JP2019533803A - Ａａｖを検出するための方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書に提供されるのは、ウイルス粒子の血清型を決定するための方法および／またはウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の不均一性を決定するための方法である。他の実施形態では、本発明は、ＡＡＶ粒子の不均一性を決定する方法を提供する。一部の態様では、本発明は、カプシドタンパク質のアセチル化および／または脱アミド化を増加させることにより、改善された安定性および／または改善された形質導入効率を有するウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる２０１６年８月１５日出願の米国仮出願第６２／３７５，３１４号の優先権の利益を主張する。
配列表
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる以下の提出の内容は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる：配列表のコンピュータ読取り可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：１５９７９２０１４１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１７年８月１４日、サイズ：５１ＫＢ）。
本発明は、質量決定を使用する、例えば、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）または液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー−マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を採用することによる、ウイルス粒子（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子）の血清型判定および／または不均一性の決定のための方法に関する。一部の態様では、本発明は、ＡＡＶ粒子の安定性を改善する方法に関する。
ウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ）はウイルス感染性にとって重要であるため、その配列および翻訳後修飾を含む、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）のウイルスカプシドタンパク質の完全な特徴付けが、遺伝子治療の研究および開発において望まれる。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）産物のようなウイルスベクター産物は、典型的に、核酸導入遺伝子を標的とする分子ツールを使用して同定される。これらの方法は、導入遺伝子に特異的な配列を標的とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および制限断片長多型（ＲＦＬＰ）技術を含む。ｒＡＡＶテクノロジーが発展するにつれ、多くの施設が標的とされた組織の指向性を改善するための努力においてその治療的導入遺伝子をコードする複数のＡＡＶカプシド血清型の調査を開始している。
伝統的な分子同定方法は、独特な導入遺伝子を含有する産物を同定するが、異なるＡＡＶカプシドの血清型を有するものを識別することはできない。現在、ほとんどのＡＡＶ血清型同一性試験は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドパターン、抗体ベースのＥＬＩＳＡ、またはウェスタンブロットアッセイに基づく。しかしながら、バンドパターンおよび抗体は、異なるＡＡＶ血清型を区別するためには十分に特異的でない。ゲル−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、カプシド血清型の同定方法として報告されている。しかしながら、この方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル内消化およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳを含む複数の工程を含み、よって、分析に何日も必要である一方、提供する配列の適用範囲は限られている。ｒＡＡＶベクターのようなベクターを同定するための方法は、遺伝子治療用ベクターにとって興味深い（例えば、特許文献１を参照されたい）。よって、ウイルス粒子を特徴付けする改善された方法は有用であろう。
特許出願および特許出願公開を含む、本明細書において引用されるすべての参考文献は、参照によってその全体を組み入れる。
米国付与前特許出願公開第２０１１０２７５５２９号
例としてｒＡＡＶを使用して本明細書に記載されるのは、異なるウイルスカプシド血清型（例えば、ｒＡＡＶカプシド血清型）を特異的に同定するための分析ツールとしてのＬＣ／ＭＳの使用である。ウイルスの特徴付けの一部として、ＬＣ／ＭＳは、分子同定方法を増強するために使用される。この分析の組合せは、製品の治療的導入遺伝子の同一性およびカプシド血清型の同一性の両方を識別することにより、規制上の要件を満たすことができる。この方法は、例えば、ＡＡＶ血清型の同一性試験としてまたは組換えＡＡＶ遺伝子治療の開発におけるウイルスカプシドタンパク質の不均一性をモニターするために使用することができる。これは、カプシド工学研究においてＶＰ配列を確認するためにも使用することができる。加えて、この技術は、ウイルスカプシドタンパク質のＮ末端アセチル化のような翻訳後修飾の、トランスフェクション能力および細胞内タンパク質輸送に対する影響を研究するためにも使用することができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、２位のアミノ酸が野生型ＡＡＶカプシドと比較してより高い程度までアセチル化されるように、ＡＡＶカプシドのＶＰ１および／またはＶＰ３の２位のアミノ酸残基を変更することにより、より大きな安定性および／または改善された形質導入効率のためにＡＡＶ粒子をデザインするためにも使用される。一部の実施形態では、方法は、例えば、２位のアミノ酸が野生型ＡＡＶカプシドと比較してより高いまたはより低い程度まで脱アセチル化されるように、ＡＡＶカプシドのＶＰ１および／またはＶＰ３の２位のアミノ酸残基を変更することにより、低減された形質導入効率を有するＡＡＶ粒子をデザインするために使用される。
一部の態様では、本発明は、ウイルス粒子の血清型を決定する方法であって、ａ）ウイルス粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したウイルス粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供する工程と、ｃ）ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量を決定する工程とを含み；１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量の特定の組合せが、ウイルス血清型の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の計算された質量は、１つまたはそれ以上のウイルス血清型の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の理論的質量に対して比較される。
一部の態様では、本発明は、ウイルス粒子の不均一性を決定する方法であって、ａ）ウイルス粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したウイルス粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、ｃ）ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量を決定する工程と、ｄ）工程ｃ）の質量を、ウイルス血清型の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の理論的質量と比較する工程とを含み；１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ウイルスカプシドの不均一性の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を含む。
上記態様の一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）である。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、異種導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含む。
一部の態様では、本発明は、ウイルス粒子の血清型を決定する方法であって、ａ）ウイルス粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したウイルス粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、ｃ）変性したウイルス粒子を消化に供して、ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を生成する工程と、ｄ）１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、ｅ）ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量を決定する工程とを含み；１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量の特定の組合せが、ウイルス血清型の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の計算された質量が、１つまたはそれ以上のウイルス血清型の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の理論的質量に対して比較される。
一部の態様では、本発明は、ウイルス粒子の血清型の不均一性を決定する方法であって、ａ）ウイルス粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したウイルス粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、ｃ）変性したウイルス粒子を消化に供して、ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を生成する工程と、ｄ）１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、ｅ）ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量を決定する工程と、ｆ）工程ｅ）の質量を、ウイルス血清型の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の理論的質量と比較する工程とを含み；１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ウイルスカプシドの不均一性の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである。
本明細書に示されるとおり、方法は、ゲル分離工程（例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））の非存在下で実行される。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ウイルス粒子は、異種導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、およびヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）からなる群から選択されるウイルス科に属する。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、アタデノウイルス属（Ａｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アビアデノウイルス属（Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、イクタデノウイルス属（Ｉｃｈｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、マストアデノウイルス属（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、シアデノウイルス属（Ｓｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アンビデンソウイルス属（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス属（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス属（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラデンソウイルス属（Ｉｔｅｒａｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ペンスチルデンソウイルス属（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、アムドパルボウイルス属（Ａｍｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス属（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ボカパルボウイルス属（Ｂｏｃａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス属（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、デペンドパルボウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、エリスロパルボウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス属（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス属（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アルファレトロウイルス属（Ａｌｐｈａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ベータレトロウイルス属（Ｂｅｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、デルタレトロウイルス属（Ｄｅｌｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、イプシロンレトロウイルス属（Ｅｐｓｉｌｏｎｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ガンマレトロウイルス属（Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス属（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、スプマウイルス属（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）、アルファバキュロウイルス属（Ａｌｐｈａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、ベータバキュロウイルス属（Ｂｅｔａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、デルタバキュロウイルス属（Ｄｅｌｔａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、ガンマバキュロウイルス属（Ｇａｍｍａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、イルトウイルス属（Ｉｌｔｏｖｉｒｕｓ）、マルディウイルス属（Ｍａｒｄｉｖｉｒｕｓ）、シンプレックスウイルス属（Ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）、バリセロウイルス属（Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス属（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ムロメガロウイルス属（Ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、プロボシウイルス属（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｖｉｒｕｓ）、ロゼオロウイルス属（Ｒｏｓｅｏｌｏｖｉｒｕｓ）、リンホクリプトウイルス属（Ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、マカウイルス属（Ｍａｃａｖｉｒｕｓ）、ペルカウイルス属（Ｐｅｒｃａｖｉｒｕｓ）、およびラジノウイルス属（Ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されるウイルス属に属する。
一部の態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の血清型を決定する方法であって、ａ）ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供する工程と、ｃ）ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量を決定する工程とを含み；ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量の特定の組合せが、ＡＡＶ血清型の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の計算された質量が、１つまたはそれ以上のＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の理論的質量に対して比較される。
一部の態様では、本発明は、ＡＡＶ粒子の不均一性を決定する方法であって、ａ）ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、ｃ）ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量を決定する工程と、ｄ）工程ｃ）の質量を、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の理論的質量と比較する工程とを含み；ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ＡＡＶカプシドの不均一性の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を含む。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は酢酸、塩酸グアニジンおよび／または有機溶媒により変性する。一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、Ｃ４またはＣ８逆相クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、水中にギ酸を含む移動相Ａを使用する。一部の実施形態では、移動相Ａは、約０．１％のギ酸を含む。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にギ酸を含む移動相Ｂを含む。一部の実施形態では、移動相Ｂは、約０．１％のギ酸を含む。一部の実施形態では、クロマトグラフィーにおける移動相Ｂの割合は経時的に増加する。一部の実施形態では、クロマトグラフィーにおける移動相Ｂの割合は段階的に増加する。一部の実施形態では、移動相Ｂは、約１０％から約２０％まで、約２０％から約３０％まで、および約３０％から約３８％まで増加する。一部の実施形態では、移動相Ｂは、約６分間で約１０％から約２０％まで、約１０分間で約２０％から約３０％まで、および約４０分間で約３０％から約３８％まで増加する。一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、超高速液体クロマトグラフィー（ｕｌｔｒａ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＵＰＬＣ）である。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、マススペクトロメトリーは、約３．５ｋＶのキャピラリー電圧を含む。一部の実施形態では、マススペクトロメトリーは、約４５Ｖのサンプリングコーン電圧を含む。一部の実施形態では、マススペクトロメトリーは、支援付き校正を含む。一部の実施形態では、ヨウ化ナトリウムは、校正物質として使用される。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端はアセチル化されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子はＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、またはマウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量が、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、またはマウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）、ＡＡＶ２ＨＢＫＯカプシド、ＡＡＶＰＨＰ．ＢカプシドまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢカプシドのうちの１つまたはそれ以上の理論的質量に対して比較される。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。
一部の態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の血清型を決定する方法であって、ａ）ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したＡＡＶ粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、ｃ）変性したＡＡＶ粒子を消化に供して、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を生成する工程と、ｄ）ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、ｅ）ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量を決定する工程とを含み；ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量の特定の組合せが、ＡＡＶ血清型の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片の計算された質量が、１つまたはそれ以上のＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片の理論的質量に対して比較される。
一部の態様では、本発明は、ＡＡＶ粒子の血清型の不均一性を決定する方法であって、ａ）ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したＡＡＶ粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、ｃ）変性したＡＡＶ粒子を消化に供して、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を生成する工程と、ｄ）ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、ｅ）ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量を決定する工程と、ｆ）工程ｅ）の質量を、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の理論的質量と比較する工程とを含み；ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ＡＡＶカプシドの不均一性の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、還元は、ＡＡＶ粒子をジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノール、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）に供することによる。一部の実施形態では、アルキル化は、ＡＡＶ粒子をヨード酢酸、ヨードアセトアミド、または４−ビニルピリジンに供することによる。一部の実施形態では、消化は、酵素消化または化学的消化である。一部の実施形態では、酵素消化は、エンドペプチダーゼ消化である。一部の実施形態では、酵素消化は、トリプシン消化、ＬｙｓＣ消化、Ａｓｐ−Ｎ消化またはＧｌｕ−Ｃ消化である。一部の実施形態では、化学的消化は、臭化シアン消化または酸消化である。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、酢酸、塩酸グアニジンおよび／または有機溶媒により変性する。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、逆相液体クロマトグラフィーは、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、水中にギ酸を含む移動相Ａを使用する。一部の実施形態では、移動相Ａは、約０．１％のギ酸を含む。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にギ酸を含む移動相Ｂを含む。一部の実施形態では、移動相Ｂは、約０．１％のギ酸を含む。一部の実施形態では、クロマトグラフィーにおける移動相Ｂの割合は経時的に増加する。一部の実施形態では、移動相Ｂは、約２％から約６０％まで増加する。一部の実施形態では、移動相Ｂは、約１２１分間で約２％から約６０％まで増加する。一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、マススペクトロメトリーは、約３．５ｋＶのキャピラリー電圧を含む。一部の実施形態では、マススペクトロメトリーは、約４５Ｖのサンプリングコーン電圧を含む。一部の実施形態では、マススペクトロメトリーは、支援付き校正を含む。一部の実施形態では、ヨウ化ナトリウムは、校正物質として使用される。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端はアセチル化されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子はＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、またはマウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量が、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、またはマウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）のうちの１つまたはそれ以上の理論的質量に対して比較される。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。
一部の実施形態では、本発明は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、組換えＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態では、置換は、より高い頻度のＮ末端アセチル化またはより低い頻度のＮ末端アセチル化をもたらす。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＶＰ１のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；ＶＰ１のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；ＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する。一部の実施形態では、アミノ酸残基２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ，Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸残基２は、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されている。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ血清型カプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、同じ血清型に由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、異なる血清型に由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲに隣接した異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは自己相補的なベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子をコードする第１の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲにより連結され、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端解離配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の突然変異を含む。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を含み、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供するＡＡＶ産生細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｃｅｌｌ）により産生される。一部の実施形態では、ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスにＡＡＶ産生細胞を感染させることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ機能は、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を提供し、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する。
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または医薬組成物を含むキットを提供する。一部の態様では、本発明は、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または医薬組成物を含む製造品を提供する。
一部の態様では、本発明は、ＡＡＶカプシドタンパク質であって、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；アミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。一部の実施形態では、置換は、より高い頻度のＮ末端アセチル化またはより低い頻度のＮ末端アセチル化をもたらす。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＶＰ１またはＶＰ３である。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸残基２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ，Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸残基２は、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＡＡＶカプシドのより少ない脱アミド化をもたらす。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ血清型カプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む。
一部の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の安定性を改善する方法であって、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み；アミノ酸残基２を置換する工程が、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２と比較して、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端アセチル化を変更する、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、細胞内のｒＡＡＶ粒子のアセンブリを改善する方法であって、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み；２位におけるアミノ酸を置換する工程が、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２と比較して、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端アセチル化を変更する、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、細胞内のｒＡＡＶ粒子の形質導入を改善する方法であって、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み、アミノ酸残基２を置換する工程が、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２と比較して、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端アセチル化を変更する、方法を提供する。一部の実施形態では、置換されたアミノ酸は、より高い頻度のＮ末端アセチル化またはより低い頻度のＮ末端アセチル化をもたらす。一部の実施形態では、ＶＰ１のアミノ酸残基２におけるアミノ酸が置換されている。一部の実施形態では、ＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸が置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸残基２が、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ，Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸残基２は、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されている。一部の態様では、本発明は、細胞内のｒＡＡＶ粒子の形質導入を低減させる方法であって、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み；２位において置換されたアミノ酸が、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２と比較して、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端アセチル化を変更する、方法を提供する。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ血清型カプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、同じ血清型に由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、異なる血清型に由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲに隣接した異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは自己相補的なベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子をコードする第１の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲにより連結され、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端解離配列の突然変異を含む。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を含み、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供するＡＡＶ産生細胞により産生される。一部の実施形態では、ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスにＡＡＶ産生細胞を感染させることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ機能は、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を提供し、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する。
一部の態様では、本発明は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子であって、親粒子のＶＰ１またはＶＰ３のアミノ酸残基Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；１つまたはそれ以上のアミノ酸置換が、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、組換えＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＡ３５、Ｎ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６のアミノ酸残基にあり、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＮ５１１、またはＶＰ３のＮ７１５におけるＡｓｐの置換を含み；親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より高い頻度の脱アミド化をもたらす。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、Ｎ５７ＫまたはＮ５７Ｑ置換を含み、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＡ３５におけるＡｓｐの置換を含み、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１の脱アミド化と比較して、より高い頻度の脱アミド化をもたらす。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＧ５１２、またはＶＰ３のＧ７１６にあり、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。一部の実施形態では、ＶＰ１のＧ５８はＡｓｐで置換されている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１粒子またはＡＡＶ２粒子である。
一部の態様では、本発明は、ＶＰ１またはＶＰ３のアミノ酸残基Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むＡＡＶ粒子を含む、医薬組成物であって、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換が、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、医薬組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、ＡＡＶ粒子またはＡＡＶ粒子を含む組成物を含むキットであって、ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１またはＶＰ３のアミノ酸残基Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換が、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、キットを提供する。一部の態様では、本発明は、ＡＡＶ粒子またはＡＡＶ粒子を含む組成物を含む製造品であって、ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１またはＶＰ３のアミノ酸残基Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み；アミノ酸置換が、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、製造品を提供する。一部の態様では、本発明は、ＡＡＶカプシドタンパク質であって、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸置換を含み；アミノ酸置換が、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、カプシドの脱アミド化を変更する、ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。
