WO2023132338A1 - タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法、及びキット - Google Patents

タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法、及びキット Download PDF

Info

Publication number
WO2023132338A1
WO2023132338A1 PCT/JP2023/000038 JP2023000038W WO2023132338A1 WO 2023132338 A1 WO2023132338 A1 WO 2023132338A1 JP 2023000038 W JP2023000038 W JP 2023000038W WO 2023132338 A1 WO2023132338 A1 WO 2023132338A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
mass spectrometry
sugar
amino acid
compound
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/000038
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
俊 松田
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Publication of WO2023132338A1 publication Critical patent/WO2023132338A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying sugar-bound amino acid sites in proteins.
  • the invention further relates to kits for carrying out the method of identifying amino acid sites.
  • sugar chain modifications to proteins can affect the blood half-life and biological activity. It is necessary. In order to control sugar chain modification to proteins, it is necessary to identify the amino acid sites to which sugars are bound in proteins.
  • Patent Document 1 describes a process of fluorescently labeling a sugar chain in a glycoprotein, a process of obtaining glycopeptide fragments by fragmenting the glycoprotein, and obtaining fluorescence analysis data by fluorescence detection using liquid chromatography. obtaining mass spectrometric data by mass detection using a mass spectrometer; comparing the fluorometric data with the mass spectrometric data to determine the mass-to-charge ratio (m/z) corresponding to the fluorescence intensity peak and extracting the peak of .
  • m/z mass-to-charge ratio
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method that can identify amino acid sites to which sugars are bound in proteins.
  • a further object of the present invention is to provide a kit for carrying out the above-described method for identifying the sugar-bound amino acid site in a protein.
  • the present inventors performed a first mass spectrometry step of mass spectrometry of the fragmented protein, and then bound sugars in the first mass spectrometry step.
  • the protein confirmed to be a It was found that by performing two mass spectrometry steps, it was possible to identify the modified site of GlcNAc in the viral capsid modified with O-glycans.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a method for identifying a sugar-bound amino acid site in a protein comprising: a first mass spectrometry step of mass spectrometry of the fragmented protein; A substitution modification step of substituting and/or modifying an amino acid at an amino acid site to which a sugar is bound in the protein confirmed to be sugar-bound in the first mass spectrometry step, and a fragmentation of the protein. process and a second mass spectrometry step of mass spectrometry of the substituted and/or modified and fragmented protein obtained by the above substitution modification step and fragmentation step.
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, comprising comparing the mass spectrometry results obtained from the first mass spectrometry step and the mass spectrometry results obtained from the second mass spectrometry step.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the sugar-bound amino acid is serine and/or threonine.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the substitution modification step is a substitution reaction by a Michael addition reaction to an amino acid site from which a sugar has been eliminated by a ⁇ -elimination reaction.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the Michael addition reaction in the substitution modification step is a reaction with a cyclic active methylene compound.
  • the Michael addition reaction in the substitution modification step is a reaction with a pyrazolone compound, a barbituric acid compound, a dimedone compound, or a hydroxycoumarin compound.
  • the Michael addition reaction in the substitution modification step is a reaction with a pyrazolone compound.
  • ⁇ 8> The method according to ⁇ 7>, wherein the pyrazolone compound is 3-methyl-1-phenyl-pyrazolone.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the sugar is N-acetylglucosamine.
  • ⁇ 10> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the protein is a viral capsid.
  • ⁇ 11> The method according to ⁇ 10>, wherein the virus is an adeno-associated virus.
  • ⁇ 12> The method of ⁇ 11>, wherein the virus is adeno-associated virus 5 called AAV5.
  • ⁇ 13> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, wherein the amount of protein to be analyzed is 100 fmol or less.
  • FIG. 1 shows MS/MS spectra of O-GlcNAc binding peptides detected from fragmented AAV capsids.
  • FIG. 2 shows MS/MS spectra of O-GlcNAc binding peptides detected from fragmented AAV capsids.
  • FIG. 3 shows the MS/MS spectrum of PMP-ylated and fragmented AAV capsid-derived peptides.
  • FIG. 4 shows the MS/MS spectrum of PMP-ylated and fragmented AAV capsid-derived peptides.
  • FIG. 5 shows an extracted chromatogram of precursor ions for an unmodified peptide preparation and an internal standard (IS).
  • FIG. 6 shows precursor ion extraction chromatograms for S469 modified peptide preparations and an internal standard (IS).
  • FIG. 7 shows the standard curve.
  • AAV means adeno-associated virus.
  • LC means liquid chromatography.
  • MS means mass spectrum.
  • ESI means electrospray ionization.
  • HCD means high energy collisional dissociation.
  • a method for identifying an amino acid site to which a sugar is attached in a protein comprises: a first mass spectrometry step of mass spectrometry of the fragmented protein; A substitution modification step of substituting and/or modifying an amino acid at an amino acid site to which a sugar is bound in the protein confirmed to be sugar-bound in the first mass spectrometry step, and a fragmentation of the protein. process and and a second mass spectrometry step of mass spectrometry of the substituted and/or modified and fragmented protein obtained by the above substitution modification step and fragmentation step.
  • proteins modified with sugars can be identified.
  • the subsequent substitution modification step in the range of amino acid residues found to be modified by sugars in the first mass spectrometry step, the subsequent substitution modification step, fragmentation step and second mass spectrometry step. Since the analysis step identifies the labeled amino acid residue (that is, the amino acid residue modified by sugar), it is possible to identify the site modified by sugar with high accuracy.
  • the sugar-modified site can be identified. .
  • identifying the amino acid site to which the sugar is bound means determining the position of the amino acid to which the sugar is bound.
  • the protein is not particularly limited as long as it is a protein that can be modified with sugar. Proteins may be naturally occurring proteins, proteins obtained by genetic recombination methods, or chemically synthesized proteins. Proteins obtained by genetic recombination include recombinant proteins expressed in host cells.
  • the host cells are preferably eukaryotic cells, more preferably mammalian cells.
  • mammalian cells include, but are not limited to, human cells, mouse cells, rat cells, monkey cells, hamster cells, and the like.
  • human cells can be used.
  • examples of cells include mouse myeloma (NSO) cell line, Chinese hamster ovary (CHO) cell line, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, NIH3T3, PC12, BHK (baby hamster kidney cells), VERO, SP2.
  • NSO mouse myeloma
  • CHO Chinese hamster ovary
  • the cells are HEK293 cells, CHO cells, more preferably HEK293 cells.
  • the protein is preferably a viral capsid.
  • the viral capsid also called capsid, is a protein shell that surrounds the viral genome.
  • Viruses include, but are not particularly limited to, adeno-associated viruses, adenoviruses, retroviruses, lentiviruses, Sendai viruses, and the like.
  • the virus is preferably an adeno-associated virus, for example any of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 or AAV11, more preferably AAV5, AAV8 or AAV9. , more preferably AAV5.
  • AAV is produced within the host cell, it is believed that the capsid undergoes sugar modification by host cell-derived enzymes, which may affect the efficacy and side effects of AAV.
  • the FDA (U.S. Food and Drug Administration) guidance published in January 2020 recommends that therapeutic AAVs be analyzed not only for their molecular weight and size, but also for their properties such as sugar modification sites.
  • glycosylation of AAV there is almost no knowledge about glycosylation of AAV, and it is unclear whether AAV is glycosylated or not, and its analysis method has not been established.
  • the methods of the present invention allow analysis of AAV GlcNAc modification sites. This allows the method of the present invention to be used for quality assessment of AAV.
  • the protein may be a protein other than the virus capsid, such as an antibody (e.g., human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, mouse antibody, bispecific antibody, etc.), fragmented immunoglobulin, single-chain antibody (scFv). etc. Fragmented immunoglobulins include Fab, F(ab')2, Fv, and the like.
  • the antibody class is not particularly limited, and may be of any class such as IgG such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, IgA, IgD, IgE, and IgM, but IgG and IgM are preferred when used as a medicine.
  • Amino acid residues that constitute proteins are not particularly limited, but preferably those containing serine or threonine.
  • the amount of protein to be analyzed may be 1000 fmol or less, 500 fmol or less, 200 fmol or less, or 100 fmol or less.
  • Sugars may be monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides, oligosaccharides (2 to 20 sugar molecules linked together), or polysaccharides (many monosaccharides polymerized). , preferably a monosaccharide.
  • Monosaccharide is a general term for sugars that cannot be further hydrolyzed among sugars.
  • Specific examples of monosaccharides include N-acetylglucosamine (abbreviated as GlcNAc) whose structure is shown below, but are not particularly limited, but N-acetylglucosamine is preferred.
  • amino acid to which sugar is bound is not particularly limited, but is, for example, serine, threonine or asparagine, preferably serine and/or threonine.
  • the sugar (eg, GlcNAc) modification rate in a protein represents the ratio of modified proteins among the protein molecules contained in the sample. number of protein molecules)/(number of protein molecules contained in the sample).
  • the sugar modification rate in the protein may be, for example, less than 1%, preferably 0.8% or less, 0.6% or less, 0.5% or less, or 0.4% or less.
  • the quantification of the sugar modification rate in proteins can be performed as described in Examples below.
  • amino acid sites to which sugar chains are bound can be identified in a protein having a sugar modification rate of 0.0001% or more and less than 1% and 1 fmol or more and 1000 fmol or less. Furthermore, in a protein with a sugar modification rate of 0.001% or more and 0.6% or less and 5 fmol or more and 500 fmol or less, the amino acid site to which the sugar chain binds can be identified. Furthermore, in a protein with a sugar modification rate of 0.005% or more and 0.4% or less and 10 fmol or more and 100 fmol or less, amino acid sites to which sugar chains are bound can be identified.
  • substitution-modification step for proteins confirmed to have sugar-bonded sugars in the first mass spectrometry step, amino acids at sugar-bonded amino acid sites in the protein are substituted and/or modified.
  • the substitution modification step is preferably a Michael addition reaction to the amino acid site from which the sugar has been eliminated by the ⁇ -elimination reaction.
  • the ⁇ -elimination reaction and the Michael addition reaction can be carried out in the same step, where the reaction apparently replaces the substituent on the same atom of the compound.
  • the Michael addition reaction in the substitution modification step is preferably a reaction with a cyclic active methylene compound, more preferably a pyrazolone compound, a barbituric acid compound, a dimedone compound, or a hydroxycoumarin compound, and particularly preferably a pyrazolone compound. It is a reaction by
  • the pyrazolone compound is not particularly limited as long as it is a compound having a pyrazolone group.
  • p-tolyl-5-pyrazolone MTP
  • 3-methyl-1-(quinolin-8-yl)-1H-pyrazol-5(4H)-one Two or more types may be used in combination.
  • the pyrazolone compound is particularly preferably 3-methyl-1-phenyl-pyrazolone (PMP).
  • the concentration of the cyclic active methylene compound in the Michael addition reaction in the substitution modification step is not particularly limited, but the concentration in the reaction solution is generally 0.05 mol/L to 1 mol/L, preferably 0.1 mol. /L to 0.5 mol/L.
  • a compound represented by the following formula (1) can be used as the cyclic active methylene compound.
  • a cyclic active methylene compound may be used in combination of two or more compounds.
  • W and X each represent a substituent containing an electron-withdrawing group, and W and X are linked to each other to form a 5- or 6-membered ring.
  • Electron-withdrawing groups contained in W and X include those having a carbonyl bond or an azomethine bond.
  • Representative active methylene compounds include a pyrazolone compound represented by formula (2), a barbiturate compound represented by formula (3), a dimedone compound represented by formula (4), and a compound represented by formula (5). and hydroxycoumarin compounds represented.
  • Ar represents an aromatic ring optionally having one or more substituents.
  • Aromatic rings include benzene ring, pyrimidine ring, pyridazine ring, pyrazine ring, pyridine ring and the like.
  • substituents on these aromatic rings include alkyl groups having 1 to 8 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 8 carbon atoms, monoalkylamino groups having 1 to 8 carbon atoms, dialkylamino groups having 2 to 16 carbon atoms, and halogen atoms. and a cyano group.
  • R 1 represents an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxycarbonylalkyl group having 3 to 16 carbon atoms, a carbamoylalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, or It represents an aromatic ring which may have a substituent.
  • Aromatic rings include benzene ring, pyrimidine ring, pyridazine ring, pyrazine ring, pyridine ring, pyrrole ring, pyrazole ring, imidazole ring, triazole ring and tetrazole ring.
  • substituents on these aromatic rings include alkyl groups having 1 to 8 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 8 carbon atoms, monoalkylamino groups having 1 to 8 carbon atoms, dialkylamino groups having 2 to 16 carbon atoms, and halogen atoms. , and a cyano group.
  • R 4 and R 5 each independently represent an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 6 and R 7 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, a monoalkylamino group having 1 to 8 carbon atoms, or a dialkylamino group having 2 to 16 carbon atoms. group, a halogen atom, a cyano group, or the like.
  • the fragmentation step of fragmenting a protein can be performed by allowing a proteolytic enzyme to act on the protein. Pretreatment may include reduction and carbamidomethylation of the protein, followed by protein fragmentation.
  • Pretreatment may include reduction and carbamidomethylation of the protein, followed by protein fragmentation.
  • a cysteine residue in a protein can be reduced by allowing a reducing agent such as dithiothreitol to act on the protein.
  • the reduced protein can then be carbamidomethylated by adding iodoacetamide.
  • the protein can then be fragmented by allowing a proteolytic enzyme to act on the protein.
