ES2216005T3 - Produccion de titulos elevados de vectores de aav recombinantes. - Google Patents

Abstract

VECTORES AAV PUEDEN TENER UTILIDAD PARA TERAPIA GENICA AUNQUE ANTERIORMENTE UN OBSTACULO IMPORTANTE FUE LA INCAPACIDAD DE GENERAR CANTIDADES SUFICIENTES DE DICHOS VECTORES RECOMBINANTES EN CANTIDADES QUE SERIAN CLINICAMENTE UTILES PARA APLICACION DE TERAPIA GENICA HUMANA. LAS LINEAS CELULARES DE EMPAQUETAMIENTO AAV SIN AYUDA, ESTABLES HAN SIDO EVASIVAS, PRINCIPALMENTE DEBIDO A LAS ACTIVIDADES DE LA PROTEINA REP, QUE REGULA BAJO SU PROPIA EXPRESION Y TRASTORNA LA INMORTALIDAD CELULAR. ESTA INVENCION PROPORCIONA SISTEMAS DE EMPAQUETAMIENTO Y PROCESOS PARA EMPAQUETAR VECTORES AAV QUE EVITAN DE FORMA EFECTIVA ESTOS PROBLEMAS SUSTITUYENDO EL PROMOTOR AAV P5 POR UN PROMOTOR HETEROLOGO Y QUE PERMITE UNA EFICACIA DE EMPAQUETAMIENTO SUSTANCIALMENTE MEJORADA.

Description

Producción de títulos elevados de vectores de AAV recombinantes.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a la terapia génica, y más específicamente a materiales y métodos utilizados para la generación de títulos elevados de vectores de AAV recombinante para su uso en los procedimientos de la terapia génica.

Antecedentes de la invención

Los vectores de AAV pueden tener utilidad para la terapia génica pero hasta ahora un obstáculo significativo ha sido la incapacidad para generar cantidades suficientes de tales vectores recombinantes en cantidades que serían clínicamente útiles para la aplicación de la terapia génica en humanos. Este es un problema concreto para las aplicaciones in vivo tales como la liberación directa al pulmón.

Los vectores de virus adeno-asociados (AAV) se encuentran entre un pequeño número de sistemas vectores de virus recombinantes que se ha demostrado que tienen utilidad como agentes de trasferencia génica in vivo (revisado por Carter, 1.992, Current Opinion in Biotechnology, 3:533-539, Muzcyzka, 1.992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129) y por tanto son potencialmente de gran importancia para la terapia génica en humanos. Los vectores de AAV son susceptibles de la integración de ADN estable de alta frecuencia y la expresión en una variedad de células incluyendo las células epiteliales bronquiales y nasales de la fibrosis quística (CF) (Flotte y col., 1.992a, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356; Egan y col., 1.992, Nature, 358:581-584; Flotte y col., 1.993a, J. Biol. Chem. 268:3781-3790; Flotte y col., 1.993b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, en imprenta), células de eritroleucemia derivadas de médula ósea humana (Walsh y col., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7257-7261), y otras muchas. AAV no requiere una división celular activa para la expresión estable lo que podría ser una clara ventaja sobre otros virus, especialmente en tejidos tales como el epitelio de las vías respiratorias humanas donde la mayor parte de las células están diferenciadas terminalmente y no en división.

AAV es un parvovirus defectuoso que crece sólo en células en las que ciertas funciones son proporcionadas por un virus coadyuvante que infecta simultáneamente (ver la Fig. 1). Las revisiones generales de AAV se pueden encontrar en Carter, 1.989, Handbook of Parvoviruses, Vol. I, págs. 169-228, Carter, 1.989, Handbook of Parvoviruses, Vol. I, págs. 169-228, Bernes, 1.990, Virology, págs. 1743-1764, Raven Press, (Nueva York). Son ejemplos de los virus que infectan simultáneamente que proporcionan funciones coadyuvantes para el crecimiento y la replicación de AAV los adenovirus, los herpesvirus y en algunos casos los poxvirus tales como vaccinia. La naturaleza de la función coadyuvante no es conocida pero parece haber cierto efecto indirecto del virus coadyuvante que hace a la célula permisiva para la replicación del AAV. Este concepto está apoyado por la observación de que en ciertos casos la replicación de AAV se puede producir a un bajo nivel de eficacia en ausencia de infección simultánea del virus coadyuvante si las células se tratan con agentes que sean o bien genotóxicos o bien que desorganicen el ciclo celular.

Aunque el AAV puede replicar hasta un grado limitado en ausencia de virus coadyuvante en ciertas condiciones inusuales, como se ha observado antes, el resultado más general es que la infección de las células con AAV en ausencia de funciones coadyuvantes da como resultado la integración de AAV en el genoma de la célula huésped. El genoma de AAV integrado puede ser rescatado y replicado para rendir un estallido de partículas de AAV de la progenie infecciosa si las células que contienen un provirus de AAV integrado son superinfectadas con un virus coadyuvante tal como un adenovirus. Debido a que la integración de AAV parece ser un evento eficaz, esto sugiere que AAV podría ser un vector útil para introducir genes en células para la expresión estable para usos tales como la terapia génica en humanos. Los resultados más recientes (Kotin & Berns, 1.989, Virology 170:460-467; Kotin y col., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2211-2215; Samulski y col., 1.991, EMBO J. 10:3941-3950) han sugerido que AAV puede manifestar cierta preferencia hacia la integración en un sitio del cromosoma humano 19 pero la generalidad y el mecanismo de este fenómeno no han sido completamente elucidados.

AAV tiene una gama de huéspedes muy amplia sin una especie o una especificidad de tejido obvia y replicará virtualmente en cualquier línea celular de origen humano, simio o roedor siempre que esté presente un coadyuvante apropiado. AAV es ubicuo y ha sido aislado de una amplia variedad de especies animales incluyendo la mayor parte de los mamíferos y diversas especies de aves.

AAV no ha sido asociado con la causa de ninguna enfermedad. AAV no es un virus transformante ni oncogénico. La integración de AAV en los cromosomas de líneas celulares humanas no causa alteración significativa alguna en las propiedades de crecimiento o en las características morfológicas de las células. Estas propiedades de AAV también lo recomiendan como un vector para la terapia génica en humanos potencialmente útil debido a que la mayor parte de los otros sistemas virales propuestos para esta aplicación tales como retrovirus, adenovirus, herpesvirus, o poxvirus son virus causantes de enfermedades.

Las partículas de AAV están formadas por una cápsida de proteína que tiene tres proteínas de la cápsida, VP1, VP2 y VP3, y que engloban un genoma de ADN. El genoma de ADN de AAV es una molécula de ADN de hebra sencilla lineal que tiene un peso molecular de aproximadamente 1,5 x 10^{6} daltons o aproximadamente 4680 nucleótidos de longitud. La hebras de cualquier sentido complementario, hebras "más" o "menos", están empaquetadas en partículas individuales pero cada partícula tiene sólo una molécula de ADN. El mismo número de partículas de AAV contienen una hebra más o una hebra menos. Cualquier hebra es igualmente infecciosa y la replicación se produce por conversión de la hebra sencilla infecciosa parental en una forma dúplex y posterior amplificación de una gran reserva de moléculas dúplex a partir de la cual las hebras sencillas de la progenie se desplazan y se empaquetan en cápsidas. Las copias dúplex o de hebra sencilla de los genomas de AAV insertadas en los plásmidos bacterianos o fagémidos son infecciosas cuando son transfectadas en células infectadas con adenovirus, y esto ha permitido el estudio de la genética de AAV y el desarrollo de vectores de AAV. El ciclo de replicación de AAV se esquematiza en la Figura 1.

El genoma de AAV2 tiene una copia de la ITR (repetición terminal invertida) de 145 nucleótidos de longitud de cada extremo y una única región de la secuencia de aproximadamente 4470 nucleótidos de longitud (Srivastava y col., 1.983, J. Virol., 45:555-564) que contiene dos marcos de lectura abiertos principales para los genes rep y cap (Hermonat y col., J. Virol, 51:329-339; Tratschin y col., 1.984a, J. Virol., 51:611-619). La región única contiene tres promotores de la transcripción p_{5}, p_{19} y p_{40} (Laughlin y col., 1.979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5567-5571) que se utilizan para expresar los genes rep y cap. Las secuencias de ITR son requeridas en cis y son suficientes para proporcionar un origen funcional de replicación (ori) y también son suficientes para proporcionar las señales requeridas para la integración en el genoma celular así como para la escisión eficaz y el rescate a partir de los cromosomas de la célula huésped o a partir de plásmidos recombinantes. Además se ha demostrado que la ITR puede funcionar directamente como un promotor de la transcripción en un vector de AAV (Flotte y col., 1.993, vide supra).

Los genes rep y cap son requeridos en trans para proporcionar funciones para la replicación y encapsidación del genoma viral respectivamente. El gen rep es expresado a partir de dos promotores p_{5} y p_{19}. La transcripción de p_{5} rinde un ARNm de 4,2 kb no empalmado que codifica una proteína, Rep78, y un ARNm de 3,9 kb empalmado que codifica una proteína Rep68. La transcripción de p_{19} rinde un ARNm no emplamado que codifica Rep52 y un ARNm de 3,3 kb empalmado que codifica Rep40. Así, las cuatro proteínas Rep comprenden una secuencia de la región interna común pero difieren con respecto a sus regiones amino y carboxilo terminales. Sólo Rep78 y Rep68 son requeridas para la replicación del ADN dúplex de AAV, pero Rep52 y Rep40 parecen ser necesarias para la acumulación de ADN de hebra sencilla de la progenie. Las mutaciones en Rep78 y Rep68 son fenotípicamente Rep^{-} mientras la mutaciones que afectan solo a Rep52 y Rep40 son Rep^{+} pero Ssd. Rep68 y Rep78 se unen específicamente a la conformación en horquilla de la ITR de AAV y poseen diversas actividades enzimáticas requeridas para resolver la replicación en los extremos de AAV. Rep52 y Rep40 no tienen ninguna de estas propiedades.

Las proteínas Rep, principalmente Rp78 y Rep68 manifiestan numerosas actividades reguladoras pleiotrópicas incluyendo la regulación positiva y negativa de los genes de AAV y la expresión a partir de algunos promotores heterólogos, así como efectos inhibidores del crecimiento celular (Tratschin y col., 1.986, Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894; Labow y col., 1,987, Mol. Cell. Biol., 7:1320-1325; Khleif y col., Virology, 181:738-741). El promotor p_{5} de AAV está autorregulado negativamente por Rep78 y Rep68 (Tratschin y col., 1.986, Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894). Debido a los efectos inhibidores de la expresión de rep sobre el crecimiento celular, no se ha alcanzado fácilmente la expresión constitutiva de rep en las líneas celulares. Por ejemplo, Mendelson y col. (1.988, Virology, 166:154-165) informaron de un nivel de expresión muy bajo de ciertas proteínas Rep en ciertas líneas celulares tras la integración estable de genomas de AAV.