一部の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の安定性を改善する方法であって、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６であり、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換が、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、細胞内のｒＡＡＶ粒子のアセンブリを改善する方法であって、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６であり、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換が、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、細胞内のｒＡＡＶ粒子の形質導入を改善する方法であって、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６であり、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換が、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、方法を提供する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６にあり；アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する。一部の実施形態では、ＶＰ１の３５位における親Ａｌａ残基は、Ａｓｎで置換されている。一部の実施形態では、ＶＰ１の５８位における親Ｇｌｙ残基は、Ａｓｐで置換されている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１粒子またはＡＡＶ２粒子である。
一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の安定性、アセンブリおよび／または形質導入効率を改善する方法であって、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６であり、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換が、上記の親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更し、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型カプシドを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、同じ血清型に由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、異なる血清型に由来する。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲに隣接した異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは自己相補的なベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子をコードする第１の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲにより連結され、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端解離配列の突然変異を含む。
上記態様および実施形態の一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を含み、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供するＡＡＶ産生細胞により産生される。一部の実施形態では、ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスにＡＡＶ産生細胞を感染させることにより提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ機能は、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸置換を提供し、アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子と比較して、カプシドの脱アミド化を調節する。
図１Ａ〜Ｄは、ＡＡＶ２のＶＰのＬＣ／ＭＳの全イオンクロマトグラムを示す図である。図１Ａ：１．７％／分のグラジエントを有する、長さ１０ｃｍのＢＥＨＣ ４カラム、図１Ｂ：０．５％／分のグラジエントを有する、長さ１０ｃｍのＢＥＨ Ｃ４カラム、；図１Ｃ：０．５％／分のグラジエントを有する、長さ１５ｃｍのＢＥＨ Ｃ４カラム、図１Ｄ：０．５％／分のグラジエントを有する、長さ１５ｃｍのＢＥＨ Ｃ８カラム。 図１−１の続き。 図２ＡおよびＢは、図１Ｄのピーク１（図２Ａ）および図１Ｄピーク２（図２Ｂ）からデコンボリュートされた質量スペクトルを示す図である。 ＡＡＶ２ ＶＰ１の配列（配列番号３）の適用範囲を示す図である：緑色、トリプシンペプチド、青色、Ｌｙｓ−Ｃペプチド、ピンク、Ａｓｐ−Ｎペプチド。 ＡＡＶ２ ＶＰのＮ末端ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。図４Ａ：ＶＰ１のＮ末端のトリプシンペプチドＡ（Ａｃ）ＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲ（配列番号４）。 ＡＡＶ２ ＶＰのＮ末端ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。図４Ｂ；ＶＰ２のＮ末端のＡｓｐ−ＮペプチドＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰ（配列番号１５）。 ＡＡＶ２ ＶＰのＮ末端ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。図４Ｃ：ＶＰ−３のＮ末端のＡｓｐ−Ｎに由来するペプチドＡ（Ａｃ）ＴＧＳＧＡＰＭ（配列番号５）。 １３種のＡＡＶ血清型の配列アラインメントを示す図である。白地に黒字：非類似；青地に青字：保存的；緑地に黒字：同様なブロック；黄地に赤字：同一の；白地に緑字：わずかに同様。ＡＡＶＲｈ１０（配列番号１７）；ＡＡＶ１０（配列番号１８）；ＡＡＶ８（配列番号１９）；ＡＡＶ７（配列番号２０）；ＡＡＶ１（配列番号２１）；ＡＡＶ６（配列番号２２）；ＡＡＶ２（配列番号２３）；ＡＡＶ３（配列番号２４）；ＡＡＶ１１（配列番号２５）；ＡＡＶ１２（配列番号２６）；ＡＡＶ４（配列番号２７）；ＡＡＶ５（配列番号２８）；ＡＡＶ９（配列番号２９）；コンセンサス（配列番号３０）。 １３種のＡＡＶ血清型の配列アラインメントを示す図である。白地に黒字：非類似；青地に青字：保存的；緑地に黒字：同様なブロック；黄地に赤字：同一の；白地に緑字：わずかに同様。ＡＡＶＲｈ１０（配列番号１７）；ＡＡＶ１０（配列番号１８）；ＡＡＶ８（配列番号１９）；ＡＡＶ７（配列番号２０）；ＡＡＶ１（配列番号２１）；ＡＡＶ６（配列番号２２）；ＡＡＶ２（配列番号２３）；ＡＡＶ３（配列番号２４）；ＡＡＶ１１（配列番号２５）；ＡＡＶ１２（配列番号２６）；ＡＡＶ４（配列番号２７）；ＡＡＶ５（配列番号２８）；ＡＡＶ９（配列番号２９）；コンセンサス（配列番号３０）。 １３種のＡＡＶ血清型の配列アラインメントを示す図である。白地に黒字：非類似；青地に青字：保存的；緑地に黒字：同様なブロック；黄地に赤字：同一の；白地に緑字：わずかに同様。ＡＡＶＲｈ１０（配列番号１７）；ＡＡＶ１０（配列番号１８）；ＡＡＶ８（配列番号１９）；ＡＡＶ７（配列番号２０）；ＡＡＶ１（配列番号２１）；ＡＡＶ６（配列番号２２）；ＡＡＶ２（配列番号２３）；ＡＡＶ３（配列番号２４）；ＡＡＶ１１（配列番号２５）；ＡＡＶ１２（配列番号２６）；ＡＡＶ４（配列番号２７）；ＡＡＶ５（配列番号２８）；ＡＡＶ９（配列番号２９）；コンセンサス（配列番号３０）。 ＴＴｘおよびＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２粒子における脱アミド化のパーセンテージを比較するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。Ｔ９ペプチドＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫ（配列番号９）を使用して、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２の両方における潜在的な脱アミド化部位Ｎ５７をモニターした。 ＴＴｘおよびＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２粒子における脱アミド化のパーセンテージを比較するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。Ｔ９ペプチドＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫ（配列番号９）を使用して、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２の両方における潜在的な脱アミド化部位Ｎ５７をモニターした。 ＴＴｘおよびＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２粒子における脱アミド化のパーセンテージを比較するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。Ｔ４９ペプチドＹＮＬＮＧＲ（配列番号１１）およびＹＨＬＮＧＲ（配列番号１２）を使用して、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２のそれぞれにおける潜在的な脱アミド化部位Ｎ５１１をモニターした。 ＴＴｘおよびＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２粒子における脱アミド化のパーセンテージを比較するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。Ｔ４９ペプチドＹＮＬＮＧＲ（配列番号１１）およびＹＨＬＮＧＲ（配列番号１２）を使用して、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２のそれぞれにおける潜在的な脱アミド化部位Ｎ５１１をモニターした。 ＴＴｘおよびＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２粒子における脱アミド化のパーセンテージを比較するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。Ｔ６７ペプチドＳＡＮＶＤＦＴＶＤＮＮＧＬＹＴＥＰＲ（配列番号１３）およびＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲ（配列番号１４）を使用して、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２のそれぞれにおける潜在的な脱アミド化部位Ｎ７１５をモニターした。 ＴＴｘおよびＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２粒子における脱アミド化のパーセンテージを比較するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。Ｔ６７ペプチドＳＡＮＶＤＦＴＶＤＮＮＧＬＹＴＥＰＲ（配列番号１３）およびＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲ（配列番号１４）を使用して、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２のそれぞれにおける潜在的な脱アミド化部位Ｎ７１５をモニターした。 ＡＡＶ５の脱アセチル化された突然変異体の産生およびＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比のＳＹＰＲＯタンパク質ゲル分析の結果を示す図である。 ＡＡＶ５の脱アセチル化された変異体の形質導入の有効度を試験するためのインビトロにおける形質導入アッセイを例示する図である。 指示されたＡＡＶ５の脱アセチル化された変異体または改変されていない親ＡＡＶ５による細胞侵入の有効度を、ベクターゲノムのコピー／μｇタンパク質により測定して示す図である。３種の細胞系統：２９３、ＨｅＬａ、およびＨｕＨ７を使用した。 指示されたＡＡＶ５の脱アセチル化された変異体を形質導入された細胞によるｅＧＦＰ発現（ＥＬＩＳＡにより測定された）を、改変されていない親ＡＡＶ５形質導入と比較して示す図である。３種の細胞系統：２９３、ＨｅＬａ、およびＨｕＨ７を使用した。 １３種のＡＡＶの血清型の配列アラインメントを、ＡＡＶ２中の保存されたＮ５７Ｇ５８脱アミド化部位およびＡ３５残基を強調して示す図である。ＡＡＶＲｈ１０（配列番号３１）；ＡＡＶ１０（配列番号３１）；ＡＡＶ８（配列番号３２）；ＡＡＶ７（配列番号３３）；ＡＡＶ１（配列番号３１）；ＡＡＶ６（配列番号３１）；ＡＡＶ２（配列番号３４）；ＡＡＶ３（配列番号３５）；ＡＡＶ１１（配列番号３１）；ＡＡＶ１２（配列番号３６）；ＡＡＶ４（配列番号３７）；ＡＡＶ５（配列番号３８）；ＡＡＶ９（配列番号３９）；コンセンサス（配列番号４０）。 ＰＣＬまたはＴＴｘ方法により産生されたＡＡＶ１またはＡＡＶ２粒子からのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のタンパク質ゲルを示す図である。＊は先端を切られたＶＰ１（ｔＶＰ１）タンパク質の印である。 指示されたＡＡＶ２の突然変異体の脱アミド化のＬＣ／ＭＳ分析結果を、対照ＡＡＶ２カプシドと比較して示す図である。 ＡＡＶ２脱アミド化突然変異体の産生およびＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比のＳＹＰＲＯタンパク質ゲル分析の結果を示す図である。 ＡＡＶ２脱アミド化変異体の形質導入の有効度を試験するためのインビトロにおける形質導入アッセイを例示する図である。 指示されたＡＡＶ２脱アミド化変異体または改変されていない親ＡＡＶ２による細胞侵入の有効度を、ベクターゲノムコピー／μｇタンパク質で測定して示す図である。３種の細胞系統：２９３、ＨｅＬａ、およびＨｕＨ７を使用した。 指示されたＡＡＶ２脱アミド化変異体を形質導入された細胞によるｅＧＦＰ発現（ＥＬＩＳＡにより測定された）を、改変されていない親ＡＡＶ２を形質導入と比較して示す図である。３種の細胞系統：２９３、ＨｅＬａ、およびＨｕＨ７を使用した。
一部の態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の血清型を決定する方法であって：ａ）ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供する工程と、ｃ）ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量を決定する工程とを含み；ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量の特定の組合せが、ＡＡＶ血清型の指標である、方法を提供する。
他の態様では、本発明は、ＡＡＶ粒子の不均一性を決定する方法であって：ａ）ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供する工程と、ｃ）ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量を決定する工程と、ｄ）工程ｃ）の質量を、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の理論的質量と比較する工程とを含み；ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ＡＡＶカプシドの不均一性の指標である、方法を提供する。
他の態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の血清型を決定する方法であって、ａ）ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したＡＡＶ粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、ｃ）変性したＡＡＶ粒子を消化に供して、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を生成する工程と、ｄ）ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、ｅ）ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量を決定する工程とを含み；ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量の特定の組合せが、ＡＡＶ血清型の指標である、方法を提供する。
他の態様では、本発明は、ＡＡＶ粒子の血清型の不均一性を決定する方法であって：ａ）ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、ｂ）変性したＡＡＶ粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、ｃ）変性したＡＡＶ粒子を消化に供して、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を生成する工程と、ｄ）ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、ｅ）ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量を決定する工程と、ｆ）工程ｅ）の質量を、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の理論的質量と比較する工程とを含み；ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ＡＡＶカプシドの不均一性の指標である、方法を提供する。
一部の態様では、本発明は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、組換えＡＡＶ粒子を提供する。
一部の態様では、本発明は、細胞内のｒＡＡＶ粒子のアセンブリを改善する方法であって、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み；２位において置換されたアミノ酸が、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２よりも高い頻度でＮ−アセチル化される、方法を提供する。一部の態様では、本発明は、細胞内のｒＡＡＶ粒子の形質導入を改善する方法であって、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み、２位において置換されたアミノ酸が、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２よりも高い頻度でＮ−アセチル化される、方法を提供する。
Ｉ． 一般的技術
本明細書において記載されまたは参照される技術および手順は、一般に、当業者によりよく理解され、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ２０１２）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；「ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，第６版、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ」（Ｊ．Ｅ． Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ． ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ． Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；「Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」（Ａ． Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ． ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ． Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３〜８頁）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｐ． Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｄ． Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９頁）；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐ． ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ． Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；「Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｅ． ＨａｒｌｏｗおよびＤ． Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；「Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｍ． ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ． Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；および「Ｃａｎｃｅｒ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」（Ｖ．Ｔ． ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）に記載の広く利用される方法論のような慣用の方法論を使用して、一般的に採用される。
ＩＩ． 定義
本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞中へ送達されるべき核酸を含む、組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を指す。よって、この用語は、それに限定されることなく、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、または他の自然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非自然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。核酸の主鎖は、（ＲＮＡまたはＤＮＡにおいて典型的に見出されるとおり）糖およびリン酸基、または修飾されたもしくは置換された糖もしくはリン酸基を含む。あるいは、核酸の主鎖は、ホスホラミデートのような合成サブユニットのポリマーを含むことができ、よって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホラミデート（Ｐ−ＮＨ２）またはホスホラミデート−ホスホジエステル混成オリゴマーであることができる。加えて、二本鎖核酸は、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニーリングすることによるかまたは適切なプライマーとともにＤＮＡポリメラーゼを使用して、ｄｅ ｎｏｖｏで相補鎖を合成することによる、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得られる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小の長さに限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、自然のまたは非自然のアミノ酸残基を含み、それに限定されることなく、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体および多量体を含む。完全長タンパク質およびその断片の両方が、この定義に包含される。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的のためには、「ポリペプチド」は、所望の活性をタンパク質が維持する限り、天然の配列への（一般には事実上保存的な）欠失、付加および置換のような修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異生成による計画的なものであるか、またはタンパク質を産生する宿主の突然変異によるかまたはＰＣＲ増幅によるエラーのような偶発的なものである。
「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源でない核酸配列）を含む、組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸は、少なくとも１つ、例えば、２つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つ、例えば、２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接した１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源のものでない核酸配列）を含む、ポリヌクレオチドベクターを指す。そのようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルス（または好適なヘルパー機能を発現しているもの）に感染し、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチド中（例えば、染色体中またはクローニングもしくはトランスフェクションのために使用されるプラスミドのような別のベクター中）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下での複製およびカプシド形成により「レスキュー」されることのできる「プロベクター」と呼ばれる。ｒＡＡＶベクターは、それに限定されないが、脂質と複合化され、リポソーム内に密封され、実施形態では、ウイルス粒子、特に、ＡＡＶ粒子中でカプシド形成されたプラスミド、線状の人工染色体を含む、多数の形態のいずれかであることができる。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスカプシド中にパッケージングされて、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。
「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド形成されたｒＡＡＶベクターゲノムからなるウイルス粒子を指す。
Ｎ−アセチル化および／または脱アミド化を比較することの関係で本明細書中で使用される場合、「親ＡＡＶ粒子」および「親ＡＡＶカプシドタンパク質」は、その中へアミノ酸修飾が導入されて、Ｎ−アセチル化および／または脱アミド化を調節するＡＡＶ粒子またはカプシドタンパク質（例えば、主題の発明のＡＡＶ粒子／カプシドと同じまたはそれに類似しているが、本明細書に記載のＮ−アセチル化および／または脱アミド化を調節／変更する突然変異を含まない、ＡＡＶ粒子／カプシドタンパク質）を指す。一部の実施形態では、親ＡＡＶ粒子は、組換えＡＡＶゲノムを含む組換えＡＡＶ粒子である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシド粒子または親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ粒子の他の態様に影響を与えるアミノ酸置換を含む。例えば、親ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合に影響を与えるような、ＡＡＶのその受容体への結合に影響を与えるアミノ酸置換を含むことができる（例えば、ＡＡＶ２ ＨＢＫＯ粒子）。ＡＡＶ２ ＨＢＫＯ粒子は、Ｎ−アセチル化および／または脱アミド化を調節するアミノ酸置換を導入するために、突然変異させることができる。次いで、そのような突然変異したＡＡＶ粒子は、本明細書に記載の本発明の態様において、親ＡＡＶ２ ＨＢＫＯに対して比較される。親ＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＶＰ１カプシドタンパク質、親ＶＰ２カプシドタンパク質、またはＶＰ３カプシドタンパク質を含む。
本明細書中で使用される場合、親分子に関して、用語「調節する」または「変更する」は、親分子の特徴を変化させることを意味する。例えば、Ｎ−アセチル化の変更されたＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、増加したまたは減少したＮ−アセチル化を示し、脱アミド化の変更されたＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、増加したまたは減少した脱アミド化を示す。
「異種性」は、それが比較される実体またはそれが導入されるかもしくは組み込まれる実体のその他の部分とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術により異なる細胞型に導入された核酸は、異種核酸である（そして、発現されるときには、異種ポリペプチドをコードする）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞の配列（例えば、遺伝子またはその一部）は、ベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。
用語「導入遺伝子」は、細胞に導入され、適切な条件下でＲＮＡに転写され、場合により、翻訳されおよび／または発現されることができる核酸を指す。態様では、それが導入された細胞に所望の性質を付与するか、または所望の治療的もしくは診断的アウトカムに導く。別の態様では、これは、ｓｉＲＮＡのようなＲＮＡ干渉を仲介する分子に転写される。
ウイルス力価に関して使用される場合、用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」または「ゲノムコピー」は、感染性または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。具体的なベクター調製物中のゲノム粒子の数は、本明細書中の実施例、または例えば、Ｃｌａｒｋら、（１９９９） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１〜１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら、（２００２）Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、６：２７２〜２７８頁に記載されたような手順により測定される。
ウイルス力価に関して使用される場合、用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」または「複製単位」は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、（１９８８）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３〜１９７３頁に記載の複製中心アッセイとしても知られる感染中心アッセイにより測定した、感染性かつ複製コンピテントな組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
ウイルス力価に関して使用される場合、用語「形質導入単位（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｔ）（ｔｕ）」は、本明細書中の実施例、または例えば、Ｘｉａｏら、（１９９７）Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３〜１２４頁；もしくはＦｉｓｈｅｒら、（１９９６）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０〜５３２頁（ＬＦＵアッセイ）に記載されたような機能アッセイにおいて測定された機能的導入遺伝子産物の産生をもたらす感染性の組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
「末端逆位反復」または「ＩＴＲ」配列は、当分野でよく理解されており、反対方向のウイルスゲノムの末端に見出される比較的短い配列を指す。
当分野でよく理解されている用語「ＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）」配列は、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、２つの代替的な方向付けのいずれかで存在し、異なるＡＡＶゲノムの間および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端の間の不均一性をもたらす。最も外側の１２５ヌクレオチドは、（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と名付けられた）自己相補的なより短い数個の領域も含有し、ＩＴＲのこの部分内に鎖内塩基対形成が起こることを可能とする。
「末端解離配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡの複製の間にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質により切断されるＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域中の配列である。突然変異体末端解離配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に対して不応性である。「ＡＡＶヘルパー機能」は、宿主細胞によりＡＡＶが複製され、パッケージングされることを可能とする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの複製およびパッケージングを助けるヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子を含むがそれに限定されない、多くの形態のうちのいずれにおいても提供される。他のＡＡＶヘルパー機能は、遺伝毒性物質のように当分野で公知である。
「ＡＡＶヘルパー機能」は、宿主細胞によりＡＡＶが複製され、パッケージングされることを可能とする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの複製およびパッケージングを助けるヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子を含むがそれに限定されない、多くの形態のうちのいずれにおいても提供される。他のＡＡＶヘルパー機能は、遺伝毒性物質のように当分野で公知である。
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、（欠損パルボウイルスである）ＡＡＶが宿主細胞により複製され、パッケージングされることを可能とするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアのようなポックスウイルス、およびバキュロウイルスを含むそのようなヘルパーウイルスが多数同定されている。アデノウイルスは、多くの異なる亜群を包含するが、Ｃ亜群の５型アデノウイルス（Ａｄ５）が最も一般に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣのような寄託機関からも入手可能である。ＡＴＣＣのような寄託機関からも入手可能なヘルペス科のウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および偽性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含む。寄託機関から入手可能なバキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルスを含む。
参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインさせ、必要に応じてギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一の、候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。アミノ酸または核酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の能力の範囲内の様々な方法、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアプログラム、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、補遺３０、セクション７．７．１８、表７．７．１）に記載され、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含むものを使用して達成可能である。可能性のあるアラインメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較されている配列の完全長にわたり最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書の目的のために、所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとのまたはそれに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとのまたはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは構成する所与のアミノ酸配列Ａとも表現される）は、以下のように計算される：分数Ｘ／Ｙを１００倍し、ここで、Ｘは、プログラムのＡおよびＢのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムにより同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、ここで、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは等しくないことは理解されるだろう。本明細書の目的のために、所与の核酸配列Ｃの所与の核酸配列Ｄへの、それとのまたはそれに対する核酸配列同一性％（あるいは、所与の核酸配列Ｄへの、それとのまたはそれに対するある特定の核酸配列同一性％を有するかまたは構成する所与の核酸配列Ｃとも表現される）は、以下のように計算される：分数Ｗ／Ｚを１００倍し、ここで、Ｗは、プログラムのＣおよびＤのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムにより同一マッチとしてスコア化されたヌクレオチドの数であり、ここで、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、Ｄに対するＣの核酸配列同一性％は、Ｃに対するＤの核酸配列同一性％とは等しくないことは理解されるだろう。
「単離された」分子（例えば、核酸もしくはタンパク質）または細胞は、それが同定され、その自然の環境の構成要素から分離および／または回収されたことを意味する。
「質量分析」は、気相イオンの質量対電荷比および存在量を測定することにより、化合物（例えば、ポリペプチド）の量および／または種類を同定する分析化学的技術を指す。用語「質量分析」は、本明細書中で互換的に使用される。
ＡＡＶカプシドに関して使用される場合、「不均一性」は、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３ポリペプチドもしくはその断片の参照質量から逸脱することが観察された１種またはそれ以上のカプシドポリペプチドを特徴とする、ＡＡＶカプシドを指す。参照質量は、制限なく、例えば、公知のＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３ポリペプチドの理論的な、予測される、または期待される質量を含む。例えば、ＡＡＶカプシドは、以下の性質（制限なく）：混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を表示する場合に、不均一性を呈すると言われる。
本明細書中の「約」ある値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に向けた実施形態を含む（そして記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
本明細書中で使用される場合、物品の単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別段の指示のない限り、複数の指示物を含む。
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含んでいる」、「からなる」および／または「から本質的になる」ことを含むと理解される。
ＩＩＩ． 方法
