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Diese
Anmeldung beansprucht gemäß 35 U.S.C. §119(e) das
Privileg der provisorischen US-Anmeldung 60/368,654, eingereicht
am 29. März 2002.
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ERKLÄRUNG BEZÜGLICH MIT BUNDESMITTELN GEFÖRDERTER
FORSCHUNG UND ENTWICKLUNG
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BEZUGNAHME AUF MIKROFILM-ANHANG
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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Maximierung der
Produktion eines thermostabilen Virus, basierend auf einer Zellkulturtemperatur-Verschiebungsstrategie,
welche zu einer substantiellen Erhöhung der Produktion von thermisch
stabilem Virus führt.
Die Manipulation von Zellkulturbedingungen erfordert es, Zellen
bei einer suboptimalen Wirtszellwachstumstemperatur für eine Zeitspanne vor
der Virusinfektion zu züchten,
indem die Zellwachstumstemperatur für eine Zeitspanne nach unten
auf ein suboptimales Niveau verschoben wird oder indem die Zellen
für die
gesamten mehrfachen Passagen des Zellexpansionsprozesses von der
Inokulation einer kryokonservierten Ampulle von Zellen an bei einer
suboptimalen Temperatur gezüchtet
werden, gefolgt von Verschiebung der Temperatur auf ein höheres Niveau
vor, gleichzeitig oder nach Virusinfektion der Wirtszellen. Diese
Methodik resultiert in einer substantiellen Erhöhung von gewinnbarem Virus
im Vergleich mit bekannten Temperaturschemata für die Virusproduktion innerhalb
einer Wirtszellkultur.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Fortschritte
auf den Gebieten der Verwendung rekombinanter viraler Vektoren für Gentherapie-
und DNA-Vakzinierungs-Anwendungen haben einen Bedarf für die großmaßstäbliche Herstellung und
Reinigung von Virus klinischen Reinheitsgrads geschaffen. Eine solche
Familie von Viren sind die Adenoviren. Die Adenoviren werden in
die Familie Adenoviridae eingeordnet, welche in die Gattung Aviadenovirus
(Vögel)
und Mastadenovirus (Mensch, Affe, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund
und Opossum) unterteilt ist. Ein Überblick über die Familie Adenoviridae
ist in Fundamental Biology, 3. Aufl., Fields, B. N., Knipe, D. M.,
und Howley, P. M., Hrsg., in Kapitel 30, S. 979–1016(1996), zu finden, hier durch
die Bezugnahme miteingeschlossen. Von speziellem Interesse bei Genvakzinierungs-
und/oder Gentherapie-Anwendungen ist die Verwendung eines replikationsunfähigen Adenovirus,
verstümmelt durch
E1- oder weitere Deletionen, einschließlich „gutless" Adenovirus-Vektoren. Das Adenovirus-Genom
ist im Allgemeinen mit gutartigen Pathologien bei Menschen assoziiert
und die genomische Organisation des Virus wurde seit seiner Entdeckung
in den früheren
fünfziger
Jahren des 19. Jahrhunderts gut untersucht. Darüber hinaus ist das Genom einer
Manipulation zugänglich,
in Abhängigkeit
von der verwendeten Strategie zur Konstruktion des jeweiligen Vektors.
Ein replikationsunfähiges
Virus (wie z. B. ein E1/E3-deletierter Ad5gag-Vektor, der ein HIV-gag-Transgen
exprimiert, wie hier beispielhaft dargestellt) erfordert eine Zelllinie,
welche die Deletionen komplementiert. Eine beliebige solche Zelllinie kann
zur Erzeugung rekombinanter Virusvektoren verwendet werden, wobei
bevorzugte Zelllinien 293-Zellen und PER.C6
TM-Zellen
einschließen,
jedoch nicht darauf beschränkt
sind. Diesbezüglich wurden
zahlreiche rekombinante Adenovirus-Vektoren der ersten Generation
in der Literatur beschrieben (siehe z. B. Bett et al., 1994, Proc.
