JP2022064980A - Aavを検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる2016年8月15日出願の米国仮出願第62/375,314号の優先権の利益を主張する。
ASCIIテキストファイルによる以下の提出の内容は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる:配列表のコンピュータ読取り可能な形式(CRF)(ファイル名:159792014140SEQLIST.txt、記録日:2017年8月14日、サイズ:51KB)。
するウイルスベクターを含む。
イルス属(Tetraparvovirus)、アルファレトロウイルス属(Alpharetrovirus)、ベータレトロウイルス属(Betaretrovirus)、デルタレトロウイルス属(Deltaretrovirus)、イプシロンレトロウイルス属(Epsilonretrovirus)、ガンマレトロウイルス属(Gammaretrovirus)、レンチウイルス属(Lentivirus)、スプマウイルス属(Spumavirus)、アルファバキュロウイルス属(Alphabaculovirus)、ベータバキュロウイルス属(Betabaculovirus)、デルタバキュロウイルス属(Deltabaculovirus)、ガンマバキュロウイルス属(Gammabaculovirus)、イルトウイルス属(Iltovirus)、マルディウイルス属(Mardivirus)、シンプレックスウイルス属(Simplexvirus)、バリセロウイルス属(Varicellovirus)、サイトメガロウイルス属(Cytomegalovirus)、ムロメガロウイルス属(Muromegalovirus)、プロボシウイルス属(Proboscivirus)、ロゼオロウイルス属(Roseolovirus)、リンホクリプトウイルス属(Lymphocryptovirus)、マカウイルス属(Macavirus)、ペルカウイルス属(Percavirus)、およびラジノウイルス属(Rhadinovirus)からなる群から選択されるウイルス属に属する。
から約30%まで、および約40分間で約30%から約38%まで増加する。一部の実施形態では、液体クロマトグラフィーは、超高速液体クロマトグラフィー(ultra-performance liquid chromatography)(UPLC)である。
E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、ヤギAAVカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、ウシAAVカプシド、またはマウスAAVカプシド、rAAV2/HBoV1(キメラAAV/ヒトボカウイルスウイルス1)を含む。一部の実施形態では、AAVカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を含む。一部の実施形態では、VP1、VP2およびVP3の質量が、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV4カプシド、AAV5カプシド、AAV6カプシド、AAV7カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8カプシド、AAV9カプシド、AAV10カプシド、AAVrh10カプシド、AAV11カプシド、AAV12カプシド、AAV LK03カプシド、AAV2R471Aカプシド、AAV2/2-7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、ヤギAAVカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、ウシAAVカプシド、またはマウスAAVカプシド、rAAV2/HBoV1(キメラAAV/ヒトボカウイルスウイルス1)、AAV2HBKOカプシド、AAVPHP.BカプシドまたはAAVPHP.eBカプシドのうちの1つまたはそれ以上の理論的質量に対して比較される。
ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む。一部の実施形態では、AAV粒子は異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む。
AAV血清型の指標である、方法を提供する。一部の実施形態では、VP1、VP2および/またはVP3の断片の計算された質量が、1つまたはそれ以上のAAV血清型のVP1、VP2および/またはVP3の断片の理論的質量に対して比較される。
プシド、AAVrh10カプシド、AAV11カプシド、AAV12カプシド、AAV LK03カプシド、AAV2R471Aカプシド、AAV2/2-7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2
E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、ヤギAAVカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、ウシAAVカプシド、またはマウスAAVカプシド、rAAV2/HBoV1(キメラAAV/ヒトボカウイルスウイルス1)を含む。一部の実施形態では、AAVカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を含む。一部の実施形態では、VP1、VP2およびVP3の質量が、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV4カプシド、AAV5カプシド、AAV6カプシド、AAV7カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8カプシド、AAV9カプシド、AAV10カプシド、AAVrh10カプシド、AAV11カプシド、AAV12カプシド、AAV LK03カプシド、AAV2R471Aカプシド、AAV2/2-7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、ヤギAAVカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、ウシAAVカプシド、またはマウスAAVカプシド、rAAV2/HBoV1(キメラAAV/ヒトボカウイルスウイルス1)のうちの1つまたはそれ以上の理論的質量に対して比較される。
ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む。一部の実施形態では、AAV粒子は異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む。
たはヘパリン結合突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、rAAV粒子は、rAAVベクターを含む。一部の実施形態では、rAAVベクターは、1つまたはそれ以上のAAV ITRを含む。一部の実施形態では、rAAVベクターは、AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む。一部の実施形態では、AAVカプシドおよびAAV ITRは、同じ血清型に由来する。一部の実施形態では、AAVカプシドおよびAAV ITRは、異なる血清型に由来する。一部の実施形態では、AAV粒子は、1つまたはそれ以上のAAV ITRに隣接した異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む。
チル化をもたらす。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、VP1またはVP3である。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質のアミノ酸残基2は、Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp,Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、ProまたはTyrで置換されている。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質のアミノ酸残基2は、Ser、AspまたはGluで置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、AAVカプシドのより少ない脱アミド化をもたらす。
B血清型カプシドを含む。一部の実施形態では、AAVカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、rAAV粒子は、rAAVベクターを含む。一部の実施形態では、rAAVベクターは、1つまたはそれ以上のAAV ITRを含む。一部の実施形態では、rAAVベクターは、AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む。一部の実施形態では、AAVカプシドおよびAAV ITRは、同じ血清型に由来する。一部の実施形態では、AAVカプシドおよびAAV ITRは、異なる血清型に由来する。一部の実施形態では、AAV粒子は、1つまたはそれ以上のAAV ITRに隣接した異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む。
換は、VP1のN57、VP3のN382、VP3のN511、またはVP3のN715におけるAspの置換を含み;親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、より高い頻度の脱アミド化をもたらす。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、N57KまたはN57Q置換を含み、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、VP1のA35におけるAspの置換を含み、親AAV粒子のVP1の脱アミド化と比較して、より高い頻度の脱アミド化をもたらす。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、VP1のG58、VP3のG383、VP3のG512、またはVP3のG716にあり、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。一部の実施形態では、VP1のG58はAspで置換されている。一部の実施形態では、rAAV粒子は、AAV1粒子またはAAV2粒子である。
VP1のG58、VP3のN382、VP3のG383、VP3のN511、VP3のG512、VP3のN715、またはVP3のG716にあり;アミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する。一部の実施形態では、VP1の35位における親Ala残基は、Asnで置換されている。一部の実施形態では、VP1の58位における親Gly残基は、Aspで置換されている。一部の実施形態では、rAAV粒子は、AAV1粒子またはAAV2粒子である。
LK03、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAV、マウスAAV、またはrAAV2/HBoV1血清型カプシドを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、AAVカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む。一部の実施形態では、rAAV粒子は、rAAVベクターを含む。一部の実施形態では、rAAVベクターは、1つまたはそれ以上のAAV ITRを含む。一部の実施形態では、rAAVベクターは、AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む。一部の実施形態では、AAVカプシドおよびAAV ITRは、同じ血清型に由来する。一部の実施形態では、AAVカプシドおよびAAV ITRは、異なる血清型に由来する。一部の実施形態では、AAV粒子は、1つまたはそれ以上のAAV ITRに隣接した異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む。
ー機能をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、AAVヘルパー機能は、AAVヘルパー機能を提供するAAVヘルパーウイルスにAAV産生細胞を感染させることにより提供される。一部の実施形態では、AAVヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである。一部の実施形態では、AAV cap機能は、VP1および/またはVP3のアミノ酸置換を提供し、アミノ酸置換は、親AAV粒子と比較して、カプシドの脱アミド化を調節する。
3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較して、N末端アセチル化を変更する、組換えAAV粒子を提供する。
本明細書において記載されまたは参照される技術および手順は、一般に、当業者によりよく理解され、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(Sambrookら、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y., 2012);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M. Ausubelら編、2003);Methods in Enzymologyシリーズ(Academic Press, Inc.);「PCR 2: A Practical Approach」(M.J. MacPherson、B.D. HamesおよびG.R. Taylor編、1995);「Antibodies, A Laboratory Manual」(HarlowおよびLane編、1988);「Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R.I. Freshney,第6版、J.