本開示のある態様は、ウイルス粒子の血清型を決定する方法に関する。本開示の他の態様は、ウイルス粒子の不均一性を決定する方法に関する。下に記載されるように、各ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の正確な質量は固有であり、ＡＡＶカプシド血清型を同定または区別するために使用することができる。これらの方法は、変性後の異なる型のＡＡＶの直接ＬＣ／ＭＳを、完全なタンパク質レベルにおける正確な質量測定で、タンパク質配列および翻訳後修飾をモニターするために使用することができるという本明細書に記載されている発見に一部は基づく。さらに、ＶＰ１およびＶＰ３のＮ末端のアセチル化も、異なるＡＡＶ血清型で同定および／またはモニターすることができる。これらのＡＡＶ結果および本明細書で提供される指針に基づいて、そのような方法は、プロファイルの種々のウイルスの、例えば、本開示の科、亜科、および属のウイルスの特徴を分析するために容易に適用することができると考えられる。本開示の方法は、例えば、ＶＰの発現、翻訳後修飾、および先端切断をモニターするため、ならびにＶＬＰ産生時における生成物の一貫性を確実にするため、ならびに部位特異的突然変異生成もしくはカプシドタンパク質の操作の適用のための構造の特徴付けを確認するため、ならびに／またはウイルス粒子または調製の不均一性をモニターもしくは検出するためのＶＰのプロファイルにおける使用を見出すことができる。
一部の実施形態では、該方法は、ウイルス粒子を変性させることを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子などのウイルス粒子は、洗剤、熱、高塩、または低または高ｐＨを用いる緩衝を使用して変性することができる。ある実施形態では、ＡＡＶ粒子は、酢酸またはグアニジン塩酸塩を使用して変性させることができる。当業者は、タンパク質変性を促進および／またはモニターするために役立つ種々の方法が当技術分野で利用可能であることを認識しており、液体クロマトグラフィー／質量分析と適合性の変性方法を適当に選択することができる。例えば、熱変性が使用されるならば、タンパク質の沈殿および逆相カラムの詰まりを避けるために注意を払うこともできる。同様に、高塩変性では、ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ／ＭＳの前に、脱塩工程と結合する（couple）こともできる。他の実施形態では、高ｐＨ変性、低ｐＨ変性、または有機溶媒を使用する変性が使用される。
一部の実施形態では、方法は、本開示の変性したウイルス粒子を、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供することを含む。当技術分野で公知であるように、ＬＣ／ＭＳは、イオンを物理的に分離するために液体クロマトグラフィーを、およびイオンからの質量スペクトルのデータを発生させるために質量分析を利用する。そのような質量スペクトルのデータは、例えば、分子量または構造、質量による粒子の同定、量、純度等々を決定するために使用することができる。これらのデータは、経時的なシグナル強度（例えば、存在量）（例えば、保持時間）、または質量対電荷の比に関する相対存在量などの検出されたイオンの性質を表すこともできる。
一部の実施形態では、液体クロマトグラフィー（例えば、本明細書に記載されているようにＬＣ／ＭＳで使用される）は、超高速液体クロマトグラフィー（本明細書では、ＵＰＬＣ；用語「超高速液体クロマトグラフィー」またはＵＨＰＬＣが互換的に使用される）。ＵＰＬＣは、減小した粒子サイズ（例えば、２μｍ未満）を有するカラムおよび増大した流速に依存してクロマトグラフィーの分解能、有効度、ピーク容量、および感度が改善されたＬＣ技法として当技術分野で公知である（例えば、Ｐｌｕｍｂ、Ｒ．ら（２００４） Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１８：２３３１〜２３３７頁を参照されたい）。一部の実施形態では、ＵＰＬＣは、液体クロマトグラフィーにおける粒子サイズが２μｍ未満のカラムの使用を指す。一部の実施形態では、ＵＰＬＣは、液体クロマトグラフィーにおける溶媒の高い線速度（例えば、６０００ｐｓｉ以上で作動するときに観察される）の使用を指す。典型的なＵＰＬＣ装置は市販されている（例えば、Ｗａｔｅｒｓ；Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州からのＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標））。
一部の実施形態では、質量分析（例えば、本明細書に記載されているようにＬＣ／ＭＳで使用される）は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を指すことがある。ＥＳＩ−ＭＳは、質量分析を使用して溶液から誘導されるイオンを分析するために電気エネルギーを使用する技法として、当技術分野で公知である（例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｍ．ａｎｄ Ｆｅｎｎ、Ｊ．Ｂ。（１９８４） Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８：４４５１〜４４５９頁を参照されたい）。イオン種（または溶液もしくは気相でイオン化される中性種）は、荷電液滴のエアロゾルで分散されることにより溶液から気相に移動し、続いて溶媒が蒸発し、荷電液滴のサイズが縮小して、溶液が細いキャピラリーを通過するときに、アース（例えば、周囲チャンバーの壁）に対する電圧で、試料のイオンが荷電液滴から射出される。一部の実施形態では、キャピラリー電圧は、約２ｋＶから約１０ｋＶ、または約２．５ｋＶから約６．０ｋＶである。ある実施形態では、液体クロマトグラフィー（例えば、本明細書に記載されているようにＬＣ／ＭＳで使用される）は、約３．５ｋＶのキャピラリー電圧を使用する。一部の実施形態では、キャピラリー電圧は、約１ｋＶから約１０ｋＶの範囲である。他の実施形態では、質量分析（例えば、本明細書に記載されているようにＬＣ／ＭＳで使用される）は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）を指すこともある。
一部の実施形態では、質量分析（例えば、本明細書に記載されているようにＬＣ／ＭＳで使用される）は、イオンが分析計に入る前に通るサンプリングコーンおよび／またはスキマーを使用する。一部の実施形態では、例えば、上で記載されたようにキャピラリーに電圧をかけたときに、サンプリングコーンは、キャピラリー電圧より低い電圧に保たれる。ある実施形態では、液体クロマトグラフィー（例えば、本明細書に記載されているようにＬＣ／ＭＳで使用される）は、約４５Ｖのサンプリングコーン電圧を使用する。一部の実施形態にでは、サンプリングコーン電圧は、約０Ｖから約２００Ｖの範囲である。
一部の実施形態では、質量分析（例えば、本明細書に記載されているようにＬＣ／ＭＳで使用される）は、支援付き校正を使用する。校正は、質量分析に関して使用される場合に、質量の検出（例えば、ｍ／ｚ測定）に関して装置を校正する目的のための１種またはそれ以上の公知の質量を有する化合物（例えば標準）の導入を含む。一部の実施形態では、支援付き校正とは、公知の標準（例えば、校正物質）のピークおよび／または位置を、特定の質量対電荷（ｍ／ｚ）比と関係づけるソフトウェアの使用を指す。一旦校正されたら、次に、使用者は、１種またはそれ以上の未知の化合物、または未知の濃度で存在する化合物を含む試料について、例えば、以前のまたは公知の実験条件と比較して、ある程度の正確度もしくは誤差および／または所望のレベルの再現性内で、質量分析を実行することができる。ヨウ化ナトリウム、ヨウ化ナトリウムセシウム、ポリエチレングリコール、およびペルフルオロトリブチルアミンを含むが、これらに限定されない種々の校正物質が、当技術分野で公知である。ある実施形態では、ヨウ化ナトリウムが校正物質として使用される。一部の実施形態では、校正物質は、ＬＣ／ＭＳ操作時に質量を固定するグル−１−フィブリノペプチドＢおよびロイシンエンケファリンペプチドである。
一部の実施形態では、方法は、本開示の変性したウイルス粒子、または本開示の変性したウイルス粒子の消化された断片を、液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供することを含む。当技術分野で公知であるように、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（本明細書では、用語「液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析」が互換的に使用されることもある）は、イオンを物理的に分離するために液体クロマトグラフィーを、およびイオンから質量スペクトルのデータを発生させるために質量分析を利用し、ここで、質量分析は、典型的には、断片化工程により分離された、複数の段階の質量（例えば、ｍ／ｚ）分離を使用する。例えば、ｍ／ｚの範囲内の対象のイオンが、ＭＳの第１ラウンドで分離されて断片化され、次に、ＭＳの第２のラウンドで個々のｍ／ｚに基づいてさらに分離される。イオンの断片化は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、電子捕捉解離（ＥＣＤ）、または電子移動解離（ＥＴＤ）などの技法を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、方法は、本開示の変性したウイルス粒子を還元および／またはアルキル化することを含む。ウイルス粒子を還元する手段は、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いる処理を含むが、これらに限定されない。ウイルス粒子をアルキル化する手段は、ＡＡＶ粒子をヨード酢酸、ヨードアセトアミド、または４−ビニルピリジンで処理することを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、方法は、本開示の変性したウイルス粒子を消化に供して、例えば、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を発生させることを含む。例えば、変性したＡＡＶ粒子は、消化に供することができてペプチド断片を発生し、例えば、分析のための分離およびＭＳ／ＭＳのためにＬＣを使用してその断片を分析することができる（より詳しい説明については下を参照されたい）。一部の実施形態では、消化は酵素的消化である。一部の実施形態では、消化は、機器による断片化のＣＮＢｒ処理などの化学的消化を使用する（例えば、トップダウン）。一部の実施形態では、消化は、酸消化などの化学的消化を使用する。
一部の実施形態では、酵素的消化は、エンドペプチダーゼ消化である。エンドペプチダーゼは、ポリペプチドの非末端アミノ酸のペプチド結合のタンパク質分解を触媒する任意のペプチダーゼを含む。公知のエンドペプチダーゼは、トリプシン、キモトリプシン、ＡｓｐＮ、Ｇｌｕ−Ｃ、ＬｙｓＣ、ペプシン、テルモリシン、グルタミルエンドペプチダーゼ、エラスターゼ、およびネプリリシンを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、酵素的消化は、トリプシン消化またはＬｙｓＣ消化である。
一部の実施形態では、液体クロマトグラフィー（例えば、本明細書に記載されているようにＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ／ＭＳで使用される）は、逆相液体クロマトグラフィーである（「逆相液体クロマトグラフィー（reversed phase liquid chromatography）」またはＲＰＬＣという用語は、本明細書では逆相液体クロマトグラフィー（reverse phase liquid chromatography）と互換的に使用される）。当技術分野で公知であるように、逆相液体クロマトグラフィーは、極性の移動相中の疎水性分子を吸着する疎水性固定相（例えば、カラムなどの支持体または基材）を使用するクロマトグラフィーの分離を指すこともある。移動相の極性を低下させることにより（例えば、有機溶媒を添加することにより）、疎水性による分子のグラジエント分離を達成することができて、それは、より疎水性の分子は、カラムとのより強い疎水性相互作用に基づいて、より高い濃度の有機溶媒でカラムにとどまるからである。一部の実施形態では、分離は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、カチオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によるが、オンラインＬＣ／ＭＳに限定されず、ＭＳ前にオフライン分離；例えば、チップ、カラム；プレートまたはカートリッジなどによる。
一般的に、逆相液体クロマトグラフィーのために適当な固定相（例えば、疎水性部分）は、粒子またはビーズ（例えば、多孔性シリカ粒子またはポリスチレン）を充填されたカラムまたは樹脂を含むが、これらに限定されない支持体に結合される。疎水性アルキル鎖、オクチルまたはオクタデシルシリル部分、シアノ部分、およびアミノ部分を含むが、これらに限定されない種々の疎水性固定相が当技術分野で公知である。一部の実施形態では、固定相は、Ｃ４、Ｃ８、またはＣ１８などの特定の長さの疎水性アルキル鎖を含むことができる。ある実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、Ｃ４またはＣ８逆相クロマトグラフィー（例えば、Ｃ４またはＣ８固定相を利用する逆相クロマトグラフィー）である。当業者は、対象の分子（例えば、変性したＡＡＶ粒子またはそれらの断片）に基づいて固定相を適当に選択することができる。
逆相液体クロマトグラフィーのために適当な種々の移動相が当技術分野で公知である。上で記載されたように、逆相液体クロマトグラフィーの移動相は、有機溶媒（例えば、疎水性）および水性溶媒（例えば、極性）の混合物を含むことができる。有機溶媒の比率を上げると、疎水性化合物を固定相から溶出させるその能力が増大する。化合物の保持および／または選択性は、例えば、固定相のタイプまたは露出を変更することにより、末端封止試薬などの極性試薬を付加することにより、温度を変更することにより、および／または有機溶媒の比率、ｐＨ、緩衝剤、および使用される有機溶媒のタイプなどの移動相の特性を変更することによって変更することができる。一部の実施形態では、移動相の極性の構成要素は、水または緩衝水溶液を含むことができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、移動相の極性の構成要素は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、およびギ酸を含むことができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、２種以上の移動相を（例えば、移動相Ａ、移動相Ｂ、その他）目的のグラジエントまたは比率で使用することができる。ある実施形態では、クロマトグラフィーは、水中にギ酸を含む移動相Ａを使用する。ある実施形態では、移動相Ａは、約０．１％のギ酸を含む。ある実施形態では、移動相Ａは、約０．１％から約５％のギ酸を含む。ある実施形態では、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にギ酸を含む移動相Ｂを使用する。ある実施形態では、移動相Ｂは、約０．１％のギ酸を含む。
一部の実施形態では、クロマトグラフィー中における移動相Ｂの比率は、経時的に増大する。例えば、クロマトグラフィー中における移動相Ｂの比率は、段階的様式で増大することができる。ある実施形態では、移動相Ｂは、約１０％から約２０％に、約２０％から約３０％に、および約３０％から約３８％に増大する。他の実施形態では、移動相Ｂは、約２％から約６０％に増大する。他の実施形態では、移動相Ｂは、約２％から約１００％に約１分から約２００分で増大する。一部の実施形態では、移動相の残余は、本開示の第２の移動相、例えば、移動相Ａである。ある実施形態では、移動相Ｂは、約１０％から約２０％に約６分で、約２０％から約３０％に約１０分で、および約３０％から約３８％に約４０分で増大する。他の実施形態では、移動相Ｂは、約２％から約６０％に約１２１分で増大する。当業者は、対象の移動相および使用されるグラジエントのタイミングを、所望のクロマトグラフィーの分離および／または対象分析物に基づいて適当に調節することができる。
一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。ＨＰＬＣは、試料を含有する液体溶媒が固体相を含有するカラムを通過するときに加圧されている液体クロマトグラフィーの形態として、当技術分野で公知である。伝統的なまたは低圧のＬＣは、移動相を固体相を通して通すために重力を使用するが、ＨＰＬＣは、ポンプを使用して移動相に圧力をかけて、典型的には、粒子がより小さい固体相を使用して分解能を向上させる。一部の実施形態では、ＨＰＬＣは、約５０バールと約３５０バールの間の圧力を使用する。一部の実施形態では、逆相ＨＰＬＣは、ＭＳ分析のためにタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質）を濃縮および／または脱塩するために使用されることもある。
一部の実施形態では、電源電圧、キャピラリー温度、ＥＳＩ電圧（ＥＳＩ−ＭＳを使用する場合）、ＣＩＤエネルギー、およびＭＳ／ＭＳ事象の数を含むが、これらに限定されない１種またはそれ以上のパラメーターが、例えば、本明細書において使用されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳでは、本明細書に記載されている発見に基づいて調節される。一部の実施形態では、質量分析（例えば、本明細書に記載されているＬＣ／ＭＳ／ＭＳで使用される）は、約２．５ｋＶの電源電圧（例えば、キャピラリー電圧）を使用する。一部の実施形態では、質量分析（例えば、本明細書に記載されているＬＣ／ＭＳ／ＭＳで使用される）は、約２７５℃のキャピラリー温度を使用する。一部の実施形態では、キャピラリー温度の範囲は約２０℃から約４００℃である。
飛行時間（ＴＯＦ）分析計、四極子質量フィルター、四極子ＴＯＦ（ＱＴＯＦ）、およびイオントラップ（例えば、フーリエ変換に基づく質量分析計またはＯｒｂｉｔｒａｐ）を含むが、これらに限定されない、ＬＣ／ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳのために適当な種々の質量分析計が、当技術分野で公知である。Ｏｒｂｉｔｒａｐでは、遠心力と静電力のバランスにより閉じ込められて、中心軸に沿って振幅して、中心電極の周りで楕円形に回転する軌道でイオンを捕捉するために、アース電位の樽状の外部電極および紡錘状の中心電極が使用される。そのような装置の使用は、イメージ電流の検出から時間ドメインのシグナル（例えば、頻度）を高分解能の質量測定に変換するフーリエ変換操作を使用する（例えば、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）。さらなる説明および詳細は、例えば、Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ、Ｒ．Ａ．ら（２０１４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３：３６９８〜３７０８頁；Ｐｅｒｒｙ、Ｒ．Ｈ．ら（２００８）Ｍａｓｓ． Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． Ｒｅｖ ２７：６６１〜６９９頁；およびＳｃｉｇｅｌｏｖａ、Ｍ．ら（２０１１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０：Ｍ１１１．００９４３１で見出すことができる。
上で記載されたように、一部の実施形態では、ＭＳは、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用するナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳを備える。一部の実施形態では、イオン源は、積層式の環イオンガイドまたはＳレンズを備えることができる。当技術分野で公知であるように、Ｓレンズは、ラジオ周波数（ＲＦ）を使用してイオンビームの焦点を結ばせることができて、それによりイオンの装置への透過を増大させる。これは、感度（例えば、低強度のイオンについて）および／または走査速度を改善することができる。ある実施形態では、質量分析のＳレンズのＲＦレベルは約５５％である。ある実施形態では、質量分析のＳレンズのＲＦレベルは約２０％から約１００％である。
一部の実施形態では、ウイルスのカプシドタンパク質の質量は、例えば、ＬＣ／ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳのデータに基づいて決定することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、またはＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量は、例えば、ＬＣ／ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータに基づいて決定することができる。ＭＳデータからタンパク質質量および／または同一性を決定する種々の方法が、当技術分野で公知である。例えば、ペプチドの質量指紋をＭＳデータに基づいてタンパク質配列を決定するために使用することができるか、またはタンパク質を１種またはそれ以上の構成成分のペプチドに関するＭＳ／ＭＳデータに基づいて同定することができる。タンデムＭＳを使用する場合、生成物のイオン走査を、対象のタンパク質の１種またはそれ以上のペプチドに関するｍ／ｚデータを分析するために使用することができる。その場合、当技術分野で公知のソフトウェアを、例えば、同定されるピークを参照ピークまたは公知のピークと一致させて、ピークをアイソトポマーエンベロープにグループ分けするため等々に使用することができる。ペプチドの質量の値は、公知のペプチド配列のデータベースと比較することができる。例えば、Ｍａｓｃｏｔは、観察されたペプチドを、例えば、特定の消化パターンのインシリコのタンパク質データベースに対する適用から生ずる理論的データベースペプチドと一致させるために使用することができる。他の適当なソフトウェアには、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ、Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ、Ｂｏｎｉｃｓ、またはＭａｓｓＬｙｎｘ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ）が含まれるが、これらに限定されない。ＭＳデータ分析の種々の工程のために適当な他のソフトウェアは、例えば、ｗｗｗ．ｍｓ−ｕｔｉｌｓ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ｐｍｗｉｋｉ．ｐｈｐ／Ｍａｉｎ／ＳｏｆｔｗａｒｅＬｉｓｔに見出すことができる。
一部の実施形態では、本開示の決定または計算された質量（例えば、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の決定または計算された質量）を、１種またはそれ以上のＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３の参照質量、例えば、理論的質量と比較することができる。本開示の参照は、本明細書に記載されているＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３の１種またはそれ以上のいずれかの理論的質量を含むことができる。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３の質量は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶＬＫ０３カプシド（米国特許第９，１６９，２９９号を参照されたい）、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２〜７ｍ８のカプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド（米国特許第７，５８８，７７２号を参照されたい）、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、またはマウスＡＡＶカプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）、ＡＡＶ２ＨＢＫＯカプシド、ＡＡＶＰＨＰ．ＢカプシドまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢカプシドの１種またはそれ以上の理論的質量に対して比較される。一部の実施形態では、本開示の決定または計算された質量（例えば、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の決定または計算された質量）は、対応するＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３の理論的質量と比較することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶ粒子の不均一性を決定することを含む。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の質量の１つまたはそれ以上の偏差（例えば、理論的な、予測される、または期待される質量などの参照質量からの）が、ＡＡＶカプシドの不均一性を示す。一部の実施形態では、不均一性は、以下の：混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、末端が切断されたカプシド、または改変されたカプシドの１種またはそれ以上を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載されたＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳの使用を組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子の血清型を決定する方法は、変性したＡＡＶ粒子をＬＣ／ＭＳ（例えば、本明細書に記載された）に供し、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量を決定する工程；ならびにＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供し、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量を決定する工程（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量の特定の組合せがＡＡＶ血清型を示す）を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子の不均一性を決定する方法は、変性したＡＡＶ粒子をＬＣ／ＭＳ（例えば、本明細書に記載された）に供し、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量を決定し、これらの質量をＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の理論的質量と比較する工程；ならびにＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供し、ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量を決定し、これらの質量をＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の理論的質量と比較する工程（ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の質量の１つまたはそれ以上の偏差がＡＡＶカプシドの不均一性を示す）を含むことができる。
一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、アセチル化されていることがある。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端がアセチル化されている。下でさらに詳細に説明するように、ＡＡＶカプシドタンパク質のメチオニン（ｉＭｅｔ Ｘ）から数えて２番目の位置にあるアミノ酸は、Ｎ末端（Ｎｔ−）アセチル化に対するその効果、ならびにＡＡＶ粒子のトラフィッキング、形質導入、および／または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、ユビキチン化等々）に対して影響するＮｔ−アセチル化の機能的意義を決定するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３）のＮ末端は、場合によっては、例えば、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼによって除去されることもあるメチオニンから数えて最初のアミノ酸を指すこともある。
一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子（例えば、組換えＡＡＶまたはｒＡＡＶ粒子）は、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、参照（例えば、アミノ酸置換前の親ＡＡＶ粒子、または異なるＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を有するＡＡＶ粒子）と比較してＮ末端アセチル化の異なる頻度または比率を有するＶＰ１および／またはＶＰ３を生ずる。一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換はＮ末端アセチル化を、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して変更する。例えば、ある実施形態では、ＶＰ１のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換はＮ末端アセチル化を、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して変更する。ある実施形態では、ＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換はＮ末端アセチル化を、親ＡＡＶ粒子のＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して変更する。一部の実施形態では、Ｎ末端アセチル化を「変更する」アミノ酸置換（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換）は、例えば、親ＶＰ１またはＶＰ３などの置換されていないＶＰ１またはＶＰ３と比較して、より高い頻度のＮ末端アセチル化またはより低い頻度のＮ末端アセチル化をもたらす。ＶＰ１および／またはＶＰ３は、本明細書に記載された典型的なＡＡＶの血清型のいずれかに属して、変異体またはそれらのハイブリッド（例えば、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を有する）を含むこともある。Ｎ末端アセチル化の典型的アッセイは、質量分析、同位体標識（例えば、同位体で標識されたアセチル基またはそれらの前駆体で）、アセチル化特異的抗体を用いるウェスタンブロット法等々を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３）のアミノ酸残基２が、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＡＡＶカプシドのより少ない脱アミド化を生ずる。
一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、脱アミド化されていることもある。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のＮ５７および／またはＶＰ３のＮ３８２、Ｎ５１１、および／またはＮ７１５は脱アミド化されている。下でさらに詳細に説明するように、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３）のＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６から選択されるアミノ酸は、脱アミド化に対するその効果、ならびにＡＡＶ粒子のトラフィッキング、形質導入、および／または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、ユビキチン化等々）に対して影響する脱アミド化の機能的意義を決定するために突然変異させることができる。
一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子（例えば、組換えＡＡＶまたはｒＡＡＶ粒子）は、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、およびＶＰ３のＧ７１６から選択される１種またはそれ以上のアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、および／またはＶＰ３のＧ７１６におけるアミノ酸置換は、参照（例えば、アミノ酸置換前の親ＡＡＶ粒子、または異なる対応するアミノ酸残基２を有するＡＡＶ粒子）と比較して、脱アミド化の異なる頻度または比率を有するＶＰ１および／またはＶＰ３を生じさせる。一部の実施形態では、脱アミド化を「変更する」アミノ酸置換（例えば、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６におけるアミノ酸置換）は、例えば、親ＶＰ１またはＶＰ３などの置換されていないＶＰ１またはＶＰ３と比較して、より高い頻度の脱アミド化またはより低い頻度の脱アミドをもたらす。ＶＰ１および／またはＶＰ３は、本明細書に記載されている典型的ＡＡＶ血清型のいずれかに属して、変異体またはそれらのハイブリッド（例えば、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を有する）を含むこともある。脱アミド化の典型的アッセイは、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、ＰｒｏｍｅｇａからのＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）イソアスパルテート検出キットを参照されたい）等々を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＮ５１１、および／またはＶＰ３のＮ７１５がＡｓｐで置換されており、該アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較してより高い頻度の脱アミド化をもたらす。他の実施形態では、アミノ酸置換はＮ５７ＫまたはＮ５７Ｑであり、該アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較してより低い頻度の脱アミド化をもたらす。さらに他の実施形態では、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＧ５１２、および／またはＶＰ３のＧ７１６が、Ｇｌｙでないアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ）で置換されて、該アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。さらに他の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５がＡｓｎで置換されて、親粒子のＶＰ１の脱アミド化と比較してより高い頻度の脱アミド化をもたらす。
本明細書において使用する「Ｎ−アセチル化」とは、アセチル基がタンパク質のＮ末端アミノ酸のアミノ基に共有結合で付加されるプロセスを指す。典型的には、Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）が、アセチル基をアセチル補酵素Ａ（Ａｃ−ＣｏＡ）からタンパク質の第１アミノ酸残基のα−アミノ基に移動させる。
本明細書で使用される「脱アミド化」とは、アルパラギンまたはグルタミンの側鎖におけるアミド官能基が除去されるかまたは別の官能基に変換される化学反応を指す。例えば、アルパラギンは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸に変換される。他の例では、グルタミンは、グルタミン酸またはピログルタミン酸（５−オキソプロリン）に変換される。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、より高い程度でＮ−アセチル化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のいずれかを超えるＮ−アセチル基を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜５５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜１００％、５〜２５％、２５〜５０％、５０〜７５％、７５％〜１００％、５〜５０％または５０％〜１００％の間いずれかを超えるＮ−アセチル基を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍を超えるいずれかのＮ−アセチル基を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して約２倍から３倍、３倍から４倍、４倍から５倍、５倍から１０倍、１０倍から２５倍、２５倍から５０倍、５０倍から１００倍、１００倍から５００倍、５００倍から１０００倍、２倍から１０倍、１０倍から１００倍、または１００倍から１０００倍を超えるいずれかのＮ−アセチル基を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してより低い程度でＮ−アセチル化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のいずれかを超えて少ないＮ−アセチル基を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜５５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜１００％、５〜２５％、２５〜５０％、５０〜７５％、７５％〜１００％、５〜５０％または５０％〜１００％の間のいずれかで少ないＮ−アセチル基を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍のいずれかを超えて少ないＮ−アセチル基を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、２倍から３倍、３倍から４倍、４倍から５倍、５倍から１０倍、１０倍から２５倍、２５倍から５０倍、５０倍から１００倍、１００倍から５００倍、５００倍から１０００倍、２倍から１０倍、１０倍から１００倍、または１００倍から１０００倍のいずれかの間で少ないＮ−アセチル基を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較してより高い程度で脱アミド化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のいずれかを超えて多く脱アミド化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜５５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜１００％、５〜２５％、２５〜５０％、５０〜７５％、７５％〜１００％、５〜５０％または５０％〜１００％の間のいずれかで、親ＡＡＶ粒子より多く脱アミド化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍のいずれかを超えて脱アミド化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子よりも、約２倍から３倍、３倍から４倍、４倍から５倍、５倍から１０倍、１０倍から２５倍、２５倍から５０倍、５０倍から１００倍、１００倍から５００倍、５００倍から１０００倍、２倍から１０倍、１０倍から１００倍、または１００倍から１０００倍の間のいずれかで脱アミド化される。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してより低い程度で脱アミド化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のいずれかを超えて少なく脱アミド化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子よりも、約５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜５５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜１００％、５〜２５％、２５〜５０％、５０〜７５％、７５％〜１００％、５〜５０％または５０％〜１００％の間のいずれかで少なく脱アミド化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子よりも、約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍のいずれかを超えて少なく脱アミド化される。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子より、約２倍から３倍、３倍から４倍、４倍から５倍、５倍から１０倍、１０倍から２５倍、２５倍から５０倍、５０倍から１００倍、１００倍から５００倍、５００倍から１０００倍、２倍から１０倍、１０倍から１００倍、または１００倍から１０００倍の間のいずれかで少なく脱アミド化される。