Las proteínas VP1, VP2, y VP3 comparten todas una secuencia de solapamiento común pero difieren en que VP1 y VP2 contienen secuencias amino terminales adicionales. Las tres están codificadas a partir del mismo marco de lectura del gen cap expresado a partir de un ARNm de 2,3 kb empalmado transcrito a partir del promotor p_{40}. VP2 y VP3 son generados a partir del mismo ARNm mediante el uso de codones de iniciación alternos. VP1 es codificada a partir de un ARNm minoritario utilizando el sitio donador 3' que está 30 nucleótidos aguas arriba del donador 3' utilizado para el ARNm principal que codifica VP2 y VP3. VP1, VP2, y VP3 son requeridas para la producción de la cápsida. Las mutaciones que eliminan las tres proteínas (Cap^{-}) evitan la acumulación de ADN de AAV en la progenie de hebra sencilla mientras las mutaciones en el exttremo amino de VP1 (Lip^{-} Inf^{-}) permiten la producción de la hebra sencilla pero evitan el ensamblaje de partículas infecciosas estables.

El análisis genético de AAV que se había descrito antes se basaba en el análisis mutacional de los genomas de AAV que eran clonados molecularmente en plásmidos bacterianos. En los primeros trabajos, se construyeron clones moleculares de genomas infecciosos de AAV mediante la inserción de moléculas de doble hebra de AAV en plásmidos mediante procedimientos tales como la formación de colas de GC (Samulski y col., 1.982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2077-2081), la adición de conectores sintéticos conteniendo endonucleasas de restricción (Laughlin y col., 1.983, Gene, 23:65-73) o mediante ligadura de extremos romos, directa (Senapathy & Carter, 1.984, J. Biol. Chem.,259:4661-4666). Se demostró después que la transfección de semejantes plásmidos recombinantes de AAV of células de mamífero que también eran infectados con un virus coadyuvante apropiado, tal como adenovirus, daba como resultado el rescate y la escisión del genoma de AAV libre de cualquier secuencia plasmídica y la replicación del genoma rescatado y la generación de una cosecha de partículas de AAV infecciosas de la progenie (ver la Fig. 1). Esto proporcionaba la base para realizar el análisis genético de AAV como se ha resumido antes y permitía la construcción de vectores transductores de AAV.

Basándose en el análisis genético, se definieron los principios generales de la construcción del vector de AAV como se ha revisado recientemente (Carter, 1.992, Current Opinions in Biotechnology, 3:533-539; Muzyczka, 1.992, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129). Los vectores de AAV fueron construidos en plásmidos recombinantes de AAV sustituyendo las porciones de la secuencia codificadora de AAV por el ADN foráneo para generar un plásmido vector. En el plásmido vector, las porciones terminales (ITR) de la secuencia de AAV deben ser conservadas intactas debido a que estas regiones son necesarias en cis para numerosas funciones incluyendo la escisión del plásmido tras la transfección, la replicación del genoma vector y la integración y el rescate del genoma de la célula huésped. Después el vector puede ser empaquetado en una partícula de AAV para generar un virus transductor de AAV mediante transfección del plásmido vector en células que son infectadas por un virus coadyuvante apropiado tal como adenovirus o herpesvirus. Con el fin de lograr la replicación y la encapsidación del genoma del vector en partículas de AAV, el plásmido vector debe ser complementado para cualquiera de las funciones de AAV requeridas en trans, esto es rep y cap, que fueron suprimidas en la construcción del plásmido vector.

Existen al menos dos rasgos deseables de cualquier vector de AAV que se diseña para su uso en la terapia génica en humanos. Primero, el vector transductor debe ser generado con unos títulos suficientemente elevados de manera que sea practicable como sistema de liberación. Esto es especialmente importante para las estratagemas de la terapia génica dirigidas a una liberación in vivo del vector. Es probable que para muchas aplicaciones deseables de los vectores de AAV, tales como el tratamiento de la fibrosis quística mediante la liberación in vivo directa a las vías respiratorias, la dosis requerida de vector transductor puede superar 10^{10}. En segundo lugar, las preparaciones de vector deben estar libres de virus AAV de tipo salvaje. La consecución de elevados títulos de vectores de AAV ha sido difícil por varias razones incluyendo la encapsidación preferente de los genomas de AAV de tipo salvaje si están presentes o se generan por recombinación, y la incapacidad de generar suficientes funciones complementadoras tales como rep o cap. No se han generado líneas celulares útiles que expresen tales funciones complementadoras, en parte, debido a las diversas funciones inhibidoras del gen rep.

Los primeros vectores de AAV que fueron descritos contenían genes informadores foráneos tales como neo o cat o dhfr que eran expresados a partir de promotores de la transcripción de AAV o de un promotor SV40 (Tratschin y col., 1.984b, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Hermonat & Muzyczka, 1.984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; Tratschin y col., 1.985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260; McLaughlin y col., 1.988, J. Virol., 62:1963-1973; Lebkowski y col., 1.988 Mol. Cell. Biol. 7:349-356). Estos vectores fueron empaquetados en partículas transductoras de AAV mediante transfección simultánea en células infectadas por adenovirus junto con un segundo plásmido de empaquetamiento que contenía los genes rep y cap expresados a partir de los promotores de la transcripción de AAV de tipo salvaje naturales. En un intento de evitar el empaquetamiento del plásmido de empaquetamiento que contenía los genes rep y cap de AAV expresados a partir de los promotores de la transcripción de AAV de tipo salvaje natural. En un intento de evitar el empaquetamiento del plásmido de empaquetamiento en partículas de AAV se adoptaron diversos enfoques. En algunos casos, (Hermonat & Muzyczka, 1.984; Mclaughlin y col., 1.988) el plásmido de empaquetamiento tenía insertada una región grande del ADN del bacteriófago lambda dentro de la secuencia de AAV para generar un genoma sobredimensionado que podía no ser empaquetado. En otros casos, (Tratschin y col., 1.984b; Tratschin y col., 1.985, Lebkowski y col., 1.988), el plásmido de empaquetamiento tenía suprimidas las regiones ITR de AAV con el fin de que no pudiera ser escindido y replicado y por tanto no pudiera ser empaquetado. Todos estos enfoques fracasaban al evitar la generación de partículas que contenían ADN de AAV de tipo salvaje y también fracasaban al generar títulos elevados eficaces de partículas transductoras de AAV. De hecho, Hermonat & Muzyczka, 1.984, citaban títulos de no más de 10^{4} ml. La producción de partículas de AAV de tipo salvaje en estos estudios se debía probablemente a la presencia de una homología solapante entre las secuencias de AAV presentes en el vector y los plásmidos de empaquetamiento. Senapathy y Carter (1.984, J. Biol. Chem. 259:4661-4666) demostraron que el grado de recombinación en semejante sistema es aproximadamente equivalente al grado de solapamiento de la secuencia. Se sugirió en una revisión del primer trabajo (Carter 1.989, Handbook of Parvoviruses, Vol. II, págs. 247-284, CRC Press, Boca Raton, FL) que se podrían obtener títulos de 10^{6} por ml, pero esto se basaba en los estudios citados antes en los que grandes cantidades de AAV de tipo salvaje contaminaban la preparación del vector. Tales preparaciones de vector que contenían AAV de tipo salvaje no eran útiles en la terapia génica humana. Además, estos primeros vectores mostraban eficacias de transducción bajas y no transducían más del 4 o 2% de las células de los cultivos de diversas líneas celulares humanas incluso aunque los vectores fueran suministrados a multiplicidades de hasta 50.000 partículas por célula. Esto puede haber reflejado en parte la contaminación con partículas de AAV de tipo salvaje y la presencia del gen rep de AAV en el vector. Además, Samulski y col. (1.989, J. Virol.63:3822-3828) mostraron que la presencia de AAV de tipo salvaje intensificaba significativamente el rendimiento de vector empaquetado. Así, en los sistemas de empaquetamiento en los que se elimina la producción de AAV de tipo salvaje, el rendimiento de vector empaquetado puede ser realmente disminuida. Con todo, para el uso en cualquier aplicación clínica en humanos será esencial eliminar la producción de AAV de tipo salvaje.

Los estudios adicionales (McLaughlin y col., 1.988: Lebkowski y col., 1.988) para generar vectores de AAV que no contuvieran el gen rep o cap de AAV todavía se encontraban con la generación de AAV de tipo salvaje y todavía producían frecuencias de transducción muy bajas en líneas celulares humanas. Así, McLaughlin y col., 1.988 informaron que los vectores rep^{-}cap^{-} de AAV que contenían el gen neo empaquetado con el mismo plásmido de empaquetamiento utilizado antes por Hermonat & Muzyczka (1.984) todavía contenían AAV de tipo salvaje. Como consecuencia sólo era posible utilizar este virus a una multiplicidad de 0,03 partículas por célula (es decir, 300 unidades infecciosas por 10.000 células) para evitar dobles impactos con el vector y las partículas de tipo salvaje. Cuando el experimento se realizaba de este modo, infectando 32.000 células con 1.000 unidades infecciosas, se obtenía un promedio de 800 colonias resistentes a la geneticina. Aunque esto se interpretaba como demostración de que el virus era capaz de rendir una frecuencia de transducción del 80%, de hecho sólo el 2,5% de las células eran transducidas. Así se limitaba el título efectivamente útil de este vector. Además, este estudio no demostraba que el título real de la preparación de vector era apenas más alto que los obtenidos previamente por Hermonat & Muzyczka (1.984). De un modo similar, Lebkowski y col., 1.988, empaquetaron vectores de AAV que no contenían el gen rep ni el cap y utilizaron un plásmido de empaquetamiento ori^{-} pBa1A idéntico al utilizado antes por Tratschin y col., (1.984b, 1.985) e informaron sobre frecuencias de transducción que eran similarmente bajas, ya que para muchas líneas celulares humanas no más del 1% de las células podían ser transducidas para la resistencia a la geniticina incluso con sus soluciones de partida del vector más concentradas. Lebkowski y col., (1.988) no informaron sobre los títulos reales del vector de un modo significativo pero los análisis biológicos que muestran una frecuencia de transducción de no más del 1% cuando 5 x 10^{6} células eran expuestas a tres ml de preparación de vector indican que el título era menor de 2 x 10^{4}. Asimismo, el plásmido de empaquetamiento pBa1 contiene homología de solapamiento con la secuencia ITR y conduce a la generación de AAV de tipo salvaje.