Wiley and Sons、2010);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J. Gait編、1984);「Methods in Molecular Biology」、Humana Press;「Cell Biology: A Laboratory Notebook」(J.E. Cellis編、Academic Press、1998);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. MatherおよびP.E. Roberts、Plenum Press、1998);「Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures」(A. Doyle、J.B. GriffithsおよびD.G. Newell編、J. Wiley and Sons、1993~8頁);「Handbook of Experimental Immunology」(D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編、1996);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M. MillerおよびM.P. Calos編、1987);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994);「Current Protocols
in Immunology」(J.E. Coliganら編、1991);「Short Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら編、J. Wiley and Sons、2002);「Immunobiology」(C.A. Janewayら、2004);「Antibodies」(P. Finch、1997);「Antibodies: A Practical Approach」(D. Catty編、IRL Press、1988~1989頁);「Monoclonal Antibodies: A Practical Approach」(P. ShepherdおよびC. Dean編、Oxford University Press、2000);「Using Antibodies: A
Laboratory Manual」(E. HarlowおよびD. Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);「The Antibodies」(M. ZanettiおよびJ.D. Capra編、Harwood Academic Publishers、1995);および「Cancer: Principles and Practice of Oncology」(V.T. DeVitaら編、J.B. Lippincott Company、2011)に記載の広く利用される方法論のような慣用の方法論を使用して、一般的に採用される。
本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、in vitroまたはin vivoのいずれかで宿主細胞中へ送達されるべき核酸を含む、組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
ているもの)に感染し、AAV repおよびcap遺伝子産物(すなわち、AAV RepおよびCapタンパク質)を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。rAAVベクターがより大きなポリヌクレオチド中(例えば、染色体中またはクローニングもしくはトランスフェクションのために使用されるプラスミドのような別のベクター中)に組み込まれる場合、rAAVベクターは、AAVパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下での複製およびカプシド形成により「レスキュー」されることのできる「プロベクター」と呼ばれる。rAAVベクターは、それに限定されないが、脂質と複合化され、リポソーム内に密封され、実施形態では、ウイルス粒子、特に、AAV粒子中でカプシド形成されたプラスミド、線状の人工染色体を含む、多数の形態のいずれかであることができる。rAAVベクターは、AAVウイルスカプシド中にパッケージングされて、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子(rAAV粒子)」を生成することができる。
導く。別の態様では、これは、siRNAのようなRNA干渉を仲介する分子に転写される。
Ther.、6:272~278頁に記載されたような手順により測定される。
unit)(tu)」は、本明細書中の実施例、または例えば、Xiaoら、(1997)Exp. Neurobiol.、144:113~124頁;もしくはFisherら、(1996)J. Virol.、70:520~532頁(LFUアッセイ)に記載されたような機能アッセイにおいて測定された機能的導入遺伝子産物の産生をもたらす感染性の組換えAAVベクター粒子の数を指す。
細胞により複製され、パッケージングされることを可能とするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアのようなポックスウイルス、およびバキュロウイルスを含むそのようなヘルパーウイルスが多数同定されている。アデノウイルスは、多くの異なる亜群を包含するが、C亜群の5型アデノウイルス(Ad5)が最も一般に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ATCCのような寄託機関からも入手可能である。ATCCのような寄託機関からも入手可能なヘルペス科のウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)および偽性狂犬病ウイルス(PRV)を含む。寄託機関から入手可能なバキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルスを含む。
本開示のある態様は、ウイルス粒子の血清型を決定する方法に関する。本開示の他の態様は、ウイルス粒子の不均一性を決定する方法に関する。下に記載されるように、各AAV血清型のVP1、VP2およびVP3の正確な質量は固有であり、AAVカプシド血清型を同定または区別するために使用することができる。これらの方法は、変性後の異なる型のAAVの直接LC/MSを、完全なタンパク質レベルにおける正確な質量測定で、タンパク質配列および翻訳後修飾をモニターするために使用することができるという本明細書に記載されている発見に一部は基づく。さらに、VP1およびVP3のN末端のアセチル化も、異なるAAV血清型で同定および/またはモニターすることができる。これらのAAV結果および本明細書で提供される指針に基づいて、そのような方法は、プロファイルの種々のウイルスの、例えば、本開示の科、亜科、および属のウイルスの特徴を分析するために容易に適用することができると考えられる。本開示の方法は、例えば、VPの発現、翻訳後修飾、および先端切断をモニターするため、ならびにVLP産生時における生成物の一貫性を確実にするため、ならびに部位特異的突然変異生成もしくはカプシドタンパク質の操作の適用のための構造の特徴付けを確認するため、ならびに/またはウイルス粒子または調製の不均一性をモニターもしくは検出するためのVPのプロファイルにおける使用を見出すことができる。
ィー/質量分析(LC/MS)に供することを含む。当技術分野で公知であるように、LC/MSは、イオンを物理的に分離するために液体クロマトグラフィーを、およびイオンからの質量スペクトルのデータを発生させるために質量分析を利用する。そのような質量スペクトルのデータは、例えば、分子量または構造、質量による粒子の同定、量、純度等々を決定するために使用することができる。これらのデータは、経時的なシグナル強度(例えば、存在量)(例えば、保持時間)、または質量対電荷の比に関する相対存在量などの検出されたイオンの性質を表すこともできる。
それ以上の公知の質量を有する化合物(例えば標準)の導入を含む。一部の実施形態では、支援付き校正とは、公知の標準(例えば、校正物質)のピークおよび/または位置を、特定の質量対電荷(m/z)比と関係づけるソフトウェアの使用を指す。一旦校正されたら、次に、使用者は、1種またはそれ以上の未知の化合物、または未知の濃度で存在する化合物を含む試料について、例えば、以前のまたは公知の実験条件と比較して、ある程度の正確度もしくは誤差および/または所望のレベルの再現性内で、質量分析を実行することができる。ヨウ化ナトリウム、ヨウ化ナトリウムセシウム、ポリエチレングリコール、およびペルフルオロトリブチルアミンを含むが、これらに限定されない種々の校正物質が、当技術分野で公知である。ある実施形態では、ヨウ化ナトリウムが校正物質として使用される。一部の実施形態では、校正物質は、LC/MS操作時に質量を固定するグル-1-フィブリノペプチドBおよびロイシンエンケファリンペプチドである。
である(「逆相液体クロマトグラフィー(reversed phase liquid chromatography)」またはRPLCという用語は、本明細書では逆相液体クロマトグラフィー(reverse phase liquid chromatography)と互換的に使用される)。当技術分野で公知であるように、逆
相液体クロマトグラフィーは、極性の移動相中の疎水性分子を吸着する疎水性固定相(例えば、カラムなどの支持体または基材)を使用するクロマトグラフィーの分離を指すこともある。移動相の極性を低下させることにより(例えば、有機溶媒を添加することにより)、疎水性による分子のグラジエント分離を達成することができて、それは、より疎水性の分子は、カラムとのより強い疎水性相互作用に基づいて、より高い濃度の有機溶媒でカラムにとどまるからである。一部の実施形態では、分離は、キャピラリー電気泳動(CE)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、カチオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィー(IEC)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、親水性相互作用液体クロマトグラフィー(HILIC)によるが、オンラインLC/MSに限定されず、MS前にオフライン分離;例えば、チップ、カラム;プレートまたはカートリッジなどによる。
約2%から約60%に増大する。他の実施形態では、移動相Bは、約2%から約100%に約1分から約200分で増大する。一部の実施形態では、移動相の残余は、本開示の第2の移動相、例えば、移動相Aである。ある実施形態では、移動相Bは、約10%から約20%に約6分で、約20%から約30%に約10分で、および約30%から約38%に約40分で増大する。他の実施形態では、移動相Bは、約2%から約60%に約121分で増大する。当業者は、対象の移動相および使用されるグラジエントのタイミングを、所望のクロマトグラフィーの分離および/または対象分析物に基づいて適当に調節することができる。
は、質量分析のSレンズのRFレベルは約55%である。ある実施形態では、質量分析のSレンズのRFレベルは約20%から約100%である。
の偏差(例えば、理論的な、予測される、または期待される質量などの参照質量からの)が、AAVカプシドの不均一性を示す。一部の実施形態では、不均一性は、以下の:混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、末端が切断されたカプシド、または改変されたカプシドの1種またはそれ以上を含むが、これらに限定されない。
X)から数えて2番目の位置にあるアミノ酸は、N末端(Nt-)アセチル化に対するその効果、ならびにAAV粒子のトラフィッキング、形質導入、および/または翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、ユビキチン化等々)に対して影響するNt-アセチル化の機能的意義を決定するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質(例えば、VP1またはVP3)のN末端は、場合によっては、例えば、Met-アミノペプチダーゼによって除去されることもあるメチオニンから数えて最初のアミノ酸を指すこともある。
量分析、同位体標識(例えば、同位体で標識されたアセチル基またはそれらの前駆体で)、アセチル化特異的抗体を用いるウェスタンブロット法等々を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質(例えば、VP1またはVP3)のアミノ酸残基2が、Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp、Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、ProまたはTyrで置換される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、AAVカプシドのより少ない脱アミド化を生ずる。
親AAVカプシドタンパク質より低い程度でN-アセチル化されて、親AAVカプシドタンパク質より高い程度で脱アミド化されることもあり、AAVカプシドタンパク質が、親AAVカプシドタンパク質より低い程度でN-アセチル化されて、親AAVカプシドタンパク質と同じ程度で脱アミド化されることもあり、またはAAVカプシドタンパク質が、親AAVカプシドタンパク質より低い程度でN-アセチル化されて、親AAVカプシドタンパク質より低い程度で脱アミド化されることもある。
ある態様で、本発明は、任意の本明細書に記載されている方法で使用するために適当なウイルス粒子に関し、該ウイルス粒子はAAVベクター(例えば、rAAVベクター)または別のウイルスに由来するベクターを含むこともある。一部の実施形態では、該ウイルス粒子は異種核酸、例えば、異種導入遺伝子をコードするベクターを含む。一部の実施形態では、AAV粒子は、異種核酸、例えば、異種導入遺伝子をコードするAAVベクターゲノムを含む。
ADC)。例えば、パーキンソン病の処置に有用な導入遺伝子は、ドーパミンの合成において律速酵素であるTHをコードする。TII補助因子のテトラヒドロビオプテリンを発生するGTPCIIをコードする導入遺伝子も、パーキンソン病の処置に使用することができる。L-DopaのDAへの転換を助長するGDNFまたはBDNF、またはAADCをコードする導入遺伝子も、パーキンソン病の処置のために使用することができる。ALSの処置のために有用な導入遺伝子は、GDNF、BDNFまたはCNTFをコードすることができる。ALSの処置のためにも、有用な導入遺伝子は、機能的RNA、例えば、SOD1の発現を阻害するshRNA、miRNAをコードすることができる。虚血の処置のために有用な導入遺伝子は、NAIPまたはNGFをコードすることができる。ベータ-グルクロニダーゼ(GUS)をコードする導入遺伝子は、ある種のリソソーム貯蔵疾患(例えば、VII型ムコ多糖症タイプ(MPS VII))の処置のために有用である。プロドラッグ活性化遺伝子をコードする導入遺伝子、例えば、ガンシクロビルを、DNA合成を撹乱して細胞死を生じさせる毒性ヌクレオチドに変換するHSV-チミジンキナーゼは、例えばプロドラッグとの組合せで投与すると、ある種の癌を処置するために役立つことがある。β-エンドルフィンなどの内因性オピオイドをコードする導入遺伝子は、疼痛を処置するために有用である場合がある。酸化防止剤の例は、SOD1;SOD2;カタラーゼ;サーチュイン1、3、4、または5;NRF2;PGC1a;GCL(触媒的サブユニット);GCL(変更子サブユニット);アジポネクチン;グルタチオンペルオキシダーゼ1;およびニューログロビンを含むが、これらに限定されない。抗血管形成ポリペプチドの例は、アンジオスタチン、エンドスタチン、PEDF、可溶性VEGF受容体、および可溶性PDGF受容体を含むが、これらに限定されない。抗炎症性ポリペプチドの例は、IL-10、可溶性IL17R、可溶性TNF-R、TNF-R-Ig、IL-1阻害剤、およびIL18阻害剤を含むが、これらに限定されない。本発明のrAAVベクターで使用することができる導入遺伝子の他の例は、当業者には明らかであろう(例えば、Costantini L Cら、Gene Therapy(2000)7、93~109頁を参照されたい)。