  • Enzymes that fragment proteins are preferably capable of cleaving proteins between 5 and 100 residues, more preferably between 6 and 60 residues, more preferably 7 residues.
  • proteolytic enzymes include trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, ficin, bromelain, Lys-C (Promega), Asp-N (Promega), Arg-C (Promega), proteinase K, lysyl endopeptidase, V8. proteases, etc., preferably trypsin.
  • the amount of proteolytic enzyme used is preferably 1/20 to 1/100 times the weight of the protein in the sample.
  • the order of the substitution modification step and the fragmentation step of fragmenting the protein is not particularly limited. That is, the fragmentation step of fragmenting the protein may be performed after performing the substitution modification step, or the fragmentation step of fragmenting the protein may be performed before the substitution modification step.
  • the first mass spectrometry step in the present invention is a step of mass spectrometry of the fragmented protein, confirming that the protein is modified by sugar, and furthermore, the range of amino acid residues that have been modified by sugar It is a process for specifying.
  • the amino acid at the amino acid site where the sugar is bound in the protein is substituted and / or modified. and a step of analyzing the protein obtained by carrying out a substitution modification step and a fragmentation step of fragmenting the protein.
  • the method of mass spectrometry is not particularly limited, but as an example, the mass of ions and molecules can be measured by ionizing molecules and measuring their mass-to-charge ratio (m/z).
  • Pretreatment preferably includes reduction, carbamidomethylation and fragmentation of the protein.
  • a cysteine residue in a protein can be reduced by allowing a reducing agent such as dithiothreitol to act on the protein.
  • the reduced protein can then be carbamidomethylated by adding iodoacetamide.
  • the protein can be fragmented by allowing a proteolytic enzyme to act on the protein. Enzymes that fragment proteins are preferably capable of cleaving proteins between 5 and 100 residues, more preferably between 6 and 60 residues, more preferably 7 residues. Particularly preferred is one that cuts between more than 40 residues and less.
  • proteolytic enzymes examples include trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, ficin, bromelain, Lys-C, Asp-N, Arg-C, proteinase K, lysylendopeptidase, V8 and the like, preferably trypsin.
  • trypsin a proteolytic enzyme
  • chymotrypsin pepsin
  • papain ficin
  • bromelain Lys-C
  • Asp-N Asp-N
  • Arg-C proteinase K
  • lysylendopeptidase V8 and the like
  • trypsin preferably trypsin.
  • the fragmented protein (peptide) may be desalted using GL-Tip SDB (GL Sciences) or the like.
  • the protein was subjected to the substitution modification step and the fragmentation step (the order of the substitution modification step and the fragmentation step does not matter).
  • mass spectrometry can be performed.
  • the fragmented protein may be desalted using GL-Tip SDB (GL Sciences) or the like.
  • Mass spectrometric analysis of pretreated samples can be performed using liquid chromatography (LC) and mass spectrometry (MS).
  • the liquid chromatography device and mass spectrometer may be connected in series with each other, or only the mass spectrometer may be used.
  • an LC-MS system configured by serially connecting a liquid chromatography device and a mass spectrometer can be used.
  • tandem-type LC-MS/MS, LC-MS/MS/MS, or the like can be used.
  • the liquid chromatography (LC) device is not particularly limited as long as it can separate sugar-modified proteins by liquid chromatography.
  • liquid chromatography for example, high performance liquid chromatography (HPLC), ultra high performance high separation liquid chromatography (UHPLC, UPLC, or UFLC), or low flow rate LC can be used. equipment can be selected.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • UHPLC ultra high performance high separation liquid chromatography
  • UFLC ultra high performance high separation liquid chromatography
  • low flow rate LC can be used. equipment can be selected.
  • liquid chromatography (LC) low flow LC is preferred.
  • examples of low-flow LC include nanoflow liquid chromatography (nano-LC), capillary LC, micro-LC, etc. Among them, nano-LC is particularly preferred.
  • An LC apparatus generally includes a separation column and a pump that feeds a separation solution into the separation column.
  • the LC apparatus may include other elements than those described above, such as autosamplers, heaters, detectors to detect separated components, and the like.
  • Detectors include, for example, UV detectors and fluorescence detectors.
  • a detector can be connected between the column and the ion source (ionization section).
  • the conditions of the analytical column used for liquid chromatography are not particularly limited and can be appropriately selected.
  • a reversed-phase column can be used as the separation column. Examples of reversed-phase columns include columns packed with octadecylsilyl silica gel packing material and columns with ion-exchange resin mixed therein. Columns used in reversed phase chromatography packed with chemically bound packing (ODS columns) are preferred.
  • ODS columns chemically bound packing
  • As the separation column for example, MonoCap C18 HighResolution 750 (GL Sciences) can be used.
  • a mobile phase concentration gradient can be formed by mixing two or more solutions with different compositions while changing the mixing ratio. Combinations of solutions can be selected as appropriate to form the desired gradient.
  • the flow rate can be appropriately selected according to various conditions such as the inner diameter of the separation column.
  • the flow rate of the separation solution may or may not be constant throughout the separation process. For example, it can be appropriately selected in the range of 100 nL/min to 100 ⁇ L/min.
  • a person skilled in the art can appropriately select the column temperature in liquid chromatography. For example, it is 20 to 70°C, preferably 25 to 50°C.
  • the liquid chromatography/tandem mass spectrometry fragment ion analysis method is an apparatus consisting of a liquid chromatography section and a mass spectrometer section, and the mass spectrometer section further has a section capable of decomposing and detecting precursor ions.
  • a normal mass spectrometer can be used as the mass spectrometer unit. There may be one mass spectrometer, two or more. Two or more mass spectrometers can be used in series. That is, the LC-MS system may be LC-MS/MS or LC-MS/MS/MS.
  • the tandem mass spectrometer can use a magnetic deflection type, a quadrupole type, an ion trap type, a time-of-flight type, an orbitrap type, or a hybrid type thereof.
  • a quadrupole/orbitrap tandem mass spectrometer is preferred.
  • ionization methods in mass spectrometers include electrospray ionization (ESI), matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI), electron ionization (EI), chemical Ionization (CI: Chemical Ionization) method, Field Desorption (FD) method, Fast Atom Bombardment (FAB) method, Atmospheric pressure chemical ionization (APCI: Atmospheric Pressure Chemcal Ionization) on,) method, or inductive coupling
  • ESI electrospray ionization
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • EI electron ionization
  • CI chemical Ionization
  • FD Field Desorption
  • FAB Fast Atom Bombardment
  • APCI Atmospheric pressure chemical ionization
  • ICP Inmospheric Pressure Chemcal Ionization
  • a quadrupole/orbitrap tandem mass spectrometer is a mass spectrometer consisting of an ion source, a quadrupole (Q1), a collision cell (Q2), an orbitrap (Q3), and a detector.
  • the analyte is ionized in the ion source to produce precursor ions, which are separated by mass in the quadrupole (Q1) according to their mass-to-charge ratio (m/z).
  • product ions are generated by colliding with an inert gas such as nitrogen or argon in the collision cell (Q2) (collision-induced dissociation: CID).
  • CID collision-induced dissociation
  • the spectrum of the mass-to-charge ratio (m/z) of the precursor ion of the peptide and the mass-to-charge ratio of the product ion indicates that the peptide has undergone sugar modification. It can be made clear that Within the range of peptide amino acid residues found to undergo glycosylation, the subsequent substitution modification step, fragmentation step and second mass spectrometry step result in the mass-to-charge ratio (m/ z) and labeled amino acid residues (ie, sugar-modified amino acid residues) can be identified from the mass-to-charge ratio spectrum of the product ions.
  • the sugar chain modification rate can be quantified based on the results of mass spectrometry.
  • the sugar chain modification rate can be quantified, for example, as follows.
  • the modification rate is obtained by quantifying the number of molecules of peptides to be measured (unmodified peptides and GlcNAc-modified peptides having the same amino acid sequence) present in the sample.
  • peptides to be measured and preparations of their stable isotopes are used.
  • Stable isotopes are used as internal standards (IS) for measurements.
  • a calibration curve is obtained using a known amount of peptide preparation to which an internal standard has been added, and this is used to quantify each peptide to be measured in the sample.
  • Quantitation based on the results of mass spectrometry is determined from the ratio of the peak area obtained from the extracted chromatogram of precursor ions corresponding to each peptide to be measured and the peak area obtained from the extracted chromatogram of precursor ions corresponding to each IS. .
  • kits for carrying out the above-described method for identifying sugar-bonded amino acid sites in a protein according to the present invention comprising a cyclic active methylene compound.
  • cyclic active methylene compounds are as described herein above.
  • the kit of the present invention may further contain means for purifying the fragmented protein.
  • means for purifying the fragmented protein include solid-phase extraction using hydrophobic interaction (a solid phase packed with a filler to which ODS groups are chemically bonded).
  • a kit of the invention may comprise a written protocol for carrying out a method of identifying sugar-linked amino acid sites in a protein according to the invention. This protocol includes, for example, identification procedures and information required for identification.
  • the kit of the present invention may further contain reagents used in the above methods. Examples of reagents include proteolytic enzymes and buffers.
  • the AAV pellet was dissolved in 20 ⁇ L of MPEX PTS Reagent B (GL Sciences), dithiothreitol (DTT) with a final concentration of 5 mmol/L was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes to reduce the cysteine residues in the protein. After that, iodoacetamide (IAA) with a final concentration of 25 mmol/L was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes in the dark for carbamidomethylation.
  • DTT dithiothreitol
  • IAA iodoacetamide
  • the flow rate was 500 nL/min, mobile phase A was 0.1% formic acid (in H 2 O) and mobile phase B was acetonitrile.
  • the column temperature was set at 35° C. and the injection volume was 10 ⁇ L.
  • ESI-MS (Positive mode) was used for detection, and the capillary voltage was set to 2 kV.
  • the MS scan range was m/z 350-1800 (resolution 70,000, AGC 3 ⁇ 10 6 ) and the top 10 precursor ions in each MS scan were fragmented with HCD followed by MS/MS scans (resolution 35,000, AGC 1 ⁇ 10 5 ).
  • the normalized collision energy was set to 25% and the dynamic exclusion time was 30 seconds. Isolation width was set to 2.0 m/z.
  • a database search was used for peptide qualitative screening.
  • Proteome Discoverer Ver1.3 (Thermo Fisher Scientific) was used for database analysis, and Sequest HT (Thermo Fisher Scientific) and Mascot (Matrix Science) were used as database search engines. Allowable trypsin uncleavage number within 2, allowable precursor mass error of 10 ppm, fragment mass error of 20 mmu, fixed modification set to carbamidomethylation (C), dynamic modification set to oxidation (O), and HexNAc (S and T) bottom.
  • AAV9 Q6JC40
  • Q6JC40 UniProt accession number Q6JC40
  • the false identification rate was calculated based on the decoy database (reverse amino acid sequence of the database) and set to less than 1% at the peptide level.
  • the MS/MS spectrum of each peptide hit by the search was manually checked, and those with a mass error of 10 ppm or less from the theoretical value of fragment ions were adopted as the basis for qualitative analysis.
  • the glycopeptide candidates hit by the search those in which sugar-derived ion groups (m/z 204 and two or more other fragment ions) were observed in the MS/MS spectrum were judged to be glycopeptides.
  • FIGS. 1 and 2 MS/MS spectra of O-GlcNAc-bound peptides detected from AAV are shown in FIGS. 1 and 2.
  • FIG. FSVAGPSNMAVQGR shown in Figure 1 shows the amino acid sequence of amino acid positions 463-476 of AAV.
  • VSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGR shown in FIG. 2 indicates the amino acid sequence of amino acid positions 489-514 of AAV.
  • the results in FIG. 1 show that one O-GlcNAc binds to amino acid positions 463-476 of AAV9.
  • the results in FIG. 2 indicate that one O-GlcNAc binds to amino acid positions 489-514 of AAV9.
  • FIGS. 1 shows the amino acid sequence of amino acid positions 463-476 of AAV.
  • the air-dried AAV pellet was dissolved in 20 ⁇ L of MPEX PTS Reagent B, and subjected to reduction by DTT, alkylation by IAA, and fragmentation by trypsin digestion (fragmentation step) in the same manner as in (1) above.
  • Peptide desalting was also performed using GL-Tip SDB in the same manner as in (1) above.
  • FIGS. 3 and 4 MS/MS spectra of PMP-derived AAV-derived peptides are shown in FIGS. 3 and 4.
  • FIG. 3 the difference in the mass-to-charge ratios of the y 8 + and y 7 + ions of the peptide closely matches the mass of the PMP-attached serine, indicating that It was found that serine (S469 of AAV9) was PMPylated.
  • FIG. 4 the difference in the mass-to-charge ratios of the y 8 + and y 7 + ions of the peptide closely matches the mass of the PMP-attached serine, indicating that It was found that serine (S507 of AAV9) was PMPylated. That is, binding of O-GlcNAc to S469 and S507 of AAV9 could be detected.
  • the ion extraction conditions used for peptide quantification are as follows. FSVAGPSNMAVQGR (m/z 710.8559) FSVAGP(GlcNAc-S)NMAVQGR (m/z 715.8578) [ 13C5,15N5 ] FSVAGPSNMAVQGR (m/z 812.3959 ) [ 13 C 5 , 15 N 5 ]FSVAGP(GlcNAc-S) NMAVQGR (m/z 817.3976)
  • Precursor ion extraction chromatograms for the unmodified peptide preparation and the internal standard (IS) are shown in FIG.
  • Precursor ion extraction chromatograms for the S469-modified peptide preparation and the internal standard (IS) are shown in FIG.
  • the peak area of each peptide was calculated from the extracted chromatogram of precursor ions corresponding to each peptide.
  • Each peptide was quantified by the peak area ratio of the target peptides (unmodified and GlcNAc-modified peptides) and their corresponding IS.
  • Each peptide standard product to which IS was added was used to create a calibration curve. The obtained calibration curve is shown in FIG.
  • Modification rate number of GlcNAc-modified peptide molecules/(number of unmodified peptide molecules + number of GlcNAc-modified peptide molecules) Based on , the percent modification was calculated in moles. The modification rate was 0.4%.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本発明の課題は、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を従来より正確に同定することができる方法、および上記方法を行うためのキットを提供することである。本発明によれば、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法であって、断片化されたタンパク質を質量分析する第一の質量分析工程と、第一の質量分析工程において糖が結合していることが確認されたタンパク質について、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位のアミノ酸を置換および／または修飾する置換修飾工程、およびタンパク質を断片化する断片化工程と、上記の置換修飾工程及び断片化工程により得られた、置換および／または修飾され、かつ断片化されたタンパク質を質量分析する第二の質量分析工程と、を含む方法が提供される。