Laface y col., (1.988) utilizaron el mismo vector que el utilizado por Hermonat & Muzyczka (1.984) preparado de la misma manera y obtuvieron una frecuencia de transducción del 1,5% en cultivos de médula ósea murina que de nuevo mostraban un título muy bajo.

Samulski y col., (1.987, J. Virol., 61:3096-3101) construyeron un plásmido denominado pSub201 que era un genoma de AAV intacto en un plásmido bacteriano pero que tenía una deleción de 13 nucleótidos en la extremidad de cada ITR y por tanto era rescatado y replicado menos eficazmente que otros plásmidos de AAV que contenían el genoma completo de AAV. Samulski y col. (1.989, J. Virol., 63:3822-3828) construyeron vectores de AAV basados en pSub201 pero con rep y cap suprimidos y conteniendo un gen hyg o neo expresado a partir de un promotor del gen temprano de SV40. Empaquetaron estos vectores mediante transfección simultánea con un plásmido de empaquetamiento denominado pAAV/Ad que constaba de la secuencia de nucleótidos de AAV completa desde el nucleótido 190 hasta el 4490 incluida en cualquier extremo con una copia de la ITR del adenovirus. En este plásmido de empaquetamiento los genes rep y cap de AAV eran expresados a partir de los promotores de AAV naturales p_{5}, p_{19} y p_{40}. Se pensó que la función de la ITR del adenovirus en pAAV/Ad era intensificar el nivel de expresión de las proteínas de la cápsida de AAV. No obstante, rep es expresado a partir de su promotor homólogo y está regulado negativamente y de ese modo su expresión es limitada. Utilizando su sistema de encapsidación Samulski y col., 1.989, generaron soluciones de partida de vector de AAV que estaban sustancialmente libres de AAV de tipo salvaje pero tenían títulos de transducción de sólo 3 x 10^{4} unidades resistentes a higromicina por ml de sobrenadante. Cuando se utilizaba un genoma de AAV de tipo salvaje en el plásmido de empaquetamiento el título de prep del vector AAV aumentaba hasta 5 x 10^{4}. El escaso título producido en este sistema parece por tanto haberse debido en parte al defecto de las secuencias de ITR del plásmido pSub201 básico utilizado para la construcción del vector y en parte debido a la expresión limitante de los genes de AAV a partir de pAAV/Ad. En un intento de incrementar el título de la preparación del vector AAVneo, Samulski y col., 1.989, generaron soluciones de partida de vector transfectando, en masa, treinta placas de 10 cm de células 293 y concentrando la solución de partida de vector mediante formación de bandas en CsCl. Esto producía una solución de partida de vector AAVneo que contenía un total de 10^{8} partículas medido mediante un análisis de hibridación puntual del ADN. Cuando esta solución de partida del vector era utilizada a multiplicidades de hasta 1.000 partículas por célula, se obtenía una frecuencia de transducción del 70%. Esto sugiere que la proporción de partícula-a-transducción es de aproximadamente 500 a 1.000 partículas puesto que a la proporción de una unidad de transducción por célula, la proporción de células esperada que debería ser transducida es del 63% según la distribución de Poisson.

Aunque el sistema de Samulski y col., 1.989, en el que se utiliza el plásmido vector pSub201 y el plásmido de empaquetamiento pAAV/Ad no tenía homología de solapamiento en la secuencia de AAV entre los dos plásmidos, existe homología de solapamiento en los sitios XbaI y la recombinación de estos sitios conduce a la generación de AAV de tipo salvaje completo. Esto es, aunque la homología de solapamiento de la secuencia de AAV no está presente, la secuencia de AAV completa está contenida en los dos plásmidos, y por tanto la recombinación puede generar AAV de tipo salvaje, lo que no es deseable. Que esta clase de recombinación se produce en los plásmidos de AAV fue demostrado por Senapathy & Carter (1.984, J. Biol. Chem. 259:4661-4666). Por lo tanto, debido a los problemas del bajo título y de la capacidad de generar recombinantes de tipo salvaje, el sistema descrito por Samulski y col., 1.989, no tiene utilidad para la terapia génica humana.

En otros informes diversos se han descrito vectores de AAV. Srivastava y col., (1.989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8078-8082) describen un vector de AAV basado en el plásmido pSub201 de Samulski y col., (1.987), en el que las secuencias codificadoras de AAV eran remplazadas por las secuencias codificadoras de otro parvovirus, B19. Este vector fue empaquetado en partículas de AAV utilizando el plásmido de empaquetamiento pAAV/Ad y generaba un vector funcional, pero no se informaba sobre los títulos. Este sistema estaba basado en pSub201 y por tanto adolece de los defectos descritos antes para este plásmido. Segundo, el vector y el plásmido de empaquetamiento contenían ambos las secuencias de AAV solapantes (las regiones ITR) y por tanto la recombinación para dar virus de tipo salvaje contaminante era muy probable.

WO92/10574 tiene que ver con la inhibición del HIV. Este documento hace referencia a los plásmidos que tienen un gen rep conectado operablemente con el promotor HIV-LTR y que contienen una secuencia A17VITR.

Chaterjee y col., (1.991, Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 85-89), Wong y col., (1.991 Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 183-189) y Chaterjee y col. (1.992, Science, 258:1485-1488) describen vectores de AAV diseñados para expresar ARN antisentido dirigido contra virus infecciosos tales como HIV o Virus del Herpes Simplex. No obstante, estos autores no informaron sobre ninguno de los títulos de sus soluciones de partida de AAV. Además, empaquetaron sus vectores utilizando un plásmido de empaquetamiento Ori análogo al utilizado por Tratschin y col. (1.984b, 1.985) que contenía el fragmento Ba1A del genoma de AAV y por lo tanto su plásmido de empaquetamiento contenía secuencias del vector AAV que tenían homología con las secuencias de AAV que estaban presentes en sus constructos vectores. Esto también conducirá a la generación de AAV de tipo salvaje. Así, Chaterjee y col., y Wong y col., utilizaron sistemas de empaquetamiento conocidos por proporcionar sólo títulos bajos y que pueden conducir a la generación de genomas de AAV de tipo salvaje debido a la homología de solapamiento del vector y las secuencias de empaquetamiento.

En otros informes se ha descrito el uso de vectores de AAV para expresar genes en linfocitos humanos (Muro-Cacho y col., 1.992, J. Immunotherapy, 11:231-237) o en una línea celular de leucemia eritroide humana (Walsh y col., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7257-7261) con vectores basados en el plásmido vector pSub201 y el plásmido de empaquetamiento pAAV/Ad. De nuevo, no se informó sobre los títulos de las soluciones de partida y eran aparentemente bajos debido a que se utilizó un gen marcador selectivo para identificar aquellas células que habían sido transducidas con éxito con el vector.

Se informó sobre la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas, desarrolladas in vitro a partir de un paciente con fibrosis quística, con un vector de AAV que expresaba el gen neo marcador selectivo a partir del promotor p_{5} de AAV (Flotte y col., 1.992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356). En este estudio el vector AAVneo era empaquetado en partículas de AAV utilizando el plásmido de empaquetamiento pAAV/Ad. Hasta el 70% de las células del cultivo pudieron ser transducidas para la resistencia a la geneticina y la proporción de partícula-a-transducción era similar a la referida por Samulski y col., (1.989). Así para obtener una transducción del 70% de las células, se requería una multiplicidad de hasta varios cientos de partículas de vector por célula. La transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas en cultivo in vitro utilizando un vector de transducción de AAV que expresaba el gen CFTR a partir del promotor ITR de AAV mostraba que las células podían ser corregidas funcionalmente para el defecto electrofisiológico en la función del canal de cloruro que existe en las células de los pacientes con fibrosis quística (Egan y col., Nature, 1.992, 358:581-584; Flotte y col., J. Biol. Chem. 268:3781-
3790).

Los estudios anteriormente citados sugieren que los vectores de AAV pueden tener una utilidad potencial como vectores para el tratamiento de enfermedades humanas mediante terapia génica. Sin embargo, la capacidad para generar suficientes cantidades de vectores de AAV ha sido una grave limitación del desarrollo de la terapia génica en humanos utilizando vectores de AAV. Un aspecto de esta limitación también ha dado como resultado la ausencia previa de cualquier estudio en el que se utilicen vectores de AAV en modelos animales in vivo. Esto es generalmente reflejo de la dificultad asociada con la generación de cantidades suficientes de soluciones de partida del vector de AAV que tienen un título suficientemente elevado para ser útil en el análisis de la liberación in vivo y la expresión génica. Uno de los factores limitantes para la terapia génica de AAV ha sido la relativa ineficacia de los sistemas de empaquetamiento de vectores que se han utilizado. Debido a la carencia de líneas celulares que expresan las funciones complementadoras en trans de AAV, tales como rep y cap, se ha logrado el empaquetamiento de los vectores de AAV en células infectadas con adenovirus mediante transfección simultánea de un plásmido de empaquetamiento y un plásmido vector. La eficacia de este procedimiento puede estar limitada por la eficacia de transfección de cada uno de los constructos plasmídicos, y por el nivel de expresión de las proteínas Rep a partir de los plásmidos de empaquetamiento descritos hasta la fecha. Cada uno de estos problemas parece corresponderse con las actividades biológicas de las proteínas Rep de AAV. Además, como se ha observado antes, todos los sistemas de empaquetamiento descritos antes tienen la capacidad de generar AAV de tipo salvaje por recombinación.

La carencia de líneas celulares que expresen establemente Rep funcional refleja aparentemente una función citotóxica o citostática de Rep como se demuestra mediante la inhibición por Rep de la formación de colonias resistentes a neo (Labow y col., 1.987; Trempe y col., 1.991). Esto también parece estar relacionado con la tendencia de Rep a invertir el fenotipo inmortalizado en células cultivadas, que ha hecho extremadamente difícil la producción de líneas celulares que expresan establemente Rep funcional. Se han realizado numerosos intentos para generar líneas celulares que expresen Rep. Mendelson y col., (1.988, Virology, 166:154-165) informaron sobre la obtención en una línea celular de un nivel algo bajo de la expresión de AAV Rep52 pero no de proteína Rep78 o Rep68 tras la transfección estable de HeLa o células 293 con plásmidos que contienen el gen rep de AAV. Debido a la ausencia de las proteínas Rep78 y Rep68, el vector no podía ser producido en la línea celular. Otra línea celular elaboraba una cantidad apenas detectable de Rep78 que no era funcional.