es(Basel)4:435~456頁に記載されている任意の遺伝子)、ハンチントン病(突然変異体HTT)、癲癇(例えば、SCN1A、NMDAR、ADK、および/またはBoison、D.(2010) Epilepsia 51:1659~1668頁に記載されている任意の遺伝子)、パーキンソン病(アルファ-シヌクレイン)、ルー・ゲーリック病(筋萎縮性側索硬化症としても公知である;SOD1)、アルツハイマー病(タウ、アミロイド前駆体タンパク質)、大脳皮質基底核変性症またはCBD(タウ)、大脳皮質基底核神経節変性またはCBGD(タウ)、前頭側頭型認知症またはFTD(タウ)、進行性核上麻痺またはPSP(タウ)、多系統萎縮症またはMSA(アルファ-シヌクレイン)、脳癌(例えば、脳癌に関与する突然変異体または過発現した発癌遺伝子)、およびリソソーム貯蔵疾患(LSD)を含む。本発明の障害は、皮質の大きい領域、例えば、皮質の1箇所以上の機能的領域、皮質の1箇所以上の葉、および/または皮質全体に関与する障害を含むことがある。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸により処置することができる本発明の障害の他の非限定的な例は、外傷性の脳損傷、酵素機能不全障害、精神医学的障害(外傷後ストレス症候群を含む)、神経変性性疾患、および認知障害(認知症、自閉症、およびうつ病を含む)を含む。酵素機能不全障害は、大脳白質萎縮症(カナバン病を含む)および下に記載した任意のリソソーム貯蔵疾患を含むが、これらに限定されない。
的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータ-アクチン/ウサギβ-グロビンプロモーター(CAGプロモーター;Niwaら、Gene、1991、108(2):193~9頁)および伸張因子1-アルファプロモーター(EFl-アルファ)プロモーター(Kim et al.、Gene、1990、91(2):217~23頁およびGuoら、Gene Ther.、1996、3(9):802~10頁)を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトβ-グルクロニダーゼプロモーターまたはニワトリβ-アクチン(CBA)プロモーターに連結されたサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成性、誘発性または抑制性プロモーターであることができる。一部の実施形態では、本発明は、CBAプロモーターに作動的に連結された本開示の異種導入遺伝子をコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。典型的プロモーターおよび説明は、例えば、米国特許付与公開第20140335054号に見出すことができる。
できる。さらなる実施形態では、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位またはコザックのコンセンサス配列などの他の自然のままの発現制御要素は、自然のままの発現を模倣するために使用することもできる。
本開示のある態様は、組換えウイルス粒子(例えば、rAAV粒子)に関する。
アルファバキュロウイルス属、ベータバキュロウイルス属、デルタバキュロウイルス属、またはガンマバキュロウイルス属のものである。
3のN715、またはVP3のG716から選択される。例えば、一部の実施形態では、VP1のN57、VP3のN382、VP3のN511、および/またはVP3のN715がAspで置換されて、該アミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較してより高い頻度の脱アミド化をもたらす。他の実施形態では、アミノ酸置換はN57KまたはN57Qであり、該アミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。さらに他の実施形態では、VP1のG58、VP3のG383、VP3のG512、および/またはVP3のG716が、Glyでないアミノ酸(例えば、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはVal)で置換され、該アミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす。
%、約40%から約60%、約50%から約60%、約10%から約50%、約20%から約50%、約30%から約50%、約40%から約50%、約10%から約40%、約20%から約40%、約30%から約40%、約10%から約30%、約20%から約30%、または約10%から約20%のいずれかの比率で改善する。AAV粒子の安定性は、示差走査蛍光測定(DSF)、示差走査熱量測定(DSC)、他の熱変性アッセイ、タンパク質の分解に対する感受性、変性を観察する撮像または構造分析(例えば、電子顕微鏡を使用して)、形質導入の有効度または別の機能的アッセイを含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して、指定された時間間隔で特定の温度(例えば、熱的安定性のために、室温または4℃)に保たれた、または特定のpH(例えば、pH安定性)で処理された等のAAV粒子組成物について測定することができる。
P3のアミノ酸残基2を置換する工程を含む。例えば、一部の実施形態では、VP1のアミノ酸残基2が置換される。他の実施形態では、VP3のアミノ酸残基2が置換される。一部の実施形態では、2位において置換されたアミノ酸は、例えば、本明細書に記載されているように、親のVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2より高い頻度でN-アセチル化される。一部の実施形態では、VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2の置換は、rAAV粒子の形質導入を、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約100%改善する。一部の実施形態では、2位において置換されたアミノ酸を有するrAAV粒子の形質導入は、野生型または親AAVカプシド、例えば、同じ血清型のAAVカプシドと比較することができる。例えば、一部の実施形態では、VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2の置換は、rAAV粒子の形質導入を、例えば、野生型カプシドを含むrAAV粒子の形質導入と比較して、約10%から約100%、約20%から約100%、約30%から約100%、約40%から約100%、約50%から約100%、約60%から約100%、約70%から約100%、約80%から約100%、約90%から約100%、約10%から約90%、約20%から約90%、約30%から約90%、約40%から約90%、約50%から約90%、約60%から約90%、約70%から約90%、約80%から約90%、約10%から約80%、約20%から約80%、約30%から約80%、約40%から約80%、約50%から約80%、約60%から約80%、約70%から約80%、約10%から約70%、約20%から約70%、約30%から約70%、約40%から約70%、約50%から約70%、約60%から約70%、約10%から約60%、約20%から約60%、約30%から約60%、約40%から約60%、約50%から約60%、約10%から約50%、約20%から約50%、約30%から約50%、約40%から約50%、約10%から約40%、約20%から約40%、約30%から約40%、約10%から約30%、約20%から約30%、または約10%から約20%のいずれかの比率で改善する。AAV粒子の形質導入は、本明細書に記載されている形質導入の有効度のアッセイを含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。一部の実施形態では、本発明は、例えば、VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2を置換することにより、rAAV粒子の形質導入を減少させる方法を提供する。
715、またはVP3のG716が置換されたrAAV粒子の安定性を、野生型または親AAVカプシド、例えば、同じ血清型のAAVカプシドと比較することができる。例えば、一部の実施形態では、VP1のA35、VP1のN57、VP1のG58、VP3のN382、VP3のG383、VP3のN511、VP3のG512、VP3のN715、および/またはVP3のG716の置換は、rAAV粒子の安定性を、例えば、野生型カプシドを含むrAAV粒子の安定性と比較して、約10%から約100%、約20%から約100%、約30%から約100%、約40%から約100%、約50%から約100%、約60%から約100%、約70%から約100%、約80%から約100%、約90%から約100%、約10%から約90%、約20%から約90%、約30%から約90%、約40%から約90%、約50%から約90%、約60%から約90%、約70%から約90%、約80%から約90%、約10%から約80%、約20%から約80%、約30%から約80%、約40%から約80%、約50%から約80%、約60%から約80%、約70%から約80%、約10%から約70%、約20%から約70%、約30%から約70%、約40%から約70%、約50%から約70%、約60%から約70%、約10%から約60%、約20%から約60%、約30%から約60%、約40%から約60%、約50%から約60%、約10%から約50%、約20%から約50%、約30%から約50%、約40%から約50%、約10%から約40%、約20%から約40%、約30%から約40%、約10%から約30%、約20%から約30%、または約10%から約20%のいずれかの比率で改善する。AAV粒子の安定性は、示差走査蛍光測定(DSF)、示差走査熱量測定(DSC)、他の熱変性アッセイ、タンパク質の分解に対する感受性、変性を観察する撮像または構造分析(例えば、電子顕微鏡を使用して)、形質導入の有効度または別の機能的アッセイを含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して、指定された時間間隔で特定の温度(例えば、熱的安定性のために、室温または4℃)に保たれた、または特定のpH(例えば、pH安定性)で処理された等のAAV粒子組成物について測定することができる。
0%から約100%、約60%から約100%、約70%から約100%、約80%から約100%、約90%から約100%、約10%から約90%、約20%から約90%、約30%から約90%、約40%から約90%、約50%から約90%、約60%から約90%、約70%から約90%、約80%から約90%、約10%から約80%、約20%から約80%、約30%から約80%、約40%から約80%、約50%から約80%、約60%から約80%、約70%から約80%、約10%から約70%、約20%から約70%、約30%から約70%、約40%から約70%、約50%から約70%、約60%から約70%、約10%から約60%、約20%から約60%、約30%から約60%、約40%から約60%、約50%から約60%、約10%から約50%、約20%から約50%、約30%から約50%、約40%から約50%、約10%から約40%、約20%から約40%、約30%から約40%、約10%から約30%、約20%から約30%、または約10%から約20%のいずれかの比率で改善する。AAV粒子アセンブリは、粒子産生量および/または速度の測定、カプシド産生の定量(例えば、本明細書に記載されている方法のいずれかを使用して精製した後)、完全なベクターに対する空のカプシドの産生のアッセイ、形質導入の有効度の測定、粒子形成を観察する撮像または構造分析(例えば、電子顕微鏡を使用して)、AAVカプシドタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット法によりアッセイされる)等を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。
約70%、約10%から約60%、約20%から約60%、約30%から約60%、約40%から約60%、約50%から約60%、約10%から約50%、約20%から約50%、約30%から約50%、約40%から約50%、約10%から約40%、約20%から約40%、約30%から約40%、約10%から約30%、約20%から約30%、または約10%から約20%のいずれかの比率で改善する。AAV粒子の形質導入は、本明細書に記載されている形質導入の有効度のアッセイを含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。
ードA~FからのAAV血清型のカプシドタンパク質を含む(Gaoら、J.Virol.2004、78(12):6381頁)。
率で低下させる。約20%から約100%、約30%から約100%、約40%から約100%、約50%から約100%、約60%から約100%、約70%から約100%、約80%から約100%、約90%から約100%、約10%から約90%、約20%から約90%、約30%から約90%、約40%から約90%、約50%から約90%、約60%から約90%、約70%から約90%、約80%から約90%、約10%から約80%、約20%から約80%、約30%から約80%、約40%から約80%、約50%から約80%、約60%から約80%、約70%から約80%、約10%から約70%、約20%から約70%、約30%から約70%、約40%から約70%、約50%から約70%、約60%から約70%、約10%から約60%、約20%から約60%、約30%から約60%、約40%から約60%、約50%から約60%、約10%から約50%、約20%から約50%、約30%から約50%、約40%から約50%、約10%から約40%、約20%から約40%、約30%から約40%、約10%から約30%、約20%から約30%、または約10%から約20%(野生型カプシドを含むrAAV粒子の結合と比較して)。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、野生型rAAV粒子の結合と比較して、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカンへrAAV粒子の検出可能な結合を生じない。HSPGに対するAAV粒子の結合を測定する手段は当技術分野で公知であり;例えば、ヘパリン硫酸塩クロマトグラフィーの媒体への結合、またはその表面にHSPGを発現することが公知である細胞への結合である。例えば、Opie、SRら、(2003) J.Virol.77:6995~7006頁およびKern、Aら、(2003) J.Virol.77:11072~11081頁を参照されたい。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子の細胞(例えば、眼またはCNS中の細胞)への形質導入の有効度を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約100%(野生型カプシドを含むrAAV粒子の形質導入の有効度と比較して)改善する。一部の実施形態では、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子の細胞(例えば、眼またはCNS中の細胞)への形質導入の有効度を、約10%から約100%のいずれか1つの比率で改善する。約20%から約100%、約30%から約100%、約40%から約100%、約50%から約100%、約60%から約100%、約70%から約100%、約80%から約100%、約90%から約100%、約10%から約90%、約20%から約90%、約30%から約90%、約40%から約90%、約50%から約90%、約60%から約90%、約70%から約90%、約80%から約90%、約10%から約80%、約20%から約80%、約30%から約80%、約40%から約80%、約50%から約80%、約60%から約80%、約70%から約80%、約10%から約70%、約20%から約70%、約30%から約70%、約40%から約70%、約50%から約70%、約60%から約70%、約10%から約60%、約20%から約60%、約30%から約60%、約40%から約60%、約50%から約60%、約10%から約50%、約20%から約50%、約30%から約50%、約40%から約50%、約10%から約40%、約20%から約40%、約30%から約40%、約10%から約30%、約20%から約30%、または約10%から約20%(野生型カプシドを含むrAAV粒子の形質導入の有効度と比較して)。AAV粒子の細胞(例えば、培養または組織の一部における細胞)への形質導入の有効度を測定する手段は当技術分野で公知である。例えば、細胞の集団(例えば、培養または組織の一部における)を、細胞で発現されたときにアッセイ可能な受容体(例えば、GFP蛍光、sFLT産生、その他)を産生するベクターを含有するrAAV粒子の濃度で感染させることができる。