Description

タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法、及びキット
　本発明は、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法に関する。本発明はさらに、アミノ酸部位を同定する方法を行うためのキットに関する。
　タンパク質への糖鎖の修飾は、タンパク質の機能を調節する重要な翻訳後修飾の一つである。抗体などのバイオ医薬品においては、タンパク質への糖鎖の修飾が、血中半減期や生物活性に影響する場合があることが分かり、品質管理のために、タンパク質への糖鎖の修飾を制御することが必要になっている。タンパク質への糖鎖の修飾を制御するためには、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定することが必要である。
　特許文献１には、糖タンパク質における糖鎖を蛍光標識する工程と、糖タンパク質を断片化することにより糖ペプチド断片を取得する工程と、液体クロマトグラフィーを用いた蛍光検出により蛍光分析データを取得する工程と、質量分析機器を用いた質量検出により質量分析データを取得する工程と、蛍光分析データと質量分析データとを比較して、蛍光強度のピークに対応する質量対電荷比（ｍ／ｚ）のピークを抽出する工程とを含む糖タンパク質における糖鎖の結合領域の同定方法が記載されている。
特開２０１９－５２９９５号公報
　特許文献１に記載の方法においては、ＧｌｃＮＡｃ修飾が検出されたタンパク質（ペプチド）に複数のセリンまたはスレオニン残基が存在する場合、ＧｌｃＮＡｃ修飾されたアミノ酸残基を特定することはできなかった。
　本発明は、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定することができる方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記したタンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法を行うためのキットを提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、断片化されたタンパク質を質量分析する第一の質量分析工程を行い、次に、第一の質量分析工程において糖が結合していることが確認されたタンパク質について、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位のアミノ酸を置換および／または修飾する置換修飾工程、タンパク質を断片化する断片化工程、及び得られたタンパク質を質量分析する第二の質量分析工程を行うことによって、Ｏ型糖鎖で修飾されたウイルスカプシドにおいてＧｌｃＮＡｃの修飾部位を同定できることを見出した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法であって、
断片化されたタンパク質を質量分析する第一の質量分析工程と、
第一の質量分析工程において糖が結合していることが確認されたタンパク質について、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位のアミノ酸を置換および／または修飾する置換修飾工程、およびタンパク質を断片化する断片化工程と、
上記の置換修飾工程及び断片化工程により得られた、置換および／または修飾され、かつ断片化されたタンパク質を質量分析する第二の質量分析工程と、を含む方法。
＜２＞　第一の質量分析工程から得られた質量分析結果と、第二の質量分析工程から得られた質量分析結果とを比較することを含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞　糖が結合したアミノ酸がセリンおよび／又はスレオニンである、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞　置換修飾工程が、β脱離反応により糖が脱離したアミノ酸部位へのマイケル付加反応による置換反応である、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞　置換修飾工程におけるマイケル付加反応が、環状活性メチレン化合物による反応である、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載の方法。
＜６＞　置換修飾工程におけるマイケル付加反応が、ピラゾロン化合物、バルビツール酸化合物、ジメドン化合物、またはヒドロキシクマリン化合物による反応である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の方法。
＜７＞　置換修飾工程におけるマイケル付加反応が、ピラゾロン化合物による反応である、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞　ピラゾロン化合物が３－メチル－１－フェニル－ピラゾロンである、＜７＞に記載の方法。
＜９＞　糖が、Ｎ－アセチルグルコサミンである、＜１＞から＜８＞のいずれか一に記載の方法。
＜１０＞　タンパク質がウイルスカプシドである、＜１＞から＜９＞のいずれか一に記載の方法。
＜１１＞　ウイルスが、アデノ随伴ウイルスである、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞　ウイルスが、ＡＡＶ５と称されるアデノ随伴ウイルス５である、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞　分析に供されるタンパク質の量が１００ｆｍｏｌ以下である、＜１＞から＜１２＞のいずれか一に記載の方法。
＜１４＞　環状活性メチレン化合物を含む、＜１＞から＜１３＞の何れか一に記載の方法を行うためのキット。
＜１５＞　断片化タンパク質を精製する手段をさらに含む、＜１４＞に記載のキット。
　本発明の方法及びキットによれば、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を従来より正確に同定することができる。
図１は、断片化したＡＡＶカプシドから検出したＯ－ＧｌｃＮＡｃ結合ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。 図２は、断片化したＡＡＶカプシドから検出したＯ－ＧｌｃＮＡｃ結合ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。 図３は、ＰＭＰ化かつ断片化したＡＡＶカプシド由来ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。 図４は、ＰＭＰ化かつ断片化したＡＡＶカプシド由来ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。 図５は、無修飾のペプチド標品と内部標準（ＩＳ）についてのプリカーサーイオンの抽出クロマトグラムを示す。 図６は、Ｓ４６９が修飾されたペプチド標品と内部標準（ＩＳ）についてのプリカーサーイオンの抽出クロマトグラムを示す。 図７は、検量線を示す。
　以下において、本発明の内容について詳細に説明する。本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。また、本明細書において、ペプチドとタンパク質は同じ意味を表しており、相互に置き換え可能である。
　ＡＡＶは、アデノ随伴ウイルスを意味する。ＡＡＶ２やＡＡＶ５やＡＡＶ９のようにＡＡＶの直後の数字は、ＡＡＶのセロタイプを表す。
　ＬＣは、液体クロマトグラフィーを意味する。
　ＭＳは、質量スペクトルを意味する。
　ＥＳＩは、エレクトロスプレーイオン化を意味する。
　ＨＣＤは、高エネルギー衝突解離を意味する。
　本発明によるタンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法は、
断片化されたタンパク質を質量分析する第一の質量分析工程と、
第一の質量分析工程において糖が結合していることが確認されたタンパク質について、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位のアミノ酸を置換および／または修飾する置換修飾工程、およびタンパク質を断片化する断片化工程と、
上記の置換修飾工程及び断片化工程により得られた、置換および／または修飾され、かつ断片化されたタンパク質を質量分析する第二の質量分析工程と、を含む。
　第一の質量分析工程においては、糖による修飾を受けたタンパク質を同定することができる。本発明の方法によれば、第一の質量分析工程において糖による修飾を受けていることが判明したアミノ酸残基の範囲の中において、その後の、置換修飾工程、断片化工程および第二の質量分析工程により、標識されたアミノ酸残基（即ち、糖による修飾を受けたアミノ酸残基）を特定するため、糖による修飾部位を高い精度で特定することが可能である。本発明においては、第一の質量分析工程から得られた質量分析結果と、第二の質量分析工程から得られた質量分析結果とを比較することによって、糖による修飾部位を特定することができる。
　本発明において、糖が結合したアミノ酸部位を同定するとは、糖が結合したアミノ酸の位置を決定することである。
　タンパク質としては、糖による修飾を受ける可能性のあるタンパク質であれば特に限定されない。タンパク質は、天然由来のタンパク質、遺伝子組換え法で得られたタンパク質または化学合成タンパク質のいずれでもよい。遺伝子組換え法で得られたタンパク質としては、宿主である細胞において発現させた組み換えタンパク質を挙げることができる。