Vincent y col. (1.990, Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pág. 353-359) intentaron generar líneas celulares que contenían los genes rep y cap de AAV a partir de los promotores de AAV normales, pero estos intentos no tuvieron éxito debido a que los vectores estaban contaminados con 100 veces más partículas de AAV de tipo salvaje o debido a que los vectores eran producidos sólo a títulos muy bajos de menos de 4 x 10^{3}.

En un enfoque alternativo, Lebkoswski y col. (Patente de los Estados Unidos 5.173.414, expedida en 22 de Diciembre de 1.992) construyeron líneas celulares que contenían vectores de AAV en un plásmido episómico. Estas líneas celulares podían ser infectadas después con adenovirus y transfectadas con las funciones de AAV complementadoras en trans rep y cap para generar preparaciones de vector de AAV. Se reivindica que esto permite producir títulos superiores de soluciones de partida de AAV. Sin embargo, en los ejemplos mostrados, la única información relativa al título que se muestra es que una línea celular humana, K562, podía ser transducida sólo a eficacias del 1% o menos, lo que no indica la producción de títulos elevados de cualquier vector de AAV. En este sistema el vector se porta en forma de episoma (constructo no integrado), y se establece que no se prefieren las copias integradas del vector.

El enfoque para el empaquetamiento de los vectores de AAV descrito por Lebkowski y col., 1.992, tiene diversos aspectos no deseables. Primero, mantener el vector en forma de un plásmido episómico de elevado número de copias, no integrado en una línea celular no es deseable debido a que el número de copias por célula no puede ser controlado rigurosamente y es mucho más probable que el ADN episómico experimente una transposición que conduzca a la producción de vectores defectuosos. Segundo, en este sistema, el vector debe ser empaquetado infectando la línea celular con adenovirus e introduciendo un plásmido que contenga los genes rep y cap de AAV. El plásmido utilizado por Lebkowski y col., 1.992 era de nuevo pBa1 que, como se ha observado antes, tiene homología de solapamiento con las secuencias ITR del vector y producirá la generación de AAV de tipo salvaje. Tercero, en el plásmido de empaquetamiento pBa1 utilizado por Lebkowski y col., 1.988, 1992, el gen rep es expresado fuera de su promotor p_{5} homólogo y de ese modo es autorregulado negativamente y por lo tanto es probable que la expresión de rep esté limitada.

El problema de los niveles subóptimos de expresión de rep tras la transfección con el plásmido puede estar relacionado con otra actividad biológica de estas proteínas. Existe evidencia (Tratschin y col., 1.986, Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894) de que las proteínas Rep de AAV infrarregulan su propia expresión a partir del promotor p_{5} de AAV que ha sido utilizado en todos los constructos de empaquetamiento descritos previamente tales como pAAV/Ad (Samulski y col., 1.989) o pBa1 (Lebkowski y col., 1.988, 1.992)

Compendio de la invención

Uno de los desafíos básicos para la terapia génica ha sido el desarrollo de estrategias para la transducción de células y tejidos que no pueden ser fácilmente manipulados ex vivo o que no se están dividiendo activamente. Los vectores de AAV pueden lograr la transferencia génica in vivo en el tracto respiratorio, por ejemplo, pero unos títulos elevados son críticos de manera que permitan una multiplicidad suficientemente elevada de vector para la liberación en un volumen tan pequeño como sea posible. Esto hace que la metodología de empaquetamiento óptima tenga una importancia central en la determinación de la viabilidad de una terapia génica basada en AAV. Las líneas celulares de empaquetamiento de AAV libres de coadyuvante, estables, han sido difíciles de encontrar, debido principalmente a la actividad de la proteína Rep, que infrarregula su propia expresión e invierte la inmortalización celular. Los enfoques descritos en esta invención evitan eficazmente estos problemas y han permitido mejoras sustanciales en la eficacia del empaquetamiento.

El uso de un promotor HIV-LTR para expresar elevados niveles de proteínas Rep de AAV ha sido referido en otra parte (Antoni y col., 1.991), pero la aplicación de este sistema de expresión al empaquetamiento de vectores de AAV recombinante es un nuevo progreso. De hecho, no se ha demostrado previamente que los niveles de expresión de Rep sean limitantes en el procedimiento de empaquetamiento del vector de AAV por transfección simultánea. El hecho de que se logre un incremento de 100 veces en el título de empaquetamiento incrementando la expresión de Rep proporciona una evidencia directa de que los niveles de Rep son limitantes en esta circunstancia. El hecho de que la transfección simultánea con pARtat no incrementara adicionalmente la eficacia del empaquetamiento puede indicar que (1) el nivel de expresión del promotor de HIV en las células 293 fuera maximizado incluso en ausencia de tat o (2) que los niveles de Rep logrados solo con pRS5 eran suficientes para asegurar que la expresión de Rep ya no era limitante para la eficacia del empaquetamiento. Ahora resultaría obvio que se pueden utilizar otros promotores distintos de AAV para generar Rep en plásmidos de empaquetamiento análogos a pRS5.

Del mismo modo, se conoce el fenómeno del rescate de los genomas de AAV recombinante integrados (Tratschin y col., 1.985; Flotte y col., 1.993a), pero nunca antes se ha aplicado para producir una línea celular productora de vectores como se describe aquí.

La eficacia de empaquetamiento global del sistema de la línea celular del vector pRS5 era de al menos 10^{4} partículas por célula de empaquetamiento, lo que será más que suficiente para permitir la producción de reactivos para vectores recombinantes de AAV de grado clínico. La generación de AAV de tipo salvaje no ha sido observada con este método, lo que es una ventaja adicional sobre la mayor parte de los métodos de transfección simultánea. Estas mejoras hace factible la producción de vectores de AAV recombinantes de grado clínico para su uso en la terapia génica.

Aquí se describen procedimientos y constructos que permiten la producción de títulos elevados de vectores de AAV en ausencia de generación de AAV de tipo salvaje.

Por consiguiente, una realización de la invención es un procedimiento para la generación de títulos elevados de vectores de AAV recombinante que comprende:

(a) proporcionar células que contienen al menos una copia intacta de un vector de AAV recombinante integrado establemente, donde el vector de AAV está constituido por regiones de repetición terminal invertida (ITR) de AAV y un promotor de la transcripción conectado operablemente a un polinucleótido diana, y donde la expresión del gen rep es limitante en dichas células;

(b) proporcionar un plásmido de empaquetamiento de AAV que permite la expresión del producto del gen rep, donde en el plásmido el gen rep está conectado operablemente a un promotor heterólogo, y donde el plásmido de empaquetamiento carece de homología de solapamiento con las secuencias de AAV del vector de la célula proporcionada en (a);

(c) insertar el plásmido de empaquetamiento de AAV en la célula e incubar la célula en condiciones que permitan la replicación de AAV; y

(d) aislar los vectores de AAV recombinante producidos en la etapa (c).

Están incluidos en esta realización los procedimientos en los que el promotor del plásmido de empaquetamiento al cual está conectado operablemente Rep es HIV-LTR, y aquellos procedimientos en los que el plásmido de empaquetamiento es pRS5.

También están incluidos en esta realización los procedimientos en los que el polinucleótido diana codifica un polipéptido que puede funcionar como regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR).

Otra realización de la invención es un sistema de empaquetamiento para la generación de títulos elevados de vectores de AAV recombinante que comprende:

(a) células que contienen al menos una copia intacta de un vector de AAV recombinante integrado establemente, donde el vector de AAV está constituido por regiones de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un promotor de la transcripción conectado operablemente a un polinucleótido diana, y donde la expresión del gen rep es limitante en dichas células; y

(b) un plásmido de empaquetamiento de AAV que permite la expresión del producto del gen rep, donde en el plásmido el gen rep está conectado operablemente a un promotor heterólogo, y donde el plásmido de empaquetamiento carece de homología de solapamiento con las secuencias de AAV del vector de la célula proporcionada en (a).

Otra realización más de la invención es un plásmido de empaquetamiento para su uso en la producción de la generación de títulos elevados de vectores de AAV recombinante que permiten la expresión del producto del gen rep, donde el plásmido está constituido por el gen rep conectado operablemente a un promotor heterólogo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama del ciclo vital de AAV.

La Figura 2 es un esquema que muestra la producción del plásmido de empaquetamiento pRS5, y la relación del promotor HIV-LTR y la secuencia codificadora de los genes rep y cap de AAV2.

La Figura 3 es un reproducción a medio tono de hibridaciones Southern de muestras de ADN de extracción Hirt que muestra genomas AAV-neo intactos rescatables en líneas celulares estables.

La Figura 4 es una reproducción a medio tono de hibridaciones puntuales que comparan la detección de neo en el control y en genomas AAV-neo empaquetados.

La Figura 5 es una reproducción a medio tono de hibridaciones Southern de muestras de ADN de extracción Hirt que muestra el rescate del vector CFTR de AAV (TRF42)^{-} de clones productores del vector en las células 293.

La Figura 6 es un gráfico del porcentaje de células de carcinoma de pulmón teñidas para el marcador CD44, como se determina mediante tinción con anticuerpos y análisis FACS.

Descripción detallada de la invención

Los vectores de AAV tienen relevancia para la terapia génica en humanos, concretamente para enfermedades tales como la fibrosis quística y la anemia de las células falciformes. La invención descrita aquí proporciona métodos y materiales para su uso en la producción de títulos elevados de vectores de AAV recombinante para su utilización en la terapia génica.

En la práctica de la presente invención se emplearán, a menos que se indique de otro modo, mecanismos convencionales de la biología molecular, la microbiología, la recombinación de ADN, y la inmunología, que están dentro del criterio lógico de la técnica. Tales mecanismos se explican detalladamente en la literatura. Ver, v.g., Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1.989), Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gail Ed., 1.984), Animal Cell Culture (R.I. Freshney, Ed., 1.987), la serie Methods in Enzimology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos eds. 1.987), Handbook of Experimental Immunology, (D.M. Weir and C.C. Blackwell, Eds.), Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Siedman, J.A. Smith, y K. Struhl, eds., 1.987), y Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach y W. Strober, eds.,
1.991).

La generación de títulos elevados de vectores de AAV recombinante de polinucleótidos heterólogos que requieren transcripción se completa mediante el siguiente método.