一部の態様では、本発明は、アミノ酸残基2におけるアミノ酸置換を含むAAVカプシドタンパク質を提供し;アミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAVカプシドタンパク質のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較してN末端アセチル化を変更する。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質はVP1またはVP3である。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質(例えば、VP1またはVP3)のアミノ酸残基2は、Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp、Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、ProまたはTyrで置換される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、AAVカプシドタンパク質のより少ない脱アミド化を生ずる。本発明のAAVカプシドタンパク質の非限定的な例は、以下のAAV血清型:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV LK03、AAV2R471A、AAV2/2~7m8、AAV DJ、AAV DJ8、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAV、マウスAAV、またはrAAV2/HBoV1血清型カプシドのいずれかのVP1および/またはVP3を含む。一部の実施形態では、AAVカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む。
トランスフェクション、安定な細胞系統の産生、ならびにアデノウイルス-AAVハイブリッド、ヘルペスウイルス-AAVハイブリッド(Conway、JEら、(1997) J.Virology 71(11):8780~8789頁)およびバキュロウイルス-AAVハイブリッド(Urabe、M.ら、(2002) Human Gene
Therapy 13(16):1935~1943頁;Kotin、R.(2011) Hum Mol Genet.20(R1):R2~R6)を含む感染性ハイブリッドウイルス産生システムを含む、rAAVベクターを産生するための多くの方法が当技術分野で公知である。rAAVウイルス粒子を産生するためのrAAV産生培養は;1)適当な宿主細胞、2)適当なヘルパーウイルス機能、3)AAV repおよびcap遺伝子および遺伝子産物;4)少なくとも1つのAAV ITR配列(例えば、GNPTABをコードするAAVゲノム)に隣接した核酸(治療用核酸など);および5)rAAV産生を支持する適当な培地および培地構成要素のすべてを必要とする。一部の実施形態では、適当な宿主細胞は、霊長類の宿主細胞である。一部の実施形態では、適当な宿主細胞は、HeLa、A549、293、またはPerc.6細胞などのヒトに由来する細胞系統である。一部の実施形態では、適当なヘルパーウイルス機能は、野生型または突然変異体のアデノウイルス(感温性アデノウイルスなど)、ヘルペスウイルス(HSV)、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構造により提供される。一部の実施形態では、AAV repおよびcap遺伝子産物は任意のAAV血清型から可能である。一般的に、しかし必ずではなく、AAV rep遺伝子産物は、rep遺伝子産物がrAAVゲノムを複製およびパッケージングするように機能することができる限り、rAAVベクターゲノムのITRと同じ血清型のものである。当技術分野で公知の適当な培地は、rAAVベクターの産生のために使用することができる。これらの培地は、Hyclone LaboratoriesおよびJRHにより産生される、改変Eagle培地(MEM)、Dulbeccoの改変Eagle培地(DMEM)、特に組換えAAVベクターの産生に使用するための慣行の培地製剤に関する、各々その全体が参照によって本明細書に組み入れる米国特許第6,566,118号に記載されたもの、および米国特許第6,723,551号に記載されたSf-900IISFM培地などの慣行の製剤を含む培地を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、AAVヘルパー機能は、アデノウイルスまたはHSVによって提供される。一部の実施形態では、AAVヘルパー機能は、バキュロウイルスにより提供されて、宿主細胞は昆虫細胞(例えば、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda(Sf9)の細胞)である。一部の実施形
態では、AAV cap機能は、VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換を提供し、VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較してN末端アセチル化を変更する。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質(例えば、VP1またはVP3)のアミノ酸残基2は、Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp、Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、ProまたはTyrで置換される。一部の実施形態では、アミノ酸置換はAAVカプシドのより少ない脱アミド化を生ずる。
repおよびcap遺伝子および/またはrAAVゲノムをコードする核酸は、1種またはそれ以上のプラスミドに載せて細胞系統に導入されて産生細胞系統を発生する。一部の実施形態では、AAV rep、AAV cap、およびrAAVゲノムが、同じプラスミドで細胞中に導入される。他の実施形態では、AAV rep、AAV capおよびrAAVゲノムが、異なるプラスミドで細胞中に導入される。一部の実施形態では、プラスミドで安定にトランスフェクトされた細胞系統は、該細胞系統の複数の継代(例えば、該細胞の5、10、20、30、40、50代または50代を超える継代)の間該プラスミドを維持する。例えば、プラスミドは、細胞が複製されるときに複製されるか、またはプラスミドが細胞ゲノム中に組み込まれることもある。プラスミドが細胞中(例えば、ヒトの細胞)で自律的に複製されることを可能にする種々の配列が同定されている(例えば、Krysan、P.J.ら(1989) Mol.Cell Biol.9:102
6~1033頁を参照されたい)。一部の実施形態では、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー(例えば、抗生物質耐性マーカー)を含有することもできる。哺乳動物の細胞で一般的に使用される選択可能なマーカーは、ブラスチシジン、G418、ハイグロマイシンB、ゼオシン、ピューロマイシン、およびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。核酸を細胞に導入する方法は当技術分野で公知であり、ウイルスの形質導入、カチオン性トランスフェクション(例えば、DEAE-デキストランなどのカチオン性ポリマーまたはリポフェクタミンなどのカチオン性脂質を使用する)、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、粒子衝撃、電気穿孔、およびナノ粒子トランスフェクションを含むが、これらに限定されない(さらなる詳細については、例えば、Kim, T.K. and Eberwine, J.H.(2010) Anal.Bioanal.Chem.397:3173~3178頁を参照されたい)。
cap、およびrAAVゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態では、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー(例えば、抗生物質耐性のマーカー)を含有することができる。核酸を種々の宿主細胞系統に安定に組み込む方法は、当技術分野で公知である。例えば、繰り返される選択(例えば、選択可能なマーカーの使用により)は、選択可能なマーカー(およびAAV capおよびrep遺伝子および/またはrAAVゲノム)を含有する核酸が組み込まれた細胞を選択するために使用することができる。他の実施形態では、核酸は、部位特異的様式で細胞系統に組み込まれて、産生細胞系統を発生することができる。FLP/FRT(例えば、O’Gorman、S.ら(1991) Science 251:1351~1355頁を参照されたい)、Cre/loxP(例えば、Sauer、B. and Henderson、N.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.85:5166~5170頁を参照されたい)、およびphi C31-att(例えば、Groth、A.C. et al.(2000) Proc.Natl.Acad.Sci.97:5995~6000頁を参照されたい)などの数通りの部位特異的組換えシステムが当技術分野で公知である。
きい凝集塊または容器の側面におけるよりむしろ)、細胞系統を成長させることを含む。さらなる説明については、例えば、ATCC frequently asked questions document(the world wide web at atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line%20to%20suspension-40.aspxで利用できる)およびそこで引用されている参考文献を参照されたい。
Millistak+HC Podフィルター、規格A1HCのMillipore Millistak HC Podフィルター、および0.2μmフィルターOpticap XL1O Millipore Express SHC親水性膜フィルターを含む一連のデプスフィルターを通す濾過により清浄化される。清浄化は、遠心分離または当
技術分野で公知の0.2μm以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターを通す濾過などの当技術分野で公知である種々の他の標準技法によっても達成することができる。
一部の実施形態では、本開示のAAV粒子(例えば、rAAV粒子)は医薬組成物中にある。該医薬組成物は、本明細書に記載されているまたは当技術分野で公知である任意の様式の投与に適することができる。一部の実施形態では、該医薬組成物は、安定性を改善するように、および/またはrAAV粒子の形質導入の有効度を改善するように;例えば、VP1および/またはVP3の位置2におけるアミノ酸残基を、rAAVカプシドタンパク質のアセチル化を改善するように置換することに使用するために改変されたrAAV粒子を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定性および/またはrAAV粒子の形質導入の有効度を調整するように(例えば、安定性および/または形質導入の有効度を増大させるかまたは安定性および/または形質導入の有効度を低下させる);例えば、脱アミド化を調整する(例えば、脱アミド化を増大させるかまたは脱アミド化を減少させる)アミノ酸残基の置換に使用するために改変されたrAAV粒子を含む。
SCIENCES(Mack Pub.Co.、ニュージャージー州、1991)で利用できる。一部の実施形態では、本明細書に記載されているrAAV粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物は、ヒトに投与するために適する。そのような担体は当技術分野で周知である(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第15版、1035~1038頁および1570~1580頁を参照されたい)。
本発明は、本開示のrAAV粒子のいずれかおよび/または医薬組成物を含むキットまたは製造品も提供する。キットまたは製造品は、本発明の任意のrAAV粒子またはrAAV粒子組成物を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、安定性を改善するために、および/またはrAAV粒子の形質導入の有効度を改善するために使用される;例えば、rAAVカプシドタンパク質のアセチル化を改善するためにVP1および/またはVP3の位置2におけるアミノ酸残基を置換することに使用するために使用される。一部の実施形態では、キットは、rAAV粒子の安定性および/または形質導入の有効度を調整するために使用される(例えば、安定性および/もしくは形質導入の有効度を向上させるために、または安定性および/もしくは形質導入の有効度を低下させるために);例えば、脱アミド化を調整する(例えば、脱アミド化を増大させるかまたは脱アミド化を減少させる)アミノ酸残基の置換のために使用される。
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、それらの非病原性の性質、分裂しているおよび分裂してない細胞の両方に感染する能力および長期遺伝子発現のために、人気のある遺伝子治療のベクターになった。現在、AAVに基づく遺伝子治療は、筋ジストロフィー、血友病、パーキンソン病、Leberの先天性黒内障および黄斑変性などの多くの疾患の標的のための臨床試験で使用されている。
材料および試薬
ジチオスレイトール(DTT)、4-ビニルピリジン、超純粋ギ酸、酢酸、グアニジン-HCl、Tris-HClおよびTris塩基はSigma Chemicals(St.Louis、ミズーリ州)から購入した。Amiconのultra-4フィルターは、Millipore(Billerica、マサチューセッツ州)から購入した。ブタの配列決定規格トリプシンは、(Milwaukee、ウィスコンシン州)から購入した。エンドプロテイナーゼLys-CおよびAsp-Nは、Roche(ドイツ)から購入した。10,000のMWCOを有するSlide-A-Lyzerカセットは、Pierce(Rockford、イリノイ州)から購入した。
AAVベクターは、前に記載した一過性三重トランスフェクション法(Xiao、1998#123)を使用して産生した。簡単に説明すると、HEK293細胞を、ポリエチレンイミン、PEI、および1:1:1の比の3種のプラスミド(ITRベクター、AAVrep/capおよびAdヘルパープラスミド)を使用してトランスフェクトした。ベクターのプラスミドは、ベクターのゲノムCBA-EGFPおよびAAV2からのITR
配列を含有する。EGFP発現は、記載されたように(Miyazaki、1989#124)(Niwa、1991#125)、CMVエンハンサーニワトリベータアクチンハイブリッドプロモーター(CBA)によって推進された。AAV rep/capヘルパーは、AAV2および血清型特異的なカプシド配列からのrep2/cap2、rep2/cap5、rep2/cap7その他と命名されたrep配列を含有していた。使用されたpAdヘルパーは、pHelper(Stratagene/Agilent Technologies、Santa Clara、カリフォルニア州)であった。AAVの精製は、Quら(2007、J.Virol.Methods 140:183~192頁)に記載されたように実行した。
AAVビリオンを、Amiconのultra-4フィルター(10kDaのMWCO)で濃縮して10%酢酸で変性させ、続いてAcquity UPLC-Xevo(登録商標)QTOFMS装置(Waters、Milford、マサチューセッツ州)で直接分析した。分離は、UPLC BEH C4またはC8カラム(1.7μm、内径2.1mm)を0.25ml/分の流速で用いて実行した。移動相Aは水中0.1%ギ酸であったが、移動相Bは、アセトニトリル中0.1%ギ酸であった。最終のグラジエントは以下の通りであった:6分間で10%Bから20%B、10分間で20%Bから30%B、次に40分間で30%から38%B。MSではキャピラリー電圧およびサンプリングコーン電圧をそれぞれ3.5kVおよび45Vに設定した。質量スペクトルは、500~4000のm/z範囲で高感度様式で得た。質量校正のために、校正物質としてヨウ化ナトリウムを用いる支援付き校正を実行した。タンパク質のデコンボリューションのために、MasslynxソフトウェアにおけるMaxEnt1を使用した。
濃縮されたAAV2ビリオンを6Mグアニジン-HCl、0.1M Trisを用いてpH8.5で変性した。該タンパク質を、30mMのDTTを用いて55℃で1時間暗所で還元し、0.07%の4-ビニルピリジンを用いて室温で2時間アルキル化した。反応を1M DTTの添加により停止させた。試料を、Slide-A-Lyzerカセット(10,000のMWCO)を用いて、25mMのTris緩衝液に対してpH8.5で約18時間透析した。透析後、試料を3つの部分に分けた。各部分を、トリプシンを用いて1:25でまたはLys-Cを用いて1:50で、またはAsp-Nを用いて1:100の酵素:タンパク質比(wt/wt)で18時間37℃で、それぞれ消化した。
ナノLC/MS/MSを、Orbitrap Velos質量分析計(Thermo-Fisher Scientific、Waltham、マサチューセッツ州)と連結されたNanoAcquity HPLCシステム(Waters、Milford、マサチューセッツ州)を使用して、充填材料Magic C18(5μm、Bruker、Billerica、マサチューセッツ州)を自家充填したnanoLCカラム(75μm×10mm)を300nl/分の流速で使用して実行した。移動相AおよびBは、水およびアセトニトリル中それぞれ0.1%ギ酸であった。グラジエントは、121分で2%Bから60%Bであった。