　宿主である細胞は、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞などを挙げることができるが、特に限定されない。好ましくはヒト細胞を使用することができる。細胞の例としては、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（乳児ハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。好ましくは、細胞はＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞であって、より好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞である。
　タンパク質としては、好ましくは、ウイルスカプシドである。ウイルスカプシドとは、カプシドとも呼ばれ、ウイルスゲノムを取り囲むタンパク質の殻である。
　ウイルスとしては、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルスなどが挙げられるが、特に限定されない。ウイルスは好ましくは、アデノ随伴ウイルスであり、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はAＡＶ１１の何れでもよく、より好ましくはＡＡＶ５、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９であり、さらに好ましくはＡＡＶ５である。
　ＡＡＶは宿主細胞内で産生されるため、宿主細胞由来の酵素によりカプシドが糖修飾を受け、これがＡＡＶの薬効や副作用に影響する可能性があると考えられている。２０２０年１月に公開されたＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）のガイダンスでは、治療用ＡＡＶについて、分子量や大きさだけでなく、糖修飾部位といった特性についても解析することが推奨されている。しかしながら、ＡＡＶの糖修飾についての知見はほとんど存在せず、糖で修飾されているのか否かさえ不明な状況であり、その解析手法も確立されていない。本発明の一実施態様においては、本発明の方法によりＡＡＶのＧｌｃＮＡｃ修飾部位を解析することができる。これにより、本発明の方法は、ＡＡＶの品質評価に用いることができる。
　タンパク質としては、ウイルスカプシド以外のタンパク質でもよく、例えば、抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、バイスペシフィック抗体など）、断片化免疫イムノグロブリン、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などでもよい。断片化免疫イムノグロブリンとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどが挙げられる。抗体のクラスも特に限定されるものではなく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどいずれのクラスでもよいが、医薬として用いる場合はＩｇＧ及びＩｇＭが好ましい。タンパク質を構成するアミノ酸残基としては特に限定されるものではないが、好ましくはセリンまたはスレオニンを含むものがよい。
　本発明において、分析に供されるタンパク質の量は、１０００ｆｍｏｌ以下でもよく、５００ｆｍｏｌ以下、２００ｆｍｏｌ以下、１００ｆｍｏｌ以下でもよい。
　糖としては、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖（２分子～２０分子程度の糖が結合したもの）、又は多糖（多数の単糖が重合したもの）のいずれでもよいが、好ましくは単糖である。単糖とは、糖類のうちそれ以上加水分解できない糖の総称である。単糖の具体例としては、以下に構造を示すＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃと表記する）などが挙げられるが、特に限定されないが、好ましくはＮ－アセチルグルコサミンである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　糖が結合するアミノ酸は、特に限定されないが、例えば、セリン、スレオニン又はアスパラギンであり、好ましくはセリンおよび／又はスレオニンである。
　本発明において、タンパク質（例えば、ウイルスカプシド）における糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）の修飾率は、試料中に含まれるタンパク質分子のうち、修飾を受けているタンパク質の比率を表し、（修飾を受けているタンパク質の分子数）／（試料中に含まれるタンパク質分子数）を意味する。タンパク質における糖の修飾率は、例えば１％未満、好ましくは０．８％以下、０．６％以下、０．５％以下、または０．４％以下でもよい。タンパク質における糖の修飾率の定量は、後記の実施例に記載の通り行うことができる。
　タンパク質の解析においては、タンパク質の量が少ないほど、より感度の高い解析が求められ、また、修飾率が低いほど、より感度の高い解析が求められる。本発明によれば、糖の修飾率が０．０００１％以上１％未満、かつ、１ｆｍｏｌ以上１０００ｆｍｏｌ以下のタンパク質において、糖鎖の結合するアミノ酸部位を同定することができる。さらに糖の修飾率が０．００１％以上０．６％以下、かつ、５ｆｍｏｌ以上５００ｆｍｏｌ以下のタンパク質において、糖鎖の結合するアミノ酸部位を同定することができる。さらには、糖の修飾率が０．００５％以上０．４％以下、かつ、１０ｆｍｏｌ以上１００ｆｍｏｌ以下のタンパク質において、糖鎖の結合するアミノ酸部位を同定することができる。
＜置換修飾工程について＞
　置換修飾工程においては、第一の質量分析工程において糖が結合していることが確認されたタンパク質について、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位のアミノ酸を置換および／または修飾する。
　置換修飾工程は、好ましくは、β脱離反応により糖が脱離したアミノ酸部位へのマイケル付加反応である。本開示において、β脱離反応とマイケル付加反応は同一の工程で行うことができ、このとき、見かけ上、化合物の同一原子上で置換基が置き換わる反応が起きる。
　置換修飾工程におけるマイケル付加反応は、好ましくは、環状活性メチレン化合物による反応であり、より好ましくは、ピラゾロン化合物、バルビツール酸化合物、ジメドン化合物、またはヒドロキシクマリン化合物による反応であり、特に好ましくはピラゾロン化合物による反応である。
　ピラゾロン化合物とは、ピラゾロン基を有した化合物であれば、特に限定されないが、３－メチル－１－フェニル－５ピラゾロン（ＰＭＰ）、１，３－ジメチル－ピラゾロン（ＤＰ）、３－メチル１－ｐ－トリル－５－ピラゾロン（ＭＴＰ）、３－メチル－１－（キノリン－８－イル）－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン等が挙げられる。ピラゾロン化合物は、２種類以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。ピラゾロン化合物は、特に好ましくは、３－メチル－１－フェニル－ピラゾロン（ＰＭＰ）である。
　置換修飾工程でのマイケル付加反応における環状活性メチレン化合物の濃度は、特に限定されないが、反応溶液における濃度としては、一般的には０．０５ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌ～０．５ｍｏｌ／Ｌである。
　環状活性メチレン化合物としては、以下の式（１）で示される化合物を使用することができる。環状活性メチレン化合物は、２種類以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　式（１）において、ＷおよびＸはそれぞれ電子求引性基を含有する置換基を表し、ＷとＸは互いに連結して５員環もしくは６員環を形成する。ＷおよびＸが含有する電子求引性基としては、カルボニル結合やアゾメチン結合を有するものが挙げられる。
　代表的な活性メチレン化合物としては、式（２）で表されるピラゾロン化合物、式（３）で表されるバルビツール酸化合物、式（４）で表されるジメドン化合物、および式（５）で表されるヒドロキシクマリン化合物などが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　式（２）において、Ａｒは１個以上の置換基を有していてもよい芳香環を表す。芳香環としては、ベンゼン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環などが挙げられる。これらの芳香環の置換基としては炭素数１～８のアルキル基、炭素数１～８のアルコキシ基、炭素数１～８のモノアルキルアミノ基、炭素数２～１６のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子およびシアノ基などが挙げられる。Ｒ１は炭素数１～８のアルキル基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式（３）において、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１～８のアルキル基、炭素数３～１６のアルコキシカルボニルアルキル基、炭素数２～９のカルバモイルアルキル基、または置換基を有していてもよい芳香環を表す。芳香環としてはベンゼン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環、ピロール環、ピラゾール環、イミダゾール環、トリアゾール環、テトラゾール環などが挙げられる。これらの芳香環の置換基としては炭素数１～８のアルキル基、炭素数１～８のアルコキシ基、炭素数１～８のモノアルキルアミノ基、炭素数２～１６のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、およびシアノ基などが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式（４）において、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に、炭素数１～４のアルキル基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（５）において、ＹおよびＺはそれぞれ独立に－ＣＨ＝もしくは窒素原子を表す。Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１～８のアルキル基、炭素数１～８のアルコキシ基、炭素数１～８のモノアルキルアミノ基、炭素数２～１６のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子またはシアノ基などを表す。
　式（２）～（５）で示される化合物の具体例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
＜タンパク質を断片化する断片化工程＞
 タンパク質を断片化する断片化工程は、タンパク質分解酵素をタンパク質に作用させることにより行うことができる。前処理としては、タンパク質を還元およびカルバミドメチル化してから、タンパク質の断片化を行ってもよい。タンパク質の還元は、例えば、タンパク質に、ジチオトレイトールなどの還元剤を作用させることにより、タンパク質中のシステイン残基を還元することができる。その後、還元したタンパク質に、ヨードアセトアミドを添加することによりカルバミドメチル化することができる。その後、タンパク質分解酵素をタンパク質に作用させることにより、タンパク質を断片化することができる。タンパク質を断片化する酵素としては、タンパク質を５残基以上１００残基以下の間で切断可能なものが好ましく、６残基以上６０残基以下の間で切断するものがより好ましく、７残基以上４０残基以下の間で切断するものが特に好ましい。タンパク質分解酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、フィシン、ブロメライン、Ｌｙｓ－Ｃ（プロメガ社）、Ａｓｐ－Ｎ（プロメガ社）、Ａｒｇ－Ｃ（プロメガ社）、プロテイナーゼＫ、リシルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ等が挙げられ、好ましくはトリプシンである。好ましい残基数に断片化するために、適宜複数種類の酵素で断片化することも可能である。タンパク質分解酵素の使用量としては、好ましくは、重量比で試料中タンパク質の１／２０～１／１００倍量である。
　本発明においては、置換修飾工程と、タンパク質を断片化する断片化工程の順番は特に限定されない。即ち、置換修飾工程を行ってから、タンパク質を断片化する断片化工程を行ってもよいし、あるいはタンパク質を断片化する断片化工程を行ってから、置換修飾工程を行ってもよい。
＜第一の質量分析工程および第二の質量分析工程＞
　本発明における第一の質量分析工程は、断片化されたタンパク質を質量分析する工程であり、タンパク質が糖による修飾を受けていることを確認し、さらに糖による修飾を受けたアミノ酸残基の範囲を特定するための工程である。
　本発明における第二の質量分析工程は、第一の質量分析工程において糖が結合していることが確認されたタンパク質について、さらに、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位のアミノ酸を置換および／または修飾する置換修飾工程、およびタンパク質を断片化する断片化工程を行うことにより得られたタンパク質を分析する工程である。