本発明は、Ｎ−アセチル化および脱アミド化の任意の組合せを提供する。例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質より高い程度でＮ−アセチルされて、親ＡＡＶカプシドタンパク質より高い程度で脱アミド化されることもあり、ＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質より高い程度でＮ−アセチル化されて、親ＡＡＶカプシドタンパク質と同じ程度で脱アミド化されることもあり、ＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質より高い程度でＮ−アセチル化されて、親ＡＡＶカプシドタンパク質より低い程度で脱アミド化されることもあり、ＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質と同じ程度でＮ−アセチル化されて、親ＡＡＶカプシドタンパク質より高い程度で脱アミド化されることもあり、ＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質と同じ程度でＮ−アセチル化されて、親ＡＡＶカプシドタンパク質と同じ程度で脱アミド化されることもあり、ＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質と同じ程度でＮ−アセチル化されて、親ＡＡＶカプシドタンパク質より低い程度で脱アミド化されることもあり、ＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質より低い程度でＮ−アセチル化されて、親ＡＡＶカプシドタンパク質より高い程度で脱アミド化されることもあり、ＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質より低い程度でＮ−アセチル化されて、親ＡＡＶカプシドタンパク質と同じ程度で脱アミド化されることもあり、またはＡＡＶカプシドタンパク質が、親ＡＡＶカプシドタンパク質より低い程度でＮ−アセチル化されて、親ＡＡＶカプシドタンパク質より低い程度で脱アミド化されることもある。
ＩＶ． ベクター
ある態様で、本発明は、任意の本明細書に記載されている方法で使用するために適当なウイルス粒子に関し、該ウイルス粒子はＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）または別のウイルスに由来するベクターを含むこともある。一部の実施形態では、該ウイルス粒子は異種核酸、例えば、異種導入遺伝子をコードするベクターを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、異種核酸、例えば、異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターゲノムを含む。
本発明は、ｒＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするための治療用ポリペプチドおよび／または核酸をコードする１種またはそれ以上の核酸配列を導入するための組換えウイルスゲノムの使用を考慮する。組換えウイルスゲノムは、治療用ポリペプチドおよび／または核酸、例えば、プロモーター、本開示のＩＴＲ、リボソーム結合要素、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製の起源の発現を確立するための任意の要素を含むことができる。
一部の実施形態では、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。治療用ポリペプチドは、例えば、細胞または生物体中に存在しないかまたは低下したレベルで存在するポリペプチドおよび／または酵素活性を供給することができる。あるいは、治療用ポリペプチドは、細胞または生物体における不均衡を、間接的に解消するポリペプチドおよび／または酵素活性を供給することができる。例えば、代謝酵素または活性における欠損により引き起こされた代謝物の蓄積に関係する障害のための治療用ポリペプチドは、消失した代謝酵素または活性を供給することができるか、またはそれは、代謝物の低減を導く代替する代謝酵素または活性を供給することができる。治療用ポリペプチドは、例えば、優性阻害ポリペプチドとして作用することにより、ポリペプチド（例えば、機能獲得突然変異により過発現して活性化されたか、または活性の調節が狂って他の状態になったポリペプチド）の活性を低下させるためにも使用することができる。
本発明の核酸は、細胞内タンパク質で、細胞膜に固定されて細胞内にとどまっているか、または本発明のベクターを形質導入された細胞により分泌されるポリペプチドをコードすることができる。ベクターを受け入れた細胞により分泌されるポリペプチドについて；ポリペプチドは、可溶性であることができる（すなわち、細胞に取り付けられて（attached）いない）。例えば、可溶性ポリペプチドは膜貫通領域を欠いて、細胞から分泌される。膜貫通ドメインをコードする核酸配列を同定して除去する技法は、当技術分野で公知である。
本発明の核酸は（例えばＡＡＶベクターのゲノム）、導入遺伝子として、ＣＮＳ関連障害を調節または処置するタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする核酸を含むことがある。以下は、ＣＮＳ関連障害と関連する遺伝子の非限定的リストである：ニューロンのアポトーシス阻害タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経膠誘導成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＭ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、抗酸化性物質、抗血管形成ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチド、およびアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）。例えば、パーキンソン病の処置に有用な導入遺伝子は、ドーパミンの合成において律速酵素であるＴＨをコードする。ＴＩＩ補助因子のテトラヒドロビオプテリンを発生するＧＴＰＣＩＩをコードする導入遺伝子も、パーキンソン病の処置に使用することができる。Ｌ−ＤｏｐａのＤＡへの転換を助長するＧＤＮＦまたはＢＤＮＦ、またはＡＡＤＣをコードする導入遺伝子も、パーキンソン病の処置のために使用することができる。ＡＬＳの処置のために有用な導入遺伝子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦまたはＣＮＴＦをコードすることができる。ＡＬＳの処置のためにも、有用な導入遺伝子は、機能的ＲＮＡ、例えば、ＳＯＤ１の発現を阻害するｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡをコードすることができる。虚血の処置のために有用な導入遺伝子は、ＮＡＩＰまたはＮＧＦをコードすることができる。ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする導入遺伝子は、ある種のリソソーム貯蔵疾患（例えば、ＶＩＩ型ムコ多糖症タイプ（ＭＰＳ ＶＩＩ））の処置のために有用である。プロドラッグ活性化遺伝子をコードする導入遺伝子、例えば、ガンシクロビルを、ＤＮＡ合成を撹乱して細胞死を生じさせる毒性ヌクレオチドに変換するＨＳＶ−チミジンキナーゼは、例えばプロドラッグとの組合せで投与すると、ある種の癌を処置するために役立つことがある。β−エンドルフィンなどの内因性オピオイドをコードする導入遺伝子は、疼痛を処置するために有用である場合がある。酸化防止剤の例は、ＳＯＤ１；ＳＯＤ２；カタラーゼ；サーチュイン１、３、４、または５；ＮＲＦ２；ＰＧＣ１ａ；ＧＣＬ（触媒的サブユニット）；ＧＣＬ（変更子サブユニット）；アジポネクチン；グルタチオンペルオキシダーゼ１；およびニューログロビンを含むが、これらに限定されない。抗血管形成ポリペプチドの例は、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＰＥＤＦ、可溶性ＶＥＧＦ受容体、および可溶性ＰＤＧＦ受容体を含むが、これらに限定されない。抗炎症性ポリペプチドの例は、ＩＬ−１０、可溶性ＩＬ１７Ｒ、可溶性ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｇ、ＩＬ−１阻害剤、およびＩＬ１８阻害剤を含むが、これらに限定されない。本発明のｒＡＡＶベクターで使用することができる導入遺伝子の他の例は、当業者には明らかであろう（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ Ｌ Ｃら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７、９３〜１０９頁を参照されたい）。
一部の実施形態では、異種核酸が治療用核酸をコードする。一部の実施形態では、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムを含むことができるが、これらに限定されない。そのようなものとして、治療用核酸は、ベクターの核酸から転写されたときに、本発明の障害と関連する異常なまたは過剰なタンパク質の翻訳または転写に干渉することにより、障害を処置することができるＲＮＡをコードすることができる。例えば、本発明の核酸は、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高度に特異的排除または低減により、障害を処置するＲＮＡをコードすることができる。治療用ＲＮＡ配列は、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高度に特異的な排除または低減により障害を処置することができるＲＮＡｉ、小さい阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはリボザイム（ハンマーヘッド型およびヘアピンリボザイムなど）を含む。
一部の実施形態では、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するために使用される。理論に拘束されることは望まず、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、機能獲得が障害と関連しているポリペプチドの発現および／もしくは活性を低減もしくは排除するために、または障害と関連している欠損を補足するポリペプチドの発現および／もしくは活性を強化するために使用することができると考えられる（例えば、発現が同様なまたは関係する活性を示す遺伝子における突然変異）。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸により処置される本発明の障害の非限定的な例（標的とされるかまたは補われる典型的遺伝子は、各障害について括弧内に記載してある）は、脳卒中（例えば、カスパーゼ−３、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ａｓｋ１、ＰＡＲ１、ＨＩＦ１α、ＰＵＭＡ、および／またはＦｕｋｕｄａ、Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｂａｄａｕｔ、Ｊ．（２０１３）Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）４：４３５〜４５６頁に記載されている任意の遺伝子）、ハンチントン病（突然変異体ＨＴＴ）、癲癇（例えば、ＳＣＮ１Ａ、ＮＭＤＡＲ、ＡＤＫ、および／またはＢｏｉｓｏｎ、Ｄ．（２０１０） Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ５１：１６５９〜１６６８頁に記載されている任意の遺伝子）、パーキンソン病（アルファ−シヌクレイン）、ルー・ゲーリック病（筋萎縮性側索硬化症としても公知である；ＳＯＤ１）、アルツハイマー病（タウ、アミロイド前駆体タンパク質）、大脳皮質基底核変性症またはＣＢＤ（タウ）、大脳皮質基底核神経節変性またはＣＢＧＤ（タウ）、前頭側頭型認知症またはＦＴＤ（タウ）、進行性核上麻痺またはＰＳＰ（タウ）、多系統萎縮症またはＭＳＡ（アルファ−シヌクレイン）、脳癌（例えば、脳癌に関与する突然変異体または過発現した発癌遺伝子）、およびリソソーム貯蔵疾患（ＬＳＤ）を含む。本発明の障害は、皮質の大きい領域、例えば、皮質の１箇所以上の機能的領域、皮質の１箇所以上の葉、および／または皮質全体に関与する障害を含むことがある。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸により処置することができる本発明の障害の他の非限定的な例は、外傷性の脳損傷、酵素機能不全障害、精神医学的障害（外傷後ストレス症候群を含む）、神経変性性疾患、および認知障害（認知症、自閉症、およびうつ病を含む）を含む。酵素機能不全障害は、大脳白質萎縮症（カナバン病を含む）および下に記載した任意のリソソーム貯蔵疾患を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、リソソーム貯蔵疾患を処置するために使用される。当技術分野で公知であるように、リソソーム貯蔵疾患は、リソソーム機能における欠陥により特徴づけられる稀な遺伝性の代謝性障害である。そのような障害は、しばしば適切なムコ多糖、糖タンパク質、および／または脂質代謝のために必要な酵素の欠損により惹起されて、リソソームに貯蔵される細胞材料の病理学的蓄積に至る。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸（標的とされるかまたは補われる典型的遺伝子は各障害について括弧内に記載した）により処置される本発明のリソソーム貯蔵疾患の非限定的な例は、２型または３型ゴシェ病（酸性ベータ−グルコシダーゼ、ＧＢＡ）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ベータ−ガラクトシダーゼ−１、ＧＬＢ１）、ハンター病（イズロネート２−スルファターゼ、ＩＤＳ）、クラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼ、ＧＡＬＣ）、マンノース症疾患（アルファ−Ｄ−マンノシダーゼなどのマンノシダーゼ、ＭＡＮ２Ｂ１）、βマンノース症疾患（ベータ−マンノシダーゼ、ＭＡＮＢＡ）、異染性白質ジストロフィー疾患（シュードアリールスルファターゼＡ、ＡＲＳＡ）、ムコ脂質症ＩＩ／ＩＩＩ疾患（Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、ＧＮＰＴＡＢ）、ニーマン・ピック病Ａ型（酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＡＳＭ）、ニューマン・ピック病Ｃ型（ニューマン・ピックＣタンパク質、ＮＰＣ１）、ポンペ病（酸性アルファ−１，４−グルコシダーゼ、ＧＡＡ）、サンドホフ病（ヘキソスアミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ）、サンフィリッポ病Ａ型（Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ＭＰＳ３Ａ）、サンフィリッポ病Ｂ型（Ｎ−アルファ−アセチルグルコサミニダーゼ、ＮＡＧＬＵ）、サンフィリッポ病Ｃ型（ヘパリンアセチル−ＣｏＡ：アルファ−グルコサミニダーゼＮ−アセチルトランスフェラーゼ、ＭＰＳ３Ｃ）、サンフィリッポ病Ｄ型（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、ＧＮＳ）、シンドラー病（アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、ＮＡＧＡ）、スライ病（ベータ−グルクロニダーゼ、ＧＵＳＢ）、テイ−サックス病（ヘキソスアミニダーゼアルファサブユニット、ＨＥＸＡ）、およびウォルマン病（リソソーム酸リパーゼ、ＬＩＰＡ）を含む。
追加のリソソーム貯蔵疾患、ならびに各疾患と関連する欠陥酵素を下の表１でリストにした。一部の実施形態では、下の表でリストにした疾患は、対応する酵素欠陥を補完するかまたは他の方法で補償する本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置される。
Figure 2019533803
一部の実施形態では、異種核酸は、プロモーターに作動的に連結される。典型的プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセレートキナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１、１０８（２）：１９３〜９頁）および伸張因子１−アルファプロモーター（ＥＦｌ−アルファ）プロモーター（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１９９０、９１（２）：２１７〜２３頁およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６、３（９）：８０２〜１０頁）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーターまたはニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されたサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成性、誘発性または抑制性プロモーターであることができる。一部の実施形態では、本発明は、ＣＢＡプロモーターに作動的に連結された本開示の異種導入遺伝子をコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。典型的プロモーターおよび説明は、例えば、米国特許付与公開第２０１４０３３５０５４号に見出すことができる。
構成性プロモーターの例には、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１〜５３０頁（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートレダクターゼプロモーター、１３−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦｌａプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が含まれるが、これらに限定されない。
誘発性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にして、外部から供給された化合物、温度などの環境因子、または細胞の特定の生理学的状態の存在、例えば、急性相、特定の分化状態により、または複製中の細胞でのみ調節することができる。誘発性プロモーターおよび誘発性システムは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含むが、これらに限定されない種々の商業的供給源から入手可能である。多くの他のシステムが記載されており、当業者により容易に選択される。外部から供給されるプロモーターにより調節される誘発性プロモーターの例には、亜鉛誘発性のヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘発性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（ＷＯ第９８／１００８８号）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１頁（１９９６））、テトラサイクリン抑制性システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５５１頁（１９９２））、テトラサイクリン誘発性システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６〜１７６９頁（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２〜５１８頁（１９９８）も参照されたい）、ＲＵ４８６誘発性システム（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９〜２４３頁（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２〜４４１頁（１９９７））およびラパマイシン誘発性システム（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５〜２８７２頁（１９９７））が含まれる。この関係で役立つことができるさらに他の型の誘発性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性相、細胞の特定の分化状態により、または複製中の細胞でのみ調節されるプロモーターである。
別の実施形態では、導入遺伝子のための自然のままのプロモーター、またはそれらの断片が使用されるであろう。自然のままのプロモーターは、導入遺伝子の発現が、自然のままの発現を模倣するべきことが望まれる場合に、使用することができる。自然のままのプロモーターは、導入遺伝子の発現が、一時的にまたは発達上、または組織特異的様式で、または特異的な転写の刺激に応答して調節されなければならない場合に、使用することができる。さらなる実施形態では、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位またはコザックのコンセンサス配列などの他の自然のままの発現制御要素は、自然のままの発現を模倣するために使用することもできる。
一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を与える。一部の場合では、組織特異的調節配列は、組織特異的様式で転写を誘発する組織特異的転写因子に結合する。そのような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、その他）は当技術分野で周知である。
一部の実施形態では、ベクターはイントロンを含む。例えば、一部の実施形態では、イントロンは、ニワトリベータ−アクチンおよびウサギベータ−グロビンに由来するキメライントロンである。一部の実施形態では、イントロンは、マウス（ＭＶＭ）イントロンの微小ウイルスである。
一部の実施形態では、ベクターはポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）配列（例えば、受入番号ＥＦ５９２５３３を参照されたい）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、およびＨＳＶ ＴＫ ｐＡポリアデニル化配列などのポリアデニル化配列の多数の例が、当技術分野で公知である。
Ｖ． ウイルス粒子およびウイルス粒子を産生する方法
本開示のある態様は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）に関する。
本明細書で提供される指針に基づいて、本開示の技法は、種々の異なるウイルスによる使用のために当業者により適当に適合される。
一部の実施形態では、ウイルスはアデノウイルス科のものであり、それは、典型的にはアデノウイルスとして公知である、非エンベロープ付きウイルスを含む。一部の実施形態では、該ウイルスは、アタデノウイルス属、アビアデノウイルス属、イクタデノウイルス属、マストアデノウイルス属、またはシアデノウイルス属のものである。
一部の実施形態では、ウイルスはパルボウイルス科のものであり、それらはＡＡＶおよびボカパルボウイルスなどの非エンベロープ付きウイルスを含む。一部の実施形態では、ウイルスはデンソウイルス亜科のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、イテラデンソウイルス属、またはペンスチルデンソウイルス属のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、パルボウイルス亜科のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、アムドパルボウイルス属、アベパルボウイルス属、ボカパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、デペンドパルボウイルス属、エリスロパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、またはテトラパルボウイルス属のものである。
一部の実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス科のものであり、それらは、レンチウイルスを含むエンベロープ付きウイルスを含む。一部の実施形態では、ウイルスは、オルトレトロウイルス亜科のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、アルファレトロウイルス属、ベータレトロウイルス属、デルタレトロウイルス属、イプシロンレトロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、またはレンチウイルス属のものである。一部の実施形態では、ウイルスはスプマレトロウイルス亜科のものである。一部の実施形態では、ウイルスはスプマウイルス属のものである。
一部の実施形態では、ウイルスは、バキュロウイルス科のものであり、アルファバキュロウイルスを含むエンベロープ付きウイルスを含む。一部の実施形態では、ウイルスは、アルファバキュロウイルス属、ベータバキュロウイルス属、デルタバキュロウイルス属、またはガンマバキュロウイルス属のものである。
一部の実施形態では、ウイルスは、ヘルペスウイルス科のものであり、単純ウイルスＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２などのエンベロープ付きウイルスを含む。一部の実施形態では、ウイルスは、アルファヘルペスウイルス亜科のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、イルトウイルス属、マルディウイルス属、単純ウイルス属、またはバリセロウイルス属のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、ベータヘルペスウイルス亜科のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、サイトメガロウイルス属、ムロメガロウイルス属、プロボスキウイルス属（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｖｉｒｕｓ）、またはロゼオロウイルス属のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、ガンマヘルペスウイルス亜科のものである。一部の実施形態では、ウイルスは、リンホクリプトウイルス属、マカウイルス属、ペルカウイルス属、またはラジノウイルス属のものである。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶウイルスである。ＡＡＶ粒子では、核酸はＡＡＶ粒子中でカプシド形成している。ＡＡＶ粒子はカプシドタンパク質も含む。一部の実施形態では、核酸は、異種核酸および／または、転写の方向で作動的に連結された以下の構成要素の１つまたはそれ以上、転写開始および停止配列を含む制御配列を含み、それにより発現カセットを形成する。
一部の実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。例えば、発現カセットでは、少なくとも１つの機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、５’および３’末端に隣接することができる。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」により、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンの救出、複製およびパッケージングのために意図されて機能することが意味される。すべて参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８〜３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４〜４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０〜１６頁を参照されたい。本発明の一部の態様を実行するために、組換えベクターは、カプシド形成のために必須のＡＡＶの配列の少なくともすべておよびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本発明のベクター中で使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく（例えば、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３〜８０１頁に記載されているように）、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により変更することができ、またはＡＡＶ ＩＴＲは任意の数種のＡＡＶ血清型から誘導することができる。ＡＡＶの４０種を超える血清型が現在公知であり、新しい血清型および既存の血清型の変異体の同定が続いている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９頁（１８）：１１８５４〜６；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１〜６頁；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９〜８１０頁を参照されたい。任意のＡＡＶ血清型の使用が本発明の範囲内で考慮される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲ等を含むが、これらに限定されないＡＡＶ血清型に由来するベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶベクター）中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶのＩＴＲ、またはマウスＡＡＶのＩＴＲ等を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、１種またはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲに隣接した異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６から選択されるカプセル化タンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ６カプシド、または米国特許付与公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されたＳｈＨ１０などの変異体ＡＡＶ６カプシド）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９から選択されカプセル化タンパク質（例えば、野生型ＡＡＶ９カプシド、または米国特許付与公開第２０１３／０３２３２２６号に記載された改変されたＡＡＶ９カプシド）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンのカプシド突然変異体、ヘパリン結合のカプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶＬＫ０３カプシド、ＡＡＶＤＪカプシド（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ／８カプシド、ＡＡＶ−ＤＪ／９カプシド、または米国特許付与公開第２０１２／００６６７８３号に記載された任意の他のカプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１カプシド、ＡＡＶ２ＨＢＫＯカプシド、ＡＡＶＰＨＰ．ＢカプシドまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢカプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号または国際公開第ＷＯ／２００３／０４２３９７号に記載されたＡＡＶカプシドを含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ〜ＦからのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含む。
本開示のある態様は、アミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含むＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質に関する。一部の実施形態では、アミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較してＮ末端アセチル化を変更する。本明細書に記載されているように、ＡＡＶカプシドタンパク質のメチオニン（ｉＭｅｔ Ｘ）から数えて２番目の位置にあるアミノ酸を、Ｎ末端アセチル化、トラフィッキング、形質導入、および／または他の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、ユビキチン化等々）に対する効果について検討することができる。アセチル化、またはＡＡＶ粒子に関するその機能的影響を検討するために本明細書に記載されている任意のアッセイを使用して、Ｎ末端アセチル化を査定することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３）のアミノ酸残基２が、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換される。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＡＡＶカプシドのより少ない脱アミド化を生ずる。
本開示の他の態様は、脱アミド化を変更するアミノ酸置換を含むＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質に関する。一部の実施形態では、脱アミド化を「変更する」アミノ酸置換（例えば、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６におけるアミノ酸置換）は、例えば、親ＶＰ１またはＶＰ３などの置換されていないＶＰ１またはＶＰ３と比較して、より高い頻度の脱アミド化またはより低い頻度の脱アミド化をもたらす。本明細書に記載されているように、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３）の潜在的な脱アミド化部位は、脱アミド化、トラフィッキング、形質導入、および／または他の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、ユビキチン化等々）に対する効果について検討することができる。脱アミド化、またはＡＡＶ粒子に関するその機能的影響を検討するための本明細書に記載されている任意のアッセイを使用して、脱アミド化を査定することができる。
数カ所の潜在的な脱アミド化部位が本明細書に記載されている。一部の実施形態では、脱アミド化を変更するアミノ酸置換は、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６から選択される。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＮ５１１、および／またはＶＰ３のＮ７１５がＡｓｐで置換されて、該アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較してより高い頻度の脱アミド化をもたらす。他の実施形態では、アミノ酸置換はＮ５７ＫまたはＮ５７Ｑであり、該アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。さらに他の実施形態では、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＧ５１２、および／またはＶＰ３のＧ７１６が、Ｇｌｙでないアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ）で置換され、該アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３である。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２〜７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８、ＡＡＶ２Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶＶ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１などの本明細書に記載されている任意の典型的なＡＡＶカプシド血清型を含むことができる。ＡＡＶカプシドタンパク質は、チロシンおよび／またはヘパリン結合突然変異体などの本明細書に記載されている任意のカプシドタンパク質突然変異体をさらに含むことができる。
本開示の他の態様は、ｒＡＡＶ粒子の安定性を改善する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、例えば、本明細書に記載されているように、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含む。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のアミノ酸残基２が置換される。他の実施形態では、ＶＰ３のアミノ酸残基２が置換される。一部の実施形態では、２位において置換されたアミノ酸は、例えば、本明細書に記載されているように、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２より高い頻度でＮ−アセチル化されている。一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２の置換は、ｒＡＡＶ粒子の安定性を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％改善する。一部の実施形態では、２位において置換されたアミノ酸を有するｒＡＡＶ粒子の安定性は、野生型または親ＡＡＶカプシド、例えば、同じ血清型のＡＡＶカプシドと比較することができる。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２の置換は、ｒＡＡＶ粒子の安定性を、例えば、野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の安定性と比較して、約１０％から約１００％、約２０％から約１００％、約３０％から約１００％、約４０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約１０％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約１０％から約７０％、約２０％から約７０％、約３０％から約７０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、約６０％から約７０％、約１０％から約６０％、約２０％から約６０％、約３０％から約６０％、約４０％から約６０％、約５０％から約６０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、約４０％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約４０％、約３０％から約４０％、約１０％から約３０％、約２０％から約３０％、または約１０％から約２０％のいずれかの比率で改善する。ＡＡＶ粒子の安定性は、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、他の熱変性アッセイ、タンパク質の分解に対する感受性、変性を観察する撮像または構造分析（例えば、電子顕微鏡を使用して）、形質導入の有効度または別の機能的アッセイを含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して、指定された時間間隔で特定の温度（例えば、熱的安定性のために、室温または４℃）に保たれた、または特定のｐＨ（例えば、ｐＨ安定性）で処理された等のＡＡＶ粒子組成物について測定することができる。
本開示の他の態様は、ｒＡＡＶ粒子のアセンブリを改善する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、例えば、本明細書に記載されているように、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含む。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のアミノ酸残基２が置換される。他の実施形態では、ＶＰ３のアミノ酸残基２が置換される。一部の実施形態では、２位において置換されたアミノ酸は、例えば、本明細書に記載されているように、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２より高い頻度でＮ−アセチル化される。一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２の置換は、ｒＡＡＶ粒子のアセンブリを、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％改善する。一部の実施形態では、２位において置換されたアミノ酸を有するｒＡＡＶ粒子のアセンブリは、野生型または親ＡＡＶカプシド、例えば、同じ血清型のＡＡＶカプシドと比較することができる。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２の置換は、ｒＡＡＶ粒子のアセンブリを、例えば、野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子のアセンブリと比較して、約１０％から約１００％、約２０％から約１００％、約３０％から約１００％、約４０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約１０％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約１０％から約７０％、約２０％から約７０％、約３０％から約７０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、約６０％から約７０％、約１０％から約６０％、約２０％から約６０％、約３０％から約６０％、約４０％から約６０％、約５０％から約６０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、約４０％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約４０％、約３０％から約４０％、約１０％から約３０％、約２０％から約３０％、または約１０％から約２０％のいずれかの比率で改善する。ＡＡＶ粒子アセンブリは、粒子産生量および／または速度の測定、カプシド産生の定量（例えば、本明細書に記載されている方法のいずれかを使用して精製した後）、完全なベクターに対する空のカプシドの産生のアッセイ、形質導入の有効度の測定、粒子形成を観察する撮像または構造分析（例えば、電子顕微鏡を使用して）、ＡＡＶカプシドタンパク質の産生（例えば、ウェスタンブロット法によりアッセイされる）等を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。