En el método se proporcionan células clonadas que contienen un plásmido vector de AAV adecuado. El plásmido vector de AAV adecuado está constituido por las regiones ITR de AAV y un promotor de la transcripción conectado operablemente a un polinucleótido diana. El promotor de la transcripción que está conectado al polinucleótido diana permite la formación de transcritos, e incluye, por ejemplo, promotores que no son de AAV así como promotores de AAV tales como p_{5}, p_{19}, p_{40}, y promotores ITR de AAV. Los productos de la transcripción y/o la traducción del polinucleótido diana encuentran uso, preferiblemente, en la terapia génica. Así, entre los polinucleótidos diana se incluyen genes para ser liberados para la terapia génica, por ejemplo, aquellos que codifican cadenas de la subunidad codificadora de la hemoglobina, de enzimas, de proteínas tales como el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), y similares. Los polinucleótidos diana también pueden ser polinucleótidos que cuando se transcriben tienen actividad como moléculas anti-sentido, como reclamos que se unen a factores de transcripción o traducción, como ribozimas, y similares.

Una característica requisito de las células clonadas proporcionadas para el método es que contienen al menos una copia intacta del plásmido vector de AAV que se integra establemente en la célula y puede ser rescatada por infección de la célula transfectada con un virus coadyuvante tal como adenovirus cuando también se proporcionan las funciones rep o rep y cap de AAV complementarias.

En los ejemplos mostrados más abajo los autores de la presente invención han utilizado el vector AAVneo en el que la selección inicial de la línea celular que contiene el vector se realizaba mediante selección con geneticina. No obstante, debe ser obvio para un experto en la técnica que para generar líneas celulares que contengan un vector, tal como un vector de AAV que contenga un gen CFTR, en el que no está incluido un marcador selectivo, es sencillo transfectar las células conjuntamente con el plásmido vector deseado y un segundo plásmido que contenga el marcador selectivo. Tras la selección de los clones celulares basándose en el marcador selectivo, sería obvio utilizar el rastreo directo para identificar fácilmente aquellos de los que se puede rescatar un vector a un título elevado. Un ejemplo de esto es referido por Flotte y col. (1.992a), aunque en ese ejemplo las células eran rescatadas por infección con virus AAV y adenovirus. Como informaron Flotte y col. (1.993a), también se podían obtener líneas celulares productoras que contenían un vector de AAV rescatable que no contenían un marcador seleccionable en el vector. En ese ejemplo, los plásmidos vectores de AAV comprendían constructos que contenían el ADNc de CFTR humano conectado operablemente a un promotor de AAV constituido por las ITR. Las líneas celulares que contienen copias de estos vectores integradas establemente eran derivadas mediante transfección simultánea de la línea celular epitelial humana IB-3 con el plásmido vector de AAV-CFTR y un segundo plásmido que contenía el marcador seleccionable neo. Tras la selección de las colonias en geneticina, se obtenían clones individuales que contenían el vector integrado establemente a partir del cual el vector podía ser rescatado mediante la posterior infección con adenovirus coadyuvante y partículas de AAV de tipo salvaje. Esto permite claramente la generación de clones que tienen copias integradas establemente de un vector en el que el propio vector no tiene un marcador seleccionable.

En el método también se incluye proporcionar un plásmido de empaquetamiento complementador a partir del cual se pueden expresar las proteínas Rep o Rep y Cap a partir de los genes rep o rep y cap. El plásmido de empaquetamiento carece de homología de solapamiento con secuencias del vector entre e incluyendo las secuencias ITR de AAV. Por otra parte, la combinación del plásmido de empaquetamiento y el vector no puede rendir un genoma de AAV completo. En el ejemplo mostrado más abajo, las secuencias de 120 nucleótidos de longitud entorno al promotor p_{5} de AAV están ausentes del plásmido de empaquetamiento y el vector. Además, en el plásmido de empaquetamiento el gen rep no es transcrito a partir del promotor p_{5} de AAV, en su lugar está conectado operablemente a un promotor de la transcripción heterólogo que no está fuertemente autorregulado de un modo negativo por la expresión a partir

\hbox{de  rep .}

En el ejemplo preferido de plásmido de empaquetamiento, tal como pRS5, los autores de la presente invención han utilizado HIV-LTR como promotor heterólogo pero se puede utilizar cualquier promotor heterólogo, y preferiblemente un promotor constitutivo o inducible. El HIV-LTR es un ejemplo de ambos tipos de promotor. Generalmente, este promotor es inducible a un nivel de expresión muy elevado mediante la acción de la proteína tat. No obstante, en el ejemplo preferido mostrado aquí, el promotor HIV-LTR muestra niveles elevados de expresión constitutiva de rep cuando se utiliza en células 293. Esto se debe a que las células 293 expresan el producto génico EIA de adenovirus que se sabe que transactiva el promotor HIV-LTR. Así, en las células 293 (que son la línea célula preferida para establecer células que contengan vectores) la transactivación adicional del promotor HIV-LTR en pRS5 puede no ser necesaria para obtener un nivel máximo de expresión de rep funcional. Si las líneas celulares productoras de vectores se elaboran en otras células, puede ser deseable la transactivación de pRS5, mediante la adición de un plásmido de expresión tat tal como pARtat (Antoni y col. 1.991). Tales líneas celulares podrían incluir cualquiera de las líneas celulares humanas tales como HeLa, A549, KB, Detroit, WI38 o cualquiera de las líneas celulares en las que se puedan expresar funciones coadyuvantes apropiadas. Cuando se utiliza un adenovirus humano como coadyuvante, este también podría incluir la línea celular de mono deseada, VERO. Alternativamente, si se utilizan herpesvirus o poxvirus tales como vaccinia o avipox para proporcionar la función coadyuvante, puede bastar cualquier línea celular de humano, roedor o simio apropiada como célula productora de vector.

El plásmido de empaquetamiento pRS5 sirve como modelo de un promotor o bien inducible o bien constitutivo. Sería obvio para un experto en la técnica que se pueden utilizar muchos otros promotores inducibles o constitutivos en el constructo del plásmido de empaquetamiento. La primera característica del plásmido de empaquetamiento es que no contiene el promotor p_{5} de AAV de tipo salvaje y por lo tanto no está fuertemente autorregulado negativamente por rep. Entre los ejemplos de tales promotores estarían las mutaciones del promotor p_{5} de tipo salvaje que eliminan la homología con el promotor de tipo salvaje parental o que inactiva los elementos reguladores negativos de este promotor tal como la región YYI del promotor p_{5}. Entre los ejemplos de los promotores inducibles se incluyen: los promotores inducibles por iones metálicos tales como el promotor de la metalotioneína; los promotores inducibles por hormonas esteroides tales como el promotor MMTV; o el promotor de la hormona del crecimiento; los promotores que serían inducibles por el virus coadyuvante tal como el promotor génico temprano de adenovirus inducible por la proteína EIA de adenovirus, o el promotor tardío principal de adenovirus; el promotor de herpesvirus inducible por las proteínas de herpesvirus tales como VP16 o 1CP4 o los promotores inducibles por vaccinia o poxvirus o los promotores inducibles por una ARN polimerasa de poxvirus o un promotor bacteriano tal como el del fago T7 que sería inducible por una ARN polimerasa de poxvirus o un promotor bacteriano tal como el de la ARN polimerasa de T7.

Existen muchos promotores constitutivos fuertes que serán adecuados para su uso como promotor heterólogo para la expresión de rep en el plásmido de empaquetamiento, incluyendo el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus, el promotor de acción \beta, o el promotor de la \beta-globina. También se podrían utilizar los promotores activados por la ARN polimerasa III.

La eficacia del plásmido de empaquetamiento para la complementación de las funciones Rep y Cap para el plásmido vector de AAV puede ser sometida a ensayo utilizando vectores de expresión de AAV que carezcan de la función Rep y/o Cap, y además contengan un marcador. Tales vectores de expresión son conocidos en la técnica, y entre ellos se incluyen, por ejemplo, el constructo pAAVp_{5}neo (Flotte y col., 1.992). En los Ejemplos el pAAVp_{5}neo fue utilizado como un constructo vector para someter a ensayo cada uno de los mecanismos de empaquetamiento descritos puesto que podía ser titulado para el número de partículas tanto mediante hibridación puntual del ADN (Samulski y col., 1.989) como mediante títulos de transducción de neo.

El plásmido de empaquetamiento es introducido en células que contienen el plásmido vector de AAV integrado mediante cualquier mecanismo adecuado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, transfección, electroporación, y similares. Tras la introducción del plásmido de empaquetamiento, las células se hacen crecer durante 3 a 5 días en condiciones que permitan la replicación de AAV, se preparan los productos lisados, y las partículas de vector de AAV recombinante se purifican mediante mecanismos conocidos en la técnica.

Los ejemplos presentados más abajo se proporcionan como una guía adicional para el practicante experto en la técnica, y no se pretende que sean limitantes de la invención en modo alguno.

El plásmido pRS5 de la línea celular de E. coli DH5 (E. coli::cepa pRS5) fue depositado el 9 de Noviembre de 1.993 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, y ha sido consignado con el Número de Acceso 69483. La consigna se realizó en los términos de Tratado de Budapest. Tras la concesión y la promulgación de esta solicitud como Patente de los Estados Unidos, toda restricción sobre la disponibilidad de la consigna será irrevocablemente eliminada; y el acceso a las consignas designadas será asequible durante la demora de la solicitud anteriormente mencionada para el que determine el Comisario autorizado para ello bajo 37 CFR \NAK y 35 USC \NAK 1.22. Por otra parte, las consignas designadas se mantendrán durante un período de treinta (30) años desde la fecha de la consigna, o durante cinco (5) años tras la última petición de la consigna; o durante la vida de la patente de los Estados Unidos ejecutable, lo que sea más duradero. Los materiales consignados mencionados aquí tiene la única finalidad de la conveniencia, y no se requiere poner en práctica la presente invención en vista de las presentes descripciones.

Ejemplos Ejemplo 1 Plásmido de Empaquetamiento pRS5

En el plásmido de empaquetamiento pRS5 se reemplaza el promotor p_{5} de AAV por un promotor heterólogo de manera que la expresión del polipéptido del gen rep no autorregule negativamente su propia síntesis.