　質量分析の方法は特に限定されないが、一例としては、分子をイオン化し、その質量電荷比（m/z）を測定することによってイオンや分子の質量を測定することができる。
［前処理］
  第一の質量分析においては、質量分析に先立って、試料を前処理することが好ましい。
  前処理としては、タンパク質を還元、カルバミドメチル化および断片化することを含むことが好ましい。タンパク質の還元は、例えば、タンパク質に、ジチオトレイトールなどの還元剤を作用させることにより、タンパク質中のシステイン残基を還元することができる。その後、還元したタンパク質に、ヨードアセトアミドを添加することによりカルバミドメチル化することができる。さらに、タンパク質分解酵素をタンパク質に作用させることにより、タンパク質を断片化することができる。タンパク質を断片化する酵素としては、タンパク質を５残基以上１００残基以下の間で切断可能なものが好ましく、６残基以上６０残基以下の間で切断するものがより好ましく、７残基以上４０残基以下の間で切断するものが特に好ましい。タンパク質分解酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、フィシン、ブロメライン、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ａｒｇ－Ｃ、プロテイナーゼＫ、リシルエンドペプチダーゼ、Ｖ８等が挙げられ、好ましくはトリプシンである。好ましい残基数に断片化するために、適宜複数種類の酵素で断片化することも可能である。さらに、所望により、ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢ（ジーエルサイエンス社）などを用いて、断片化されたタンパク質（ペプチド）の脱塩を行ってもよい。
　第二の質量分析においては、本明細書中において上記した通り、タンパク質について、置換修飾工程および断片化工程（置換修飾工程および断片化工程の順番は問わない）を行った後の試料を用いて、質量分析を行うことができる。なお、第二の質量分析に先立って、所望により、ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢ（ジーエルサイエンス社）などを用いて、断片化されたタンパク質（ペプチド）の脱塩を行ってもよい。
［液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析］
  前処理された試料の質量分析は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析計（ＭＳ）を使用して実施することができる。液体クロマトグラフィー装置と質量分析計は、互いに直列に接続されていてもよいし、質量分析計のみであってもよい。例えば、液体クロマトグラフィー装置と質量分析計を直列につないで構成された、ＬＣ－ＭＳシステムを用いることができる。ＬＣ－ＭＳシステムとしては、タンデム型のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳなどを使用することができる。
［液体クロマトグラフィー装置］
　液体クロマトグラフィー（ＬＣ）装置は、糖で修飾されたタンパク質を液体クロマトグラフィーにより分離できる装置であれば特に制限されない。
　液体クロマトグラフィーとしては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速高分離液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、またはＵＦＬＣ）、または低流量ＬＣを用いることができ、試料の量などに応じて適切な装置を選択することができる。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）としては、低流量ＬＣが好ましい。低流量ＬＣとしては、ナノフロー液体クロマトグラフィー（ナノＬＣ）、キャピラリーＬＣ、マイクロＬＣなどが挙げられるが、上記の中でも、ナノＬＣが特に好ましい。
　ＬＣ装置は、一般的には、分離カラム、および分離溶液を分離カラムに送り込むポンプを備えている。ＬＣ装置は、上記以外の要素、例えば、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器等、を備えていてもよい。検出器としては、例えば、ＵＶ検出器や蛍光検出器が挙げられる。例えば、検出器は、カラムとイオン源（イオン化部）の間に接続することができる。
［移動相］
  液体クロマトグラフィーに用いられる分離溶液（移動相）の条件としては、質量分析計に適用可能な溶媒であることを満たすものであれば特に制限されずに使用することが可能である。例えば、水、ギ酸、アセトニトリルなどを使用することができる。
［液体クロマトグラフィー条件］
  液体クロマトグラフィーに用いられる分析カラムの条件としては、特に制限されず、適宜選択することができる。分離カラムとしては、逆相カラムを用いることができる。逆相カラムとしては、例えば、オクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム、これらにイオン交換樹脂を配合したカラムが挙げられるが、特に、シルカゲル担体に，オクタデシルシリル基（ＯＤＳ基，Ｃ１８基）を化学結合した充填剤が詰められた逆相クロマトグラフィーで用いられるカラム（ＯＤＳカラム）が好ましい。分離カラムとしては、例えば、ＭｏｎｏＣａｐ　Ｃ１８　ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　７５０（ジーエルサイエンス社）を使用することができる。
 移動相の濃度のグラジエントは、組成の異なる２種またはそれ以上の溶液を、混合比率を変化させながら混合することで、形成することができる。溶液の組み合わせは、所望のグラジエントが形成されるよう、適宜選択することができる。
　流速は、分離カラムの内径等の諸条件に応じて適宜選択できる。分離溶液の流速は、分離工程を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、１００ｎＬ／ｍｉｎ～１００μＬ／ｍｉｎの範囲で適宜選択することができる。
　液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、２０～７０℃であり、好ましくは２５～５０℃である。
［質量分析装置］
  液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析フラグメントイオン分析法は、液体クロマトグラフィー部と質量分析装置部からなる装置であり、さらに質量分析装置部がプリカーサーイオンを分解検出できる部分を有している。
  質量分析装置部としては、通常の質量分析計が使用できる。質量分析計は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。２つまたはそれ以上の質量分析計は、直列に接続して用いることができる。即ち、ＬＣ－ＭＳシステムは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳやＬＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳでもよい。
  検出方式としては、タンデム型質量分析計は、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型やオービトラップ型、また、それらのハイブリッド型が使用できる。四重極型／オービトラップ型タンデム質量分析計が好ましい。
  質量分析計におけるイオン化法としては、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ：Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、電子イオン化（ＥＩ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、化学イオン化（ＣＩ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、電界脱離（ＦＤ：Ｆｉｅｌｄ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）法、高速原子衝撃（ＦＡＢ：Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ：Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｈｅｉｍｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、）法、または誘導結合プラズマ（ＩＣＰ：Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ）法など挙げられるが、特に、ＥＳＩ法が好ましい。
  四重極型／オービトラップ型タンデム質量分析計は、イオン源、四重極（Ｑ１）、コリジョンセル（Ｑ２）、オービトラップ（Ｑ３）、検出器で構成される質量分析計である。測定対象物は、イオン源でイオン化され、プリカーサーイオンが生成され、その質量電荷比（ｍ／ｚ）によって、四重極（Ｑ１）で質量により分離される。次いで、コリジョンセル（Ｑ２）内で窒素やアルゴン等の不活性ガスと衝突させることでプロダクトイオンが生成される（衝突誘起解離：ＣＩＤ）。プロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）によって、オービトラップ（Ｑ３）で再度、質量により分離され、検出器で検出される。
　本発明の方法においては、第一の質量分析工程において、ペプチドのプリカーサーイオンの質量対電荷比（ｍ／ｚ）と、プロダクトイオンの質量対電荷比のスペクトルから、そのペプチドが糖による修飾を受けていることを明らかにすることができる。糖修飾を受けることが判明したペプチドのアミノ酸残基の範囲の中において、その後の、置換修飾工程、断片化工程および第二の質量分析工程により、ペプチドのプリカーサーイオンの質量対電荷比（ｍ／ｚ）と、プロダクトイオンの質量対電荷比のスペクトルから標識されたアミノ酸残基（即ち、糖による修飾を受けたアミノ酸残基）を特定することができる。
　また、質量分析の結果に基づき、糖鎖の修飾率を定量することができる。糖鎖の修飾率の定量は、例えば以下の通り行うことができる。修飾率は、試料内に存在する測定対象ペプチド（同一アミノ酸配列の無修飾のペプチド及びＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチド）の分子数を定量することで求められる。定量には、測定対象ペプチド及びそれらの安定同位体の標品を用いる。安定同位体は、測定の内部標準（ＩＳ）として使用する。内部標準を添加した既知量のペプチド標品を用いて検量線を取得し、これを用いて試料中の各測定対象ペプチドを定量する。質量分析の結果に基づく定量は、各測定対象ペプチドに対応するプリカーサーイオンの抽出クロマトグラムから得られるピーク面積と、それぞれのＩＳに対応するプリカーサーイオンの抽出クロマトグラムから得られるピーク面積の比から求める。試料中の各測定対象の分子数を定量した後、下記の式に基づいて修飾率を定量できる。
修飾率＝ＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチド量／(無修飾ペプチド量＋ＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチド量)
＜キット＞
 本発明によれば、上記した本発明によるタンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法を行うためのキットであって、環状活性メチレン化合物を含むキットが提供される。環状活性メチレン化合物の具体例、及び好ましい形態は、本明細書中において上記した通りである。
　本発明のキットは、断片化タンパク質を精製する手段をさらに含んでいてもよい。断片化タンパク質を精製する手段としては、例えば、疎水性相互作用（ＯＤＳ基を化学結合した充填剤が詰められた固相）を利用した固相抽出などを挙げることができる。
  本発明のキットは、本発明によるタンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法を実施するための書面によるプロトコルを含んでいてもよい。このプロトコルには、例えば、同定手順や同定に必要な情報が含まれる。
  本発明のキットは、上記した方法に用いる試薬をさらに含んでいてもよい。試薬としては、例えば、タンパク質分解酵素、バッファなどが挙げられる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（１）Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチドの定性
＜前処理＞
　１０μＬの試料（２８５ｆｍｏｌのＡＡＶ）に９０μＬの氷冷エタノールを添加し、－２０℃で１時間以上静置した。１５，０００×ｇで４℃で１０分遠心した後に上清を除去した。ＡＡＶペレットに１００μＬの氷冷エタノールを加えた後、１５，０００×ｇで４℃で５分遠心して上清を除去し、ＡＡＶペレットを風乾することにより、精製および失活を行った。