Natl. Acad. Sci. 91: 8802–8806;
WO 01/02607 und
WO 02/22080 ). „Gutless" Adenovirus-Vektoren
sind Adenovirus-Vektoren der zweiten Generation, denen allgemein
virusprotein-codierende Sequenzen fehlen, wobei die viralen Proteine
häufig
in trans von einem Helfervirus (oft einem E1-deletierten Adenovirus)
ergänzt
werden, das mit dem helfer-abhängigen
(„helper-dependent"; HD) Adenovirus
in einer verpackenden Zelllinie (z. B. PER.C6
TM)
gezüchtet
wird. In Abwesenheit von viralen Proteinen können diese viralen Vektoren
alternativ in trans von einer Zelllinie ergänzt werden und/oder einem
"Helfervirus", welche(s) imstande
ist, die strukturellen und funktionellen adenoviralen Proteine zu
exprimieren, die für
eine erfolgreiche Replikation, Verpackung und Freisetzung erforderlich
sind. In Anbetracht der erhöhten
Popularität dieser
viralen Vektoren und des letztlichen Erfordernis, kommerzielle Mengen
entweder eines auf einem viralen Vektor basierenden Vakzins oder
eines Gentherapie-Vehikels herzustellen, wurde es essentiell, effizientere
qualitative und quantitative Methoden zur Herstellung rekombinanter
Adenovirus-Vektoren kommerziellen
Grades zu entwickeln.
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Es
wurde gezeigt, dass die Temperatur ein wichtiger Prozessparameter
sowohl für
das Zellwachstum als auch die Virusproduktion ist. Die physiologische
Temperatur von 37°C
hat sich als optimal für
das Wachstum einer Mehrheit von Säugerzelllinien erwiesen. Von
Temperaturen unterhalb von 37°C ist
historisch gezeigt worden, dass sie die Zellwachstumsrate, den gesamten
Zellmetabolismus und die spezifische Produktbildung in Sängerzellen
reduzieren (siehe z. B. Moore et al., 1997, Cytotechnology 23: 47–54; Chuppa
et al., 1997, Biotechnol Bioeng. 55: 328–338). Die optimale Temperatur
für Virusproduktion
hängt von
dem Virusstamm und der Wirtszelllinie ab, wurde jedoch oft als unter
37°C befunden, einschließlich 34°C für die Produktion
von Herpes-simplex-Virus (HSV) in FL-Zellkultur (Hoggan und Roizman,
1959, Virology 8: 508–524),
32 bis 34°C
für Myxoma-Virus
(Ross und Sanders, 1979, J. Gen. Virol. 43: 213–216) und 35°C für das Maul-
und Klauenseuche-Virus in BHK 21-Suspensionszellkulturen (Capstick
et al., 1967, J. Hyg. Camb. 65: 273–280), und 32°C für kälteadaptierte
Influenzaviren in MDCK-Zellen. Temperaturen oberhalb von 37°C sind im
Allgemeinen nicht geeignet oder sogar nicht-permissiv für die Virusreplikation
(Schweitzer-Thumann et al., 1994, Res. Virol. 145: 163–170). Für stark
wärmelabile
Viren wie ein Retrovirus kann die Virusproduktivität durch
Verschiebung der Kulturtemperatur von 37°C (während des Zellwachstums) herunter
auf 32°C
für die
Virus produktion signifikant erhöht
werden, hauptsächlich
aufgrund erhöhter
Virusstabilität
bei niedriger Temperatur (McTaggart und Al-Rubeai, 2000, Biotechnol.
Prog. 16: 859–865).
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Trotz
dieser Berichte besteht ein Bedarf für die Entwicklung eines großmaßstäblichen
Verfahrens für
die Virusproduktion aus einer Zellkultur, welches sowohl quantitative
als auch qualitative Anforderungen erfüllt, die an ein kommerzielles
virus-basiertes Vakzin und/oder Gentherapieprodukt gestellt werden.
Die vorliegende Erfindung begegnet und und erfüllt diese(n) Anforderungen
durch Offenbarung eines optimierten Zellkultur- und Virusproduktionsverfahrens,
welches optimale Temperaturbereiche definiert, was zu einer verbesserten
Virusproduktivität
sowie zur Eliminierung von Produktivitätssschwankungen innerhalb eines
Ansatzes führt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Maximierung der
Produktion eines thermostabilen Virus, basierend auf einer Zellkulturtemperatur-Verschiebungsstrategie,
welche zu einer substantiellen Erhöhung der Produktion eines thermisch
stabilen Virus führt.