El plásmido pSR5 fue construido ligando el fragmento HindIII a SphI grande (5 kb) del plásmido pHIVrep anteriormente descrito (Antoni y col., J. Virol., 65:396-404) (conteniendo el promotor HIV-LTR y las secuencias del gen rep incluyendo los nucleótidos de AAV 263 a 1.886 flanqueados por la secuencia plasmídica de pBR322) con el fragmento HindIII a SphI de un plásmido denominado pcap1 (conteniendo el gen cap de AAV desde los nucleótidos 1.886 a 4.491 sin la ITR de AAV flanqueados de nuevo por las secuencias de pBR322) (ver la Fig. 2). Tras la ligadura de estos dos fragmentos se produjo un plásmido de empaquetamiento, pRS5 en el que el gen rep de AAV (proteínas Rep 68 y 78) es transcrito a partir del promotor HIV-LTR transcribiendo los promotores p_{19} y p_{40} de AAV internos los productos Rep más pequeños (proteínas Rep de 40 kD y 52 kD) y las proteínas de la cápsida, respectivamente. Así pRS5 contiene la secuencia codificadora de AAV completa en la secuencia de nucleótidos de AAV desde el nucleótido 263 al 4.491 que incluye la secuencia codificadora rep para Rep 78 y Rep 68 conectada operablemente al promotor HIV-LTR heterólogo y expresa Rep 52 y Rep 40 a partir del promotor p_{19} de AAV y las proteínas de la cápsida de AAV a partir del promotor p_{40}. El mapa de este constructo se muestra en la Figura 1.

El constructo pAAVp_{5}neo (Flotte y col., 1.992) fue utilizado como constructo vector para someter a ensayo cada uno de los mecanismos de empaquetamiento descritos ya que podía ser titulado tanto en cuanto al número de partículas mediante hibridación puntual del ADN (Samulski, y col., 1.989) como mediante los títulos de transducción de neo.

Ejemplo 2 Líneas Celulares

Se hicieron crecer células 293-31 humanas (Graham y col., 1.967, J. Gen. Virol., 36:59-72) en Medio Esencial Modificado de Eagle con suero de ternera fetal al 10% a 37ºC en CO_{2} al 5%. La línea celular 293 fue utilizada tanto para el empaquetamiento de preparaciones de vector como para los experimentos de transducción neo para verificar los títulos de transducción neo.

Ejemplo 3 Empaquetamiento de viriones de AAV con un plásmido promotor HIV-LTR-gen rep

Se utilizó el constructo pRS5 para empaquetar el plásmido vector pAAVp_{5}neo mediante transfección simultánea en células 293 infectadas con adenovirus de tipo 5 (Ad5) (Flotte y col., 1.992). Se infectaron un total de diez placas de 10 cm conteniendo cada una 2 x 10^{6} células 293 (semi-confluente) con 2 x 10^{6} p.f.u. de Ad5 (m.o.i. = 1) 1 hora antes de la transfección con 12,5 \mug de cada uno de pRS5 y pAAVp_{5}neo. Las células fueron incubadas después durante 3 días a 37ºC antes de la cosecha. Las células fueron raspadas y reunidas mediante centrifugación a baja velocidad (4.000 rpm x 10 minutos).

El sedimento celular fue resuspendido después en 4 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, lisado mediante congelación-descongelación tres veces, empujado a través de una aguja de 25 g varias veces para disminuir la viscosidad, y tratado con nucleasa microcócica (40 \mul de solución de partida 300 \mu/\mul, incubado a 37ºC x 20 minutos, y después a 4ºC durante 10 minutos. Luego se añadió CsCl hasta una densidad final de 1,41 g/cc. Cada tubo fue cubierto con 0,5 a 1,0 ml de aceite mineral y centrifugado en un rotor de cubeta oscilante (SW50) a 35.000 rpm a 4ºC durante 12 horas.

Las fracciones seriadas de 0,5 ml fueron recogidas después y cada una fue titulada mediante hibridación puntual del ADN (Samulski y col., 1.989), con diluciones a la décima de cada fracción transferidas sobre filtros de nitrocelulosa e hibridadas con una sonda de ADN marcada con P^{32} preparada a partir de un fragmento del gen neo de 2,3 kb utilizando el estuche de cebado al azar de Boehringer-Mannheim. Las fracciones seleccionadas fueron sometidas a diálisis después frente a solución salina equilibrada de Ringer, pH 7,4, y conservadas a -20ºC para su uso en experimentos de titulación de la transducción.

Ejemplo 4 Determinación de títulos de transducción de soluciones de partida de vector AAV-neo

Las soluciones de partida de vector AAV-neo producidas como se ha esbozado antes fueron tituladas en células 293-31 infectando las células 293-31 a multiplicidades de partícula crecientes diez veces que oscilaban entre 10 y 1.000 partículas por célula. En cada caso las células fueron sembradas en pocillos de microtitulación a 10^{4} células por pocillo, y después infectadas durante 2 horas por inoculación directa del vector en el medio. Las células de cada pocillo fueron después tratadas con tripsina 24 horas más tarde y cultivadas en placa sobre placas de 4-100 mm. Tres placas de cada grupo fueron seleccionadas después en G418 a una dosis de 200 \mug/ml (activo, empezando 48 horas después de la infección original). La cuarta placa de cada grupo se hizo crecer sin G418 como control de la eficacia del cultivo en placa. Las células fueron seleccionadas durante 10 a 14 días, y después teñidas con Rojo Safranina. Se contaron las colonias resistentes a geneticina y se determinó la frecuencia de transducción dividiendo el número medio de colonias del gen en cada grupo por el número de colonias observadas en la placa de control de la eficacia del cultivo en placa. Después se definió una unidad de transducción (t.u.) en este análisis como el volumen de inóculo por célula requerido para transducir el 63% de las células para la resistencia a la geneticina.

Ejemplo 5 Mejora del empaquetamiento del vector AAV por transfección simultánea utilizando un vector de expresión con el promotor HIV-LTR

En la Tabla 1 (experimentos 1 a 3) se muestran los resultados de las titulaciones por hibridación puntual del ADN de las preparaciones de partículas AAV-neo producidas mediante el mecanismo de transfección simultánea pAAV/Ad establecido anteriormente y una transfección simultánea con pRS5 paralela.

TABLA 1 Título de Partículas de Preparaciones de Vector AAV

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}  \+ \begin{minipage}[t]{145mm} Las preparaciones de
vector fueron derivadas como sigue. Todas las preparaciones de
vector representan el vector AAVneo derivado del plásmido  vector
pAAVp _{5} neo (pSA206). En los experimentos 1, 2, y 3 la
preparación de  vector fue derivada por infección de células 293 con
aadenovirus como  coadyuvante e infección simultánea de las células
infectadas con el plásmido  vector pAAVp _{5} neo (pSA206) y el
plásmido de empaquetamiento era pAAV/Ad,  pRS5 o pRS5 más pARtat
según se indique. En el experimento 4 el vector se  obtenía por
rescate de un vector integrado a partir de la línea celular
neo4-6  mediante transfección de la línea celular
con el plásmido de empaquetamiento  pRS5 en presencia de un
adenovirus 5 infectante como coadyuvante. La línea  celular
neo4-6 fue derivada por transfección de células 293
con el plásmido  vector pAAVp _{5} neo (pSA206) y selección con el
antibiótico G418 (geneticina)  para la resistencia a la geneticina.
Todas las preparaciones de vector fueron  purificadas mediante
formación de bandas en CsCl.\end{minipage} \cr   ^{b} 
\+ \begin{minipage}[t]{145mm} Las preparaciones de vector
purificadas fueron analizadas para determinar el título de
partículas mediante análisis de hibridación
puntual.\end{minipage} \cr}

Los resultados de la Tabla 1 muestran que los títulos logrados con el constructo pRS5 introducido por transfección simultánea (experimento 4) eran aproximadamente cinco a diez veces superiores a los obtenidos utilizando el plásmido de empaquetamiento pAAV/Ad. La adición del gen trans-activador de la transcripción de HIV (tat) mediante tri-transfección daba como resultado muy poca eficacia de empaquetamiento adicional. En el experimento mostrado en la Figura 3, sólo había un incremento del 30% en el título de partículas de la fracción de título máxima, desde 3,0 x 10^{10} con pRS5 solo a 4,0 x 10^{10} con pRS5 + pARtat. Basándose en estos resultados, parecía muy probable que los niveles de expresión de rep y cap no fueran más tiempo limitantes de este mecanismo.

El experimento de las Figura 3 se realizó como sigue.

Ejemplo 6 Rescate de genomas AAV-neo intactos presentes en líneas celulares estables

En este ejemplo, un cultivo de 2 x 10^{6} células 293 humanas fue transfectado con 5 microgramos del plásmido vector de AAV pAAVp_{5} neo (pSA206). Las colonias individuales fueron seleccionadas en cuanto a la resistencia a la geneticina utilizando 200 microgramos de G418 activo (Ginco-BRL) por ml de medio, comenzando 48 horas después de la transfección. Las colonias resistentes a G418 individuales fueron aisladas con cilindros de clonación estériles y expandidas en líneas celulares estables. A partir de varias de estas líneas celulares, se infectaron 2 x 10^{6} células tanto con adenovirus de tipo 5 (moi=2) como con AAV2 de tipo salvaje (moi=2). Cuarenta y ocho horas más tarde, se seleccionó ADN de bajo peso molecular utilizando el procedimiento de detergente con alto contenido de sal de Hirt y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% y transferencia Southern con una sonda de ADN neo marcada con P^{32} cebada al azar. Los resultados de la hibridación por transferencia Southern del ADN extraído mediante Hirt se muestra en la Figura 3.

La Figura muestra que a partir de 7 a 8 líneas celulares individuales examinadas (pistas A a G), se podía rescatar la secuencia del vector y se podía replicar. La pista H muestra un ejemplo de una línea celular resistente a la geneticina a partir de la cual no se podía rescatar el vector.

Se indican las especies replicantes intracelulares esperadas de los genomas del vector (RFm para la forma replicante dúplex monomérica y RFd para la forma replicante dimérica dúplex) y los genomas de hebra sencilla (SS). En al menos 6 de los 8 ejemplos (pistas A a D y Pistas F y G) se rescataron copias del vector no transpuestas.

Ejemplo 7 El uso de líneas celulares con el vector de AAV rescatable integrado mejora la eficacia del empaquetamiento

Tras mejorar la expresión de los genes rep y cap de AAV con el constructo pRS5, los autores de la presente invención buscaron mejorar adicionalmente la eficacia del empaquetamiento produciendo poblaciones de células uniformes que contenían copias integradas pero rescatables del genoma del vector AAV-neo. La combinación de transfección con pRS5 de rep y cap con la adición estable del vector pAAVp_{5}neo a las líneas celulares daba como resultado una mejora significativa de la eficacia de empaquetamiento.