　ＡＡＶペレットを２０μＬのＭＰＥＸ　ＰＴＳ　ＲｅａｇｅｎｔＢ（ジーエルサイエンス社）に溶解し、終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え室温で３０分静置してタンパク質中のシステイン残基を還元した。その後、終濃度２５ｍｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を加え室温、遮光で３０分静置してカルバミドメチル化した。７７　μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムで５倍希釈後、２μＬの０．０５μｇ／μＬトリプシンを加え、室温で一晩静置し、ＡＡＶペレットのペプチドを断片化した。試料と等量（ｖ／ｖ）の酢酸エチル及び１／１００倍量（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えてボルテックスミキサーで１分混合し、１５，６００×ｇで室温において２分遠心した後に上層を除去した。遠心エバポレーターＣＶＥ－３１００（東京理化機械社）で試料内の酢酸エチルが揮発するまで３０℃で減圧濃縮した。試料に５０μＬの液Ａ［５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸］を加えた。
　ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢ（ジーエルサイエンス社）に２０μＬの液Ｂ［８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸］を入れ、３，０００×ｇで２分の遠心で通液した。２０μＬの液Ａを入れて３，０００×ｇで５分の遠心で通液した後に試料を入れ、３，０００×ｇで５分の遠心で通液してペプチドを上記ＳＤＢに保持させた。２０μＬの液Ａを入れて３，０００×ｇで５分の遠心で通液して洗浄後、４０μＬの液Ｂを入れて３，０００×ｇで２分の遠心でペプチドをＳＤＢから溶出させた。遠心エバポレーターＣＶＥ－３１００を用いて３０℃で乾燥させ、溶解液［２％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸］で２５μＬに調整した。
＜ＮａｎｏＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析、データベース検索＞
　装置は、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００　Ｎａｎｏ及びＱ　Ｅｘａｃｔｉｖｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した。
　トラップカラムは、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ　径０．３×５ｍｍ（粒子径５μｍ）（ＣＥＲＩ）を使用した。
　分離カラムは、ＭｏｎｏＣａｐ　Ｃ１８　ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　７５０（ジーエルサイエンス社）を使用した。
　流速は５００ｎＬ／ｍｉｎで、移動相Ａは０．１％ギ酸（Ｈ２Ｏ中）、移動相Ｂはアセトニトリルを使用した。グラジエント条件は、％Ｂ＝４％（０分）→４５％（８０分）→８０％（８５分）→８０％（９５分）→４％（９６分）→４％（１２０分）とした。カラム温度は３５℃に設定し、注入量は１０μＬとした。
　検出はＥＳＩ－ＭＳ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ）を使用し、キャピラリー電圧は２　ｋＶに設定した。ＭＳスキャン範囲はｍ／ｚ３５０－１８００（分解能７０，０００、ＡＧＣ　３×１０６）とし、各ＭＳスキャンで上位１０個のプリカーサーイオンをＨＣＤで断片化後ＭＳ／ＭＳスキャン（分解能３５，０００、ＡＧＣ　１×１０５）した。標準化コリジョンエネルギーは２５％に設定し、ｄｙｎａｍｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｔｉｍｅは３０秒とした。Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｗｉｄｔｈは２．０ｍ／ｚとした。
　ペプチド定性のスクリーニングのためにデータベース検索を使用した。データベース解析にはＰｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　Ｖｅｒ１．３（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使い、データベース検索エンジンとしてＳｅｑｕｅｓｔ　ＨＴ　（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びＭａｓｃｏｔ（マトリックスサイエンス社）を使用した。許容トリプシン未切断数は２以内、許容プリカーサー質量誤差は１０ｐｐｍ、フラグメント質量誤差は２０ｍｍｕ、固定修飾はカルバミドメチル化（Ｃ）、動的修飾は酸化（Ｏ）、及びＨｅｘＮＡｃ（Ｓ及びＴ）に設定した。データベースとして、ＡＡＶ９（Ｑ６ＪＣ４０）（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ６ＪＣ４０）を使用した。偽同定率はｄｅｃｏｙデータベース（データベースの逆アミノ酸配列）に基づき計算し、ペプチドレベルで１％未満に設定した。検索でヒットした各ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルをマニュアルでチェックし、フラグメントイオンの理論値との質量誤差が１０ｐｐｍ以内のものを定性の根拠として採用した。検索でヒットした糖ペプチド候補のうち、そのＭＳ／ＭＳスペクトル中に糖由来のイオン群（ｍ／ｚ　２０４と他２種以上のフラグメントイオン）が見られたものを糖ペプチドと判断した。
＜結果＞
　ＡＡＶから検出したＯ－ＧｌｃＮＡｃ結合ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを図１及び図２に示す。
　図１に示すＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲは、ＡＡＶのアミノ酸位置４６３－４７６のアミノ酸配列を示す。
　図２に示すＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲは、ＡＡＶのアミノ酸位置４８９－５１４のアミノ酸配列を示す。
　図１の結果から、ＡＡＶ９のアミノ酸位置４６３－４７６に１つのＯ－ＧｌｃＮＡｃが結合することが分かった。図２の結果から、ＡＡＶ９のアミノ酸位置４８９－５１４に１つのＯ－ＧｌｃＮＡｃが結合することが分かった。
　図１および図２のそれぞれの左上の図において、〇で示すピークは、ＧｌｃＮＡｃ由来のオキソニウムイオンを示す。
　図１および図２におけるｙイオンシリーズ（図１のｙ３～Ｙ１１、図２のｙ２～ｙ１７及びｙ１９）は、ＧｌｃＮＡｃが外れたペプチドに由来するピークを示す、
　図１及び図２に示すようにＯ－ＧｌｃＮＡｃ結合ペプチドを直接検出した場合には、断片化の際にＧｌｃＮＡｃが外れてしまうため、ＭＳ／ＭＳスペクトル上にＧｌｃＮＡｃの結合部位情報が残らない。そのため、ペプチド中に複数のＳｅｒまたはＴｈｒ残基が存在する場合、ＧｌｃＮＡｃの部位を一意に特定することはできない。そこで、ペプチドに結合したＧｌｃＮＡｃを断片化に対して安定な置換基に置換し、ＭＳ／ＭＳスペクトル上に結合部位情報を残す方法を行った。
（２）Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチドの修飾部位推定
＜前処理＞
　氷冷エタノールを用いて、上記の（１）と同様にしてＡＡＶの精製および失活を行い、ＡＡＶペレットを風乾した。風乾したＡＡＶペレットに１０μＬの水、２０μＬの０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、及び２０μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌの１－フェニル－３－メチル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）を添加し、８５℃で１６時間静置した。（このとき、糖ペプチドからの糖のβ脱離及びペプチドへのＰＭＰのマイケル付加が起きている。）これに４５０μＬの氷冷エタノールを添加し、－２０℃で１時間以上静置した。１５，０００×ｇで４℃で１０分遠心した後に上清を除去した。ＡＡＶペレットを５００μＬ氷冷エタノールで２回洗浄した。洗浄時の遠心は１５，０００×ｇで４℃で５分行った。風乾したＡＡＶペレットを２０μＬのＭＰＥＸ　ＰＴＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｂに溶解し、上記の（１）と同様にＤＴＴによる還元、ＩＡＡによるアルキル化、トリプシン消化による断片化（断片化工程）を行った。ペプチドの脱塩も上記の（１）と同様にＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢを用いて行った。
＜ＮａｎｏＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析、データベース検索＞
　特別に記載のない限り、上記の（１）と同様の条件で行った。ＭＳ条件は上記の（１）と同様の条件で行った。データベース検索の動的修飾は酸化（Ｏ）、脱アミド化（Ｎ）、及びＰＭＰ化（Ｓ及びＴ、質量変化＋１５６．０６８７５）に設定した。検索でヒットした各ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルをマニュアルでチェックし、フラグメントイオンの理論値との質量誤差が１０ｐｐｍ以内のものを定性の根拠として採用した。ＰＭＰ化とは、アミノ酸残基にＰＭＰを修飾することである。
＜結果＞
　ＰＭＰ化されたＡＡＶ由来ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを図３及び図４に示す。
　図３に示した通り、ペプチドのｙ８ ＋イオンとｙ７ ＋イオンの質量対電荷比の差が、ＰＭＰが付加したセリンの質量に精密に一致することから、ペプチドのカルボキシ末端から８番目のセリン（ＡＡＶ９のＳ４６９）がＰＭＰ化されたことが分かった。図４に示した通り、ペプチドのｙ８ ＋イオンとｙ７ ＋イオンの質量対電荷比の差が、ＰＭＰが付加したセリンの質量に精密に一致することから、ペプチドのカルボキシ末端から８番目のセリン（ＡＡＶ９のＳ５０７）がＰＭＰ化されたことが分かった。即ち、ＡＡＶ９のＳ４６９およびＳ５０７にＯ－ＧｌｃＮＡｃが結合していたことが検出できた。
（３）定量
＜前処理＞
　１０μＬの試料（２８５ｆｍｏｌのＡＡＶ）に９０μＬの氷冷エタノールを添加し、－２０℃で１時間以上静置した。１５，０００×ｇで４℃で１０分遠心した後に上清を除去した。ＡＡＶペレットに１００μＬ氷冷エタノールを加えた後、１５，０００×ｇで４℃で５分遠心して上清を除去し、ＡＡＶペレットを風乾した。ＡＡＶペレットに１７μＬのＭＰＥＸ　ＰＴＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｂと、３μＬの測定対象の安定同位体で標識したペプチド溶液（１０ｐｐｍ［１３Ｃ５，１５Ｎ５］ＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲ、１０ｐｐｂ［１３Ｃ５，１５Ｎ５］ＦＳＶＡＧＰ（ＧｌｃＮＡｃ－Ｓ）ＮＭＡＶＱＧＲ）を添加し、上記の（１）と同様に還元、アルキル化、トリプシン消化を行った。ペプチドの脱塩も上記の（１）と同様に行った。
＜ＮａｎｏＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析、解析＞
　上記の（１）及び（２）と同様の条件で行った。
　ペプチド定量に用いたイオン抽出条件は以下のとおりである。
ＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲ（ｍ／ｚ　７１０．８５５９）
ＦＳＶＡＧＰ（ＧｌｃＮＡｃ－Ｓ）ＮＭＡＶＱＧＲ（ｍ／ｚ　７１５．８５７８）
［１３Ｃ５，１５Ｎ５］ＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲ（ｍ／ｚ　８１２．３９５９）
［１３Ｃ５，１５Ｎ５］ＦＳＶＡＧＰ（ＧｌｃＮＡｃ－Ｓ）ＮＭＡＶＱＧＲ（ｍ／ｚ　８１７．３９７６）
＜結果＞
　無修飾のペプチド標品と内部標準（ＩＳ）についてのプリカーサーイオンの抽出クロマトグラムを図５に示す。Ｓ４６９が修飾されたペプチド標品と内部標準（ＩＳ）についてのプリカーサーイオンの抽出クロマトグラムを図６に示す。各ペプチドに対応するプリカーサーイオンの抽出クロマトグラムから各ペプチドのピーク面積を算出した。各ペプチドの定量は、測定対象ペプチド（無修飾及びＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチド）とそれらに対応するＩＳのピーク面積比で定量した。検量線の作成にはＩＳを添加した各ペプチド標準品を用いた。得られた検量線を図７に示す。
修飾率＝ＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチド分子数／(無修飾ペプチド分子数＋ＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチド分子数)
に基づいて、修飾率をモルで計算した。修飾率は０．４％であった。