タンパク質の消化物も、Acquity UPLC-Xevo qTOF MSでUPLC/MS/MSにより分析した。水中0.1%ギ酸/アセトニトリルのグラジエントを用いる移動相で分離するために、BEH300 C18カラム(2.1×150mm)を流速0.25ml/分で使用した。質量スペクトルを正のMSeモードで、200~2000の質量範囲で得た。
AAVの変性方法
AAVは、洗剤、熱、高塩、または低もしくは高pHの緩衝剤を使用する多くの方法により変性することができる。熱変性は、タンパク質沈殿を生じて、その結果、逆相カラムが詰まりやすく、過圧になる。高塩を用いる変性では、LC/MS分析の前に追加の脱塩工程が必要になる。10%酢酸を用いる変性は、きれいな質量スペクトルが可能なので、LC/MSによる完全タンパク質の分析のために使用した。ペプチドマッピングのためには、0.1% RapiGestまたは6MグアニジンHClのいずれかを変性試薬として使用することができる。
AAV2の最初の完全タンパク質の分析は、UPLC BEH C4カラムを急速グラジエントで使用して実行した。この条件下で、全イオンクロマトグラムで唯一の単一ピークが観察されて、質量がVP3に対応した(図1A)。理論に拘束されることは望まず、VP1およびVP2の不在は、おそらくVP1およびVP2の低い化学量論によるか、またはすべてのVPが共溶出すればVP3によるVP1およびVP2シグナルの抑制のためであると考えられる。VP1およびVP2を検出するために、注入またはカラム長さを増大させること、より浅いグラジエントを使用すること、および代替カラムを使用することを試みた。0.5%B/分でより浅いグラジエントを用いるより大きい負荷(1.7μg)で、左にショルダーピークが生じた(図1B)。カラム長さを10cmから15cmに増大させてもショルダーピークの分離は強化されなかった(図1C)。しかしながら、ショルダーピークは、BEH C8カラムを使用して、主ピークからさらに分離されて、改善されたシグナル強度が観察された(図1D)。
完全タンパク質の分析で観察されるN末端およびアセチル化をさらに確認するために、複数の酵素を使用してペプチドマッピングを実行し、複数の装置を使用して分析した。変性方法および脱塩工程を含む種々の試料調製方法を評価した。6MのグアニジンHClを用いる変性、還元および4-ビニルピリジンを用いるアルキル化、およびslide-A-lyzerを使用する透析とそれに続く酵素消化を含む最終消化方法により、消化プロセス時における低人工改変できれいなペプチドマッピングを創った。5μgという少ない出発原料で試験して、ナノLC/MS/MSおよびUPLC/MS/MSを使用して完全な配列適用範囲を得た。
AAV2に加えて、AAV1、AAV5、AAV7、AAV9およびAAV Rh10も、完全タンパク質の分析により分析した。AAVにおいて、理論的および予測されるVPの質量を表2に示す。
遺伝子治療の研究および開発におけるLC/MSによる完全タンパク質の分析およびAAV VPのLC/MS/MSによるペプチドマッピングの応用
これらの結果は、異なる型のAAVの変性後の直接LC/MSは、タンパク質配列および翻訳後修飾を、完全タンパク質のレベルにおける正確な質量測定でモニターするための簡単で効果的な方法であることが証明されたことを示す。AAVのVP1、VP2およびVP3のN末端は、マススペクトロメトリーにより確認された。VP1およびVP3のN末端のアセチル化は、異なる血清型のAAVにおいても同定された。AAVの直接LC/
MS/MSによるペプチドマッピングが開発されて、VP1、VP2およびVP3の100%の配列適用範囲が提供され、VPのN末端アセチル化が確認された。13種のAAV血清型の、数種類のAAV血清型の配列アラインメントおよび完全タンパク質の分析に基づいて予測される配列の理論的質量を表3に示す。
。たとえVP2およびVP3の両方がAAV1とAAV6の間で2Da差しか有していなくても、VP1のAAV1およびAAV6との間の質量差は36であり、正確な質量測定によって区別されるために十分有意である。それ故、VP1、VP2およびVP3の完全タンパク質の測定は、同一性試験として高度に特異的である。
細胞タンパク質の化学的改変は、それらの機能を制御する共通の手段である(Arnesen、T.(2006) Virology 353(2):283~293頁)。アセチル基のアセチル補酵素Aからタンパク質の第1アミノ酸残基のα-アミノ基への移動に関与するN末端アセチル化(Nt-アセチル化)(Brown、J. L.およびRoberts、W.K.(1976) J Biol Chem 251:1009~1014頁;Arnesen、T.ら(2009) Proc Natl Acad Sci
USA 106:8157~8162頁)は、タンパク質改変のなかで最も多い。大部分の他のタンパク質改変と異なって、Nt-アセチル化は不可逆的であり;それは、リボソームと関連するN末端アセチルトランスフェラーゼ(NAT)により触媒されて、タンパク質の合成時に主として起こる(Gautschi、M.ら(2003) Mol Cell Biol 23:7403~7414頁;Pestana、A.およびPitot、H.C.(1975) Biochemistry 14:1404~1412頁;Polevoda、B.ら(2003) J Biol Chem 278:30686~97頁)。真核細胞には数種の区別されるNAT、すなわちNatA~NatFがあり、各々1つまたはそれ以上のサブユニットで構成され、第1のわずかのアミノ酸のアミノ酸配列に依存して、N末端の特定のサブグループを各々アセチル化する(Jornvall、H.(1975) J Theor Biol 55:1~12頁;Persson、B.ら(1985) Eur J Biochem 152:523~527頁)。
胞質ゾルへの誤った選別を生ずる。それ故、N末端アセチル化は、細胞質ゾルに残留することが定められているタンパク質が、実際に細胞質ゾル中に存在することを確実にするために、緊縮(stringency)の臨時(extra)の層を表す形成途中のポリペプチドの細胞選
別における初期の決定工程を表す。真核生物の細胞は、特定の機能を実行するために必要な細胞小器官と呼ばれる数個の別個の区画を含む。これらの区画中のタンパク質は、細胞原形質で合成され、したがって適当な細胞小器官へのそれらの送達を確実にするために複雑な選別機構が必要になる。タンパク質は、それらの合成における非常に初期の段階に、それらのアミノ末端のアセチル化により改変される。細胞質のタンパク質と、主要な細胞小器官の1つ、小胞体(ER)に向かうことが定められたタンパク質とにおけるそのような改変の尤度の間に深甚な差があり:細胞質のタンパク質は典型的にはアセチル化されており、ERに結合したタンパク質は、大きく改変されてはいない。それに加えて、特定のERタンパク質は、それらのアセチル化を誘発するように遺伝子操作された場合には、それらがERを標的とすることは阻害された(Forte、G.M.A.ら(2011) PLoS Biology、2011年5月4日、第9巻)。
AAVカプシドタンパク質を、開始のメチオニン(iMet X)に対して2番目の位置でアミノ酸を異ならせて発生させ、Nt-アセチル化が阻害されているかまたは減少しているかを決定して、次に機能的重要性を測定する。カプシドタンパク質の細胞内で移動
する、および/またはグリコシル化などの翻訳後修飾を受ける能力を査定して、この能力は集合したAAV粒子の感染性に影響するかどうかを、その後決定する。それに加えて、ユビキチン化/分解およびリソゾーム、ER、ゴルジ体、または内部核膜を標的とすることに対するアセチル化の影響を決定する。
AAV1およびAAV2 VPの酵素消化
10μgの各AAV1-EGFPまたはAAV2-EGFP材料(三重トランスフェクションならびに産生細胞系統プロセスにより発生させた)を、Amiconフィルター(10kDaのMWCO)を使用して濃縮し、6Mグアニジン-HCl、50mMのTrisを用いてpH8.5で変性させた。タンパク質を5mMのDTTを用いて60℃で30分間暗所で還元して、15mMのヨードアセトアミドを用いて室温で30分間アルキル化し、次に、Bio-SpinR(登録商標)6Trisマイクロカラムを使用して消化するために、緩衝液をpH7.1の25mMのTrisに交換した。緩衝液を交換した後、試料を2つの部分に分けた。各部分を、トリプシンを用いて1:25、またはAsp-Nを用いて1:50の酵素:タンパク質比(wt/wt)で2時間37℃で、それぞれ消化した。
タンパク質の消化物も、Acquity UPLC-XevoqTOF MSでUPLC/MS/MSによって分析した。BEH300 C18カラム(2.1×150mm)を、水中0.1%ギ酸/アセトニトリルの移動相でグラジエントを用いて流速0.25ml/分で分離するために使用した。質量スペクトルを50~2000の質量範囲において正のMSe分割様式で得た。
NG部位を含有するペプチド(AA1およびAAV2 VP中のT9、T49、および
T67)およびそれらの対応する脱アミド化された種の抽出されたイオンクロマトグラム(XIC)を脱アミド化レベルの計算のために使用した。
とめた。T38ペプチドは、そのサイズが理由で検出されなかった。
まとめると、実施例1~3は、ウイルス粒子の完全タンパク質(例えば、AAVカプシドタンパク質)を、LC/MSを使用して分析する方法を示す。分子量は正確に測定されて、これらの技法は、ウイルスカプシドタンパク質のN末端および/または改変を推定するためにも使用することができる。その上、これらの方法は、遺伝子治療で有用なカプシド血清型の同一性アッセイとして、例えば、分析プラットホームとして適用できる。これらの結果は、カプシドタンパク質構造(例えば、先端切断、脱アミド化、その他)と潜在能力との間の相関関係をさらに確立して、最も重要な部位における点突然変異は、より効果的なベクターを遺伝子操作するために使用することができることを示唆する。
上で論じたように、AAVカプシドタンパク質のN末端は、血清型にわたって高度に保存されている(図5)。実施例1に記載された技法は、VP発現および翻訳後修飾を調べることを可能にする。AAVカプシドタンパク質のN末端アセチル化の役割および生物学的有意性を次に調べた。
AAVカプシドタンパク質の脱アセチル化の潜在的役割を解明するために、AAV5脱アセチル化変異体を試験した。CBAプロモーター(AAV5-CBA-Egfp)下でeGFPを発現するAAV5粒子を、開始のメチオニン(iMET)に隣接した突然変異したアミノ酸を有するAAV5変異体と、VP1およびVP3(deAC-AAV5-CBA-eGFP)について比較した。下の表9に例示したように、NatA、NatC、またはNatDによるアセチル化の尤度が低いと予測された3種のアミノ酸:Gly、Leu、およびProを、変異体を発生させるために選んだ。
S2GVP1 AAV5VP1において位置2でSerをGlyに変えた
S2LVP1 AAV5VP1において位置2でSerをLeuに変えた
S2PVP1 AAV5VP1において位置2でSerをProに変えた
S2GVP3 AAV5VP3において位置2でSerをGlyに変えた
S2LVP3 AAV5VP3において位置2でSerをLeuに変えた
S2PVP3 AAV5VP3において位置2でSerをProに変えた
S2PVP1/VP3 AAV5 VP1およびVP3の両方において位置2でSerをProに変えた
S2GVP1/VP3 AAV5 VP1およびVP3の両方において位置2でSerをGlyに変えた
S2LVP1/VP3 AAV5 VP1およびVP3の両方において位置2でSerをLeuに変えた。
an分析により定量した。
予測されたように、LC/MSにより調べたときに、N末端SerのPro/Leu/Glyへの突然変異体で、アセチル化は観察されなかった。AAV5 deAC変異体は、堅牢なベクター産生を示し、AAV5 deAC変異体は、親AAV5とほぼ同程度のレベルで細胞に感染した。しかしながら、deAC変異体が感染した細胞では、機能的タンパク質レベルは、親AAV5と比較して大きく低下した。これらのデータは、VP1/VP3では、向性はN末端脱アセチル化の欠如によっては最小限しか影響されないが、下流プロセシング(例えば、トラフィッキングおよび/または分解)は有意に影響されることを示唆する。試験された変異体が低下したインビトロの活性を示したので、当業者は、とりわけ、低下したレベルの形質導入が望ましい場合には、減少したかまたは排除されたアセチル化により特徴づけられる変異体を使用することができると解釈することができる。
実施例1および3は、AAVカプシドタンパク質の翻訳後修飾を調べること、およびAAV2カプシドの脱アミド化の役割を探求することを可能にする技法を示した。以下の実施例で、脱アミド化はカプシドタンパク質の潜在能力を低下させるかどうか、および/または先端切断を誘発するかどうか、および異なる製造プロセスは異なるレベルの脱アミド化を誘発することができるかどうか試験した。
AAV粒子を発生させて、脱アミド化状態を実施例3で記載されたようにアッセイした。
実施例3で記載されたように、AAV2カプシドのVP1では、潜在的な脱アミド化部位は、ホスホリパーゼA2ドメイン(Ca++結合部位)中のN57/G58で見出された。N57/G58モチーフは、AAV血清型にわたって保存されている(図13)。実施例3は、PCLによるAAV2産生は、脱アミド化において、TTxによるAAV2産生と比較してほとんど3倍の増大を示したことを示した(図6Aおよび6Bおよび表8を参照されたい)。
まとめると、AAV2脱アミド化された突然変異体ベクターは、細胞に親AAV2粒子とほぼ同程度のレベルで感染する(例えば、ほぼ同程度のvg/μgの細胞タンパク質)。しかしながら、形質導入された細胞におけるeGFPレベルの分析に基づいて、AAV2A35N変異体は、試験されたすべての細胞系統で、親AAV2より高い潜在能力を有し、AAV2G58D変異体は、HuH7細胞(肝臓に由来する細胞系統)で親AAV2より高い潜在能力を有した。これらの結果は、A35N突然変異は、多くの細胞型に形質導入するためのベクター潜在能力を増大させることに効果的であることができること、およびG58D突然変異も、ある種の細胞型、例えば、肝臓細胞で潜在能力を増大させることに効果的であることができることを示唆する。
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すべてのポリペプチド配列は、特に断らない限り、N末端からC末端へと示す。
すべての核酸配列は特に断らない限り5’から3’へと示す。
潜在的AAV2 VP3開始コドンのヌクレオチド配列(ATGコドンに下線を引いた)
ATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGAC (配列番号1)
潜在的AAV2 VP3開始コドンに対応するポリペプチド配列(メチオニンに下線を引いた)
MATGSGAPMAD (配列番号2)
AAV2 VP1ポリペプチド配列
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPG
PAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (配列番号3)
VP1 N末端トリプシンペプチド(N末端アラニンがアセチル化されている)
AADGYLPDWLEDTLSEGIR (配列番号4)
VP3N末端Asp-Nペプチド(N末端アラニンがアセチル化されている)
ATGSGAPM (配列番号5)
共通するVP1N末端配列
MAADGYLPDWLED (配列番号6)
潜在的AAV7VP3開始コドンのヌクレオチド配列(開始コドンに下線を引いた)
GTGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAAC (配列番号7)
突然変異したITRのヌクレオチド配列
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG (配列番号8)
Claims (180)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子の血清型を決定する方法であって、
a)該AAV粒子を変性させる工程と、
b)該変性したAAV粒子を液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)に供する工程と、
c)該AAV粒子のVP1、VP2およびVP3の質量を決定する工程と
を含み;
VP1、VP2およびVP3の質量の特定の組合せが、AAV血清型の指標である、前記方法。 - VP1、VP2およびVP3の計算された質量は、1つまたはそれ以上のAAV血清型のVP1、VP2およびVP3の理論的質量に対して比較される、請求項1に記載の方法。
- AAV粒子の不均一性を決定する方法であって、
a)該AAV粒子を変性させる工程と、
b)該変性したAAV粒子を液体クロマトグラフィー/質量分析/質量分析(LC/MS/MS)に供する工程と、
c)該AAV粒子のVP1、VP2およびVP3の質量を決定する工程と、
d)工程c)の質量を、AAV血清型のVP1、VP2およびVP3の理論的質量と比較する工程と