本開示の他の態様は、ｒＡＡＶ粒子の形質導入を改善する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、例えば、本明細書に記載されているように、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含む。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のアミノ酸残基２が置換される。他の実施形態では、ＶＰ３のアミノ酸残基２が置換される。一部の実施形態では、２位において置換されたアミノ酸は、例えば、本明細書に記載されているように、親のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２より高い頻度でＮ−アセチル化される。一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２の置換は、ｒＡＡＶ粒子の形質導入を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％改善する。一部の実施形態では、２位において置換されたアミノ酸を有するｒＡＡＶ粒子の形質導入は、野生型または親ＡＡＶカプシド、例えば、同じ血清型のＡＡＶカプシドと比較することができる。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２の置換は、ｒＡＡＶ粒子の形質導入を、例えば、野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の形質導入と比較して、約１０％から約１００％、約２０％から約１００％、約３０％から約１００％、約４０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約１０％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約１０％から約７０％、約２０％から約７０％、約３０％から約７０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、約６０％から約７０％、約１０％から約６０％、約２０％から約６０％、約３０％から約６０％、約４０％から約６０％、約５０％から約６０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、約４０％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約４０％、約３０％から約４０％、約１０％から約３０％、約２０％から約３０％、または約１０％から約２０％のいずれかの比率で改善する。ＡＡＶ粒子の形質導入は、本明細書に記載されている形質導入の有効度のアッセイを含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。一部の実施形態では、本発明は、例えば、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換することにより、ｒＡＡＶ粒子の形質導入を減少させる方法を提供する。
本開示の他の態様は、ｒＡＡＶ粒子の安定性を改善する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、例えば、本明細書に記載されているように、脱アミド化を変更する、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸を置換する工程を含む。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６が置換される。一部の実施形態では、置換されたアミノ酸は、例えば、本明細書に記載されているように、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基より高い頻度で脱アミド化される。一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、および／またはＶＰ３のＧ７１６の置換は、ｒＡＡＶ粒子の安定性を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％改善する。一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６が置換されたｒＡＡＶ粒子の安定性を、野生型または親ＡＡＶカプシド、例えば、同じ血清型のＡＡＶカプシドと比較することができる。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、および／またはＶＰ３のＧ７１６の置換は、ｒＡＡＶ粒子の安定性を、例えば、野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の安定性と比較して、約１０％から約１００％、約２０％から約１００％、約３０％から約１００％、約４０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約１０％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約１０％から約７０％、約２０％から約７０％、約３０％から約７０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、約６０％から約７０％、約１０％から約６０％、約２０％から約６０％、約３０％から約６０％、約４０％から約６０％、約５０％から約６０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、約４０％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約４０％、約３０％から約４０％、約１０％から約３０％、約２０％から約３０％、または約１０％から約２０％のいずれかの比率で改善する。ＡＡＶ粒子の安定性は、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、他の熱変性アッセイ、タンパク質の分解に対する感受性、変性を観察する撮像または構造分析（例えば、電子顕微鏡を使用して）、形質導入の有効度または別の機能的アッセイを含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して、指定された時間間隔で特定の温度（例えば、熱的安定性のために、室温または４℃）に保たれた、または特定のｐＨ（例えば、ｐＨ安定性）で処理された等のＡＡＶ粒子組成物について測定することができる。
本開示の他の態様は、ｒＡＡＶ粒子のアセンブリを改善する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、例えば、本明細書に記載されているように、脱アミド化を変更する、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸を置換する工程を含む。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６が置換される。一部の実施形態では、置換されたアミノ酸は、例えば、本明細書に記載されているように、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基より高い頻度で脱アミド化される。一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、および／またはＶＰ３のＧ７１６の置換は、ｒＡＡＶ粒子のアセンブリを、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％改善する。一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６が置換されたｒＡＡＶ粒子の安定性を、野生型または親ＡＡＶカプシド、例えば、同じ血清型のＡＡＶカプシドと比較することができる。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、および／またはＶＰ３のＧ７１６の置換は、ｒＡＡＶ粒子のアセンブリを、例えば、野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子のアセンブリと比較して、約１０％から約１００％、約２０％から約１００％、約３０％から約１００％、約４０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約１０％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約１０％から約７０％、約２０％から約７０％、約３０％から約７０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、約６０％から約７０％、約１０％から約６０％、約２０％から約６０％、約３０％から約６０％、約４０％から約６０％、約５０％から約６０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、約４０％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約４０％、約３０％から約４０％、約１０％から約３０％、約２０％から約３０％、または約１０％から約２０％のいずれかの比率で改善する。ＡＡＶ粒子アセンブリは、粒子産生量および／または速度の測定、カプシド産生の定量（例えば、本明細書に記載されている方法のいずれかを使用して精製した後）、完全なベクターに対する空のカプシドの産生のアッセイ、形質導入の有効度の測定、粒子形成を観察する撮像または構造分析（例えば、電子顕微鏡を使用して）、ＡＡＶカプシドタンパク質の産生（例えば、ウェスタンブロット法によりアッセイされる）等を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。
本開示の他の態様は、ｒＡＡＶ粒子の形質導入を改善する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、例えば、本明細書に記載されているように、脱アミド化を変更する、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸を置換する工程を含む。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６が置換される。一部の実施形態では、置換されたアミノ酸は、例えば、本明細書に記載されているように、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基より高い頻度で脱アミド化される。一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、および／またはＶＰ３のＧ７１６の置換は、ｒＡＡＶ粒子の形質導入を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％改善する。一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６が置換されたｒＡＡＶ粒子の安定性を、野生型または親ＡＡＶカプシド、例えば、同じ血清型のＡＡＶカプシドと比較することができる。例えば、一部の実施形態では、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、および／またはＶＰ３のＧ７１６の置換は、ｒＡＡＶ粒子の形質導入を、例えば、野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の形質導入と比較して、約１０％から約１００％、約２０％から約１００％、約３０％から約１００％、約４０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約１０％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約１０％から約７０％、約２０％から約７０％、約３０％から約７０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、約６０％から約７０％、約１０％から約６０％、約２０％から約６０％、約３０％から約６０％、約４０％から約６０％、約５０％から約６０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、約４０％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約４０％、約３０％から約４０％、約１０％から約３０％、約２０％から約３０％、または約１０％から約２０％のいずれかの比率で改善する。ＡＡＶ粒子の形質導入は、本明細書に記載されている形質導入の有効度のアッセイを含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。
一部の態様では、本発明は、組換え自己補完ゲノム（例えば、自己相補性または自己補完するｒＡＡＶベクター）を含むウイルス粒子を提供する。自己補完するベクターゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己補完するＡＡＶゲノムの使用方法は、各々が参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号；第７，４６５，５８３号；第７，７８５，８８８号；第７，７９０，１５４号；第７，８４６，７２９号；第８，０９３，０５４号；および第８，３６１，４５７号；およびＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５〜２１１１頁に記載されている。自己補完するゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に補完する配列（例えば、異種核酸のコードする、およびコードしない鎖を補完する）の力で二本鎖ＤＮＡ分子を速やかに形成する。一部の実施形態では、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および核酸の相補体をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる。
一部の実施形態では、第１の異種核酸配列と第２の異種核酸配列が、突然変異ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結される。一部の実施形態では、該ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号８）を含む。突然変異したＩＴＲは、末端解離配列を含むＤ領域の欠失を含む。その結果、ＡＡＶウイルスゲノムを複製したときに、ｒｅｐタンパク質はウイルスゲノムを突然変異ＩＴＲで切断されず、それなりに：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドと逆方向の第２の異種ポリヌクレオチド、および第３のＡＡＶ ＩＴＲを５’から３’への順で含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスのカプシドにパッケージングされるであろう。
異なるＡＡＶ血清型が、特定の標的細胞の形質導入を最適化するために、または特定の標的組織（例えば、病変組織）内の特定の細胞型を標的とするために使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含むことができる。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１種もしくはそれ以上のＩＴＲおよびカプシドを含有することができるが、またはｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子のカプシドと異なるＡＡＶ血清型に由来する１種もしくはそれ以上のＩＴＲを含有することもできる。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、突然変異を含み、例えば、カプシドは、突然変異体のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、突然変異は、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異である。一部の実施形態では、突然変異体のカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドを形成する能力を維持する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｙ４４４またはＹ７３０（ＡＡＶ２に従った番号付け）における突然変異などのＡＡＶ２またはＡＡＶ５のチロシン突然変異体のカプシドを含む（例えば、ＺｈｏｎｇＬ．ら、（２００８） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（２２）：７８２７〜７８３２頁を参照されたい）。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ〜ＦからのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含む（Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４、７８（１２）：６３８１頁）。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカンと相互作用する１箇所またはそれ以上の位置で、またはＡＡＶ２のＶＰ１の番号付けに基づく番号付けでアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１箇所またはそれ以上の位置で、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。ヘパラン硫酸塩プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、ＡＡＶ２粒子のために細胞受容体として作用することが当技術分野で公知である（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ、Ｃ．ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ、Ｒ． Ｊ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４３８〜４５頁）。細胞膜におけるＡＡＶ２粒子とＨＳＰＧの間の結合は、粒子を細胞に取り付けることに役立つ。線維芽細胞成長因子受容体およびαｖβ５インテグリンなどの他の細胞表面のタンパク質も、細胞感染を容易にすることができる。結合後、ＡＡＶ２粒子は、クラスリンでコートされた穴を通る受容体に媒介されるエンドサイトーシスを含む機構により細胞に進入することができる。ＡＡＶ２粒子は、エンドソームの酸性化でエンドサイトーシスの小胞から放出される。このことは、ＡＡＶ２粒子が核周囲の領域に、次に細胞核に移行することを可能にする。ＡＡＶ３粒子もヘパリンに結合することが公知である（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ、Ｊ．Ｅ．ら、（２００２） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（２）：７９１〜８０１頁）。
ＡＡＶ２カプシドタンパク質とＨＳＰＧの間の結合は、塩基性ＡＡＶ２カプシドタンパク質残基と負に荷電したグリコサミノグリカン残基の間の静電的相互作用により起こることが公知である（Ｏｐｉｅ、ＳＲら、（２００３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５〜７００６頁；Ｋｅｒｎ、Ａら、（２００３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２〜１１０８１頁）。これらの相互作用に影響される特定のカプシド残基は、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５、およびＲ５８８を含む。これらの残基における突然変異は、Ｈｅｌａ細胞およびヘパリン自体に対するＡＡＶ２結合を弱めることが知られている（Ｏｐｉｅ、ＳＲら、（２００３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５〜７００６頁；Ｋｅｒｎ、Ａら、（２００３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２〜１１０８１頁；ＷＯ第２００４／０２７０１９号Ａ２、米国特許第７，６２９，３２２号）。さらに、理論に拘束されることは望まず、ＡＡＶ２のＶＰ１の番号付けに基づく番号付けでアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の残基におけるアミノ酸置換が、ＨＳＰＧに結合しないＡＡＶカプシド型の形質導入の性質を調整することができるか、またはＨＳＰＧに結合するそれらの能力とは独立のＡＡＶカプシド型の形質導入の性質を調整することができると考えられる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の位置Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８における置換を含み、番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づく。
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換が、ｒＡＡＶ粒子のヘパリン硫酸塩プロテオグリカンに対する結合を、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低下させる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパリン硫酸塩プロテオグリカンに対する結合を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低下させる（野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の結合と比較して）。一部の実施形態では、１箇所またはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパリン硫酸塩プロテオグリカンに対する結合を、約１０％から約１００％のいずれか１つの比率で低下させる。約２０％から約１００％、約３０％から約１００％、約４０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約１０％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約１０％から約７０％、約２０％から約７０％、約３０％から約７０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、約６０％から約７０％、約１０％から約６０％、約２０％から約６０％、約３０％から約６０％、約４０％から約６０％、約５０％から約６０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、約４０％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約４０％、約３０％から約４０％、約１０％から約３０％、約２０％から約３０％、または約１０％から約２０％（野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の結合と比較して）。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、野生型ｒＡＡＶ粒子の結合と比較して、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカンへｒＡＡＶ粒子の検出可能な結合を生じない。ＨＳＰＧに対するＡＡＶ粒子の結合を測定する手段は当技術分野で公知であり；例えば、ヘパリン硫酸塩クロマトグラフィーの媒体への結合、またはその表面にＨＳＰＧを発現することが公知である細胞への結合である。例えば、Ｏｐｉｅ、ＳＲら、（２００３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５〜７００６頁およびＫｅｒｎ、Ａら、（２００３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２〜１１０８１頁を参照されたい。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子の細胞（例えば、眼またはＣＮＳ中の細胞）への形質導入の有効度を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％（野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の形質導入の有効度と比較して）改善する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子の細胞（例えば、眼またはＣＮＳ中の細胞）への形質導入の有効度を、約１０％から約１００％のいずれか１つの比率で改善する。約２０％から約１００％、約３０％から約１００％、約４０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約９０％から約１００％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、約８０％から約９０％、約１０％から約８０％、約２０％から約８０％、約３０％から約８０％、約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、約７０％から約８０％、約１０％から約７０％、約２０％から約７０％、約３０％から約７０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、約６０％から約７０％、約１０％から約６０％、約２０％から約６０％、約３０％から約６０％、約４０％から約６０％、約５０％から約６０％、約１０％から約５０％、約２０％から約５０％、約３０％から約５０％、約４０％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約４０％、約３０％から約４０％、約１０％から約３０％、約２０％から約３０％、または約１０％から約２０％（野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の形質導入の有効度と比較して）。ＡＡＶ粒子の細胞（例えば、培養または組織の一部における細胞）への形質導入の有効度を測定する手段は当技術分野で公知である。例えば、細胞の集団（例えば、培養または組織の一部における）を、細胞で発現されたときにアッセイ可能な受容体（例えば、ＧＦＰ蛍光、ｓＦＬＴ産生、その他）を産生するベクターを含有するｒＡＡＶ粒子の濃度で感染させることができる。
ＡＡＶカプシドタンパク質
一部の態様では、本発明は、アミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質を提供し；アミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較してＮ末端アセチル化を変更する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はＶＰ１またはＶＰ３である。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３）のアミノ酸残基２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＡＡＶカプシドタンパク質のより少ない脱アミド化を生ずる。本発明のＡＡＶカプシドタンパク質の非限定的な例は、以下のＡＡＶ血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２〜７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型カプシドのいずれかのＶＰ１および／またはＶＰ３を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む。
ＡＡＶ粒子の産生
トランスフェクション、安定な細胞系統の産生、ならびにアデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ、ＪＥら、（１９９７） Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０〜８７８９頁）およびバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッド（Ｕｒａｂｅ、Ｍ．ら、（２００２） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３（１６）：１９３５〜１９４３頁；Ｋｏｔｉｎ、Ｒ．（２０１１） Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０（Ｒ１）：Ｒ２〜Ｒ６）を含む感染性ハイブリッドウイルス産生システムを含む、ｒＡＡＶベクターを産生するための多くの方法が当技術分野で公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するためのｒＡＡＶ産生培養は；１）適当な宿主細胞、２）適当なヘルパーウイルス機能、３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列（例えば、ＧＮＰＴＡＢをコードするＡＡＶゲノム）に隣接した核酸（治療用核酸など）；および５）ｒＡＡＶ産生を支持する適当な培地および培地構成要素のすべてを必要とする。一部の実施形態では、適当な宿主細胞は、霊長類の宿主細胞である。一部の実施形態では、適当な宿主細胞は、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３、またはＰｅｒｃ．６細胞などのヒトに由来する細胞系統である。一部の実施形態では、適当なヘルパーウイルス機能は、野生型または突然変異体のアデノウイルス（感温性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構造により提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は任意のＡＡＶ血清型から可能である。一般的に、しかし必ずではなく、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物は、ｒｅｐ遺伝子産物がｒＡＡＶゲノムを複製およびパッケージングするように機能することができる限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型のものである。当技術分野で公知の適当な培地は、ｒＡＡＶベクターの産生のために使用することができる。これらの培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨにより産生される、改変Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、特に組換えＡＡＶベクターの産生に使用するための慣行の培地製剤に関する、各々その全体が参照によって本明細書に組み入れる米国特許第６，５６６，１１８号に記載されたもの、および米国特許第６，７２３，５５１号に記載されたＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ培地などの慣行の製剤を含む培地を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、バキュロウイルスにより提供されて、宿主細胞は昆虫細胞（例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）の細胞）である。一部の実施形
態では、ＡＡＶ ｃａｐ機能は、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を提供し、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較してＮ末端アセチル化を変更する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１またはＶＰ３）のアミノ酸残基２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換される。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＡＡＶカプシドのより少ない脱アミド化を生ずる。
ｒＡＡＶ粒子を産生する１つの方法は、三重トランスフェクション法である。簡単に説明すると、ｒｅｐ遺伝子およびカプシド遺伝子をヘルパーアデノウイルスプラスミドと一緒に含有するプラスミドは、細胞系統（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）にトランスフェクトすることができ（例えば、リン酸カルシウム法を使用して）、ウイルスを収集して、場合により精製することができる。そのように、一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、およびＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重トランスフェクションにより産生され、該核酸の宿主細胞へのトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を産生することができる宿主細胞を発生させる。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、産生細胞系統法により産生することができる（Ｍａｒｔｉｎら、（２０１３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３〜２６９頁；米国特許付与公開第２００４／０２２４４１１号；およびＬｉｕ、Ｘ．Ｌ．ら（１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：２９３〜２９９頁を参照されたい）。簡単に説明すると、ある細胞系統（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、またはＰｅｒｃ．６細胞系統）には、ｒｅｐ遺伝子、カプシド遺伝子、およびプロモーター−異種核酸配列を含むベクターゲノム（例えば、ＧＮＰＴＡＢ）を含有するプラスミドを、安定にトランスフェクトすることができる。細胞系統は、ｒＡＡＶ産生のためのリードクローンを選択するためにスクリーニングされて、次にそれを産生バイオリアクターに拡大して、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶ）に感染させて、ｒＡＡＶ産生を開始させる。その後、ウイルスを収穫して、アデノウイルスを不活性化（例えば、加熱により）および／または除去して、ｒＡＡＶ粒子を精製することができる。そのように、一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクター、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、およびＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１種またはそれ以上を含む産生細胞系統により産生された。本明細書に記載されているように、産生細胞系統法は、三重トランスフェクション法と比較して、大きすぎるゲノムを有するｒＡＡＶ粒子の産生に有利なこともある。
一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、産生細胞系統で安定に維持される。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１種またはそれ以上のプラスミドに載せて細胞系統に導入されて産生細胞系統を発生する。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムが、同じプラスミドで細胞中に導入される。他の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒＡＡＶゲノムが、異なるプラスミドで細胞中に導入される。一部の実施形態では、プラスミドで安定にトランスフェクトされた細胞系統は、該細胞系統の複数の継代（例えば、該細胞の５、１０、２０、３０、４０、５０代または５０代を超える継代）の間該プラスミドを維持する。例えば、プラスミドは、細胞が複製されるときに複製されるか、またはプラスミドが細胞ゲノム中に組み込まれることもある。プラスミドが細胞中（例えば、ヒトの細胞）で自律的に複製されることを可能にする種々の配列が同定されている（例えば、Ｋｒｙｓａｎ、Ｐ．Ｊ．ら（１９８９） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：１０２６〜１０３３頁を参照されたい）。一部の実施形態では、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有することもできる。哺乳動物の細胞で一般的に使用される選択可能なマーカーは、ブラスチシジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ゼオシン、ピューロマイシン、およびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。核酸を細胞に導入する方法は当技術分野で公知であり、ウイルスの形質導入、カチオン性トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランなどのカチオン性ポリマーまたはリポフェクタミンなどのカチオン性脂質を使用する）、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、粒子衝撃、電気穿孔、およびナノ粒子トランスフェクションを含むが、これらに限定されない（さらなる詳細については、例えば、Ｋｉｍ， Ｔ．Ｋ． ａｎｄ Ｅｂｅｒｗｉｎｅ， Ｊ．Ｈ．（２０１０） Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３９７：３１７３〜３１７８頁を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、産生細胞系統のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１種またはそれ以上のプラスミドに載せて細胞系統中に導入され、産生細胞系統を発生する。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態では、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性のマーカー）を含有することができる。核酸を種々の宿主細胞系統に安定に組み込む方法は、当技術分野で公知である。例えば、繰り返される選択（例えば、選択可能なマーカーの使用により）は、選択可能なマーカー（およびＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノム）を含有する核酸が組み込まれた細胞を選択するために使用することができる。他の実施形態では、核酸は、部位特異的様式で細胞系統に組み込まれて、産生細胞系統を発生することができる。ＦＬＰ／ＦＲＴ（例えば、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ、Ｓ．ら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１〜１３５５頁を参照されたい）、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（例えば、Ｓａｕｅｒ、Ｂ． ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎ．（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５１６６〜５１７０頁を参照されたい）、およびｐｈｉ Ｃ３１−ａｔｔ（例えば、Ｇｒｏｔｈ、Ａ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５〜６０００頁を参照されたい）などの数通りの部位特異的組換えシステムが当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、産生細胞系統は、霊長類の細胞系統（例えば、ＶｅｒｏまたはＦＲｈＬ−２細胞系統などの非ヒト霊長類細胞系統）から誘導される。一部の実施形態では、細胞系統はヒト細胞系統から誘導される。一部の実施形態では、産生細胞系統は、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、またはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞に由来する。例えば、産生細胞系統を発生するための、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および／または大きすぎるｒＡＡＶゲノムをコードする核酸の細胞系統中への導入および／または安定維持／組み込みに当たって、細胞系統はＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、またはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞系統、またはそれらの誘導体である。
一部の実施形態では、産生細胞系統は、懸濁液中における成長に適合されている。当技術分野で公知であるように、固定に依存する細胞は、典型的には、微小担体ビーズなどの基材なしでは懸濁液中で成長することができない。細胞系統を懸濁液中で成長するように適合させることは、例えば、凝集防止のためにカルシウムおよびマグネシウムイオンを欠く培養培地（および場合により消泡剤）を使用し、シリコーン処理化合物でコートした培養容器を使用し、各継代で培養する細胞を選択し、攪拌棒で攪拌するスピナー培養で（大きい凝集塊または容器の側面におけるよりむしろ）、細胞系統を成長させることを含む。さらなる説明については、例えば、ＡＴＣＣ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ａｓｋｅｄ ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ｄｏｃｕｍｅｎｔ（ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ ａｔ ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｇｌｏｂａｌ／ＦＡＱｓ／９／１／Ａｄａｐｔｉｎｇ％２０ａ％２０ｍｏｎｏｌａｙｅｒ％２０ｃｅｌｌ％２０ｌｉｎｅ％２０ｔｏ％２０ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−４０．ａｓｐｘで利用できる）およびそこで引用されている参考文献を参照されたい。
本発明の適当なＡＡＶ産生培養培地は、血清または血清に由来する組換えタンパク質を、０．５％〜２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで補完されている。あるいは、当技術分野で公知であるように、ＡＡＶベクターは、動物由来の産物を含まない培地ということもできる無血清条件で産生することもできる。当業者は、ＡＡＶベクターの産生を支持するようにデザインされた市販のまたは慣行の培地が、産生培養におけるＡＡＶの力価を増大させるために、グルコース、ビタミン、アミノ酸、およびまたは成長因子を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知である１種またはそれ以上の細胞培養構成要素で補完されていることもあることを認識することができる。
ＡＡＶ産生培養物は、利用される特定の宿主細胞に適した種々の条件下で（広い温度範囲にわたって、時間の長さを変えて等）成長させることができる。当技術分野で公知であるように、ＡＡＶ産生培養は、例えば、ローラー瓶、中空繊維フィルター、微小担体、および充填床または流動床のバイオリアクターなどの適当な取り付け依存性容器中で培養することができる取り付け依存性培養を含む。ＡＡＶベクター産生培養は、例えば、スピナーフラスコ、攪拌槽バイオリアクター、およびＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含む種々の方法で培養することができるＨｅＬａ、２９３、およびＳＦ−９細胞などの懸濁に適合された宿主細胞も含むことができる。
本発明のＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ産生培養から、産生培養の宿主細胞の溶解により、または米国特許第６，５６６，１１８号にさらに完全に記載されているように、完全な細胞からＡＡＶ粒子を培地中に放出させる当技術分野で公知である条件下で、細胞が培養されるならば、産生培養から使用の終わった培地を収穫することにより収穫することができる。細胞を溶解する適当な方法も、当技術分野で公知であり、例えば複数回の凍結／融解サイクル、超音波処置、微小流動化、および洗剤および／またはプロテアーゼなどの化学物質を用いる処理を含む。
さらなる実施形態では、ＡＡＶ粒子は精製される。本明細書において使用する用語「精製される」は、ＡＡＶ粒子が天然で生ずるかまたは最初に調製される場合にも存在することがある少なくとも一部の他の構成要素が取り去られたＡＡＶ粒子の調製を含む。したがって、例えば、単離されたＡＡＶ粒子は、培養溶解物または産生培養上清などの供給源混合物から富化される精製技法を使用して調製することができる。富化は、例えば、溶液中に存在するＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）またはゲノムコピー（ｇｃ）の比率により、または感染性によるなどの種々の方法で測定することができるか、またはそれは、第２の、供給源混合物中に存在する可能性のある、ヘルパーウイルス、培地構成要素等を含む産生培養の汚染物質またはプロセス中の汚染物質を含む汚染物質などの妨害物質に関して測定することができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶ産生培養収穫物は宿主細胞デブリを除去して清浄化される。一部の実施形態では、産生培養収穫物は、例えば、規格ＤＯＨＣのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ Ｐｏｄフィルター、規格Ａ１ＨＣのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ ＨＣ Ｐｏｄフィルター、および０．２μｍフィルターＯｐｔｉｃａｐ ＸＬ１Ｏ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ親水性膜フィルターを含む一連のデプスフィルターを通す濾過により清浄化される。清浄化は、遠心分離または当技術分野で公知の０．２μｍ以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターを通す濾過などの当技術分野で公知である種々の他の標準技法によっても達成することができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶ産生培養収穫物を、ベンゾナーゼ（登録商標）でさらに処理して、産生培養物中に存在するいかなる高分子量ＤＮＡも消化する。一部の実施形態では、ベンゾナーゼ（登録商標）消化は、例えば、１〜２．５単位／ｍｌのベンゾナーゼ（登録商標）の最終濃度、周囲温度から３７℃の温度範囲で３０分から数時間の間を含む当技術分野で公知の標準条件下で実行される。
ＡＡＶ粒子は、以下の精製工程：平衡遠心分離；流通アニオン性交換濾過；ＡＡＶ粒子を濃縮するための接線流濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの加熱不活性化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝交換；ナノ濾過；およびアニオン性交換クロマトグラフィー、カチオン性交換クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーによるＡＡＶ捕捉の１種またはそれ以上を使用して、単離または精製することができる。これらの工程は、単独で、種々の組合せで、または異なる順序で使用することができる。一部の実施形態では、方法は、下に記載される順ですべての工程を含む。ＡＡＶ粒子を精製する方法は、例えば、Ｘｉａｏら、（１９９８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４〜２２３２頁；米国特許第６，９８９，２６４号および第８，１３７，９４８号；および国際公開ＷＯ２０１０／１４８１４３号に見出される。
医薬組成物
一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）は医薬組成物中にある。該医薬組成物は、本明細書に記載されているまたは当技術分野で公知である任意の様式の投与に適することができる。一部の実施形態では、該医薬組成物は、安定性を改善するように、および／またはｒＡＡＶ粒子の形質導入の有効度を改善するように；例えば、ＶＰ１および／またはＶＰ３の位置２におけるアミノ酸残基を、ｒＡＡＶカプシドタンパク質のアセチル化を改善するように置換することに使用するために改変されたｒＡＡＶ粒子を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定性および／またはｒＡＡＶ粒子の形質導入の有効度を調整するように（例えば、安定性および／または形質導入の有効度を増大させるかまたは安定性および／または形質導入の有効度を低下させる）；例えば、脱アミド化を調整する（例えば、脱アミド化を増大させるかまたは脱アミド化を減少させる）アミノ酸残基の置換に使用するために改変されたｒＡＡＶ粒子を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物中にある。当技術分野で周知のように、薬学的に許容される賦形剤は、薬理学的に効果的な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質であり、液体溶液または懸濁液として、エマルションとして、または使用前に液体に溶解または懸濁するために適当な固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形態または形を保持している状態を与えるか、または希釈剤として役立つことができる。適当な賦形剤には、安定剤、加湿および乳化剤、浸透圧を変えるための塩、カプセル化剤、ｐＨ緩衝物質、および緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤は、過度の毒性がなく投与することができる、眼に直接送達するために適当な任意の医薬品を含む。薬学的に許容される賦形剤は、ソルビトール、任意の種々のツイーン化合物、および水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体が含むが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は、それらに含めることができ、例えば、塩酸塩、臭素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩である。薬学的に許容される賦形剤の詳細な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ニュージャージー州、１９９１）で利用できる。一部の実施形態では、本明細書に記載されているｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物は、ヒトに投与するために適する。そのような担体は当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。
そのような薬学的に許容される担体は、水およびピーナツ油、ダイズ油、ミネラル油などの石油、動物、植物または合成起源の油を含む油などの滅菌液体であることができる。食塩水溶液およびデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射用溶液のために使用することができる。医薬組成物は、追加の成分、例えば防腐剤、緩衝剤、等張剤、酸化防止剤および安定剤、非イオン性の加湿または浄化剤、増粘剤等をさらに含むことができる。本明細書に記載されている医薬組成物は、単一の投薬単位または多回投与形態で包装することができる。組成物は、一般的に滅菌および実質的に等張の溶液として製剤化される。
キットおよび製造品
本発明は、本開示のｒＡＡＶ粒子のいずれかおよび／または医薬組成物を含むキットまたは製造品も提供する。キットまたは製造品は、本発明の任意のｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子組成物を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、安定性を改善するために、および／またはｒＡＡＶ粒子の形質導入の有効度を改善するために使用される；例えば、ｒＡＡＶカプシドタンパク質のアセチル化を改善するためにＶＰ１および／またはＶＰ３の位置２におけるアミノ酸残基を置換することに使用するために使用される。一部の実施形態では、キットは、ｒＡＡＶ粒子の安定性および／または形質導入の有効度を調整するために使用される（例えば、安定性および／もしくは形質導入の有効度を向上させるために、または安定性および／もしくは形質導入の有効度を低下させるために）；例えば、脱アミド化を調整する（例えば、脱アミド化を増大させるかまたは脱アミド化を減少させる）アミノ酸残基の置換のために使用される。
一部の実施形態では、キットまたは製造品は、ｒＡＡＶ粒子の組成物を投与するための使用説明書をさらに含む。本明細書に記載されているキットまたは製造品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針、注射器、および任意の本明細書に記載されている方法を実行するための使用説明書を含む包装挿入物を含む、商業的なおよび使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含むことができる。適当な包装材料は、例えば、バイアル（封止されたバイアルなど）、容器、アンプル、瓶、ジャー、可撓性包装（例えば、封止されたＭｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）等を含む当技術分野で公知である任意の包装材料に含まれることもあり、それらであることもできる。これらの製造の物品は、さらに滅菌され、および／または封止されていることもある。
一部の実施形態では、キットまたは製造品は、本明細書に記載されている緩衝剤および／または薬学的に許容される賦形剤の１種またはそれ以上（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ニュージャージー州、１９９１に記載されているような）をさらに含有する。一部の実施形態では、キットまたは製造品は１種またはそれ以上の本明細書に記載されている薬学的に許容される賦形剤、担体、溶液、および／または追加の成分を含む。本明細書に記載されているキットまたは製造品は、単一の単位投薬または多回投与形態で包装することができる。キットまたは製造品の内容物は、一般的に滅菌されて製剤化され、凍結乾燥されるかまたは実質的に等張の溶液として提供することができる。
本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に記載されている実施例および実施形態は、例示の目的のためだけであること、およびそれらに照らした種々の改変または変化が、当業者に示唆されており、本出願の精神および趣旨および添付の請求項の範囲内に含まれるべきであることは理解される。
組換えＡＡＶウイルスのカプシドタンパク質の完全な特徴付けのための直接ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、それらの非病原性の性質、分裂しているおよび分裂してない細胞の両方に感染する能力および長期遺伝子発現のために、人気のある遺伝子治療のベクターになった。現在、ＡＡＶに基づく遺伝子治療は、筋ジストロフィー、血友病、パーキンソン病、Ｌｅｂｅｒの先天性黒内障および黄斑変性などの多くの疾患の標的のための臨床試験で使用されている。
ＡＡＶは、二十面体のシェルにカプセル化された単鎖ＤＮＡゲノムを有する小さいおよびエンベロープのないパルボウイルスである。カプシドの各々は、３種のウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１（８７ｋＤａ）、ＶＰ２（７３ｋＤａ）およびＶＰ３（６２ｋＤａ）の６０コピーを約１：１：１０比で含む。３種のウイルスカプシドタンパク質は、同じオープンリーディングフレームから選択的スプライシングおよび非定型開始コドンを使用することにより発現されて、したがって重なる配列を有する。ＶＰ１は、ＶＰ３と比較して約１３７個の追加のＮ末端アミノ酸残基を有し、一方、ＶＰ２は、ＶＰ３と比較して約６５個の追加のＮ末端アミノ酸残基を有する。少なくとも１３種のＡＡＶ血清型および約１５０通りの遺伝子配列が、ヒトおよび非ヒト霊長類組織から単離されており；ＡＡＶ血清型は、ウイルスカプシドタンパク質のアミノ酸配列および標的とするそれらの対応する細胞受容体および共受容体が異なる。
ＡＡＶカプシドは、ゲノムの内部を保護することに加えて、受容体結合、ウイルスのエンドソームからの脱出、およびウイルスＤＮＡの核中への輸送を媒介することで、ウイルスの感染サイクルにおいて重要な役割を演じて、したがって、ウイルスの感染性に直接強く影響する。ＶＰ１のＮ末端は、ホスホリパーゼＰＬＡ２ドメイン（ａ．ａ．５２〜９７）を含有することが示されており、そのことは、ウイルスのエンドソーム脱出に決定的に重要である［１〜３］。ＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端は、３個の塩基性アミノ酸クラスターも、核局在化シグナルとして含有する。これらの配列は、異なるＡＡＶ血清型の間で高度に保存されている。これらのアミノ酸の突然変異は、感染性を完全に低下させるかまたは無効にすることが示されている［４］。それに加えて、各ＡＡＶ血清型は、対応する配列に特異的な受容体および共受容体を有する。例えば、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカンは、ＡＡＶ２の主要な受容体として同定されており、および、αＶβ５インテグリン、線維芽細胞増殖因子受容体１、および肝細胞成長受容体を含む数種類の他の共受容体が同定されている［５〜８］。ＡＡＶ２カプシドタンパク質の突然変異の分析により、塩基性アミノ酸（アルギニン４８４、４８７、５８５、およびリシン５３２）の群が、ヘパリンおよびＨｅＬａ細胞結合に寄与するヘパリン結合モチーフとして同定された［９］。ＡＡＶ２中のＮＧＲドメインは、ウイルスの細胞侵入のために必須のインテグリンα５β１結合ドメインとして同定された［１０］。まとめると、ウイルス感染サイクルにおいて、ウイルスカプシドタンパク質配列は、細胞のターゲティングおよびトラフィッキングで重要である。異なる産生条件が、ウイルスカプシドタンパク質の異なる発現レベル、翻訳後修飾、および先端切断の原因になるので、ウイルスカプシドタンパク質は、遺伝子治療の開発プログラムにおいて生成物の一貫性を確実にするために、特徴付けされてモニターされる必要がある。
伝統的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質を特徴付けして、およその分子量情報を８７ｋＤａ、７３ｋＤａおよび６２ｋＤａなどと提供するために使用されてきた。おそらく、ＶＰ２以外のウイルスカプシドタンパク質の封鎖されたＮ末端のために、エドマン配列決定から配列情報は得られなかった。複数のＡＡＶのＸ線構造が解析されたが、ＶＰ３領域の配列が結晶構造で観察されただけであった。ＶＰ３の１５種のＮ末端アミノ酸残基が、おそらくその固有の障害のために、Ｘ線構造でまだ不明であった［１１〜１３］。原子構造におけるＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端領域の情報の欠如が、カプシドにおけるＶＰ１およびＶＰ２の低い化学量論に基づくことはあり得る。それに加えて、一部の文献で報告されたように、ＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端は、カプシドの内側に埋め込まれていて、自然のままの状態では、抗体に近づくことができない［３、１４、１５］。従来、ゲル−ＬＣ／ＭＳの方法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル中のトリプシンによる消化およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）がＶＰの特徴付けで使用された［１６〜１８］。しかしながら、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のＮ末端は、これらの手法を使用しても確認されず、その理由は、これらの方法は、ゲルからのペプチドの回収が限定されたために、ＶＰの１００％の配列適用範囲を得ることができなかったことにある。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用した直接分析が、有機酸を用いた解離後のタバコモザイクウイルスＵ２を含む数種類のウイルスカプシドタンパク質について報告された［１９］。アミド水素交換後の直接ペプチドマッピングおよびマススペクトロメトリーが、ブロモモザイクウイルス（ＢＭＶ）のカプシドにおけるｐＨに誘発される構造変化を研究するために使用された［２０］。ＡＡＶは、カプシドタンパク質およびゲノムのみを含有するエンベロープのないウイルスであるから、ＡＡＶカプシドは、タンパク質のＲＰ−ＬＣ／ＭＳおよびペプチドマッピングのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって直接分析することができて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離をしないでカプシド解離後の１００％の配列適用範囲が得られた。ＤＮＡ断片は、空隙体積で溶出することができ、したがってＬＣ／ＭＳによるタンパク質／ペプチドの検出に干渉しなかった。これらの方法を検討するために、変性後の異なる型のＡＡＶの直接ＬＣ／ＭＳを使用して、ＡＡＶカプシドタンパク質のタンパク質配列および翻訳後修飾をモニターした。本明細書に記載されているように、ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のＮ末端は、マススペクトロメトリーにより確認されている。ＶＰ１およびＶＰ３のＮ末端アセチル化は、異なる血清型のＡＡＶでも同定された。ＡＡＶの直接ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピングが、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の配列適用範囲を提供してＶＰ１およびＶＰ３のＮ末端アセチル化を確認するために開発された。
方法
材料および試薬
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、４−ビニルピリジン、超純粋ギ酸、酢酸、グアニジン−ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＴｒｉｓ塩基はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）から購入した。Ａｍｉｃｏｎのｕｌｔｒａ−４フィルターは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）から購入した。ブタの配列決定規格トリプシンは、（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州）から購入した。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−ＣおよびＡｓｐ−Ｎは、Ｒｏｃｈｅ（ドイツ）から購入した。１０，０００のＭＷＣＯを有するＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセットは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）から購入した。
ベクター産生および精製
ＡＡＶベクターは、前に記載した一過性三重トランスフェクション法（Ｘｉａｏ、１９９８＃１２３）を使用して産生した。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を、ポリエチレンイミン、ＰＥＩ、および１：１：１の比の３種のプラスミド（ＩＴＲベクター、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐおよびＡｄヘルパープラスミド）を使用してトランスフェクトした。ベクターのプラスミドは、ベクターのゲノムＣＢＡ−ＥＧＦＰおよびＡＡＶ２からのＩＴＲ配列を含有する。ＥＧＦＰ発現は、記載されたように（Ｍｉｙａｚａｋｉ、１９８９＃１２４）（Ｎｉｗａ、１９９１＃１２５）、ＣＭＶエンハンサーニワトリベータアクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢＡ）によって推進された。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐヘルパーは、ＡＡＶ２および血清型特異的なカプシド配列からのｒｅｐ２／ｃａｐ２、ｒｅｐ２／ｃａｐ５、ｒｅｐ２／ｃａｐ７その他と命名されたｒｅｐ配列を含有していた。使用されたｐＡｄヘルパーは、ｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、カリフォルニア州）であった。ＡＡＶの精製は、Ｑｕら（２００７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０：１８３〜１９２頁）に記載されたように実行した。
ＬＣ／ＭＳによる完全タンパク質の分析
ＡＡＶビリオンを、Ａｍｉｃｏｎのｕｌｔｒａ−４フィルター（１０ｋＤａのＭＷＣＯ）で濃縮して１０％酢酸で変性させ、続いてＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ−Ｘｅｖｏ（登録商標）ＱＴＯＦＭＳ装置（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）で直接分析した。分離は、ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ４またはＣ８カラム（１．７μｍ、内径２．１ｍｍ）を０．２５ｍｌ／分の流速で用いて実行した。移動相Ａは水中０．１％ギ酸であったが、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ギ酸であった。最終のグラジエントは以下の通りであった：６分間で１０％Ｂから２０％Ｂ、１０分間で２０％Ｂから３０％Ｂ、次に４０分間で３０％から３８％Ｂ。ＭＳではキャピラリー電圧およびサンプリングコーン電圧をそれぞれ３．５ｋＶおよび４５Ｖに設定した。質量スペクトルは、５００〜４０００のｍ／ｚ範囲で高感度様式で得た。質量校正のために、校正物質としてヨウ化ナトリウムを用いる支援付き校正を実行した。タンパク質のデコンボリューションのために、ＭａｓｓｌｙｎｘソフトウェアにおけるＭａｘＥｎｔ１を使用した。
ＡＡＶ２ ＶＰの酵素消化
濃縮されたＡＡＶ２ビリオンを６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５で変性した。該タンパク質を、３０ｍＭのＤＴＴを用いて５５℃で１時間暗所で還元し、０．０７％の４−ビニルピリジンを用いて室温で２時間アルキル化した。反応を１Ｍ ＤＴＴの添加により停止させた。試料を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（１０，０００のＭＷＣＯ）を用いて、２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液に対してｐＨ８．５で約１８時間透析した。透析後、試料を３つの部分に分けた。各部分を、トリプシンを用いて１：２５でまたはＬｙｓ−Ｃを用いて１：５０で、またはＡｓｐ−Ｎを用いて１：１００の酵素：タンパク質比（ｗｔ／ｗｔ）で１８時間３７℃で、それぞれ消化した。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピング
ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州）と連結されたＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を使用して、充填材料Ｍａｇｉｃ Ｃ１８（５μｍ、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）を自家充填したｎａｎｏＬＣカラム（７５μｍ×１０ｍｍ）を３００ｎｌ／分の流速で使用して実行した。移動相ＡおよびＢは、水およびアセトニトリル中それぞれ０．１％ギ酸であった。グラジエントは、１２１分で２％Ｂから６０％Ｂであった。
ｖｅｌｏｓのための供給源のパラメーターは以下の通りであった：電源電圧：２．５ｋｖ、キャピラリー温度２７５℃；ＳレンズＲＦレベル：５５％。データは、正確な１ｍｓを６０，０００に分割して、イオントラップで１０個のＭＳ／ＭＳを用いてトップテンデータに依存的な方法を使用して得た。ＡＡＶ２ウイルスカプシドタンパク質配列に対するデータベース検索のために、Ｍａｓｃｏｔを使用した。データベース検索のために１０ｐｐｍのＭＳ許容差および０．８Ｄａのｍｓ／ｍｓ許容差を使用した。
ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピング
タンパク質の消化物も、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ−Ｘｅｖｏ ｑＴＯＦ ＭＳでＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。水中０．１％ギ酸／アセトニトリルのグラジエントを用いる移動相で分離するために、ＢＥＨ３００ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ）を流速０．２５ｍｌ／分で使用した。質量スペクトルを正のＭＳｅモードで、２００〜２０００の質量範囲で得た。
結果
ＡＡＶの変性方法
ＡＡＶは、洗剤、熱、高塩、または低もしくは高ｐＨの緩衝剤を使用する多くの方法により変性することができる。熱変性は、タンパク質沈殿を生じて、その結果、逆相カラムが詰まりやすく、過圧になる。高塩を用いる変性では、ＬＣ／ＭＳ分析の前に追加の脱塩工程が必要になる。１０％酢酸を用いる変性は、きれいな質量スペクトルが可能なので、ＬＣ／ＭＳによる完全タンパク質の分析のために使用した。ペプチドマッピングのためには、０．１％ ＲａｐｉＧｅｓｔまたは６ＭグアニジンＨＣｌのいずれかを変性試薬として使用することができる。
完全タンパク質の分析方法の開発
ＡＡＶ２の最初の完全タンパク質の分析は、ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ４カラムを急速グラジエントで使用して実行した。この条件下で、全イオンクロマトグラムで唯一の単一ピークが観察されて、質量がＶＰ３に対応した（図１Ａ）。理論に拘束されることは望まず、ＶＰ１およびＶＰ２の不在は、おそらくＶＰ１およびＶＰ２の低い化学量論によるか、またはすべてのＶＰが共溶出すればＶＰ３によるＶＰ１およびＶＰ２シグナルの抑制のためであると考えられる。ＶＰ１およびＶＰ２を検出するために、注入またはカラム長さを増大させること、より浅いグラジエントを使用すること、および代替カラムを使用することを試みた。０．５％Ｂ／分でより浅いグラジエントを用いるより大きい負荷（１．７μｇ）で、左にショルダーピークが生じた（図１Ｂ）。カラム長さを１０ｃｍから１５ｃｍに増大させてもショルダーピークの分離は強化されなかった（図１Ｃ）。しかしながら、ショルダーピークは、ＢＥＨ Ｃ８カラムを使用して、主ピークからさらに分離されて、改善されたシグナル強度が観察された（図１Ｄ）。
結果として、ＶＰ１およびＶＰ２の質量が、このショルダーピークで図２Ａに示したシグナル強度で得られた。ＶＰ１およびＶＰ３の質量は、ａ．ａ．２〜７３５（アセチル化）およびａ．ａ．２０４〜７３５（アセチル化）に、それぞれに対応する（図２Ａおよび２Ｂ）。ＶＰ２（ａ．ａ．１３９〜７３５）ではアセチル化は観察されなかった。それに加えて、ＶＰ３より小さい質量の小さいピークが観察されて、質量は１つのアセチル化を有するアミノ酸配列２１２〜７３５に対応した（図２Ｂ）。これらのデータは、ＤＮＡ配列と一致するが、それは、ＶＰ３は、ＡＡＶ２中の２つのＡＴＧ開始コドンを含有し：ＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣ（配列番号１）、２つの可能なＮ末端（下線を引いた）：ＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤ（配列番号２）を生ずるからである。Ｎ末端のメチオニン残基は、完全タンパク質の分析により測定されて、ＶＰ１およびＶＰ３には両方とも存在しなかった。ＶＰ１およびＶＰ３のアセチル化は、酢酸を用いない別の変性方法を使用したＡＡＶ調製でも観察されたので、ＶＰ１およびＶＰ３のアセチル化は、方法（１０％酢酸によるＡＡＶの変性）に誘発されたアーチファクトではない。完全タンパク質のデータにより、数種のＮに連結されたコンセンサス配列が存在するが、グリコシル化は、ウイルスカプシドタンパク質では存在しないことも確認された［１６］。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピング
完全タンパク質の分析で観察されるＮ末端およびアセチル化をさらに確認するために、複数の酵素を使用してペプチドマッピングを実行し、複数の装置を使用して分析した。変性方法および脱塩工程を含む種々の試料調製方法を評価した。６ＭのグアニジンＨＣｌを用いる変性、還元および４−ビニルピリジンを用いるアルキル化、およびｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒを使用する透析とそれに続く酵素消化を含む最終消化方法により、消化プロセス時における低人工改変できれいなペプチドマッピングを創った。５μｇという少ない出発原料で試験して、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して完全な配列適用範囲を得た。
トリプシン消化物のナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ単独からＭａｓｃｏｔ検索により、イオンスコア１３のカットオフで、図３に示したように、７８％の配列適用範囲を得た。ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳから見失われていた２つの大きいトリプシンペプチド、Ｔ２７およびＴ３８（枠で囲んだ）が、ＢＥＨ Ｃ１８カラムとＸｅｖｏ ＴＯＦ ＭＳにおけるＬＣ／ＭＳで見出された（図３）。それに加えて、図３で斜体で示したように、Ｔ２７およびＴ３８ペプチド配列の大部分が、Ａｓｐ−Ｎ消化物のナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってさらに確認された。図３で下線を引いたように、完全なＮ末端およびＣ末端ペプチドが、Ｌｙｓ−Ｃ消化物によって包含されている。それ故、ＶＰ１の１００％の配列適用範囲が、複数の酵素消化および２つのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法により達成された。
完全タンパク質の分析で観察されたＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のＮ−およびＣ末端およびＶＰ１およびＶＰ３のＮ末端アセチル化は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより確認された。図４Ａ〜４Ｃは、ＶＰ１のＮ末端トリプシンペプチドＡ（Ａｃ）ＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲ（配列番号４）（図４Ａ）、ＶＰ２のＮ末端Ａｓｐ−Ｎに由来するペプチド（ＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰ）（配列番号１５）（図４Ｂ）、およびＶＰ３のＮ末端Ａｓｐ−ＮペプチドＡ（Ａｃ）ＴＧＳＧＡＰＭ（配列番号５）（図４Ｃ）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。ＭＳ／ＭＳにより、ＶＰ１およびＶＰ３両方のペプチドにおけるＮ末端アラニン残基のアセチル化の位置が確認された。図４Ａにおける、改変されていないｙ１８およびｙ１７イオン、および４２Ｄａの質量偏移を有するすべての検出されたｂイオンの存在は、４２ｄａの改変がＶＰ１のＮ末端に位置することを示す。同様に、図４Ｃにおける改変されていないｙ３からｙ８イオンの存在により、Ｎ末端アラニン残基におけるアセチル化の位置が確認された。
ＡＡＶ ＶＰ Ｎ末端の比較
ＡＡＶ２に加えて、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９およびＡＡＶ Ｒｈ１０も、完全タンパク質の分析により分析した。ＡＡＶにおいて、理論的および予測されるＶＰの質量を表２に示す。
Figure 2019533803
Ｎ末端、ならびにそれらの翻訳後修飾は、分析されたＡＡＶ血清型の間で高度に保存されているが、図５に配列アラインメントで示したように、ＡＡＶ５は、最も多様なＡＡＶ血清型配列として報告された。１３種のＡＡＶ血清型のうち１１種で、ＶＰ１のＮ末端は、１３個のアミノ酸の同一の残基配列（ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤ）（配列番号６）を共有するが、一方、１３種のすべてのＡＡＶ血清型は、ＶＰ２におけるものと同一のＴＡＰ・・・Ｎ末端配列を有する（図５）。タンパク質レベルでＡＡＶ２のＬＣ／ＭＳは、ＴがＶＰ２で見当たらないことを示した。ＶＰ３のＮ末端は、３種のウイルスカプシドタンパク質の中で最も多様であり、１３種のＡＡＶ血清型のうち８種がＭＡ・・・Ｎ末端配列を共有する。ＡＡＶ２と同様に、ＡＡＶ１およびＡＡＶ Ｒｈ１０も、２通りのＡＴＧ開始コドンを有し、ＬＣ／ＭＳによる完全タンパク質の分析に基づいて、第１のコドンはＮ末端として支配的である。興味深いことに、ＡＡＶ７は２種の潜在的開始コドン（ＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣ・・・）（配列番号７）を有するが、完全タンパク質の分析に基づいて、第２の開始コドン（ＡＴＧ）が有利であり：２１３（ａｃ）〜７３７を有するＶＰ３が支配的なピークであり、それに対して２０３（ａｃ）〜７３７を有するＶＰ３は小さいピークであった。
結論
遺伝子治療の研究および開発におけるＬＣ／ＭＳによる完全タンパク質の分析およびＡＡＶ ＶＰのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピングの応用
これらの結果は、異なる型のＡＡＶの変性後の直接ＬＣ／ＭＳは、タンパク質配列および翻訳後修飾を、完全タンパク質のレベルにおける正確な質量測定でモニターするための簡単で効果的な方法であることが証明されたことを示す。ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のＮ末端は、マススペクトロメトリーにより確認された。ＶＰ１およびＶＰ３のＮ末端のアセチル化は、異なる血清型のＡＡＶにおいても同定された。ＡＡＶの直接ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピングが開発されて、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の１００％の配列適用範囲が提供され、ＶＰのＮ末端アセチル化が確認された。１３種のＡＡＶ血清型の、数種類のＡＡＶ血清型の配列アラインメントおよび完全タンパク質の分析に基づいて予測される配列の理論的質量を表３に示す。
Figure 2019533803
各血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の正確な質量は固有であり、それ故、完全タンパク質の分析は、ＡＡＶカプシド血清型を区別するための同一性試験として使用することができる。表４〜６は、１３種の一般的なＡＡＶ血清型の間のＶＰの質量の相違を示す。通常のフォントで示したのは、１０を超えるデルタ質量であり、１０未満のデルタ質量は太字にした。
Figure 2019533803
Figure 2019533803
Figure 2019533803
３種すべてのＶＰの２つのアイソタイプ間で１０Ｄａ以内の質量差は観察されなかった。たとえＶＰ２およびＶＰ３の両方がＡＡＶ１とＡＡＶ６の間で２Ｄａ差しか有していなくても、ＶＰ１のＡＡＶ１およびＡＡＶ６との間の質量差は３６であり、正確な質量測定によって区別されるために十分有意である。それ故、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の完全タンパク質の測定は、同一性試験として高度に特異的である。
これらの結果は、完全タンパク質の分析およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、ＶＰをプロファイルして、ＶＰの発現、翻訳後修飾、および先端切断をモニターして、ＶＬＰ産生時における生成物の一貫性を確実にするために使用することができることを示す。これらの２通りの分析は、部位特異的突然変異生成またはカプシドタンパク質の遺伝子操作の適用のための構造の特徴付けを確認するために使用することもできる。
ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端アセチル化の役割