Claims (15)

  1. タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法であって、
    断片化されたタンパク質を質量分析する第一の質量分析工程と、
    第一の質量分析工程において糖が結合していることが確認されたタンパク質について、タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位のアミノ酸を置換および／または修飾する置換修飾工程、およびタンパク質を断片化する断片化工程と、
    前記の置換修飾工程及び断片化工程により得られた、置換および／または修飾され、かつ断片化されたタンパク質を質量分析する第二の質量分析工程と、を含む方法。
  2. 第一の質量分析工程から得られた質量分析結果と、第二の質量分析工程から得られた質量分析結果とを比較することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 糖が結合したアミノ酸がセリンおよび／又はスレオニンである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 置換修飾工程が、β脱離反応により糖が脱離したアミノ酸部位へのマイケル付加反応による置換反応である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 置換修飾工程におけるマイケル付加反応が、環状活性メチレン化合物による反応である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 置換修飾工程におけるマイケル付加反応が、ピラゾロン化合物、バルビツール酸化合物、ジメドン化合物、またはヒドロキシクマリン化合物による反応である、請求項１から５のいずかれ一項に記載の方法。
  7. 置換修飾工程におけるマイケル付加反応が、ピラゾロン化合物による反応である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ピラゾロン化合物が３－メチル－１－フェニル－ピラゾロンである、請求項７に記載の方法。
  9. 糖が、Ｎ－アセチルグルコサミンである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. タンパク質がウイルスカプシドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ウイルスが、アデノ随伴ウイルスである、請求項１０に記載の方法。
  12. ウイルスが、ＡＡＶ５と称されるアデノ随伴ウイルス５である、請求項１１に記載の方法。
  13. 分析に供されるタンパク質の量が１００ｆｍｏｌ以下である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 環状活性メチレン化合物を含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法を行うためのキット。
  15. 断片化タンパク質を精製する手段をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
PCT/JP2023/000038 2022-01-06 2023-01-05 タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法、及びキット WO2023132338A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-001248 2022-01-06
JP2022001248 2022-01-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023132338A1 true WO2023132338A1 (ja) 2023-07-13

Family

ID=87073749

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/000038 WO2023132338A1 (ja) 2022-01-06 2023-01-05 タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法、及びキット

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023132338A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019052995A (ja) * 2017-09-19 2019-04-04 住友ベークライト株式会社 糖タンパク質における糖鎖の結合領域の同定方法およびキット
JP2019533803A (ja) * 2016-08-15 2019-11-21 ジェンザイム・コーポレーション Ａａｖを検出するための方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019533803A (ja) * 2016-08-15 2019-11-21 ジェンザイム・コーポレーション Ａａｖを検出するための方法
JP2019052995A (ja) * 2017-09-19 2019-04-04 住友ベークライト株式会社 糖タンパク質における糖鎖の結合領域の同定方法およびキット

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUN-ICHI FURUKAWA, NAOKI FUJITANI, KAYO ARAKI, YASUHIRO TAKEGAWA, KOTA KODAMA, YASURO SHINOHARA: "A Versatile Method for Analysis of Serine/Threonine Posttranslational Modifications by B-Elimination in the Presence of Pyrazolone Analogues", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 83, no. 23, 1 December 2011 (2011-12-01), pages 9060 - 9067, XP055134989, ISSN: 00032700, DOI: 10.1021/ac2019848 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Belov et al. Complementary middle‐down and intact monoclonal antibody proteoform characterization by capillary zone electrophoresis–mass spectrometry
Mills et al. Detecting monoclonal immunoglobulins in human serum using mass spectrometry
Lermyte et al. Electron transfer dissociation provides higher‐order structural information of native and partially unfolded protein complexes
Resemann et al. Full validation of therapeutic antibody sequences by middle-up mass measurements and middle-down protein sequencing
Zhang et al. Effects of common surfactants on protein digestion and matrix‐assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of the digested peptides using two‐layer sample preparation
Wu et al. A strategy for liquid chromatography/tandem mass spectrometry based quantitation of pegylated protein drugs in plasma using plasma protein precipitation with water‐miscible organic solvents and subsequent trypsin digestion to generate surrogate peptides for detection
Cristoni et al. Development of new methodologies for the mass spectrometry study of bioorganic macromolecules
Olivova et al. Determination of N‐glycosylation sites and site heterogeneity in a monoclonal antibody by electrospray quadrupole ion‐mobility time‐of‐flight mass spectrometry
Giménez et al. Capillary electrophoresis time‐of‐flight mass spectrometry for a confident elucidation of a glycopeptide map of recombinant human erythropoietin
Wang et al. Effect of mobile phase pH, aqueous‐organic ratio, and buffer concentration on electrospray ionization tandem mass spectrometric fragmentation patterns: implications in liquid chromatography/tandem mass spectrometric bioanalysis
WO2014121031A1 (en) Characterization of antibody mixtures by mass spectrometry
Mollah et al. Targeted mass spectrometric strategy for global mapping of ubiquitination on proteins
Stavenhagen et al. Site-specific N-and O-glycosylation analysis of atacicept
JP2023512521A (ja) 天然液体クロマトグラフィ質量分析のためのプラットフォーム
Yim et al. Quantification of recombinant human erythropoietin by amino acid analysis using isotope dilution liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Kuzyk et al. CE-MS for proteomics and intact protein analysis
Couto et al. Application of the broadband collision‐induced dissociation (bbCID) mass spectrometry approach for protein glycosylation and phosphorylation analysis
Song et al. Quantitative analysis of therapeutic proteins in biological fluids: recent advancement in analytical techniques
WO2023132338A1 (ja) タンパク質における糖が結合したアミノ酸部位を同定する方法、及びキット
Sandoval Matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass analysis of peptides
Sakaguchi et al. Quantification of peptides using N‐terminal isotope coding and C‐terminal derivatization for sensitive analysis by micro liquid chromatography‐tandem mass spectrometry
Zarei et al. A novel protocol for in‐depth analysis of recombinant adeno‐associated virus capsid proteins using UHPLC–MS/MS
Faria et al. Internal standards for absolute quantification of large molecules (proteins) from biological matrices by LC-MS/MS
Henzel et al. Matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass analysis of peptides
Chalk Mass spectrometric analysis of proteins

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23737289

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1