を含み;
VP1、VP2またはVP3の質量のうちの1つまたはそれ以上の偏差が、AAVカプシドの不均一性の指標である、前記方法。 - 不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの1つまたはそれ以上を含む、請求項3に記載の方法。
- AAV粒子は、酢酸、塩酸グアニジンおよび/または有機溶媒により変性する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーである、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 逆相クロマトグラフィーは、C4またはC8逆相クロマトグラフィーである、請求項7に記載の方法。
- クロマトグラフィーは、水中にギ酸を含む移動相Aを使用する、請求項8に記載の方法。
- 移動相Aは、約0.1%のギ酸を含む、請求項9に記載の方法。
- クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にギ酸を含む移動相Bを含む、請求項8~10のいずれか1項に記載の方法。
- 移動相Bは、約0.1%のギ酸を含む、請求項11に記載の方法。
- クロマトグラフィーにおける移動相Bの割合は、経時的に増加する、請求項11または12に記載の方法。
- クロマトグラフィーにおける移動相Bの割合は、段階的に増加する、請求項13に記載の方法。
- 移動相Bは、約10%から約20%まで、約20%から約30%まで、および約30%から約38%まで増加する、請求項14に記載の方法。
- 移動相Bは、約6分間で約10%から約20%まで、約10分間で約20%から約30%まで、および約40分間で約30%から約38%まで増加する、請求項15に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーは、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)である、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。
- マススペクトロメトリーは、約3.5kVのキャピラリー電圧を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- マススペクトロメトリーは、約45Vのサンプリングコーン電圧を含む、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。
- マススペクトロメトリーは、支援付き校正を含む、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法。
- ヨウ化ナトリウムは、校正物質として使用される、請求項20に記載の方法。
- VP1および/またはVP3のN末端は、アセチル化されている、請求項1~21のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子は、組換えAAV(rAAV)粒子である、請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV4カプシド、AAV5カプシド、AAV6カプシド、AAV7カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8カプシド、AAV9カプシド、AAV10カプシド、AAVrh10カプシド、AAV11カプシド、AAV12カプシド、AAV LK03カプシド、AAV2R471Aカプシド、AAV2/2-7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、ヤギAAVカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、ウシAAVカプシド、マウスAAVカプシド、rAAV2/HBoV1(キメラAAV/ヒトボカウイルスウイルス1)、AAV2HBKOカプシド、AAVPHP.BカプシドまたはAAVPHP.eBカプシドを含む、請求項1~23のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を含む、請求項23または24に記載の方法。
- VP1、VP2およびVP3の質量は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV4カプシド、AAV5カプシド、AAV6カプシド、AAV7カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8カプシド、AAV9カプシド、AAV10カプシド、AAVrh10カプシド、AAV11カプシド、AAV12カプシド、AAV LK03カプシド、AAV2R471Aカプシド、AAV2/2-7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、ヤギAAVカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、ウシAAVカプシド、マウスAAVカプシド、rAAV2/HBoV1(キメラAAV/ヒトボカウイルスウイルス1)、AAV2HBKOカプシド、AAVPHP.BカプシドまたはAAVPHP.eBカプシドのうちの1つまたはそれ以上の理論的質量に対して比較される、請求項1~25のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス粒子は、AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4
ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む、請求項1~26のいずれか1項に記載の方法。 - AAV粒子は、異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む、請求項1~27のいずれか1項に記載の方法。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子の血清型を決定する方法であって、
a)該AAV粒子を変性させる工程と、
b)該変性したAAV粒子を還元および/またはアルキル化に供する工程と、
c)該変性したAAV粒子を消化に供して、該AAV粒子のVP1、VP2および/またはVP3の断片を生成する工程と、
d)該VP1、VP2および/またはVP3の断片を液体クロマトグラフィー/質量分析-質量分析(LC/MS/MS)に供する工程と、
e)該AAV粒子のVP1、VP2およびVP3の断片の質量を決定する工程と
を含み;
VP1、VP2およびVP3の断片の質量の特定の組合せが、AAV血清型の指標である、前記方法。 - VP1、VP2および/またはVP3の断片の計算された質量は、1つまたはそれ以上のAAV血清型のVP1、VP2および/またはVP3の断片の理論的質量に対して比較される、請求項29に記載の方法。
- AAV粒子の血清型の不均一性を決定する方法であって、
a)該AAV粒子を変性させる工程と、
b)該変性したAAV粒子を還元および/またはアルキル化に供する工程と、
c)該変性したAAV粒子を消化に供して、該AAV粒子のVP1、VP2および/またはVP3の断片を生成する工程と、
d)該VP1、VP2および/またはVP3の断片を液体クロマトグラフィー/質量分析-質量分析(LC/MS/MS)に供する工程と、
e)該AAV粒子のVP1、VP2およびVP3の断片の質量を決定する工程と、
f)工程e)の質量を、AAV血清型のVP1、VP2およびVP3の断片の理論的質量と比較する工程と
を含み;
VP1、VP2またはVP3の質量のうちの1つまたはそれ以上の偏差が、AAVカプシ
ドの不均一性の指標である、前記方法。 - 不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの1つまたはそれ以上を含む、請求項31に記載の方法。
- 還元は、AAV粒子をジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノール、またはトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)に供することによる、請求項29~32のいずれか1項に記載の方法。
- アルキル化は、AAV粒子をヨード酢酸、ヨードアセトアミド、または4-ビニルピリジンに供することによる、請求項29~33のいずれか1項に記載の方法。
- 消化は、酵素消化または化学的消化である、請求項29~34のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素消化は、エンドペプチダーゼ消化である、請求項35に記載の方法。
- 酵素消化は、トリプシン消化、LysC消化、Asp-N消化またはGlu-C消化である、請求項35または36に記載の方法。
- 化学的消化は、臭化シアン消化または酸消化である、請求項35に記載の方法。
- AAV粒子は、酢酸、塩酸グアニジンおよび/または有機溶媒により変性する、請求項29~37のいずれか1項に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項29~39のいずれか1項に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーである、請求項29~40のいずれか1項に記載の方法。
- 逆相クロマトグラフィーは、C18逆相クロマトグラフィーである、請求項41に記載の方法。
- クロマトグラフィーは、水中にギ酸を含む移動相Aを使用する、請求項42に記載の方法。
- 移動相Aは、約0.1%のギ酸を含む、請求項43に記載の方法。
- クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にギ酸を含む移動相Bを含む、請求項42~44のいずれか1項に記載の方法。
- 移動相Bは、約0.1%のギ酸を含む、請求項45に記載の方法。
- クロマトグラフィーにおける移動相Bの割合は、経時的に増加する、請求項45または46に記載の方法。
- 移動相Bは、約2%から約60%まで増加する、請求項47に記載の方法。
- 移動相Bは、約121分間で約2%から約60%まで増加する、請求項48に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求項29~49のいずれか1項に記載の方法。
- 質量分析は、約2.5kVの電源電圧を含む、請求項29~50のいずれか1項に記載の方法。
- 質量分析は、約275℃のキャピラリー温度を含む、請求項29~51のいずれか1項に記載の方法。
- 質量分析のS-レンズRFレベルは、約55%である、請求項29~52のいずれか1項に記載の方法。
- VP1および/またはVP3のN末端は、アセチル化されている、請求項29~53のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子は、組換えAAV(rAAV)粒子である、請求項29~54のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV4カプシド、AAV5カプシド、AAV6カプシド、AAV7カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8カプシド、AAV9カプシド、AAV10カプシド、AAVrh10カプシド、AAV11カプシド、AAV12カプシド、AAV LK03カプシド、AAV2R471Aカプシド、AAV2/2-7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV DJ8カプシド、AAV2N 587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、ヤギAAVカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、ウシAAVカプシド、マウスAAVカプシド、rAAV2/HBoV1(キメラAAV/ヒトボカウイルスウイルス1)、AAV2HBKOカプシド、AAVPHP.BカプシドまたはAAVPHP.eBカプシドを含む、請求項29~55のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドは、チロシン突然変異、ヘパリン結合突然変異、またはHBKO突然変異を含む、請求項55または56に記載の方法。
- VP1、VP2およびVP3の質量は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV4カプシド、AAV5カプシド、AAV6カプシド、AAV7カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8カプシド、AAV9カプシド、AAV10カプシド、AAVrh10カプシド、AAV11カプシド、AAV12カプシド、AAV LK03カプシド、AAV2R471Aカプシド、AAV2/2-7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、ヤギAAVカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、ウシAAVカプシド、マウスAAVカプシド、rAAV2/HBoV1(キメラAAV/ヒトボカウイルスウイルス1)、AAV2HBKOカプシド、AAVPHP.BカプシドまたはAAVPHP.eBカプシドのうちの1つまたはそれ以上の理論的質量に対して比較される、請求項29~57のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス粒子は、AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4
ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10 ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む、請求項29~58のいずれか1項に記載の方法。 - AAV粒子は、異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む、請求項29~59のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項29、30または32~59のいずれか1項に記載の方法と組み合わせた、請求項1、2または4~28のいずれか1項に記載の方法を含む、AAV粒子の血清型を決定する方法。
- 請求項31~60のいずれか1項に記載の方法と組み合わせた、請求項3~28のいずれか1項に記載の方法を含む、AAV粒子の不均一性を決定する方法。
- 組換えAAV(rAAV)粒子であって、親ポリペプチドのVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換を含み;該VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較して、N末端アセチル化を変更する、前記組換えAAV粒子。
- 置換は、より高い頻度のN末端アセチル化またはより低い頻度のN末端アセチル化をもたらす、請求項63に記載のrAAV粒子。
- VP1のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換を含み;VP1のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較して、N末端アセチル化を変更する、請求項63または64に記載のrAAV粒子。
- VP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換を含み;VP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAV粒子のVP3のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較して、N末端アセチル化を変更する、請求項63~65のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- アミノ酸残基2は、Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp,Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、ProまたはTyrで置換されている、請求項63~66のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- アミノ酸残基2は、Ser、AspまたはGluで置換されている、請求項67に記載のrAAV粒子。
- AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV LK03、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV
DJ、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAV、マウスAAV、rAAV2/HBoV1血清型カプシド、AAV2HBKO、AAVPHP.BまたはAAVPHP.eB血清型カプシドを含む、請求項63~68のいずれか1項に記載のrAAV粒子。 - 粒子のカプシド中にチロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異を含む、請求項63
~69のいずれか1項に記載のrAAV粒子。 - rAAVベクターを含む、請求項63~70のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAVベクターは、1つまたはそれ以上のAAV ITRを含む、請求項71に記載のrAAV粒子。
- rAAVベクターは、AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10
ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む、請求項71または72に記載のrAAV粒子。 - AAVカプシドおよびAAV ITRは、同じ血清型に由来する、請求項72または73に記載のrAAV粒子。
- AAVカプシドおよびAAV ITRは、異なる血清型に由来する、請求項72または73に記載のrAAV粒子。
- AAV粒子は、1つまたはそれ以上のAAV ITRに隣接した異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む、請求項71~75のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAVベクターは、自己相補的なベクターである、請求項71~76のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAVベクターは、導入遺伝子をコードする第1の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第2の核酸配列を含み、該第1の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、該第2の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる、請求項77に記載のrAAV粒子。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異したAAV ITRにより連結され、突然変異したAAV ITRは、D領域の欠失を含み、末端解離配列の突然変異を含む、請求項78に記載のrAAV粒子。
- rAAVベクターをコードする核酸ならびにAAV repおよびcap機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、AAVヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される、請求項63~79のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAVヘルパー機能は、AAVヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される、請求項80に記載のrAAV粒子。
- AAVヘルバー機能は、AAVヘルパー機能を提供するAAVヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される、請求項81に記載のrAAV粒子。
- AAVヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項82に記載のrAAV粒子。
- rAAVベクターをコードする核酸ならびにAAV repおよびcap機能をコードする核酸を含み、AAVヘルパー機能をコードする核酸を提供するAAV産生細胞により産生される、請求項63~79のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAV産生細胞は、AAVヘルパー機能をコードする核酸を含む、請求項84に記載のrAAV粒子。
- AAVヘルバー機能は、AAVヘルパー機能を提供するAAVヘルパーウイルスにAAV産生細胞を感染させることにより提供される、請求項84に記載のrAAV粒子。
- AAVヘルバーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項86に記載のrAAV粒子。
- AAV cap機能は、VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換を提供し、該VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較して、N末端アセチル化を変更する、請求項80~87のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 請求項63~88のいずれか1項に記載のrAAV粒子を含む、医薬組成物。
- 請求項63~87のいずれか1項に記載のrAAV粒子または請求項89に記載の医薬組成物を含む、キット。
- 請求項63~87のいずれか1項に記載のrAAV粒子または請求項89に記載の医薬組成物を含む、製造品。
- AAVカプシドタンパク質であって、親AAVカプシドタンパク質のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換を含み;該アミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAVカプシドタンパク質のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較して、N末端アセチル化を変更する、前記AAVカプシドタンパク質。
- 置換は、より高い頻度のN末端アセチル化またはより低い頻度のN末端アセチル化をもたらす、請求項92に記載のAAVカプシドタンパク質。
- VP1またはVP3である、請求項92または93に記載のAAVカプシドタンパク質。
- アミノ酸残基2は、Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp,Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、ProまたはTyrで置換されている、請求項92~94のいずれか1項に記載のAAVカプシドタンパク質。
- アミノ酸残基2は、Ser、AspまたはGluで置換されている、請求項93に記載のAAVカプシドタンパク質。
- アミノ酸置換は、AAVカプシドのより少ない脱アミド化をもたらす、請求項92~96のいずれか1項に記載のAAVカプシドタンパク質。
- AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV LK03、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV
DJ、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシ
AAV、マウスAAV、rAAV2/HBoV1、AAV2HBKO、AAVPHP.BまたはAAVPHP.eB血清型カプシドを含む、請求項92~97のいずれか1項に記載のAAVカプシドタンパク質。 - AAVカプシドタンパク質は、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む、請求項92~98のいずれか1項に記載のrAAVカプシドタンパク質。
- rAAV粒子の安定性を改善する方法であって、親VP1および/またはVP3のVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2を置換する工程を含み;2位におけるアミノ酸を置換する工程が、親VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2と比較して、VP1および/またはVP3のN末端アセチル化を変更する、前記方法。
- 細胞内のrAAV粒子のアセンブリを改善する方法であって、VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2を置換する工程を含み;2位において置換されたアミノ酸は、親VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2と比較して、VP1および/またはVP3のN末端アセチル化を変更する、前記方法。
- 細胞内のrAAV粒子の形質導入を改善する方法であって、親VP1および/またはVP3のVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2を置換する工程を含み、アミノ酸残基2を置換する工程が、親VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2と比較して、VP1および/またはVP3のN末端アセチル化を変更する、前記方法。
- アミノ酸残基2を置換する工程は、より高い頻度のN末端アセチル化またはより低い頻度のN末端アセチル化をもたらす、請求項100~102のいずれか1項に記載の方法。
- VP1のアミノ酸残基2が置換される、請求項100~103のいずれか1項に記載の方法。
- VP3のアミノ酸残基2が置換される、請求項100~104のいずれか1項に記載の方法。
- アミノ酸残基2は、Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp,Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、ProまたはTyrで置換されている、請求項100~105のいずれか1項に記載の方法。
- アミノ酸残基2は、Ser、AspまたはGluで置換されている、請求項106に記載の方法。
- AAV粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV LK03、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAV、マウスAAV、rAAV2/HBoV1、AAV2HBKO、AAVPHP.BまたはAAVPHP.eB血清型カプシドを含む、請求項100~107のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子のカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む、請求項100~108のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、rAAVベクターを含む、請求項100~109のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVベクターは、1つまたはそれ以上のAAV ITRを含む、請求項110に記載の方法。
- rAAVベクターは、AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10
ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む、請求項110または111に記載の方法。 - AAVカプシドおよびAAV ITRは、同じ血清型に由来する、請求項110~112のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドおよびAAV ITRは、異なる血清型に由来する、請求項110~112のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子は、1つまたはそれ以上のAAV ITRに隣接した異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む、請求項110~114のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVベクターは、自己相補的なベクターである、請求項110~115のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVベクターは、導入遺伝子をコードする第1の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第2の核酸配列を含み、該第1の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、該第2の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる、請求項116に記載の方法。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異したAAV ITRにより連結され、突然変異したAAV ITRは、D領域の欠失を含み、末端解離配列の突然変異を含む、請求項117に記載の方法。
- rAAV粒子は、rAAVベクターをコードする核酸ならびにAAV repおよびcap機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、AAVヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される、請求項100~118のいずれか1項に記載の方法。
- AAVヘルパー機能は、AAVヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される、請求項119に記載の方法。
- AAVヘルバー機能は、AAVヘルパー機能を提供するAAVヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される、請求項120に記載の方法。
- AAVヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項121に記載の方法。
- rAAV粒子は、rAAVベクターをコードする核酸ならびにAAV repおよびcap機能をコードする核酸を含み、AAVヘルパー機能をコードする核酸を提供するAAV産生細胞により産生される、請求項100~118のいずれか1項に記載の方法。
- AAV産生細胞は、AAVヘルパー機能をコードする核酸を含む、請求項123に記載の方法。
- AAVヘルバー機能は、AAVヘルパー機能を提供するAAVヘルパーウイルスにAAV産生細胞を感染させることにより提供される、請求項124に記載の方法。
- AAVヘルバーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項125に記載の方法。
- AAV cap機能は、VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換を提供し、該VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるアミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3のアミノ酸残基2におけるN末端アセチル化と比較して、N末端アセチル化を変更する、請求項119~126のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス粒子の血清型を決定する方法であって、
a)該ウイルス粒子を変性させる工程と、
b)該変性したウイルス粒子を液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)に供する工程と、
c)該ウイルス粒子の1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量を決定する工程と
を含み;
該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量の特定の組合せが、ウイルス血清型の指標である、前記方法。 - 1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の計算された質量は、1つまたはそれ以上のウイルス血清型の1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の理論的質量に対して比較される、請求項128に記載の方法。
- ウイルス粒子の不均一性を決定する方法であって、
a)該ウイルス粒子を変性させる工程と、
b)該変性したウイルス粒子を液体クロマトグラフィー/質量分析/質量分析(LC/MS/MS)に供する工程と、
c)該ウイルス粒子の1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量を決定する工程と、
d)工程c)の質量を、ウイルス血清型の1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の理論的質量と比較する工程と
を含み、