細胞タンパク質の化学的改変は、それらの機能を制御する共通の手段である（Ａｒｎｅｓｅｎ、Ｔ．（２００６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５３（２）：２８３〜２９３頁）。アセチル基のアセチル補酵素Ａからタンパク質の第１アミノ酸残基のα−アミノ基への移動に関与するＮ末端アセチル化（Ｎｔ−アセチル化）（Ｂｒｏｗｎ、Ｊ． Ｌ．およびＲｏｂｅｒｔｓ、Ｗ．Ｋ．（１９７６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：１００９〜１０１４頁；Ａｒｎｅｓｅｎ、Ｔ．ら（２００９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：８１５７〜８１６２頁）は、タンパク質改変のなかで最も多い。大部分の他のタンパク質改変と異なって、Ｎｔ−アセチル化は不可逆的であり；それは、リボソームと関連するＮ末端アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）により触媒されて、タンパク質の合成時に主として起こる（Ｇａｕｔｓｃｈｉ、Ｍ．ら（２００３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２３：７４０３〜７４１４頁；Ｐｅｓｔａｎａ、Ａ．およびＰｉｔｏｔ、Ｈ．Ｃ．（１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４：１４０４〜１４１２頁；Ｐｏｌｅｖｏｄａ、Ｂ．ら（２００３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３０６８６〜９７頁）。真核細胞には数種の区別されるＮＡＴ、すなわちＮａｔＡ〜ＮａｔＦがあり、各々１つまたはそれ以上のサブユニットで構成され、第１のわずかのアミノ酸のアミノ酸配列に依存して、Ｎ末端の特定のサブグループを各々アセチル化する（Ｊｏｒｎｖａｌｌ、Ｈ．（１９７５） Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ ５５：１〜１２頁；Ｐｅｒｓｓｏｎ、Ｂ．ら（１９８５） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５２：５２３〜５２７頁）。
実験データは、Ｎ末端がアセチル化されたタンパク質は、アセチル化されていないタンパク質よりもインビボで安定であり；すなわち、Ｎｔ−アセチル化は、タンパク質を分解から保護することを示す（Ｈｅｒｓｈｋｏ、Ａ．ら（１９８４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：７０２１〜７０２５頁）。このことに対する１つの説明は、別のＮ末端改変、すなわち、小さいタンパク質であるユビキチンのＮ末端アミノ酸残基への直接連結を含むユビキチン化が、タンパク質のその後の分解を促進するという２００４年における発見（Ｂｅｎ Ｓａａｄｏｎ、Ｒ．ら（２００４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：４１４１４〜４１４２１頁）であろう。逆に、Ｎｔ−アセチル化シグナルは、折り畳まれていないかまたは折り畳みに異常のあるタンパク質を分解して、インビボにおけるタンパク質の化学量論を調節する（Ｈｗａｎｇ、Ｃ．Ｓ．ら（２０１０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：９７３〜９７７頁）品質制御機構の一部であることもできる。
細胞質ゾルのタンパク質の予測されるＮ末端プロセシングの系統的分析は、分泌経路に選別されるように定められたものと比較して、細胞質ゾルのタンパク質は、プロセシングに有利に大きく偏っているが、分泌タンパク質についてのそのような改変に対して同等の反対の偏りもあることが明らかになった（Ｆｏｒｔｅ、Ｇ．Ｍ．Ａ．ら（２０１１年） ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１年５月４日、第９巻）。それらのアセチル化を導く分泌シグナル配列における突然変異は、Ｎ末端のプロセシング機構に依存する様式で、細胞質ゾルへの誤った選別を生ずる。それ故、Ｎ末端アセチル化は、細胞質ゾルに残留することが定められているタンパク質が、実際に細胞質ゾル中に存在することを確実にするために、緊縮（stringency）の臨時（extra）の層を表す形成途中のポリペプチドの細胞選別における初期の決定工程を表す。真核生物の細胞は、特定の機能を実行するために必要な細胞小器官と呼ばれる数個の別個の区画を含む。これらの区画中のタンパク質は、細胞原形質で合成され、したがって適当な細胞小器官へのそれらの送達を確実にするために複雑な選別機構が必要になる。タンパク質は、それらの合成における非常に初期の段階に、それらのアミノ末端のアセチル化により改変される。細胞質のタンパク質と、主要な細胞小器官の１つ、小胞体（ＥＲ）に向かうことが定められたタンパク質とにおけるそのような改変の尤度の間に深甚な差があり：細胞質のタンパク質は典型的にはアセチル化されており、ＥＲに結合したタンパク質は、大きく改変されてはいない。それに加えて、特定のＥＲタンパク質は、それらのアセチル化を誘発するように遺伝子操作された場合には、それらがＥＲを標的とすることは阻害された（Ｆｏｒｔｅ、Ｇ．Ｍ．Ａ．ら（２０１１） ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１年５月４日、第９巻）。
収縮性のタンパク質アクチンおよびトロポミオシンは、適当な機能のために、特にアクチン−トロポミオシン結合およびアクトミオシンの調節に関与する機能のために、ＮａｔＢに媒介されるＮｔ−アセチル化を必要とすることが示された（Ｃｏｕｌｔｏｎ、Ａ．Ｔ．ら（２０１０） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２３：３２３５〜３２４３頁；Ｐｏｌｅｖｏｄａ、Ｂ．ら（２００３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３０６８６〜９７頁）。したがって、ＡＡＶカプシドタンパク質のＮｔアセチル化は、ｒＡＡＶベクターの形質導入の潜在能力において重要性を有する。ＡＡＶベクターが核中への侵入能力の獲得に成功しなければ、その結果としてそれらは、細胞に形質導入することに成功しない。エンドソームから核へのＡＡＶカプシドの転座におけるアクチンフィラメントおよびＦＫＢＰ５２（ＦＫ５０６に結合するタンパク質ｐ５２）の役割は、明確に定められている（Ｚｈａｏ、Ｗ．ら（２００６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５３（２）：２８３〜２９３頁）。重要なこととして、Ｎｔ−アセチル化は、タンパク質−タンパク質の相互作用を調整することによりアクチンフィラメントが機能するために必須である（Ｃｏｕｌｔｏｎ、Ａ．Ｔ．ら（２０１０） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２３：３２３５〜３２４３頁；Ｐｏｌｅｖｏｄａ、Ｂ．ら（２００３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３０６８６〜９７頁）。
タンパク質のＮ末端アセチル化は広く公知の現象であるが、ＡＡＶカプシドタンパク質に対するＮｔ−アセチル化の生物学的有意性は、よく理解されていない。ＶＰ１およびＶＰ３のＤＮＡ配列決定に基づいて予測されるＮ末端は、両方ともメチオニンであり、アラニンが続く。Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼによるＮ末端メチオニンの除去は、しばしば、生じるＮ末端アラニン、バリン、セリン、トレオニン、およびシステイン残基のＮｔ−アセチル化を生じさせること、およびＮ末端のアセチル化は、潜在的分解のシグナルとして作用することが報告された［２１］。ウイルスカプシドタンパク質のユビキチン化が、ビリオンの分解時におけるカプシドのプロセシングに対する潜在的シグナルとして提案された［２２］。ＶＰ１およびＶＰ３のＮ−アセチル化とウイルスカプシド分解および核侵入前の脱コーティングとの関連はさらに検討されている。
Ｎ末端アセチル化の機能的意味を、ＡＡＶカプシドタンパク質と関係して理解するために、ＶＰ３ Ｎ末端開始コドンの部位特異的突然変異生成が、ＡＡＶ変異体を発生させるために使用される。
方法
ＡＡＶカプシドタンパク質を、開始のメチオニン（ｉＭｅｔ Ｘ）に対して２番目の位置でアミノ酸を異ならせて発生させ、Ｎｔ−アセチル化が阻害されているかまたは減少しているかを決定して、次に機能的重要性を測定する。カプシドタンパク質の細胞内で移動する、および／またはグリコシル化などの翻訳後修飾を受ける能力を査定して、この能力は集合したＡＡＶ粒子の感染性に影響するかどうかを、その後決定する。それに加えて、ユビキチン化／分解およびリソゾーム、ＥＲ、ゴルジ体、または内部核膜を標的とすることに対するアセチル化の影響を決定する。
例えば、トラフィッキングまたはターゲティングをアッセイするために、２番目の位置（例えば、ｉＭｅｔ Ｘ）に突然変異を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を、蛍光標識して、細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）に感染させるために使用する。これらのＡＡＶ粒子を：ウイルス粒子取り込み時、特定の区画のマーカー（例えば、ゴルジ体、ＥＲ、またはリソソームタンパク質または他のマーカー）を有するＡＡＶ粒子の共局在化、核蓄積（例えば、核マーカーまたは染色との共局在化によりアッセイされる）、および／または初期のエンドソーム脱出の特異的阻害剤（バフィロマイシンＡまたは塩化アンモニウムなど）に対するトラフィッキングの感度の１つまたはそれ以上について、同じ細胞系統に感染するために使用された蛍光標識された野生型ＡＡＶ粒子と比較してアッセイする（そのようなアッセイの説明については、例えば、Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｊ．Ｓ．ら（２０００） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２７７７〜２７８５頁を参照されたい）。
感染性をアッセイするために、２番目の位置（例えば、ｉＭｅｔ Ｘ）に突然変異を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を、細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）に感染させるために使用して、それらの形質導入の有効度が、野生型ＡＡＶ粒子（例えば、同じＡＡＶ血清型を有しておよび同じタイプの細胞に感染する）と比較する。
グリコシル化をアッセイするために、２番目の位置（例えば、ｉＭｅｔ Ｘ）に突然変異を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）に感染させるために使用した。感染した細胞からのＡＡＶ粒子を、グリコシル化の化学的検出（例えば、市販のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）をグリカン検出におよび／または蛍光性糖タンパク質検出キットを、変性し電気泳動で分離されたカプシドタンパク質に適用して）およびマススペクトロメトリー（例えば、ＦＴ−ＩＣＲ ＭＳ）を含むが、これらに限定されない１種またはそれ以上のアッセイに供して、同じ細胞系統に感染させるために使用した野生型ＡＡＶ粒子と比較した（そのようなアッセイの説明については例えば、Ｍｕｒｒａｙ、Ｓ．ら（２００６） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：６１７１〜６１７６頁を参照されたい）。
ユビキチン化をアッセイするために、２番目の位置に突然変異を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）に感染させるために使用した。ＡＡＶ粒子を、感染された細胞から抗カプシド抗体を用いて免疫沈殿させて、次に抗ユビキチン抗体を用いてウェスタンブロット法に供して、細胞に感染させるために同じ様式で使用した野生型ＡＡＶ粒子と比較した。突然変異体のＡＡＶ粒子は、インビトロにおけるユビキチン化アッセイでも、野生型ＡＡＶ粒子と比較して使用することができる（例えば、Ｙａｎ、Ｚ．ら（２００２） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２０４３〜２０５３頁を参照されたい）。
ＡＡＶ２カプシドタンパク質の脱アミド化の役割
ＡＡＶ２カプシドタンパク質の配列分析により、以下のアミノ酸配列：
Figure 2019533803
 で下線を引いた潜在的な脱アミド化部位が明らかになった。
特に、潜在的な脱アミド化部位が、上の配列中で太字および斜体にしたホスホリパーゼＡ２ドメイン（Ｃａ＋＋結合部位）中のＮ５７／Ｇ５８で見出される。以下の実験は、Ｎ５７における脱アミド化がＡＡＶ２の潜在能力の低下および／または先端切断を導くことができるかどうか、ならびに異なるＡＡＶ産生方法が脱アミド化に異なる効果を有することがあるかどうかを探求することを目標とした。例えば、産生細胞系統法（Ｍａｒｔｉｎら、（２０１３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３〜２６９頁；米国特許付与公開第２００４／０２２４４１１号；およびＬｉｕ、Ｘ．Ｌ．ら（１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：２９３〜２９９頁を参照されたい）は、三重トランスフェクション法と比較して、Ｎ５７でより高いレベルの脱アミド化を誘発することができる。ＡＡＶ２の結晶構造では、Ｎ５７は示されなかったが；しかしながら、Ｎ３８２およびＮ５１１は部分的に現れ、Ｎ７１５は完全に現れた。
方法
ＡＡＶ１およびＡＡＶ２ ＶＰの酵素消化
１０μｇの各ＡＡＶ１−ＥＧＦＰまたはＡＡＶ２−ＥＧＦＰ材料（三重トランスフェクションならびに産生細胞系統プロセスにより発生させた）を、Ａｍｉｃｏｎフィルター（１０ｋＤａのＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓを用いてｐＨ８．５で変性させた。タンパク質を５ｍＭのＤＴＴを用いて６０℃で３０分間暗所で還元して、１５ｍＭのヨードアセトアミドを用いて室温で３０分間アルキル化し、次に、Ｂｉｏ−ＳｐｉｎＲ（登録商標）６Ｔｒｉｓマイクロカラムを使用して消化するために、緩衝液をｐＨ７．１の２５ｍＭのＴｒｉｓに交換した。緩衝液を交換した後、試料を２つの部分に分けた。各部分を、トリプシンを用いて１：２５、またはＡｓｐ−Ｎを用いて１：５０の酵素：タンパク質比（ｗｔ／ｗｔ）で２時間３７℃で、それぞれ消化した。
ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピング
タンパク質の消化物も、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ−ＸｅｖｏｑＴＯＦ ＭＳでＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＢＥＨ３００ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ）を、水中０．１％ギ酸／アセトニトリルの移動相でグラジエントを用いて流速０．２５ｍｌ／分で分離するために使用した。質量スペクトルを５０〜２０００の質量範囲において正のＭＳｅ分割様式で得た。
ＡＡＶ ＶＰにおける脱アミド化レベルの決定
ＮＧ部位を含有するペプチド（ＡＡ１およびＡＡＶ２ ＶＰ中のＴ９、Ｔ４９、およびＴ６７）およびそれらの対応する脱アミド化された種の抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を脱アミド化レベルの計算のために使用した。
三重トランスフェクション（ＴＴｘ）法および産生細胞系統（ＰＣＬ）法によるＡＡＶベクター産生を比較するために、ＥＧＦＰのタグを付けたＡＡＶ１またはＡＡＶ２を、ＴＴｘまたはＰＣＬ方法を使用して産生した。先端を切断されたＶＰ１（ｔＶＰ１）が、ＰＣＬにより産生されたＡＡＶ２−ＥＧＦＰ中に存在することが見出されたが、ＴＴｘにより産生されたＡＡＶ２−ＥＧＦＰには見出されなかった。ＡＡＶ１−ＥＧＦＰは、産生方法に関わらず、ｔＶＰ１を有することが見出されなかった。ＴＴｘによるＡＡＶ２産生と比較して、ＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ２のインビトロにおける潜在能力も低下していることが見出された。突然変異したＮ５７ＫおよびＮ５７ＱのＡＡＶ２粒子も、潜在能力が低下して、Ｃａ＋＋結合が攪乱されていることが見出された。
以下の表は、潜在的な各脱アミド化部位を調べるために分析された、トリプシンペプチドならびに対応する残基を示す。
Figure 2019533803
表７に示したように、ＡＡＶ１またはＡＡＶ２（それぞれ）において、Ｔ９のペプチドＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫ（配列番号９）を、Ｎ５７をモニターするために使用して、Ｔ３８のペプチドＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲ（配列番号１０）を、Ｎ３８２モニターするために使用して、Ｔ４９のペプチドＹＮＬＮＧＲ（配列番号１１）およびＹＨＬＮＧＲ（配列番号１２）を、Ｎ５１１モニターするために使用して、およびＡＡＶ１またはＡＡＶ２（それぞれ）において、Ｔ６７のペプチドＳＡＮＶＤＦＴＶＤＮＮＧＬＹＴＥＰＲ（配列番号１３）およびＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲ（配列番号１４）を、Ｎ７１５をモニターするために使用した。
ＴＴｘおよびＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２粒子における脱アミド化のパーセンテージを比較するために、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を使用した。Ｔ９ペプチドからの結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。Ｔ４９ペプチドからの結果は図７Ａおよび７Ｂに示す。Ｔ６７ペプチドからの結果は図８Ａおよび８Ｂに示す。これらの結果を表８にまとめた。Ｔ３８ペプチドは、そのサイズが理由で検出されなかった。
Figure 2019533803
特に、ＰＣＬにより産生されたＡＡＶ２は、ＴＴｘにより産生されたＡＡＶ２と比較してほとんど３倍の脱アミド化における増大を示した。これらの結果は、ＰＣＬにより産生されたＡＡＶ２のインビトロにおける潜在能力が低下するに連れて、脱アミド化はＡＡＶの潜在能力を低下させることを示唆する。
結論
まとめると、実施例１〜３は、ウイルス粒子の完全タンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質）を、ＬＣ／ＭＳを使用して分析する方法を示す。分子量は正確に測定されて、これらの技法は、ウイルスカプシドタンパク質のＮ末端および／または改変を推定するためにも使用することができる。その上、これらの方法は、遺伝子治療で有用なカプシド血清型の同一性アッセイとして、例えば、分析プラットホームとして適用できる。これらの結果は、カプシドタンパク質構造（例えば、先端切断、脱アミド化、その他）と潜在能力との間の相関関係をさらに確立して、最も重要な部位における点突然変異は、より効果的なベクターを遺伝子操作するために使用することができることを示唆する。
ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端アセチル化の役割の解明
上で論じたように、ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端は、血清型にわたって高度に保存されている（図５）。実施例１に記載された技法は、ＶＰ発現および翻訳後修飾を調べることを可能にする。ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端アセチル化の役割および生物学的有意性を次に調べた。
結果
ＡＡＶカプシドタンパク質の脱アセチル化の潜在的役割を解明するために、ＡＡＶ５脱アセチル化変異体を試験した。ＣＢＡプロモーター（ＡＡＶ５−ＣＢＡ−Ｅｇｆｐ）下でｅＧＦＰを発現するＡＡＶ５粒子を、開始のメチオニン（ｉＭＥＴ）に隣接した突然変異したアミノ酸を有するＡＡＶ５変異体と、ＶＰ１およびＶＰ３（ｄｅＡＣ−ＡＡＶ５−ＣＢＡ−ｅＧＦＰ）について比較した。下の表９に例示したように、ＮａｔＡ、ＮａｔＣ、またはＮａｔＤによるアセチル化の尤度が低いと予測された３種のアミノ酸：Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、およびＰｒｏを、変異体を発生させるために選んだ。
Figure 2019533803
以下のＡＡＶ５脱アセチル化された（ｄｅＡＣ）突然変異体を発生させた：
Ｓ２ＧＶＰ１ ＡＡＶ５ＶＰ１において位置２でＳｅｒをＧｌｙに変えた
Ｓ２ＬＶＰ１ ＡＡＶ５ＶＰ１において位置２でＳｅｒをＬｅｕに変えた
Ｓ２ＰＶＰ１ ＡＡＶ５ＶＰ１において位置２でＳｅｒをＰｒｏに変えた
Ｓ２ＧＶＰ３ ＡＡＶ５ＶＰ３において位置２でＳｅｒをＧｌｙに変えた
Ｓ２ＬＶＰ３ ＡＡＶ５ＶＰ３において位置２でＳｅｒをＬｅｕに変えた
Ｓ２ＰＶＰ３ ＡＡＶ５ＶＰ３において位置２でＳｅｒをＰｒｏに変えた
Ｓ２ＰＶＰ１／ＶＰ３ ＡＡＶ５ ＶＰ１およびＶＰ３の両方において位置２でＳｅｒをＰｒｏに変えた
Ｓ２ＧＶＰ１／ＶＰ３ ＡＡＶ５ ＶＰ１およびＶＰ３の両方において位置２でＳｅｒをＧｌｙに変えた
Ｓ２ＬＶＰ１／ＶＰ３ ＡＡＶ５ ＶＰ１およびＶＰ３の両方において位置２でＳｅｒをＬｅｕに変えた。
これらの変異体は、上で記載されたようにＴＴＸ方法を使用して発生させた。すべてのＡＡＶ５変異体は良好な生産性を示して、１０１３を超える全ＶＧを生じた。すべてのＡＡＶ５変異体は、ＳＹＰＲＯタンパク質ゲル分析により、期待されたＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３タンパク質比も示した（図９）。次に、表１０に示したように、ＬＣ／ＭＳを使用して、すべてのＡＡＶ５変異体でアセチル化が減少したことを確認した。
Figure 2019533803
これらのＬＣ／ＭＳ分析により、ＡＡＶ５変異体は、脱アセチル化されていることが確認された。変異体Ｓ２ＬＶＰ１、Ｓ２ＬＶＰ３、およびＳ２ＬＶＰ１／ＶＰ３はすべて、ＶＰ１およびＶＰ３タンパク質における増大した質量（１７３から１８２に増大した）を示して、ＶＰ１またはＶＰ３において第２Ｎ末端アミノ酸のロイシンへの変化がタンパク質を変更して、質量における増大を生じたことを示唆した。
次に、ＡＡＶ５変異体を、インビトロにおける形質導入アッセイでｅＧＦＰをレポーター遺伝子として使用して、アッセイした（図１０）。アッセイは、各変異体を改変されていない親のＡＡＶ５粒子と比較して、ＡＡＶ５脱アセチル化された突然変異体による形質導入を、感染の１０６の多様性（ＭＯＩ）で評価するようにデザインした。３種の細胞系統：２９３、ＨｕＨ７、およびＨｅＬａ細胞を使用した。感染させた後、細胞をアッセイしてベクターゲノムのコピー数（ｖｇ／μｇ細胞タンパク質）およびｅＧＦＰ発現（ＥＬＩＳＡにより）を決定した。ベクターゲノムのコピー数（ｖｇ／μｇタンパク質）は、ＡＡＶ５変異体が細胞に侵入する有効度を表し、およびｅＧＦＰは、カプシド細胞内のトラフィッキングの有効度を表すが、それは、導入遺伝子の発現は、カプシド／ベクターＤＮＡの核への効率的な輸送（図１０）を必要とするからである。ベクターゲノムをＴａｑＭａｎ分析により定量した。
図１１は、ベクターゲノム分析に基づいて、ＡＡＶ５脱アセチル化された突然変異体ベクターが、３種すべての試験細胞系統に、同様な、ただし、改変されていない親ＡＡＶ５粒子と比較して減少したレベルで感染したことを示す。図１２は、ＡＡＶ５脱アセチル化された突然変異体ベクターは、３種すべての細胞系統で、改変されていない親ＡＡＶ５による形質導入と比較してすべて減少したｅＧＦＰ発現を生じたことを示す。
結論
予測されたように、ＬＣ／ＭＳにより調べたときに、Ｎ末端ＳｅｒのＰｒｏ／Ｌｅｕ／Ｇｌｙへの突然変異体で、アセチル化は観察されなかった。ＡＡＶ５ ｄｅＡＣ変異体は、堅牢なベクター産生を示し、ＡＡＶ５ ｄｅＡＣ変異体は、親ＡＡＶ５とほぼ同程度のレベルで細胞に感染した。しかしながら、ｄｅＡＣ変異体が感染した細胞では、機能的タンパク質レベルは、親ＡＡＶ５と比較して大きく低下した。これらのデータは、ＶＰ１／ＶＰ３では、向性はＮ末端脱アセチル化の欠如によっては最小限しか影響されないが、下流プロセシング（例えば、トラフィッキングおよび／または分解）は有意に影響されることを示唆する。試験された変異体が低下したインビトロの活性を示したので、当業者は、とりわけ、低下したレベルの形質導入が望ましい場合には、減少したかまたは排除されたアセチル化により特徴づけられる変異体を使用することができると解釈することができる。
ＡＡＶカプシドタンパク質の脱アミド化のアセスメント
実施例１および３は、ＡＡＶカプシドタンパク質の翻訳後修飾を調べること、およびＡＡＶ２カプシドの脱アミド化の役割を探求することを可能にする技法を示した。以下の実施例で、脱アミド化はカプシドタンパク質の潜在能力を低下させるかどうか、および／または先端切断を誘発するかどうか、および異なる製造プロセスは異なるレベルの脱アミド化を誘発することができるかどうか試験した。
方法
ＡＡＶ粒子を発生させて、脱アミド化状態を実施例３で記載されたようにアッセイした。
結果
実施例３で記載されたように、ＡＡＶ２カプシドのＶＰ１では、潜在的な脱アミド化部位は、ホスホリパーゼＡ２ドメイン（Ｃａ＋＋結合部位）中のＮ５７／Ｇ５８で見出された。Ｎ５７／Ｇ５８モチーフは、ＡＡＶ血清型にわたって保存されている（図１３）。実施例３は、ＰＣＬによるＡＡＶ２産生は、脱アミド化において、ＴＴｘによるＡＡＶ２産生と比較してほとんど３倍の増大を示したことを示した（図６Ａおよび６Ｂおよび表８を参照されたい）。
タンパク質ゲルによりＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の産生を調べると、先端を切断されたＶＰ１タンパク質（ｔＶＰ１）は、ＰＣＬ方法により産生されたＡＡＶ２カプシドタンパク質においてのみ検出された（図１４）。
次に、一連のＡＡＶ２脱アミド化突然変異体を発生させた。これらの突然変異体は標準的なＮＧ配列におけるＧｌｙ残基を標的とした。表１１に示したように、Ａ３５残基（図１３を参照されたい）、ｔＶＰ１についてはＮ末端アミノ酸を標的とする突然変異も発生させた。複数の突然変異を有するｐＡＦ２７７およびｐＡＦ２７９の突然変異体は、パッケージングされなかった。
Figure 2019533803
次に、変異体の脱アミド化を、上で実施例３に記載したようにＬＣ／ＭＳにより分析した。ＡＡＶ２Ａ３５ＮおよびＡＡＶ２Ｇ５８Ｄ変異体は親ＡＡＶ２と比較して変更された脱アミド化を有した（図１５）。特に、ＡＡＶ２Ａ３５Ｎ突然変異体は、親ＡＡＶ２（５．７％）と比較して増大した脱アミド化（１７．８％）を有した。ＡＡＶ２Ｇ５８Ｄ変異体は、親ＡＡＶ２と比較して減少した脱アミド化（１．１％）を有した。ＳＹＰＲＯタンパク質ゲル分析は、ＡＡＶ２脱アミド化突然変異体は、正確なＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ２比を示したことを示した（図１６）。
次に、ＡＡＶ２脱アミド化変異体を、インビトロの形質導入アッセイで、ｅＧＦＰをレポーター遺伝子として使用してアッセイした（図１７）。アッセイは、各変異体を改変されていない親ＡＡＶ２粒子と比較して、ＡＡＶ２における脱アミド化突然変異体の１０６の感染多様性（ＭＯＩ）により形質導入を評価するようにデザインした。３種の細胞系統：２９３、ＨｕＨ７、およびＨｅＬａ細胞を使用した。感染させた後、細胞をアッセイして、ベクターゲノムのコピー数（ｖｇ／μｇ細胞タンパク質）およびｅＧＦＰ発現（ＥＬＩＳＡにより）を決定した。ベクターゲノムのコピー数（ｖｇ／μｇタンパク質）は、ＡＡＶ２変異体が細胞に侵入する有効度を表し、ｅＧＦＰは、カプシド細胞内のトラフィッキングの有効度を表すが、それは、導入遺伝子の発現は、カプシド／ベクターＤＮＡの核への効率的な輸送（図１７）を必要とするからである。ベクターゲノムをＴａｑＭａｎ分析により定量した。
ベクターゲノム分析は、ＡＡＶ２脱アミド化突然変異体が、試験されたすべての細胞系統に、親ＡＡＶ２ベクターの場合とほぼ同程度のレベルで感染したことを示した（図１８）。重要なこととして、ＡＡＶ２Ａ３５Ｎ変異体は、３種のすべての細胞系統における形質導入について、親ＡＡＶ２ベクターより強いことが見出された（図１９）。ＡＡＶ２Ｇ５８Ｄ変異体は、ＨｕＨ７細胞において親ＡＡＶ２ベクターより強いことが見出された（図１９）。
結論
まとめると、ＡＡＶ２脱アミド化された突然変異体ベクターは、細胞に親ＡＡＶ２粒子とほぼ同程度のレベルで感染する（例えば、ほぼ同程度のｖｇ／μｇの細胞タンパク質）。しかしながら、形質導入された細胞におけるｅＧＦＰレベルの分析に基づいて、ＡＡＶ２Ａ３５Ｎ変異体は、試験されたすべての細胞系統で、親ＡＡＶ２より高い潜在能力を有し、ＡＡＶ２Ｇ５８Ｄ変異体は、ＨｕＨ７細胞（肝臓に由来する細胞系統）で親ＡＡＶ２より高い潜在能力を有した。これらの結果は、Ａ３５Ｎ突然変異は、多くの細胞型に形質導入するためのベクター潜在能力を増大させることに効果的であることができること、およびＧ５８Ｄ突然変異も、ある種の細胞型、例えば、肝臓細胞で潜在能力を増大させることに効果的であることができることを示唆する。
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配列
すべてのポリペプチド配列は、特に断らない限り、Ｎ末端からＣ末端へと示す。
すべての核酸配列は特に断らない限り５’から３’へと示す。
潜在的ＡＡＶ２ ＶＰ３開始コドンのヌクレオチド配列（ＡＴＧコドンに下線を引いた）
ＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣ （配列番号１）
潜在的ＡＡＶ２ ＶＰ３開始コドンに対応するポリペプチド配列（メチオニンに下線を引いた）
ＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤ （配列番号２）
ＡＡＶ２ ＶＰ１ポリペプチド配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ （配列番号３）
ＶＰ１ Ｎ末端トリプシンペプチド（Ｎ末端アラニンがアセチル化されている）
ＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲ （配列番号４）
ＶＰ３Ｎ末端Ａｓｐ−Ｎペプチド（Ｎ末端アラニンがアセチル化されている）
ＡＴＧＳＧＡＰＭ （配列番号５）
共通するＶＰ１Ｎ末端配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤ （配列番号６）
潜在的ＡＡＶ７ＶＰ３開始コドンのヌクレオチド配列（開始コドンに下線を引いた）
ＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣ （配列番号７）
突然変異したＩＴＲのヌクレオチド配列
ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号８）

Claims (180)

  1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の血清型を決定する方法であって、
    ａ）該ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、
    ｂ）該変性したＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供する工程と、
    ｃ）該ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量を決定する工程と
    を含み；
    ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量の特定の組合せが、ＡＡＶ血清型の指標である、前記方法。
  2. ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の計算された質量は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の理論的質量に対して比較される、請求項１に記載の方法。
  3. ＡＡＶ粒子の不均一性を決定する方法であって、
    ａ）該ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、
    ｂ）該変性したＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、
    ｃ）該ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量を決定する工程と、
    ｄ）工程ｃ）の質量を、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の理論的質量と比較する工程と
    を含み；
    ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ＡＡＶカプシドの不均一性の指標である、前記方法。
  4. 不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項３に記載の方法。
  5. ＡＡＶ粒子は、酢酸、塩酸グアニジンおよび／または有機溶媒により変性する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 逆相クロマトグラフィーは、Ｃ４またはＣ８逆相クロマトグラフィーである、請求項７に記載の方法。
  9. クロマトグラフィーは、水中にギ酸を含む移動相Ａを使用する、請求項８に記載の方法。
  10. 移動相Ａは、約０．１％のギ酸を含む、請求項９に記載の方法。
  11. クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にギ酸を含む移動相Ｂを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 移動相Ｂは、約０．１％のギ酸を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. クロマトグラフィーにおける移動相Ｂの割合は、経時的に増加する、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. クロマトグラフィーにおける移動相Ｂの割合は、段階的に増加する、請求項１３に記載の方法。
  15. 移動相Ｂは、約１０％から約２０％まで、約２０％から約３０％まで、および約３０％から約３８％まで増加する、請求項１４に記載の方法。
  16. 移動相Ｂは、約６分間で約１０％から約２０％まで、約１０分間で約２０％から約３０％まで、および約４０分間で約３０％から約３８％まで増加する、請求項１５に記載の方法。
  17. 液体クロマトグラフィーは、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. マススペクトロメトリーは、約３．５ｋＶのキャピラリー電圧を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. マススペクトロメトリーは、約４５Ｖのサンプリングコーン電圧を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. マススペクトロメトリーは、支援付き校正を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. ヨウ化ナトリウムは、校正物質として使用される、請求項２０に記載の方法。
  22. ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端は、アセチル化されている、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. ＡＡＶ粒子は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）、ＡＡＶ２ＨＢＫＯカプシド、ＡＡＶＰＨＰ．ＢカプシドまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢカプシドを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）、ＡＡＶ２ＨＢＫＯカプシド、ＡＡＶＰＨＰ．ＢカプシドまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢカプシドのうちの１つまたはそれ以上の理論的質量に対して比較される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. ウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. ＡＡＶ粒子は、異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の血清型を決定する方法であって、
    ａ）該ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、
    ｂ）該変性したＡＡＶ粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、
    ｃ）該変性したＡＡＶ粒子を消化に供して、該ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を生成する工程と、
    ｄ）該ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、
    ｅ）該ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量を決定する工程と
    を含み；
    ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量の特定の組合せが、ＡＡＶ血清型の指標である、前記方法。
  30. ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片の計算された質量は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片の理論的質量に対して比較される、請求項２９に記載の方法。
  31. ＡＡＶ粒子の血清型の不均一性を決定する方法であって、
    ａ）該ＡＡＶ粒子を変性させる工程と、
    ｂ）該変性したＡＡＶ粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、
    ｃ）該変性したＡＡＶ粒子を消化に供して、該ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を生成する工程と、
    ｄ）該ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、
    ｅ）該ＡＡＶ粒子のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の質量を決定する工程と、
    ｆ）工程ｅ）の質量を、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の断片の理論的質量と比較する工程と
    を含み；
    ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ＡＡＶカプシドの不均一性の指標である、前記方法。
  32. 不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 還元は、ＡＡＶ粒子をジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノール、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）に供することによる、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. アルキル化は、ＡＡＶ粒子をヨード酢酸、ヨードアセトアミド、または４−ビニルピリジンに供することによる、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 消化は、酵素消化または化学的消化である、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 酵素消化は、エンドペプチダーゼ消化である、請求項３５に記載の方法。
  37. 酵素消化は、トリプシン消化、ＬｙｓＣ消化、Ａｓｐ−Ｎ消化またはＧｌｕ−Ｃ消化である、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 化学的消化は、臭化シアン消化または酸消化である、請求項３５に記載の方法。
  39. ＡＡＶ粒子は、酢酸、塩酸グアニジンおよび／または有機溶媒により変性する、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  40. 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーである、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 逆相クロマトグラフィーは、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーである、請求項４１に記載の方法。
  43. クロマトグラフィーは、水中にギ酸を含む移動相Ａを使用する、請求項４２に記載の方法。
  44. 移動相Ａは、約０．１％のギ酸を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にギ酸を含む移動相Ｂを含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 移動相Ｂは、約０．１％のギ酸を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. クロマトグラフィーにおける移動相Ｂの割合は、経時的に増加する、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 移動相Ｂは、約２％から約６０％まで増加する、請求項４７に記載の方法。
  49. 移動相Ｂは、約１２１分間で約２％から約６０％まで増加する、請求項４８に記載の方法。
  50. 液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である、請求項２９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 質量分析は、約２．５ｋＶの電源電圧を含む、請求項２９〜５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 質量分析は、約２７５℃のキャピラリー温度を含む、請求項２９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 質量分析のＳ−レンズＲＦレベルは、約５５％である、請求項２９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端は、アセチル化されている、請求項２９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. ＡＡＶ粒子は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である、請求項２９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２Ｎ ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）、ＡＡＶ２ＨＢＫＯカプシド、ＡＡＶＰＨＰ．ＢカプシドまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢカプシドを含む、請求項２９〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. ＡＡＶカプシドは、チロシン突然変異、ヘパリン結合突然変異、またはＨＢＫＯ突然変異を含む、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の質量は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２−７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）、ＡＡＶ２ＨＢＫＯカプシド、ＡＡＶＰＨＰ．ＢカプシドまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢカプシドのうちの１つまたはそれ以上の理論的質量に対して比較される、請求項２９〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. ウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む、請求項２９〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. ＡＡＶ粒子は、異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む、請求項２９〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 請求項２９、３０または３２〜５９のいずれか１項に記載の方法と組み合わせた、請求項１、２または４〜２８のいずれか１項に記載の方法を含む、ＡＡＶ粒子の血清型を決定する方法。
  62. 請求項３１〜６０のいずれか１項に記載の方法と組み合わせた、請求項３〜２８のいずれか１項に記載の方法を含む、ＡＡＶ粒子の不均一性を決定する方法。
  63. 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子であって、親ポリペプチドのＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；該ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、前記組換えＡＡＶ粒子。
  64. 置換は、より高い頻度のＮ末端アセチル化またはより低い頻度のＮ末端アセチル化をもたらす、請求項６３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  65. ＶＰ１のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；ＶＰ１のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、請求項６３または６４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  66. ＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；ＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  67. アミノ酸残基２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ，Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換されている、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  68. アミノ酸残基２は、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されている、請求項６７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  69. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型カプシド、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ血清型カプシドを含む、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  70. 粒子のカプシド中にチロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を含む、請求項６３
    〜６９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  71. ｒＡＡＶベクターを含む、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  72. ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項７１に記載のｒＡＡＶ粒子。
  73. ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む、請求項７１または７２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  74. ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、同じ血清型に由来する、請求項７２または７３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  75. ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、異なる血清型に由来する、請求項７２または７３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  76. ＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲに隣接した異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  77. ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なベクターである、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  78. ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子をコードする第１の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第２の核酸配列を含み、該第１の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、該第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる、請求項７７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  79. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲにより連結され、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端解離配列の突然変異を含む、請求項７８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  80. ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される、請求項６３〜７９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  81. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される、請求項８０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  82. ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される、請求項８１に記載のｒＡＡＶ粒子。
  83. ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項８２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  84. ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を含み、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供するＡＡＶ産生細胞により産生される、請求項６３〜７９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  85. ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む、請求項８４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  86. ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスにＡＡＶ産生細胞を感染させることにより提供される、請求項８４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  87. ＡＡＶヘルバーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項８６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  88. ＡＡＶ ｃａｐ機能は、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を提供し、該ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  89. 請求項６３〜８８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む、医薬組成物。
  90. 請求項６３〜８７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項８９に記載の医薬組成物を含む、キット。
  91. 請求項６３〜８７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項８９に記載の医薬組成物を含む、製造品。
  92. ＡＡＶカプシドタンパク質であって、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を含み；該アミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、前記ＡＡＶカプシドタンパク質。
  93. 置換は、より高い頻度のＮ末端アセチル化またはより低い頻度のＮ末端アセチル化をもたらす、請求項９２に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  94. ＶＰ１またはＶＰ３である、請求項９２または９３に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  95. アミノ酸残基２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ，Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換されている、請求項９２〜９４のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  96. アミノ酸残基２は、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されている、請求項９３に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  97. アミノ酸置換は、ＡＡＶカプシドのより少ない脱アミド化をもたらす、請求項９２〜９６のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  98. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ血清型カプシドを含む、請求項９２〜９７のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  99. ＡＡＶカプシドタンパク質は、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
  100. ｒＡＡＶ粒子の安定性を改善する方法であって、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み；２位におけるアミノ酸を置換する工程が、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２と比較して、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端アセチル化を変更する、前記方法。
  101. 細胞内のｒＡＡＶ粒子のアセンブリを改善する方法であって、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み；２位において置換されたアミノ酸は、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２と比較して、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端アセチル化を変更する、前記方法。
  102. 細胞内のｒＡＡＶ粒子の形質導入を改善する方法であって、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２を置換する工程を含み、アミノ酸残基２を置換する工程が、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２と比較して、ＶＰ１および／またはＶＰ３のＮ末端アセチル化を変更する、前記方法。
  103. アミノ酸残基２を置換する工程は、より高い頻度のＮ末端アセチル化またはより低い頻度のＮ末端アセチル化をもたらす、請求項１００〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. ＶＰ１のアミノ酸残基２が置換される、請求項１００〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. ＶＰ３のアミノ酸残基２が置換される、請求項１００〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
  106. アミノ酸残基２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ，Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＴｙｒで置換されている、請求項１００〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. アミノ酸残基２は、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されている、請求項１０６に記載の方法。
  108. ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ血清型カプシドを含む、請求項１００〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. ｒＡＡＶ粒子のカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む、請求項１００〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含む、請求項１００〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
  111. ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む、請求項１１０または１１１に記載の方法。
  113. ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、同じ血清型に由来する、請求項１１０〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
  114. ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、異なる血清型に由来する、請求項１１０〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
  115. ＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲに隣接した異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む、請求項１１０〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なベクターである、請求項１１０〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
  117. ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子をコードする第１の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第２の核酸配列を含み、該第１の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、該第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる、請求項１１６に記載の方法。
  118. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲにより連結され、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端解離配列の突然変異を含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される、請求項１００〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される、請求項１１９に記載の方法。
  121. ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される、請求項１２０に記載の方法。
  122. ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項１２１に記載の方法。
  123. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を含み、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供するＡＡＶ産生細胞により産生される、請求項１００〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
  124. ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む、請求項１２３に記載の方法。
  125. ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスにＡＡＶ産生細胞を感染させることにより提供される、請求項１２４に記載の方法。
  126. ＡＡＶヘルバーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項１２５に記載の方法。
  127. ＡＡＶ ｃａｐ機能は、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換を提供し、該ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２におけるＮ末端アセチル化と比較して、Ｎ末端アセチル化を変更する、請求項１１９〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
  128. ウイルス粒子の血清型を決定する方法であって、
    ａ）該ウイルス粒子を変性させる工程と、
    ｂ）該変性したウイルス粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供する工程と、
    ｃ）該ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量を決定する工程と
    を含み；
    該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量の特定の組合せが、ウイルス血清型の指標である、前記方法。
  129. １種またはそれ以上のカプシドタンパク質の計算された質量は、１つまたはそれ以上のウイルス血清型の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の理論的質量に対して比較される、請求項１２８に記載の方法。
  130. ウイルス粒子の不均一性を決定する方法であって、
    ａ）該ウイルス粒子を変性させる工程と、
    ｂ）該変性したウイルス粒子を液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、
    ｃ）該ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量を決定する工程と、
    ｄ）工程ｃ）の質量を、ウイルス血清型の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の理論的質量と比較する工程と
    を含み、
    該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ウイルスカプシドの不均一性の指標である、前記方法。
  131. 不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項１３０に記載の方法。
  132. 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１２８〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
  133. ウイルス粒子は、異種導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含む、請求項１２８〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. ウイルス粒子の血清型を決定する方法であって、
    ａ）該ウイルス粒子を変性させる工程と、
    ｂ）該変性したウイルス粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、
    ｃ）該変性したウイルス粒子を消化に供して、ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を生成する工程と、
    ｄ）該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、
    ｅ）該ウイルス粒子の該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量を決定する工程と
    を含み；
    該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量の特定の組合せが、ウイルス血清型の指標である、前記方法。
  135. １種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の計算された質量は、１つまたはそれ以上のウイルス血清型の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の理論的質量に対して比較される、請求項１３４に記載の方法。
  136. ウイルス粒子の血清型の不均一性を決定する方法であって、
    ａ）該ウイルス粒子を変性させる工程と、
    ｂ）該変性したウイルス粒子を還元および／またはアルキル化に供する工程と、
    ｃ）該変性したウイルス粒子を消化に供して、該ウイルス粒子の１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を生成する工程と、
    ｄ）該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を液体クロマトグラフィー／質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供する工程と、
    ｅ）該ウイルス粒子の該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量を決定する工程と、
    ｆ）工程ｅ）の質量を、ウイルス血清型の該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の理論的質量と比較する工程と
    を含み；
    該１種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量のうちの１つまたはそれ以上の偏差が、ウイルスカプシドの不均一性の指標である、前記方法。
  137. 不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項１３６に記載の方法。
  138. 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１３４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
  139. ウイルス粒子は、異種導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含む、請求項１３４〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
  140. ウイルス粒子は、アデノウイルス科、パルボウイルス科、レトロウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘルペスウイルス科からなる群から選択されるウイルス科に属する、請求項１２８〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
  141. ウイルス粒子は、アタデノウイルス属、アビアデノウイルス属、イクタデノウイルス属、マストアデノウイルス属、シアデノウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、イテラデンソウイルス属、ペンスチルデンソウイルス属、アムドパルボウイルス属、アベパルボウイルス属、ボカパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、デペンドパルボウイルス属、エリスロパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アルファレトロウイルス属、ベータレトロウイルス属、デルタレトロウイルス属、イプシロンレトロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、レンチウイルス属、スプマウイルス属、アルファバキュロウイルス属、ベータバキュロウイルス属、デルタバキュロウイルス属、ガンマバキュロウイルス属、イルトウイルス属、マルディウイルス属、シンプレックスウイルス属、バリセロウイルス属、サイトメガロウイルス属、ムロメガロウイルス属、プロボシウイルス属、ロゼオロウイルス属、リンホクリプトウイルス属、マカウイルス属、ペルカウイルス属、およびラジノウイルス属からなる群から選択されるウイルス属に属する、請求項１４０に記載の方法。
  142. 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子であって、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１またはＶＰ３のアミノ酸残基Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、該親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、前記組換えＡＡＶ粒子。
  143. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６のアミノ酸残基にあり、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、請求項１４２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  144. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＮ５１１、またはＶＰ３のＮ７１５におけるＡｓｐの置換を含み、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より高い頻度の脱アミド化をもたらす、請求項１４２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  145. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、Ｎ５７ＫまたはＮ５７Ｑ置換を含み、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす、請求項１４２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  146. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＡ３５におけるＡｓｎの置換を含み、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１の脱アミド化と比較して、より高い頻度の脱アミド化をもたらす、請求項１４２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  147. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＧ５１２、またはＶＰ３のＧ７１６にあり、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす、請求項１４２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  148. ＶＰ１のＧ５８は、Ａｓｐで置換されている、請求項１４７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  149. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１粒子またはＡＡＶ２粒子である、請求項１４２〜１４８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  150. 請求項１４２〜１４９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む、医薬組成物。
  151. 請求項１４２〜１４９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項１５０に記載の医薬組成物を含む、キット。
  152. 請求項１４２〜１４９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項１５０に記載の医薬組成物を含む、製造品。
  153. ＡＡＶカプシドタンパク質であって、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸置換を含み；該アミノ酸置換は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、カプシドの脱アミド化を変更する、前記ＡＡＶカプシドタンパク質。
  154. ｒＡＡＶ粒子の安定性を改善する方法であって、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のＶＰ１および／またはＶＰ３の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、該１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６であり、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換は、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸残基２と比較して、脱アミド化を変更する、前記方法。
  155. 細胞内のｒＡＡＶ粒子のアセンブリを改善する方法であって、ＶＰ１および／またはＶＰ３の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、該１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６であり、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換は、親ＶＰ１および／またはＶＰ３のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、前記方法。
  156. 細胞内のｒＡＡＶ粒子の形質導入を改善する方法であって、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、該１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、Ａ３５、Ｎ５７、Ｇ５８、Ｎ３８２、Ｇ３８３、Ｎ５１１、Ｇ５１２、Ｎ７１５、またはＧ７１６であり、残基の番号付けはＡＡＶ２のＶＰ１に基づき；アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、前記方法。
  157. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１のＡ３５、ＶＰ１のＮ５７、ＶＰ１のＧ５８、ＶＰ３のＮ３８２、ＶＰ３のＧ３８３、ＶＰ３のＮ５１１、ＶＰ３のＧ５１２、ＶＰ３のＮ７１５、またはＶＰ３のＧ７１６にあり；該アミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、請求項１５４〜１５６のいずれか１項に記載の方法。
  158. ＶＰ１の３５位における親Ａｌａ残基は、Ａｓｎで置換されている、請求項１５４〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
  159. ＶＰ１の５８位における親Ｇｌｙ残基は、Ａｓｐで置換されている、請求項１５４〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
  160. ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ ＬＫ０３、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ ＤＪ８カプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢ血清型カプシドを含む、請求項１５４〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
  161. ｒＡＡＶ粒子のカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む、請求項１５４〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
  162. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１粒子またはＡＡＶ２粒子である、請求項１５４〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
  163. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含む、請求項１５４〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
  164. ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項１６３に記載の方法。
  165. ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、またはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む、請求項１６３または１６４に記載の方法。
  166. ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、同じ血清型に由来する、請求項１６４〜１６５のいずれか１項に記載の方法。
  167. ＡＡＶカプシドおよびＡＡＶ ＩＴＲは、異なる血清型に由来する、請求項１６４〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
  168. ＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲに隣接した異種導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターを含む、請求項１６４〜１６７のいずれか１項に記載の方法。
  169. ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なベクターである、請求項１６４〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
  170. ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子をコードする第１の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第２の核酸配列を含み、該第１の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、該第２の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる、請求項１６９に記載の方法。
  171. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲにより連結され、突然変異したＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端解離配列の突然変異を含む、請求項１７０に記載の方法。
  172. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される、請求項１６４〜１７１のいずれか１項に記載の方法。
  173. ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される、請求項１７２に記載の方法。
  174. ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される、請求項１７３に記載の方法。
  175. ＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項１７４に記載の方法。
  176. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能をコードする核酸を含み、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を提供するＡＡＶ産生細胞により産生される、請求項１６４〜１７５のいずれか１項に記載の方法。
  177. ＡＡＶ産生細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む、請求項１７６に記載の方法。
  178. ＡＡＶヘルバー機能は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するＡＡＶヘルパーウイルスにＡＡＶ産生細胞を感染させることにより提供される、請求項１７７に記載の方法。
  179. ＡＡＶヘルバーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項１７８に記載の方法。
  180. ＡＡＶ ｃａｐ機能は、ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸置換を提供し、該ＶＰ１および／またはＶＰ３のアミノ酸置換は、親ＡＡＶ粒子のＶＰ１および／またはＶＰ３の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、請求項１７２〜１７９のいずれか１項に記載の方法。
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