Die Manipulation der Temperatur innerhalb des Zellkultur/Virusproduktionsprozesses wie
hier offenbart beruht auf einer Temperaturverschiebungsstrategie,
wodurch (1) die Kultur von Wirtszellen für einen Zeitraum vor der Virusinfektion zu
einer suboptimalen Temperatur verschoben wird oder (2) die Wirtszellkultur
inokuliert und bei einer jeweiligen suboptimalen Temperatur gezüchtet wird, gefolgt
von einer Zurückverschiebung
zu einer optimaleren Wachstumstemperatur zu oder nahe dem Zeitpunkt
der Virusinfektion der jeweiligen Wirtszellen. Die Anwendung einer
solchen Temperaturverschiebungsstrategie bietet eine einfache, jedoch
effektive Methode, um das gewinnbare Virus innerhalb eines jeweiligen
Wirtszell/Virusproduktionsschemas substantiell zu erhöhen, ohne
die Notwendigkeit, andere Kultur- und/oder Mediumbedingungen innerhalb eines
etablierten Wirtszell/Virusproduktionsschemas weiter zu manipulieren.
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Obwohl
irgendein Virus, das der Produktion in einer temperaturkontrollierten
Zellkulturumgebung zugänglich
ist, als vom Rahmen dieser Offenbarung umfasst betrachtet wird,
ist die vorliegende Erfindung besonders anwendbar auf thermostabile
Viren, wie z. B. Mitglieder der Familie Adenoviridae (einschließlich aller
bekannter Adenovirus-Serotypen und rekombinantem Virus, das aus
einem solchen Adenovirus-Serotyp erzeugt wurde, einschließlich irgendeines
rekombinanten Adenovirus-Vektors der ersten oder zweiten Generation,
der im Stand der Technik bekannt ist) und Mitglieder der Picornavirus-Familie (z.
B. Poliovirus, Rhinovirus, Hepatitis A-Virus, Maul- und Klauenseuche-Virus).
Ein bevorzugtes Virus ist irgendein Serotyp von Adenovirus und besonders
bevorzugt ist irgendein rekombinanter Adenovirus-Vektor der ersten
oder zweiten Generation, der mindestens ein heterologes Transgen
enthält
(siehe beispielsweise Bett et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:
8802–8806;
WO 01/02607 und
WO 02/22080 , die drei Publikationen
sind hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen).
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Wie
oben festgestellt, beruht die vorliegende Erfindung teilweise auf
einer Temperaturverschiebungsstrategie für das Zellwachstum, umfassend das
Verringern der Kulturtemperatur auf ein suboptimales Niveau für einen
Zeitraum vor der Virusinfektion oder das Züchten von Zellen bei einem
suboptimalen Niveau für
den gesamten Zellexpansionsprozess, einschließlich einer oder mehr als einer
Passage von Zellwachstum ausgehend von kryokonservierten Zellen,
gefolgt von einer Verschiebung auf die oder nahe der physiologische(n)
Temperatur zur Produktion des speziellen Virus vor, gleichzeitig
oder nach Virusinfektion der Wirtszellen. Verschiedene Parameter,
welche ferner in Zusammenhang mit der hier offenbarten Temperaturverschiebungsmethodik manipuliert
werden können
und vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst werden, schließen ein, sind
jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, (1) Änderung
des Bereichs der Verschiebung auf suboptimale Kulturbedingungen;
(2) Änderung
der Zeitspanne der Wirtszellkultur bei einer suboptimalen Temperatur;
und (3) Koordination des Zeitpunkts der Infektion der Zellkultur
mit Virus mit einer Rückkehr zu
einer optimalen Zellkulturbedingung bei dem oder nahe dem bekannten
physiologischen Optimum für das
jeweilige Wirtszell/Virus-System, wobei diese Temperaturverschiebung
zu einem sinnvollen Zeitpunkt stattfindet, welcher in der Nähe des Zeitpunkts der
Virusaussaat liegt, nämlich
vor der Virusinfektion der Zellkultur, gleichzeitig mit der Virusinfektion
oder zu irgendeinem Zeitpunkt nach der Virusinfektion der Zellkultur.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zellkulturtemperatur-Verschiebungsstrategie,
um die Virusproduktion zu erhöhen, wobei
die Temperaturverschiebung eine Erniedrigung der Zellkulturtemperatur
auf ein suboptimales Niveau für
das Zellwachstum für
eine Zeitspanne vor der Infektion der Zellen mit dem jeweiligen
Virus, wie z. B. einem rekombinanten Adenovirus-Vektor, umfasst.
Zu dem oder nahe dem Zeitpunkt der Virusinfektion wird die Temperatur
erneut auf die physiologische Zellkulturtemperatur verschoben oder
auf eine Temperatur, welche der physiologischen Kulturtemperatur
nahekommt; die Kombination von Zellexposition bei der niedrigen
Temperatur und der Verschiebung nach oben reflektiert eine physiologisch
optimale Praxis für
die Virusproduktion.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zellkulturtemperatur-Verschiebungsstrategie
zur Erhöhung
der Virusproduktion, wobei die Temperaturverschiebung umfasst eine Erniedrigung
der Zellkulturtemperatur auf ein suboptimales Niveau für das Zellwachstum
von dem Zeitpunkt des Inokulierens der Zellkultur mit Wirtszellen
von kryokonservierten Zellen und fortgesetztes Wachstum der Zellkultur
bei einer suboptimalen Temperatur für eine oder mehr als eine Passage
bis zu einer Temperaturverschiebung zu einer optimalen Temperatur,
welche zu einem sinnvollen Zeitpunkt in der Nähe des Zeitpunkts der Virusaussaat
stattfinden sollte, nämlich
vor der Virusinfektion der Zellkultur, gleichzeitig mit der Virusinfektion
oder zu einem Zeitpunkt nach der Virusinfektion der Zellkultur.
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Diesbezüglich betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von Virus,
welches umfasst das Inokulieren und Kultivieren von Wirtszellen
in einem geeigneten Medium bei einer Temperatur unter einem physiologischen
Optimum für
Wirtszellenwachstum, Infizieren der Wirtszellen mit einem Virus,
wodurch mit Virus infizierte Wirtszellen entstehen, Kultivieren
der mit Virus infizierten Wirtszellen bei oder nahe einer physiologisch
optimalen Temperatur für
die Produktion von Virus, Ernten und Lysieren von Wirtszellen und
dann Reinigen des Virus von den geernteten lysierten Wirtszellen, wodurch
ein gereinigtes Virusprodukt entsteht.
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Eine
spezielle Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion
von Virus, welches umfasst das Inokulieren und Kultivieren von Wirtszellen
in einem geeigneten Medium bei einer Temperatur bei oder in der
Nähe des physiologischen
Optimums für
Wirtszellenwachstum, Verschieben der Temperatur der Wirtszellenkultur
auf eine Temperatur unterhalb eines physiologischen Optimums für das Wirtszellenwachstum,
Infizieren der Wirtszellen mit einem Virus, wodurch mit Virus infizierte
Wirtszellen entstehen, Kultivieren der mit Virus infizierten Wirtszellen
bei oder nahe einer physiologisch optimalen Temperatur für die Produktion
von Virus, Ernten und Lysieren von Wirtszellen und Reinigen von
Virus von den geernteten, lysierten Wirtszellen, wodurch ein gereinigtes
Virusprodukt entsteht.
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Der
Zeitrahmen für
eine Verschiebung zu einer suboptimalen Temperatur beträgt vorzugsweise etwa
4 Stunden bis zum gesamten Vorinfektionskulturzeitraum (einschließlich vom
Zeitpunkt des Inokulierens des Kulturmediums mit den Wirtszellen
durch Inokulation einer kryokonservierten Ampulle von Zellen) vor
dem Infektionsschritt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
eine(r) anfänglichen)
Kulturinokulation bei einer suboptimalen Temperatur, einer bis mehreren
Zellpassagen bei einer suboptimalen Temperatur, gefolgt von einer
Temperaturverschiebung nach oben zu einer physiologisch optimalen
Temperatur für
Virusinfektion und -produktion.
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Die
hier offenbarten Methoden, die teilweise in den vorhergehenden Paragraphen
dieses Abschnitts zusammengefasst sind, werden vorzugsweise angewandt
auf irgendeinen Serotyp von Adenovirus der ersten oder zweiten Generation.
Bevorzugte Vor- und Nachinfektionszellkulturtemperaturen beinhalten,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, einen Bereich von etwa 31°C
bis 35°C
für suboptimales
Zellwachstum und von etwa 35°C
bis 38°C
als physiologisch optimalen Bereich für irgendeine Kulturperiode vor
(Vorinfektion) oder nach (Nachinfektion) Infektion der Wirtszellkultur
mit einer Virussaatstammlösung.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einfacher,
jedoch effektiver Methoden zur Erhöhung der Virusproduktion in
einem etablierten Wirtszell/Virusproduktion-Kultursystem durch Inkorporation eines
Temperaturschemas wie hier offenbart für das Zellwachstum und die
Virusinfektion.
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Eine
weitere Aufgabe ist die Bereitstellung solcher verbesserter Virusproduktionsmethoden durch
Inkorporation einer Temperaturverschiebungsstrategie während der
Virusproduktion, welche eine Verschiebung auf eine suboptimale Temperatur
während
der Zellkultur für
eine Zeitspanne vor dem Impfen der Kultur mit Virus verlangt, gefolgt
von einer zweiten Temperaturänderung
in dem Kultursystem, welche zu einer Temperaturverschiebung zurück zu derjenigen
oder nahe derjenigen, die ein physiologisches Optimum für das jeweilige
Wirtszell/Virusproduktions-Kultursystem darstellen würde, führt.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt
einen schematische Aufbau mehrerer Passagen von PER.C6TM-Zellen
und Adenovirus-Infektion bei Temperaturen in Rollflaschen unter
serumfreien Bedingungen.
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2A und 2B zeigen
Konzentrationen lebensfähiger
Zellen von mit Adenovirus infizierten PER.C6TM-Zellen,
die bei Temperaturen von 31, 33, 35, 37 und 39°C kultiviert wurden: A. Gruppe
I mit Zellen, die vor der Virusinfektion bei 37°C gezüchtet wurden; B. Gruppe II
mit Zellen, die vor der Virusinfektion 8 Tage lang bei 33°C gezüchtet wurden.
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3A und 3B zeigen
die Lebensfähigkeiten
von mit Adenovirus infizierten PER.C6TM-Zellen,
kultiviert bei Temperaturen von 31°, 33°, 35°, 37° und 39°C. A. Gruppe I mit Zellen, die
vor der Virusinfektion bei 37°C
gezüchtet
wurden; B. Gruppe II mit Zellen, die vor der Virusinfektion 8 Tage
lang bei 33°C gezüchtet wurden.
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4A, 4B und 4C zeigen
Adenovirus-Replikationskinetiken und Wirkungen der Kulturtemperatur
auf die Virusproduktivität
in PER.C6TM-Kulturen bei Temperaturen von
31, 33, 35, 37 und 39°C:
A. Intrazelluläre
Virus-Produktivität
in Gruppe I mit Zellen, die vor der Virusinfektion bei 37°C gezüchtet wurden;
B. Intrazelluläre
Virus-Produktivität
in der Gruppe II mit Zellen, die vor der Virusinfektion 8 Tage lang
bei 33°C
gezüchtet
worden waren; C. Virusproduktivitätsverhältnis von Gruppe II zu Gruppe
I.
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5 zeigt
einen Versuchsaufbau ähnlich dem
von 1, nämlich
zur Messung der Wirkung, welche die Länge der Zeit bei einer „suboptimalen" Temperatur auf die
Ad5gag-Virus-Produktion hat.
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6 zeigt
die Virusproduktion unter Temperaturschemata, die sich von der in 5 beschriebenen
Studie unterscheiden.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Maximierung der
Produktion eines Virus, welches unter Kulturbedingungen relativ
thermostabil ist, typischerweise irgendeines nichtumhüllten Virus,
wie z. B. Adenoviren, Parvoviren, Reoviren, und/oder Picornaviren.
Es ist eine akzeptierte Praxis, dass das Zellwachstum in Kultur
typischerweise bei der physiologischen Temperatur von 37°C durchgeführt wird und
die Viruspropagation entweder bei derselben Temperatur wie das Zellwachstum
durchgeführt
wird oder nach unten zu einer niedrigeren Temperatur verschoben
wird. Die Grundlage für
solch eine Produktionsstrategie war, dass die Kultur bei der physiologischen
Temperatur ein optimales Zellwachstum ermöglicht, jedoch die optimale
Temperatur für
die Produktion vieler Viren aufgrund verbesserter Produktivität und Stabilität gewöhnlich niedriger
ist. Die vorliegende Erfindung basiert auf einem kontra-intuitiven Ansatz,
der Zellkultur/Virusproduktions-Temperaturbereiche beinhaltet, welche
zu einer substantiellen Erhöhung
der Produktion von thermisch stabilem Virus führen. Spezieller betrifft die
vorliegende Erfindung eine Zellkultur/Virusproduktionstemperatur-Verschiebungsstrategie, wodurch
die Kultur von Wirtszellen auf eine suboptimale Kulturtemperatur
für eine
Zeitspanne vor der Virusinfektion verschoben wird oder die Zellen
für den
gesamten Zellexpansionsprozess, einschließlich einer oder mehr als einer Passage
von Zellwachstum kryokonservierter Zellen, bei einem suboptimalen
Niveau gezüchtet
werden, gefolgt von einer Verschiebung zurück auf eine optimalere Temperatur
für die
Virusproduktion. Die Produktion eines rekombinanten Adenovirus-Serotyps 5, codierend
für ein
HIV-gag-Transgen (Ad5gag), ist hier beispielhaft dargestellt. Es
wird hier gezeigt, dass eine 2-3-fache Erhöhung der Produktion von rekombinantem
Ad5-gag stattfindet, wenn die Temperatur für das Wirtszellwachstum für eine Zeitspanne vor
der Virusinfektion herunter auf ein suboptimales Niveau verschoben
wird. Die Temperatur wird nach der Virusinfektion zurück auf optimale
Niveaus verschoben.
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Somit
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Maximierung
der Produktion eines thermostabilen Virus, basierend auf einer Zellkulturtemperatur-Verschiebungsstrategie,
welche zu einer substantiellen Erhöhung der Produktion von thermisch
stabilem Virus führt.
Die Manipulation der Temperatur innerhalb des Zellkultur/Virusproduktionsprozesses,
die hier offenbart ist, beruht auf einer Temperaturverschiebungsstrategie,
wodurch (1) die Kultur von Wirtszellen für eine Zeitspanne vor der Virusinfektion
auf eine suboptimale Temperatur verschoben wird oder (2) die Wirtszellkultur
inokuliert und bei einer jeweiligen suboptimalen Temperatur gezüchtet wird,
gefolgt von einer Verschiebung zurück zu einer optimaleren Wachstumstemperatur
zu dem oder nahe dem Zeitpunkt der Virusinfektion der jeweiligen Wirtszellen.
Die Anwendung einer solchen Temperaturverschiebungsstrategie bietet
eine einfache, jedoch effektive Methode zur substantiellen Erhöhung von
gewinnbarem Virus innerhalb eines jeweiligen Wirtszell/Virusproduktionsschemas
ohne die Notwendigkeit, andere Kultur- und/oder Medienbedingungen innerhalb
eines etablierten Wirtszell/Virusproduktionsschemas weiter zu manipulieren.
Während
spezielle Zellkultur- und Virusproduktionsbedingungen hier in den
Beispielsabschnitten offenbart werden, wird es im Rahmen des Vermögens eines Durchschnittsfachmanns
liegen, diese Temperaturverschiebungsstrategie zu nutzen, um die
Virusproduktion für
andere thermostabile Viren zu optimieren, unabhängig von der jeweiligen Wirtszell/Virus-Kombination.
Der Fachmann kann anhand der vorliegenden Lehre eine Temperaturverschiebungsstrategie adaptieren
und optimieren, welche zur höchstmöglichen
Erhöhung
der Virusproduktion führt.
Es liegt auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, Kulturbedingungen,
Medienkomponenten und andere solche Schritte oder Verfahren, die
dem Fachmann bekannt sind, welche in Kombination mit einer Temperaturverschiebungsstrategie
verwendet werden können,
zu verändern
oder zu manipulieren. Solche Parameter umfassen, sind jedoch nicht
beschränkt
auf, Änderung
des Bereichs der Verschiebung zu suboptimalen Kulturbedingungen
(z. B. eine Zellkulturverschiebung von 37°C auf 33°C und zurück auf 37°C gegenüber 37°C auf 31°C und zurück auf 37°C), die Länge der Zeit einer Wirtszellkultur
bei einer suboptimalen Temperatur (z. B. vom Inokulationszeitpunkt ab
1 Tag, 4 Tage, 20 Tage etc.) sowie eine Koordination von Virusinfektion
mit einer Rückkehr
zu optimalen Zellkulturbedingungen (z. B. nach Infektion, zum Zeitpunkt
der Infektion oder zu einem speziellen Zeitpunkt vor der Virusinfektion).
Unabhängig
von den adaptierten speziellen Parametern wird die Inkorporation
einer Temperaturverschiebungsstrategie effektiv eine substantielle
Erhöhung
der Virusproduktion erlauben, im Vergleich zur Verwendung derselben Parameter
bei Verzicht auf eine Temperaturverschiebungs-Zellkulturstrategie.
Mit anderen Worten, die hier offenbarte Temperaturverschiebungsmethodik wird
insbesondere von Nutzen sein bei der Erhöhung der Virusproduktion oberhalb
der Produktionsniveaus, welche für
ein jeweiliges Wirtszell/Virus-System
existieren.
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In
Anbetracht der obigen Erörterung
und den folgenden Beispielsabschnitten betrifft die vorliegende
Erfindung eine Zellkulturtemperatur-Verschiebungsstrategie zur Erhöhung der
Virusproduktion, wobei die Temperaturverschiebung umfasst eine Erniedrigung
der Zellkulturtemperatur auf ein suboptimales Niveau für eine Zeitspanne
vor dem Kontaktieren der Zellen mit dem jeweiligen Virus, wie z.
B. einem rekombinanten Adenovirus-Vektor. Zu dem oder nahe dem Zeitpunkt
der Virusinfektion wird die Temperatur erneut auf die physiologische
Zellkulturtemperatur verschoben oder auf eine Temperatur, welche
der physiologischen Kulturtemperatur nahe kommt. Wie hier beispielhaft
dargestellt, wird die Produktion eines rekombinanten Adenovirus-Vektors durch Anwendung
einer Temperaturverschiebungsstrategie optimiert. Wirtszellen werden
bei dem optimalen Wachstumstemperaturbereich von 35°–38°C, bevorzugter
bei 36–38°C, und insbesondere
bei 37°C bei
frühen
Passagen gezüchtet,
um eine schnelle Expansion der Zellzahlen für eine großmaßstäbliche Produktion zu erlauben,
welche die Dauer des Ansatzzyklus verringert. Die Zellwachstumstemperatur wird
dann herunter auf eine suboptimale Temperatur innerhalb eines Bereiches
von 31°C
bis 35°C
(z. B. 33°C)
verschoben und bis zu mehreren Tagen vor der Virusinfektion beibehalten.
Nach der Virusinfektion wird die Temperatur nach oben in den 35°–38°C-Bereich
verschoben, um die Virusproduktivität zu maximieren. Diese Temperaturverschiebungsstrategie führte zu
einer signifikanten Erhöhung
(2 bis 3-fach in Rollflaschen und ca. 2-fach in kontrollierten 2-Liter-Rührtank-Bioreaktoren)
der volumetrischen und zellspezifischen Virusproduktivität im Vergleich
zu den traditionellen Ansätzen
der Beibehaltung derselben Temperatur oder Verschiebung der Temperatur nach
unten nach der Virusinfektion. