GI254023，在较高浓度下还观察到对TREM2细胞表面水平的有限作用，但是仅在稳定状态条件下如此。此作用可能归因于真正的ADAM10抑制，或者可能是由G1254023在高浓度下使用时对ADAM17的非特异性抑制引起的。在PMA处理的细胞中，完全没有GI254023对TREM2细胞表面表达的作用(图2B)。为了更接近生理细胞系统，在从CD14⁺人单核细胞分化的人M2A巨噬细胞中进行了相似的实验(图2C-2D)。这些结果很好地复制了在CHO-hDAP12-hTREM2细胞中的最初发现；在两种情况下，ADAM17抑制剂DPC333剂量依赖性地增加TREM2细胞表面表达(图2C-2D)，而选择性ADAM10抑制剂对稳定状态脱落显示出小的作用(图2C)。

总之，这些实验指示，在人巨噬细胞中，ADAM17对于TREM2脱落起关键作用，但是在稳定状态条件下不能排除ADAM10的少量贡献。

实例3：THP1细胞中的ADAM17消融减少了组成型脱落

为了确认实例2中的结果，使用遗传方法来进一步研究ADAM10/17对TREM2脱落的贡献。选择人单核细胞THP1细胞作为内源性表达TREM2的模型系统。使用CRISPR/CAS9技术，产生了缺少ADAM10(AD10 H4)或ADAM17(AD17 G12)表达的克隆以及对照细胞系(CtrlgRNA)。通过FACS分析或蛋白质印迹验证了基因产物的不存在(图3C-3D)。

使用三种不同的条件在同一实验中的三种细胞系中评估细胞表面表达的TREM2和sTREM2：没有反映组成型脱落的处理，最大程度激活脱落的PMA处理，以及最后是PMA和DPC333处理。在条件式脱落条件下，ADAM17的丧失增加了TREM2细胞表面的表达，并且大大降低可溶性TREM2，然而缺少ADAM10没有显著的作用(参见图3A-3B中的黑条)，从而指示ADAM17是促成组成型脱落的主要脱落酶。在对照细胞系和ADAM10缺陷型克隆中，用PMA最大限度地激活脱落酶导致细胞表面TREM2的强烈降低。sTREM2的强烈增加反映了这一点。在ADAM17缺陷型细胞系中，PMA处理还导致细胞表面TREM2的减少，但是程度小于对照CRISPR克隆。而且，与PMA处理的对照CRISPR克隆和ADAM10缺陷型克隆相比，sTREM2的增加较小。然而，在存在PMA的情况下，在AD17G12克隆中TREM2的切割必须是由ADAM17以外的脱落酶引起的。因此，在ADAM10 H4克隆中，PMA诱导的脱落的增加可能是由ADAM17的另外的激活引起的。用PMA和DPC333共同处理恢复了在Ctrl gRNA和AD10 H4细胞中的TREM2细胞表面水平，但是在AD17 G12克隆中具有较小的作用。在AD17 G12克隆中，细胞表面TREM2水平未达到在组成型脱落条件下所见的程度。然而，与仅PMA处理相比，在这些条件下，在AD17 G12克隆中的sTREM2强烈减少。

总之，在THP1细胞中，ADAM17似乎是负责组成型脱落的主要脱落酶。在PMA处理之后，其他脱落机制开始起作用，其中一种机制可能涉及ADAM10。

实例4：接近TREM2跨膜结构域的氨基酸段对于脱落是重要的

在接下来的实验中，使用定点诱变来鉴定在TREM2茎区内具有切割位点或对脱落酶的结合很重要的区域。图4A显示了已经产生和测试的不同的TREM2突变体。表4列出野生型或突变体人TREM2茎区和跨膜结构域的膜近侧部分的氨基酸序列。