該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量のうちの1つまたはそれ以上の偏差が、ウイルスカプシドの不均一性の指標である、前記方法。 - 不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの1つまたはそれ以上を含む、請求項130に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項128~131のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス粒子は、異種導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含む、請求項128
~132のいずれか1項に記載の方法。 - ウイルス粒子の血清型を決定する方法であって、
a)該ウイルス粒子を変性させる工程と、
b)該変性したウイルス粒子を還元および/またはアルキル化に供する工程と、
c)該変性したウイルス粒子を消化に供して、ウイルス粒子の1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を生成する工程と、
d)該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を液体クロマトグラフィー/質量分析-質量分析(LC/MS/MS)に供する工程と、
e)該ウイルス粒子の該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量を決定する工程と
を含み;
該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量の特定の組合せが、ウイルス血清型の指標である、前記方法。 - 1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の計算された質量は、1つまたはそれ以上のウイルス血清型の1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の理論的質量に対して比較される、請求項134に記載の方法。
- ウイルス粒子の血清型の不均一性を決定する方法であって、
a)該ウイルス粒子を変性させる工程と、
b)該変性したウイルス粒子を還元および/またはアルキル化に供する工程と、
c)該変性したウイルス粒子を消化に供して、該ウイルス粒子の1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を生成する工程と、
d)該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片を液体クロマトグラフィー/質量分析-質量分析(LC/MS/MS)に供する工程と、
e)該ウイルス粒子の該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の質量を決定する工程と、
f)工程e)の質量を、ウイルス血清型の該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の断片の理論的質量と比較する工程と
を含み;
該1種またはそれ以上のカプシドタンパク質の質量のうちの1つまたはそれ以上の偏差が、ウイルスカプシドの不均一性の指標である、前記方法。 - 不均一性は、混合血清型、変異体カプシド、カプシドアミノ酸置換、切断型カプシド、または改変カプシドのうちの1つまたはそれ以上を含む、請求項136に記載の方法。
- 液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項134~137のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス粒子は、異種導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含む、請求項134~138のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス粒子は、アデノウイルス科、パルボウイルス科、レトロウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘルペスウイルス科からなる群から選択されるウイルス科に属する、請求項128~139のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス粒子は、アタデノウイルス属、アビアデノウイルス属、イクタデノウイルス属、マストアデノウイルス属、シアデノウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデン
ソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、イテラデンソウイルス属、ペンスチルデンソウイルス属、アムドパルボウイルス属、アベパルボウイルス属、ボカパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、デペンドパルボウイルス属、エリスロパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アルファレトロウイルス属、ベータレトロウイルス属、デルタレトロウイルス属、イプシロンレトロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、レンチウイルス属、スプマウイルス属、アルファバキュロウイルス属、ベータバキュロウイルス属、デルタバキュロウイルス属、ガンマバキュロウイルス属、イルトウイルス属、マルディウイルス属、シンプレックスウイルス属、バリセロウイルス属、サイトメガロウイルス属、ムロメガロウイルス属、プロボシウイルス属、ロゼオロウイルス属、リンホクリプトウイルス属、マカウイルス属、ペルカウイルス属、およびラジノウイルス属からなる群から選択されるウイルス属に属する、請求項140に記載の方法。 - 組換えAAV(rAAV)粒子であって、親AAV粒子のVP1またはVP3のアミノ酸残基A35、N57、G58、N382、G383、N511、G512、N715、またはG716における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、残基の番号付けはAAV2のVP1に基づき;1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、該親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、前記組換えAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、VP1のA35、VP1のN57、VP1のG58、VP3のN382、VP3のG383、VP3のN511、VP3のG512、VP3のN715、またはVP3のG716のアミノ酸残基にあり、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、請求項142に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、VP1のN57、VP3のN382、VP3のN511、またはVP3のN715におけるAspの置換を含み、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、より高い頻度の脱アミド化をもたらす、請求項142に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、N57KまたはN57Q置換を含み、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす、請求項142に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、VP1のA35におけるAsnの置換を含み、親AAV粒子のVP1の脱アミド化と比較して、より高い頻度の脱アミド化をもたらす、請求項142に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、VP1のG58、VP3のG383、VP3のG512、またはVP3のG716にあり、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、より低い頻度の脱アミド化をもたらす、請求項142に記載のrAAV粒子。
- VP1のG58は、Aspで置換されている、請求項147に記載のrAAV粒子。
- rAAV粒子は、AAV1粒子またはAAV2粒子である、請求項142~148のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 請求項142~149のいずれか1項に記載のrAAV粒子を含む、医薬組成物。
- 請求項142~149のいずれか1項に記載のrAAV粒子または請求項150に記載の医薬組成物を含む、キット。
- 請求項142~149のいずれか1項に記載のrAAV粒子または請求項150に記載の医薬組成物を含む、製造品。
- AAVカプシドタンパク質であって、親AAVカプシドタンパク質のアミノ酸置換を含み;該アミノ酸置換は、親AAVカプシドタンパク質と比較して、カプシドの脱アミド化を変更する、前記AAVカプシドタンパク質。
- rAAV粒子の安定性を改善する方法であって、親VP1および/またはVP3のVP1および/またはVP3の1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、該1つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、A35、N57、G58、N382、G383、N511、G512、N715、またはG716であり、残基の番号付けはAAV2のVP1に基づき;アミノ酸置換は、親VP1および/またはVP3のアミノ酸残基2と比較して、脱アミド化を変更する、前記方法。
- 細胞内のrAAV粒子のアセンブリを改善する方法であって、VP1および/またはVP3の1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、該1つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、A35、N57、G58、N382、G383、N511、G512、N715、またはG716であり、残基の番号付けはAAV2のVP1に基づき;アミノ酸置換は、親VP1および/またはVP3のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、前記方法。
- 細胞内のrAAV粒子の形質導入を改善する方法であって、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換する工程を含み、該1つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、A35、N57、G58、N382、G383、N511、G512、N715、またはG716であり、残基の番号付けはAAV2のVP1に基づき;アミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、前記方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、VP1のA35、VP1のN57、VP1のG58、VP3のN382、VP3のG383、VP3のN511、VP3のG512、VP3のN715、またはVP3のG716にあり;該アミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、請求項154~156のいずれか1項に記載の方法。
- VP1の35位における親Ala残基は、Asnで置換されている、請求項154~157のいずれか1項に記載の方法。
- VP1の58位における親Gly残基は、Aspで置換されている、請求項154~158のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV LK03、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV DJ8カプシド、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAV、マウスAAV、rAAV2/HBoV1、AAV2HBKO、AAVPHP.BまたはAAVPHP.eB血清型カプシドを含む、請求項154~159のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子のカプシドは、チロシン突然変異またはヘパリン結合突然変異をさらに含む、請求項154~160のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV1粒子またはAAV2粒子である、請求項154~160のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、rAAVベクターを含む、請求項154~162のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVベクターは、1つまたはそれ以上のAAV ITRを含む、請求項163に記載の方法。
- rAAVベクターは、AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAVrh8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、AAVrh10
ITR、AAV11 ITR、またはAAV12 ITRを含む、請求項163または164に記載の方法。 - AAVカプシドおよびAAV ITRは、同じ血清型に由来する、請求項164~165のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドおよびAAV ITRは、異なる血清型に由来する、請求項164~166のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子は、1つまたはそれ以上のAAV ITRに隣接した異種導入遺伝子をコードするAAVベクターを含む、請求項164~167のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVベクターは、自己相補的なベクターである、請求項164~168のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVベクターは、導入遺伝子をコードする第1の核酸配列および導入遺伝子の相補体をコードする第2の核酸配列を含み、該第1の核酸配列は、そのほとんどまたはすべての長さに沿って、該第2の核酸配列と鎖内塩基対を形成することができる、請求項169に記載の方法。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異したAAV ITRにより連結され、突然変異したAAV ITRは、D領域の欠失を含み、末端解離配列の突然変異を含む、請求項170に記載の方法。
- rAAV粒子は、rAAVベクターをコードする核酸ならびにAAV repおよびcap機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトし、AAVヘルパー機能をコードする核酸を提供することにより産生される、請求項164~171のいずれか1項に記載の方法。
- AAVヘルパー機能は、AAVヘルパー機能をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトすることにより提供される、請求項172に記載の方法。
- AAVヘルバー機能は、AAVヘルパー機能を提供するAAVヘルパーウイルスに宿主細胞を感染させることにより提供される、請求項173に記載の方法。
- AAVヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項174に記載の方法。
- rAAV粒子は、rAAVベクターをコードする核酸ならびにAAV repおよびcap機能をコードする核酸を含み、AAVヘルパー機能をコードする核酸を提供するAAV産生細胞により産生される、請求項164~175のいずれか1項に記載の方法。
- AAV産生細胞は、AAVヘルパー機能をコードする核酸を含む、請求項176に記載の方法。
- AAVヘルバー機能は、AAVヘルパー機能を提供するAAVヘルパーウイルスにAAV産生細胞を感染させることにより提供される、請求項177に記載の方法。
- AAVヘルバーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項178に記載の方法。
- AAV cap機能は、VP1および/またはVP3のアミノ酸置換を提供し、該VP1および/またはVP3のアミノ酸置換は、親AAV粒子のVP1および/またはVP3の脱アミド化と比較して、脱アミド化を変更する、請求項172~179のいずれか1項に記載の方法。
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