Las líneas celulares eran producidas transfectando AAV-p_{5}neo mediante infección tanto con AAV2 de tipo salvaje como Ad5 a una m.o.i. de 5 para cada virus. La extracción Hirt fue utilizada para aislar el ADN viral replicante, y estas muestras de ADN fueron analizadas por electroforesis e hibridación por transferencia Southern utilizando una sonda neo marcada con P^{32}. Como se muestra en la Figura 3, los recombinantes AAV-neo rescatables estaban presentes en casi todas estas líneas celulares. El patrón de estas bandas, como se esperaba, incluía hebras sencillas (banda borrosa cerca de la parte superior del gel), monómeros dúplex de 2,7 kb de tamaño, dímeros de 5,4 kb, formas multiméricas más grandes.

Dos líneas celulares elaboradas de una manera similar y denominadas neo4-6 y neo4-9 fueron construidas y utilizadas para posteriores experimentos de empaquetamiento. Se realizó una comparación directa entre la transfección simultánea de pRS5 y pAAVp_{5}neo en células 293 y la transfección individual de pRS5 en líneas celulares tanto neo4-6 como neo4-9. Como se muestra en la Tabla 1, la línea celular neo4-6 producía títulos de AAV-neo empaquetado que eran 2,6 x 10^{11}. Este título de partículas representaba una mejora de varias veces sobre el método de transfección simultánea de las células 293, y rendía los títulos más elevados de cualquier método o combinación de métodos utilizados. El título de partículas total de casi 2,6 x 10^{11} partículas se lograba empezando con 2 x 10^{7} células y por tanto representa un rendimiento de 10^{4} partículas por célula.

Los análisis anteriores se basan todos en un mecanismo de ADN/hibridación puntual que también podría detectar teóricamente copias de genomas de AAV-neo que no habían sido empaquetados en partículas de AAV. Los resultados de dos tipos de experimentos de control excluían esa posibilidad. Primero, los plásmidos AAVp_{5}neo y pRS5 eran transfectados simultáneamente en células 293 como antes, pero en ausencia de infección por Ad5. Los productos lisados de estas células fueron tratados con cualquiera de las otras preparaciones mencionadas antes. Como se muestra en la Figura 4, las hibridaciones por transferencia puntual de control indicaban que las señales neo reflejaban los genomas AAV-neo empaquetados.

La hibridación por transferencia puntual del ADN se realizaba como sigue: Empezando por 50 microlitros de cada fracción, se realizaron cinco diluciones seriadas a la décima en PBS. Para lisar los viriones, se añadió 1/10 del volumen (5 \mul) de NaOH 3 N, y la mezcla se incubó a 65ºC durante 1 hora. Se añadió un volumen igual (50 \mul) de NH_{4}OAc 2 M, pH 7,0, y el volumen total de 100 \mul fue transferido a filtros de nailon de 0,45 \mum con un colector de filtración para micromuestras Schleicher y Schuell Minifold I. Estos filtros fueron hibridados después con sondas de ADN neo marcadas con P^{32} cebadas al azar en condiciones normalizadas.

Las diluciones seriadas a la décima de las soluciones de partida de control preparadas como se ha descrito antes fueron comparadas con diluciones de una solución de partida de AAV-neo preparadas mediante transfección con pRS5 de la línea celular neo4-9 tras la infección con adenovirus (mostrado en la columna A). La columna B muestra la transfección con pRS5 de la línea celular neo4-9 sin infección por adenovirus. La columna C muestra la infección por adenovirus de la línea celular neo4-6 sin transfección con pRS5. La columna D muestra la infección por adenovirus de células 293 transfectadas por pSA206 sin transfección simultánea con pRS5. En ningún caso la célula sobrante o el ADN plasmídico daba una señal neo significativa. Los resultados de la Figura 4 muestran que no se encontraba presente señal AAV-neo detectable en ADN/hibridación por transferencia puntual de ese experimento, indicando claramente que el ADN plasmídico no estaba presente en estas preparaciones purificadas.

Después se realizó una comparación directa del título de transducción de las soluciones de partida del vector AAV-neo producidas en el sistema de transfección plasmídica dual o mediante el rescate del vector a partir líneas estables. Como se indica en la Tabla 2, la frecuencia de transducción obtenida con un número equivalente de partículas de vector producidas en cualquier sistema era similar. Esto indica que las partículas de vector generadas por el rescate del vector de líneas celulares estables tenían la misma eficacia biológica y potencial de transducción que las producidas en la transfección dual. Así, los vectores rescatados de las líneas celulares no tenían ninguna alteración biológica significativa.

TABLA 2 Equivalencia Biológica de Preparaciones de Vector AAV-neo^{a}

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}  \+ \begin{minipage}[t]{145mm} La eficacia de
transducción de numerosas preparaciones de vectores
AAV-neo fue comparada en la línea celular
293.\end{minipage} \cr   ^{b} 
\+ \begin{minipage}[t]{145mm} Las preparaciones de vector fueron
derivadas como sigue: Todas las preparaciones de vector representan
el vector AAVp _{5} neo derivado del  plásmido vector
pAAVp _{5} neo. Las preparaciones denominadas neo4-6
y neo4-9  fueron obtenidas mediante rescate de un
vector de integración de las líneas  celulares 4-6 o
4-9 por transfección de la línea celular con el
plásmido de  empaquetamiento pRS5 en presencia de un adenovirus 5
infectante como  coadyuvante. Las líneas celulares
4-6 y 4-9 fueron derivadas por
transfección de  células 293 con el plásmido vector pAAVp _{5} neo y
selección con el antibiótico  G418 (geneticina) en cuanto a la
resistencia a geneticina.\end{minipage} \cr 
\+ \begin{minipage}[t]{145mm}La preparación de vector denominado
pRS5 trf fue derivada mediante transfección simultánea directa de
células 293 con el plásmido vector  pAAVp _{5} neo y el plásmido de
empaquetamiento pRS5 en presencia de un  adenovirus 5 infectante
como coadyuvante. La preparación de vector pRS+tat  también era
obtenida mediante transfección directa exactamente como para pRS5 
trf excepto que la transfección simultánea también incluía el
plásmido pARtat,  que expresa el activador transcripcional tat de
HIV.\end{minipage} \cr   ^{c} 
\+ \begin{minipage}[t]{145mm} Se infectaron cultivos de 10 ^{4} 
células 293 con 10 ^{5}  partículas de preparaciones de vector
AAV-neo. Así, cada preparación de vector  fue
utilizada para infectar las células 293 a una multiplicidad de 10
partículas  de vector por célula.\end{minipage} \cr   ^{d} 
\+ \begin{minipage}[t]{145mm}Los cultivos infectados se hicieron
crecer después en las  condiciones para seleccionar las colonias
resistentes a la geneticina. El  porcentaje de células 293
transducidas establemente para la resistencia a la  geneticina (es
decir, la frecuencia de transducción) fue calculado como el  número
de colonias resistentes a la geneticina del cultivo individual
dividido  por el número de colonias obtenidas en un cultivo de
control no tratado con
geneticina.\end{minipage} \cr}

Los resultados anteriores indican que las modificaciones combinadas descritas aquí pueden rendir incrementos en los títulos de vector de aproximadamente 50 a 100 veces. Asimismo, en comparación con los informes publicados previamente (v.g., Samulski y col., 1.989), este procedimiento puede proporcionar títulos de partículas de vector de al menos 2 x 10^{11}, que es tres órdenes de magnitud más alto que el logrado previamente a partir de un número similar de células (es decir, células 293 humanas desarrolladas en un total de diez placas de cultivo de células de 10 cm).

Ejemplo 8 Empaquetamiento de vectores AAV que codifican CFTR

Se utilizó un vector AAV-CFTR, pTRF42, que contenía el ADNc de CFTR expresado a partir de una ITR de AAV como promotor en ausencia de un marcador seleccionable para generar líneas productoras de vector estable en la línea celular 293 mediante transfección simultánea con un plásmido pSVneo. Este vector era rescatable de las líneas celulares estables, y el vector rescatado estaba intacto y sin reorganizar.

La construcción de pTRF42 ha sido descrita (Flotte y col. 1.993a, J. Biol. Chem. 268:3781-3790). Este constructo contiene un vector AAV-CFTR que consta de 145 nucleótidos del extremo 5' de AAV (la ITR) seguido de un codón de iniciación ATG (Met) dentro del marco, que lee directamente en la secuencia codificadora de CFTR desde el aminoácido 1119. El resto del ADNc de CFTR está intacto hasta el codón de terminación nativo y hasta el nucleótido 4629 de la secuencia original. Esto está seguido por una señal de poliadenilación sintética, y después por los nucleótidos de AAV 4490-4681 (ITR 3'). Cuatro microgramos de este vector fueron transfectados simultáneamente con un microgramo del plásmido pSV2neo, en 2 x 10^{6} células 293 humanas, que después fueron seleccionadas con 200 \mug de G418 activa empezando 48 horas después de la transfección. Los clones resistentes a G418 fueron aislados después con cilindros de clonación y expandidos. Los clones fueron analizados mediante rescate con AAV2 de tipo salvaje e infección con Ad5 combinados (moi=2 para cada uno) como se había realizado para las líneas que contenían el vector neo. Los extractos de ADN de bajo peso molecular (Hirt) fueron analizados de nuevo mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% y transferencia Southern con una sonda de ADNc de CFTR marcada con P^{32} cebada al azar. De nuevo, se encontró que las líneas celulares tenían secuencias del vector intactas, rescatables de los tamaños pronosticados para las formas replicantes (RF) monoméricas y diméricas, esto es 4,6 y 9,2 kb, respectivamente. Esto confirmaba la utilidad del enfoque en el que se utilizaban líneas celulares que contenían vectores rescatables con el ejemplo clínicamente significativo de un vector AAV-CFTR.

Los principios y las enseñanzas descritos antes han sido aplicados para producir ilustraciones adicionales de la presente invención, algunas de las cuales se describen más abajo, que demuestran adicionalmente la utilidad de la presente invención.

Ejemplo 9 Integración del gen lacZ en Epitelio de Vías Respiratorias Pulmonares

Se sometió a ensayo la actividad in vivo de vectores empaquetados mediante los métodos precedentes utilizando el gen lacZ que codifica una enzima con actividad \beta-galactosidasa. El vector AAVp_{5}lacZ fue elaborado sometiendo a digestión el constructo pAAVp_{5}neo con HindIII y BamHI y ligando el fragmento grande (que contiene las ITR de AAV flanqueando el promotor p_{5} y una secuencia de poliadenilación sintética) con un fragmento HindIII a BamHI de pSVBgal que contenía el gen lacZ de E. coli. Este constructo inicial fue modificado después mediante digestión con HindIII y KpnI, formación de extremos romos con polimerasa de T4 (Boehringer-Mannheim), y ligadura de nuevo del fragmento grande. Esta manipulación final permitía la eliminación de un segmento de secuencia intermedio que contenía cuatro codones ATG fuera del marco con la secuencia codificadora de lacZ. El vector fue empaquetado después utilizando el plásmido pRS5 como se ha descrito antes.

Las alícuotas de AAVp_{5}lacZ empaquetado que contenían 10^{10} partículas en 0,2 a 0,5 ml fueron administradas mediante inyección intraperitoneal en tres ratones C57BL destetados. Las alícuotas de la misma solución de vehículo frente a la cual el vector había sido sometido a diálisis fueron inyectadas en tres ratones adicionales que servían como controles. El peso de estos ratones era de aproximadamente 30 g cada uno, con un número total de células corporales estimado entre 10^{8} y 10^{9} células. La dosis de vector media por célula estaba, por lo tanto, entre 10 y 100 partículas por célula, dependiendo del flujo sanguíneo. Los animales fueron sacrificados cuatro días más tarde mediante sobredosis de pentobarbital, y las muestras de pared abdominal, pulmones, hígado, bazo, riñones, y páncreas fueron recogidas y fijadas en glutaraldehído al 2,5%.

Se realizó un análisis de PCR in situ sobre secciones de tejido embebidas en parafina de 5 micras, utilizando cebadores específicos del vector y un sistema de inmunodetección de digoxigenina-dUTP no radiactiva, anti-digoxigenina, fosfatasa alcalina como se ha descrito previamente (Flotte y col., 1.993). Los cebadores fueron seleccionados de la secuencia lacZ (cebador 5':5'-ACAACTTTAACGCCGTGCGCT-3'; cebador 3': 5'-TGCAGGAGCTCGTTATCGCTA-3'). Tras un inicio con calor a 82ºC, se realizó una PCR de 40 ciclos con incorporación directa de dUTP marcado con digoxigenina (Boehringer-Mannheim) a los productos de reacción. Los nucleótidos marcados con digoxigenina fueron detectados después con un anticuerpo anti-digoxigenina con una etiqueta de fosfatasa alcalina (estuche Genius III, Boehringer-Mannheim), y una tinción inmunohistoquímica (NBT, X-fos).

Se examinaron varias secciones de tejidos para los ratones inyectados con el vector y con el control mediante microscopia óptica. Las células que contenían el ADN vector estaban indicadas por un producto de reacción de color púrpura oscuro-marrón que cubría el núcleo. La tinción se observaba claramente en secciones de ratones a los que se había inyectado el vector pero no en las de los controles. El ADN vector era detectado en todos los tipos de células de los pulmones, así como en la mayor parte de los hepatocitos y las células pancreáticas acinares. Tras la absorción por vía linfática, las partículas del vector habrían entrado en la circulación venosa y encontrado la circulación pulmonar, que probablemente justifica la muy eficaz transferencia génica en el pulmón. Tras pasar a través de la circulación pulmonar a la general, las partículas de vector se habrían distribuido probablemente más eficazmente a otros órganos con elevado flujo sanguíneo.

Ejemplo 10 Expresión del gen lacZ In Vivo

Las secciones seriadas de las mismas muestras de tejido utilizadas para la detección mediante PCR in situ fueron teñidas para la actividad B-galactosidasa con reactivo X-gal (0,2%, 37ºC, 16 horas). Las secciones de los ratones a los que se había inyectado AAVp_{5}lacZ fueron comparadas con las de los controles a los que se había inyectado vehículo. No era detectable actividad \beta-galactosidasa endógena en los animales de control en las secciones tomadas de pulmón, bazo, hígado, páncreas, riñón, o peritoneo.

Las secciones de pulmón mostraban la expresión de lacZ en segmentos completos de epitelio de las vías respiratorias de los animales a los que se había inyectado vector pero no de los controles. En algunas de las vías respiratorias, >75% de las 200 células examinadas estaban teñidas positivamente. Aproximadamente el 25% de las vías respiratorias demostraban este grado de tinción positiva (4 a 6 vías respiratorias examinadas por secciones, una a dos secciones por animal), mientras otras regiones del pulmón tenían niveles inferiores de expresión.

Las secciones de bazo demostraban actividad \beta-galactosidasa en áreas no linfoides de los animales a los que se había inyectado vector, pero no de los controles. Los folículos linfoides del bazo eran esencialmente negativos. Se observó una tinción poco frecuente en células no epiteliales de los pulmones o en las células del hígado, la pared abdominal, y los riñones de los animales tratados con el vector, mientras no era detectable expresión en el páncreas.

La distribución del ADN vector, como se detectaba mediante un análisis de PCR in situ, se compara con la distribución de la actividad \beta-galactosidasa en la Tabla 3, como sigue (n=3): (- -) sin tinción, (+) células teñidas con X-gal <1%, (++) 1-25% de tinción, (+++) >25% de tinción, (nr) no realizado.

TABLA 3 Distribución en Tejidos de Transferencia y Expresión del Gen lacZ

3

La expresión de la actividad \beta-galactosidasa por lo tanto depende tanto de la distribución del vector de ADN, como de la especificidad de tejido del promotor. Por ejemplo, el promotor p_{5} es muy activo en las células epiteliales de las vías respiratorias, pero es mucho menos activo en otras células que han sido sometidas a ensayo, tales como aquellas derivadas del páncreas.

Ejemplo 11 Integración y expresión del gen CD44 en células de carcinoma de pulmón

El vector pSacd44, que expresa el marcador de superficie celular CD44 a partir del promotor p_{5}, fue subclonado directamente a partir del constructo pSA206 (AAVp_{5}neo). Se determinaron los números de partículas mediante análisis de hibridación puntual. Con este vector y el plásmido de empaquetamiento pRS5 fueron transfectadas simultáneamente las líneas celulares de carcinoma de pulmón H209 y H82. Se sometieron a ensayo diversas dosis del vector en 4 x 10^{4} células por alícuota. Cuarenta y ocho a 72 horas después de la transfección, las células fueron teñidas fluorescentemente para la expresión del gen de la superficie celular utilizando un anticuerpo anti-CD44. Las células se hicieron pasar después a través de un contador celular activado por fluorescencia para determinar la proporción que estaba teñida positivamente.

Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 6. Los títulos de virus se expresan en unidades de 10^{4}; así, "1000" en el eje horizontal representa 250 partículas de vector por célula de carcinoma. La elevada frecuencia de expresión de CD44 se lograba a dosis tan bajas como 100 partículas por célula.

Claims (13)

1. Un procedimiento para la generación de títulos elevados de vectores recombinantes de virus adenoasociados (AAV), comprendiendo el procedimiento incubar una célula en condiciones que permitan la replicación y el empaquetamiento de AAV, comprendiendo dicha célula:

(a)

al menos una copia intacta de un vector de AAV recombinante integrado establemente en la célula, donde el vector de AAV comprende regiones de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un promotor de la transcripción conectado operablemente a un polinucleótido diana, y donde la expresión del gen rep es limitante para el empaquetamiento en esas células;

(b)

un plásmido de empaquetamiento de AAV que permite la expresión del producto del gen rep, donde en el plásmido el gen rep está conectado operablemente a un promotor heterólogo y el plásmido de empaquetamiento carece de homología de solapamiento con las secuencias de AAV del vector (a) de la célula de manera que el plásmido de empaquetamiento y el vector integrado no se pueden recombinar para dar un genoma de AAV completo, por medio del cual se producen vectores de AAV recombinante.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde el promotor heterólogo de (b) es HIV-LTR.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, donde el polinucleótido diana codifica un polipéptido regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR).

4. Un sistema de empaquetamiento para la generación de títulos elevados de vectores de AAV recombinante, comprendiendo el sistema:

(a)

células que contienen al menos una copia intacta de un vector de AAV recombinante integrado establemente en la célula, donde el vector de AAV comprende regiones de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un promotor de la transcripción conectado operablemente a un polinucleótido diana y la expresión del gen rep es limitante para el empaquetamiento en esas células; y

(b)

un plásmido de empaquetamiento de AAV que permite la expresión del producto del gen rep, donde en el plásmido el gen rep está conectado operablemente a un promotor heterólogo y el plásmido de empaquetamiento carece de homología de solapamiento con las secuencias de AAV del vector de la célula proporcionado en (a) de manera que el plásmido de empaquetamiento y el vector integrado no se pueden recombinar para dar un genoma de AAV completo.

5. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 4, donde el promotor heterólogo de (b) es HIV-LTR.

6. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 4 ó 5, donde el polinucleótido diana codifica un polipéptidos regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR).

7. Un plásmido de empaquetamiento para su uso en la producción de la generación de títulos elevados de vectores recombinantes de AAV que permite la expresión del producto del gen rep, donde el plásmido comprende un gen rep conectado operablemente a un promotor heterólogo y el plásmido de empaquetamiento carece de homología de solapamiento con las secuencias de AAV en un vector de AAV recombinante integrado establemente en una célula de manera que el plásmido de empaquetamiento y el vector integrado no se pueden recombinar para dar un genoma de AAV completo, comprendiendo dicha célula al menos una copia intacta del vector de AAV, donde el vector de AAV comprende regiones de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un promotor de la transcripción conectado operablemente a un polinucléotido diana.

8. Un plásmido de empaquetamiento según la reivindicación 7, donde el promotor del plásmido de empaquetamiento al cual está conectado operablemente rep es HIV-LTR.

9. Una célula para la generación de títulos elevados de vectores de AAV recombinante, que comprende:

(a)

al menos una copia intacta de un vector de AAV recombinante integrado establemente en la célula, donde el vector de AAV comprende regiones de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un promotor de la transcripción conectado operablemente a un polinucleótido diana, y donde la expresión del gen rep es limitante para el empaquetamiento en esas células; y

(b)

un plásmido de empaquetamiento de AAV que permite la expresión del producto del gen rep, donde en el plásmido el gen rep está conectado operablemente a un promotor heterólogo y el plásmido de empaquetamiento carece de homología de solapamiento con las secuencias de AAV del vector de la célula definido en (a) de manera que el plásmido de empaquetamiento y el vector integrado no se pueden recombinar para dar un genoma de AAV completo.

10. Una célula según la reivindicación 11 ó 12, donde el promotor heterólogo de (b) es HIV-LTR.

11. Una célula según la reivindicación 9 ó 10, donde el polinucleótido diana codifica un polipéptido regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR).

12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el plásmido es pRS5 (NUM. DE ACCESO DE LA ATCC: 69483).

13. Un sistema de empaquetamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, un plásmido de empaquetamiento según la reivindicación 7 u 8 o una célula según una cualquier de las reivindicaciones 9 a 11, donde el plásmido es pRS5 (NUM. DE ACCESO DE LA ATCC: 69483).