表4.野生型或突变体人TREM2茎区和跨膜区的膜近侧部分的氨基酸序列

将野生型(WT)TREM2或TREM2突变体与hDAP12一起转染到HEK-FT细胞中。48h后，将细胞用PMA处理30min以激活细胞表面的ADAM(参见Sommer，Nature Communications[自然通讯]7，11523，2016)。通过FACS评估TREM2细胞表面表达，并且结果呈现为未处理的相对于PMA处理的表达比率(图4B)。在存在和不存在PMA处理的情况下对每种构建体的评价都克服了一些构建体可能显示出对抗血清不同的结合特性的可能性，并且允许在脱落酶激活后直接比较TREM2细胞表面表达的变化。1的比率指示完全抑制脱落。跨膜结构域(TM)近侧的前16个氨基酸(AA)的缺失最大程度地减少TREM2脱落(TRUNCIII-159-174)。这表明此区域可能牵涉ADAM的切割和/或结合位点。接下来产生了涵盖此区域的四个较短的缺失突变体，每个突变体的长度为6个氨基酸(TRUNC1、T2del3-8、T2del6-11和T2del11-16)。尽管对突变体TRUNC1、T2del3-8和T2del6-11的脱落没有影响或影响很小，但是突变体T2del11-16示出了减少的PMA诱导的脱落(图4B)。

设计氨基酸替代突变体以克服缺失突变体可能使切割位点更移动靠近跨膜区域从而由于空间位阻造成切割减少的问题。氨基酸156-164和169-172被较大的疏水性残基替代，所述疏水性残基应使茎区对蛋白酶的切割具有抗性(Stromstedt等人，Antimicrobialagents and chemotherapy[抗微生物剂与化疗]53，593-602，2009)。尽管T2-YGG突变体示出了减少TREM2脱落的趋势，但替代4个膜近侧氨基酸T2-WFR突变体更有效；并且两个突变的组合(T2-双重突变体)具有与缺失突变体TRUNCIII-159-174相似的作用(图4A和4B)。因此，这些TREM2突变体显示出对脱落酶切割的抗性。

总之，诱变方法揭示了两个区域(在氨基酸169-172处的近侧膜和在氨基酸156-164区域中的远侧膜)对于PMA诱导的TREM2脱落是重要的。

接下来，测试了T2-双重-TREM2构建体是否保留了功能。为此，将此突变体稳定地转染到已经表达了小鼠DAP12和由NFAT驱动的β-Gal报告物的BWZ细胞中(Hsieh，Journalof Neurochemistry[神经化学杂志]109，1144-1156，2009)。在此细胞系中未表达TREM2的mDAP12代表在此系统中的背景报告基因活性(RGA)。比较在BWZ-T2-双重和BWZ-TREM2-WT细胞中TREM2激活后的RGA，揭示了可比的活性，这指示突变的T2-双重仍然能够经由DAP12进行信号传导(图4C)。因此，T2-双重-TREM2构建体保留了TREM2功能。

实例5：在H157-S158位置处ADAM17切割TREM2茎区肽

为了鉴定TREM2茎区内ADAM10/ADAM17的切割位点，研究了茎区衍生肽的体外切割模式，并且通过确定来自细胞培养上清液的脱落的可溶性TREM2的C末端确认了切割位点。设计了覆盖茎区的一系列肽以用于ADAM10/ADAM17切割的体外研究(图5A)。所有获得的肽均具有N末端7-甲氧基香豆素(Mca)荧光标签。将肽1-3、1a和2a与ADAM17在中性缓冲液中孵育长达48小时，并且反应后通过HPLC分析在不同时间点抽取的等分试样。仅对于肽3观察到了显著的切割，而肽1、2、1a和2a仅显示出极少或没有亲本肽的减少(图5D)。

肽3/ADAM17的反应混合物的HPLC-MS分析鉴定了一种主要产物SISRSLLEGEIPFP-NH₂(SEQ ID NO：51)，以及2种次要切割产物(图5B-5C)。这表明TREM2中的H157-S158键是ADAM17的主要切割位点。在＞24小时的时间，孵育混合物的HPLC分析显示出现了多于一个的产物峰，以及减少的主产物峰。在这些时间点，本质上没有底物剩余。因此，可以得出结论，次要切割产物源自主产物的二次ADAM17切割。使用ADAM10进行了相同的分析，并且获得了非常相似的切割模式(数据未显示)。

最近的文献深入分析了对于肽和蛋白质切割的ADAM10和ADAM17偏好(Caescu等人，Biochem J[生物化学杂志]424，79-88，2009；Tucher等人，J Proteome Res[蛋白质组学研究杂志]13，2205-2214，2014)。出人意料的是，在被ADAM10和17切割的底物中，在P1中很少发现His，而在P1’位置中发现了Ser。在ADAM10和17的底物中搜索了最不优选的氨基酸后，鉴定了异亮氨酸在ADAM底物的P1中从未出现，并且在P1’和P2’中对天冬氨酸或脯氨酸的偏好非常低。为了证明这一点，制备了肽4-6。在这些肽中，H-SI切割位点分别被IPP、IPD和IDP替代。尽管所有的3种肽均对ADAM17的体外切割具有抗性(图5E)，但是肽5和6被ADAM10缓慢切割(数据未显示)。其中IPP替代了H-SI切割位点的肽4在体外显现为抗切割的。

实例6.从细胞脱落的TREM2胞外结构域在H157与S158之间被切割

为了证实在细胞系统中对TREM2的脱落酶切割位点的肽分析所得到的体外发现，用hTREM2或hTREM2-R47H与hDAP12组合来瞬时转染HEK-FT细胞。用PMA或溶剂处理来自两种条件的转染细胞。将sTREM2从细胞上清液中免疫纯化，并且经受胰蛋白酶或Asp-/Glu-C酶消化，然后通过LC-MS分析肽。在所有四种条件下，均鉴定出相同的N末端肽(D137-H157)，这指示主要切割位点在H157和S158之间(图6A-6B)。这些实验显示了PMA处理和R47H突变均不会引起主要切割位点的移位。

开始下一个实验以鉴定完整脱落的TREM2胞外结构域，所述完整脱落的TREM2胞外结构域来自用PNGase-F和唾液酸酶A处理、然后进行LC-MS分析的免疫纯化细胞上清液。在来自用WT TREM2转染的细胞的上清液中检测到15,619道尔顿的肽种类，所述肽种类对应于去糖基化的TREM219-157(图7)。在经R47H-TREM2转染的细胞的免疫纯化细胞上清液中检测到相应的15,600道尔顿的肽。由于氨基酸交换，此肽比WT肽轻19道尔顿，并且确认了对于突变的R47H-TREM2的相同切割位点。

实例7.TREM2在接近切割位点的位置处没有被O-糖基化

由于翻译后修饰可以实现脱落酶活性(Goth等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America[美国国家科学院院刊]112，14623-14628，2015；Schjoldager等人，Biochimica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学学报]1820，2079-2094，2012)，研究了糖基化可能如何实现TREM2脱落。在接近TREM2胞外结构域的鉴定的H157切割位点处存在两个推定的O-糖基化位点：S160和S168。使用C末端带有his标签的hTREM2并且通过质谱标绘糖基化位点，示出hTREM2在T171和/或S172处显示O-糖基化(图8A-8C)，然而，在S160或S168处没有检测到O-糖基化。

实例8.在脱落酶切割位点处具有突变的TREM2突变体显示出增加的细胞表面表 达。

下一组实验旨在证实在细胞系统中，在位置157-159处具有突变的TREM2突变体可以减少TREM2茎区的切割。经由定点诱变将人TREM2茎区内的ADAM17切割位点氨基酸HSI(位置157-159)用氨基酸IPD替换。在HEK293-FT细胞中，突变体构建体与hDAP12一起瞬时表达，并且如图2所述评估TREM2的细胞表面表达。最有趣的是，在脱落酶切割位点处具有三个氨基酸替代的TREM2突变体示出了具有切割位点截短的TREM2突变体(TRUNC3)或具有T2-双重突变的TREM2突变体相似的TREM2细胞表面表达增加(图4D)，这指示在细胞环境中对脱落酶切割具有抗性。

这里呈现的数据首先研究了ADAM10和ADAM17对TREM2脱落的贡献。所使用的药理学和遗传学方法明确表明，ADAM17是促成此过程的关键蛋白酶。在体外切割测定中确定了所应用的ADAM抑制剂的酶选择性，并且在宽的浓度范围内使用了这两种抑制剂来研究对在CHO-hDAP12-hTREM2细胞和人M2A巨噬细胞中TREM2细胞表面表达的作用。为了排除药理学方法没有被其他酶的非特异性抑制所混淆，这些发现通过在人单核细胞THP-1细胞系中对ADAM10或ADAM1 7的CRISPR/CAS9敲除得到证实。敲除实验确认了ADAM17缺乏增加了表面TREM2并且减少了sTREM2。这里呈现的数据表明，在稳定状态条件下，TREM2主要被ADAM17切割，但是在PMA激活ADAM后，另外的脱落机制可能会起作用。最近的文献数据指示，在稳定状态条件下，ADAM10介导sTREM2的产生(Kleinberger，2014)。此研究与这里呈现的结果之间的主要区别是使用缺乏信号传导衔接蛋白DAP12与TREM2共表达的HEK-Flp-In细胞。在不存在DAP12的情况下在重组系统中表达后，TREM2可能对ADAM10切割的敏感性增加。有趣的是，DAP12具有14个氨基酸长的细胞外结构域(参见Lanier和Bakker，Immunol Today[当代免疫学]21，611-614，2000)。DAP12的细胞外结构域与TREM2切割位点的紧密接近可能表明在细胞外部分TREM2与DAP12之间存在相互作用，所述相互作用可以调节激活和脱落。

除了研究组成型脱落外，PMA还用于增强TREM2从细胞表面的脱落。在这些条件下在ADAM17缺陷型THP1细胞中观察到的脱落可能归因于ADAM10活性，但是也可能涉及其他机制。例如，TREM2胞外结构域可能在其从ER转运到质膜期间在细胞内被切割，从而允许TREM2分泌到培养基中。

最近的研究阐明了PMA治疗与脱落酶活性的变化是如何相关的：PMA触发的信号传导级联激活了爬行酶(scramblase)，所述爬行酶增强磷脂酰丝氨酸(PS)转位到质膜外部小叶(Kodigepalli等人，Mol Cancer[分子癌症]12：32，2013)。在这里PS结合ADAM17膜近侧结构域中的阳离子基序，从而使蛋白酶执行其脱落酶功能(Sommer，Nature Communications[自然通讯]7，11523，2016)。这些实验专注于ADAM17，并且需要进一步的研究以阐明这些发现中的任一个是否扩展到ADAM10，所述ADAM10是ADAM家族中最接近ADAM17的同源物。

值得注意的是，PS也已被描述为TREM2配体(Wang等人，Cell[细胞]160，1061-1071，2015；Cannon等人，Immunogenetics[免疫遗传学]64，39-47，2012；Daws，Journal ofImmunology[免疫学杂志]171，594-599，2003；Song等人，Alzheimer’s&Dementia[阿尔茨海默病和痴呆]13：381-387，2017)。磷脂酰丝氨酸属于一系列膜磷脂，所述一系列膜磷脂被受损的神经元和神经胶质细胞暴露或被受损的髓鞘质释放。此外，已经显示带负电荷的磷脂(如PS)与脂质膜中的Aβ相关联(Ahyayauch等人，Biophys J[生物物理学杂志]103，453-463，2012；Nagarathinam等人，JNeurosci[神经科学杂志]33，19284-19294，2013)。在所有这些过程中，PS充当TREM2的配体，并且可能同时促进其脱落。

突变分析鉴定了TREM2茎区内的两个氨基酸段，所述两个氨基酸段对于TREM2脱落是重要的。膜远侧区域包含切割位点的氨基酸。有趣的是，交换接近质膜的5个氨基酸(突变体T2-WFR)也使TREM2稳定在细胞表面。尽管尚未针对TREM2进行研究，但是已经描述了ADAM17与其底物L-选择素的联合聚类(Schaff等人，Journal of Leukocyte Biology[白细胞生物学杂志]83，99-105，2008)，并且这部分茎区可能促成此过程，使得在激活ADAM17的蛋白水解活性(例如通过PS)时开始切割之前ADAM17能与其底物结合。

另外的实验鉴定了TREM2胞外结构域的精确切割位点。应用了三种互补的方法，并且所有方法均显示相同的切割位点。第一，用重组表达的ADAM10和ADAM17，使来自茎区的肽经受体外切割。第二，从重组表达hTREM2和hDAP12的HEK-FT细胞的上清液中纯化来自TREM2胞外结构域的胰蛋白酶水解肽的C末端，并进行确定。第三，验证了从细胞上清液纯化的全长TREM2胞外结构域的大小。然而当与大多数已知的ADAM17底物(12-16个氨基酸，参见Horiuchi，The Keio Journal of Medicine[庆应医学杂志]62，29-36，2013；Overall和Blobel，Nature Reviews Molecular Cell Biology[自然综述分子细胞生物学]8，245-257，2007)相比时，切割位点与质膜的距离(17个氨基酸)位于上端，序列(P2：V，P1：H，P1’：S，P2’：I)与已知的ADAM17或ADAM10底物(Caescu等人，Biochem J[生物化学杂志]424，79-88；Liu等人，Mol Immunol[分子免疫学]62，122-128，2014；Tucher，2014；Vahidi等人，Biochemical and Biophysical Research Communications[生物化学与生物物理研究通讯]450，782-787，2014)相比是相当独特的。ADAM10和17具有对P2到P2’位置处的小疏水残基的偏好，所述小疏水残基驱动底物特异性。然而，如果同时汇编了ADAM17和ADAM10的切割位点，(Tucher，2014年)P1处的精氨酸是相当共有的。在TREM2中此位置处的组氨酸也携带带有正电荷的碱性侧链。用对于ADAM17/ADAM10切割基序不共有的氨基酸交换P1、P1’和P2’减少了切割。值得注意的是，切割没有移位到肽内的另一侧。这支持了以下观察结果：脱落似乎局限于接近质膜的区域，并且切割没有向第二位点移位。这与早期发现一致，所述早期发现表明相对于跨膜区域和所述蛋白质的第一球状部分的位点的位置与切割位点的氨基酸序列一样重要(Horiuchi，The Keio Journal of Medicine[庆应医学杂志]62，29-36，2013；Hinkle，The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]279，24179-24188，2004；Wang等人，The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]277，50510-50519，2002)。

R47H变体赋予发展LOAD的显著增加的风险(Guerreiro，2013；Jonsson，2013)。与赋予FTD增加的风险的一些多态性例如T66M(Guerreiro，2013；Kleinberger，2014；Borroni等人，Neurobiology of Aging[老年神经生物学]35，934 e937-910，2014；Le Ber，Neurobiology of Aging[老年神经生物学]35，2419 e2423-2415，2017)以及Y38C(Guerreiro，2013)(其减少TREM2的细胞表面表达)相比，R47H突变不影响表达水平，而是在功能上损害TREM2(Atagi，2015；Bailey，2015；Kleinberger，2014；Wang，Cell[细胞]160，1061-1071，2015；Yin，2016)。这里呈现的数据指示，R47H突变不影响切割位点，即可溶的脱落的TREM2胞外结构域的大小。然而，这些实验不允许断定脱落的程度是否改变，即sTREM2的量是否改变。

已经描述了胞外结构域脱落受到在丝氨酸或苏氨酸残基处O-糖基化的影响，所述丝氨酸或苏氨酸残基在加工位点的±4个残基之内(Goth，2015；Schjoldager，2012)。研究了接近切割位点的O-糖基化的存在。结果指示，在茎区内，TREM2仅在T171和/或S172处被O-糖基化，而在S168或S160处没有发生O-糖基化。最可能的是，此O-糖基化位点离加工位点太远，以致无法影响切割。这些结果受到以下事实的限制：用于这些研究的hTREM2蛋白并未从细胞表面脱落，而是通过分泌途径分泌到用于产生重组蛋白的表达系统中。

近年来，已经鉴定了许多影响某些神经退行性疾病的易感性的TREM2变体(参见Dardiotis，Neurobiol Aging.[老年神经生物学]2017年5月；53：194.e13-194.e22)。最有趣的是，这些突变之一H157Y(rs2234255，Ahyayauch，2012；Cuyvers等人，Neurobiology ofAging[老年神经生物学]35，726 e711-729，2014；Jiang等人，Curr Neurovasc Res[神经血管研究现状]13，318-320，2016；Ghani，Neurobiology of Aging[老年神经生物学]42，217e217-217 e213，2016)精确地位于所鉴定的TREM2切割位点，并且增加了发展AD的倾向。体外数据显示ADAM10/17对在P1’位置处的酪氨酸具有增加的偏好(Tucher，2014)。因此，人们可以推测此突变可导致ADAM10/17增强TREM2从细胞表面的组成型脱落，并且提供了在TREM2脱落与AD发展之间的机制联系，但是当前尚不了解此突变如何影响TREM2的脱落。

由这些结果引起的一个吸引人的问题是sTREM2是否具有生理作用。在宿主防御或无菌炎症的初始阶段，稳固的炎症有利于病原体中和或去除受损组织，随后进行后续消退应答(Freire，Periodontology[牙周病学]2000，63，149-164)。消退炎症后，ADAM17活性会降低(Le Gall等人，Molecular Biology of the Cell[细胞的分子生物学]20，1785-1794，2009；Le Gall等人，Journal of Cell Science[细胞科学杂志]123，3913-3922，2010)，并且导致的TREM2增加会促进消退和吞噬作用。同时，其他促炎症细胞因子(如TNFα)的产生将减少。

除非另外指明，否则没有详细地具体描述的所有方法、步骤、技术和操作可以并且已经按照本身已知的方式进行，这对技术人员来说将是清楚的。再次对例如本文提及的标准手册和普通背景技术和本文引用的另外的参考文献进行引用。除非另外指明，否则本文引用的每个参考文献都通过引用以其整体并入。

本发明的权利要求是非限制性的并且提供于下文中。

尽管本文已经详细披露了具体方面和权利要求，但是这仅是出于说明的目的以举例的方式来进行，并且这并不旨在对所附权利要求的范围或任何相应的未来申请的权利要求主题的范围加以限制。具体而言，诸位发明人考虑到，在不脱离如由权利要求所定义的本披露的精神和范围的情况下，可以对本披露进行多种替代、改变和修饰。核酸起始材料、目的克隆或文库类型的选择被认为对于具有本文所述的方面的知识的本领域普通技术人员而言是常规的内容。其他方面、优点以及修改被认为在以下权利要求的范围内。本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体方面的许多等同方面。此类等同物旨在被以下权利要求涵盖。在今后提交的相应申请中重撰写权利要求的范围可归因于不同国家专利法的限制，而不应被理解为放弃权利要求的主题。

Claims (49)

1.一种核酸，所述核酸包含编码抗脱落酶切割的人TREM2突变体的序列。

2.如权利要求1所述的核酸，其中所述脱落酶是ADAM17或ADAM10。

3.如权利要求1所述的核酸，其中所述脱落酶是ADAM17。

4.如权利要求1所述的核酸，其中所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQID NO：33-40中任一个的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的核酸，其中所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQID NO：33-40中任一个的氨基酸序列组成。

6.如权利要求1所述的核酸，其中所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区包含选自SEQID NO：33-35中任一个的氨基酸序列。

7.如权利要求1所述的核酸，其中所述人TREM2突变体包含茎区，所述茎区由选自SEQID NO：33-35中任一个的氨基酸序列组成。

8.如权利要求1所述的核酸，其中所述人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列。

9.如权利要求1所述的核酸，其中所述人TREM2突变体包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列。

10.如权利要求1所述的核酸，其中所述序列包含SEQ ID NO：67-74中的任一个。

11.如权利要求1所述的核酸，所述核酸进一步包含启动子。

12.如权利要求11所述的核酸，其中所述启动子是组成型启动子。

13.如权利要求11所述的核酸，其中所述启动子是诱导型启动子。

14.如权利要求11所述的核酸，其中所述启动子是合成启动子。

15.如权利要求11所述的核酸，其中所述启动子是细胞类型特异性启动子。

16.如权利要求15所述的核酸，其中所述启动子特异性地驱动在小神经胶质细胞、巨噬细胞或树突细胞中的核酸表达。

17.如权利要求11所述的核酸，其中所述启动子选自TREM2启动子、TMEM119启动子、Hexb启动子、IBA1启动子、CD45启动子、CD11b启动子、Cst7启动子、Lp1启动子、Csf1启动子、Cs1R启动子、Itgax启动子、Clec7a启动子、Lilrb4启动子、Tyrobp启动子、Ctsb启动子、Ctsd启动子、B2m启动子、Lyz2启动子、Cx3cr1启动子、Cst3启动子、Ctss启动子、P2ry12启动子、C1qa启动子或C1qb启动子。

18.如权利要求11所述的核酸，其中所述启动子是TREM2启动子。

19.如权利要求1所述的核酸，所述核酸进一步包含聚腺苷酸化信号。

20.如权利要求1所述的核酸，所述核酸进一步包含编码DAP12蛋白的第二序列。

21.如权利要求20所述的核酸，其中所述DAP12蛋白包含SEQ ID NO：49。

22.如权利要求20所述的核酸，其中所述DAP12蛋白由SEQ ID NO：49组成。

23.如权利要求20-22中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含所述第二序列上游的内部核糖体进入位点。

24.如权利要求20-22中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含所述第二序列上游的2A序列，其中所述2A序列选自SEQ ID NO：52-66中的任一个。

25.一种载体，所述载体包含如权利要求1-24中任一项所述的核酸。

26.如权利要求25所述的载体，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、粘粒或病毒载体。

27.如权利要求26所述的载体，其中所述病毒载体选自基于以下病毒中任何一种的载体：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、细小病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、辛德毕斯病毒、流感病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、塞内卡谷病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒、粘液瘤病毒或马拉巴病毒。

28.如权利要求26所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

29.如权利要求26所述的载体，其中所述病毒载体是AAV载体。

30.如权利要求25所述的载体，所述载体进一步包含可选择标记物。

31.一种细胞，所述细胞包含如权利要求1-24中任一项所述的核酸或如权利要求25-30中任一项所述的载体。

32.如权利要求31所述的细胞，其中所述细胞选自巨噬细胞、树突细胞或小神经胶质细胞。

33.如权利要求31或32所述的细胞，其中所述细胞表达可检测标记物。

34.一种多肽，所述多肽包含选自SEQ ID NO：33-40中任一个的氨基酸序列。

35.如权利要求34所述的多肽，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO：41-48中任一个的氨基酸序列。

36.一种增加受试者中TREM2表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-24中任一项所述的核酸、如权利要求25-30中任一项所述的载体、如权利要求31-33中任一项所述的细胞。

37.一种在有需要的受试者中治疗TREM2相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-24中任一项所述的核酸、如权利要求25-30中任一项所述的载体、如权利要求31-33中任一项所述的细胞。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述受试者患有TREM2相关疾病或障碍。

39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述TREM2相关疾病或障碍是神经炎症或神经退行性疾病，所述神经炎症或神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、那须-哈科拉病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、抗NMDA受体脑炎、自闭症、脑狼疮(NP-SLE)、化疗引起的周围神经病变(CIPN)、带状疱疹后神经痛、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、癫痫、格林-巴利综合征(GBS)、包涵体肌炎、溶酶体贮积病、鞘磷脂沉积病(C型尼曼-皮克病)、粘多糖病II/IIIB、异染性脑白质营养不良、多灶性运动神经病、重症肌无力、神经白塞病、视神经脊髓炎(NMO)、视神经炎、多肌炎、皮肌炎、拉斯穆森脑炎、雷特综合征、中风、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、脊髓损伤、病毒性脑炎或细菌性脑膜炎。

41.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述TREM2相关疾病或障碍是阿尔茨海默病。

42.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述TREM2相关疾病或障碍是额颞叶痴呆。

43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中通过静脉内、颅内、鞘内、皮下或鼻内途径向所述受试者施用所述核酸、载体或细胞。

44.如权利要求36-43中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用第二药剂。

45.如权利要求36-44中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：

测定从受试者获得的样品中的细胞表面人TREM2水平。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述样品包括脑脊液。

47.如权利要求45所述的方法，其中样品中的所述细胞表面人TREM2水平是通过选自以下的测定来确定：流式细胞术、免疫组织化学、蛋白质印迹、免疫荧光测定、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、均相时间分辨荧光(HTRF)或正电子发射断层扫描(PET)。

48.如权利要求1-24中任一项所述的核酸、如权利要求25-30中任一项所述的载体、如权利要求31-33中任一项所述的细胞或如权利要求34或35所述的多肽用于治疗受试者中TREM2相关疾病或障碍的用途。

49.如权利要求1-24中任一项所述的核酸、如权利要求25-30中任一项所述的载体、如权利要求31-33中任一项所述的细胞或如权利要求34或35所述的多肽在制造用于治疗受试者中TREM2相关疾病或障碍的药物中的用途。

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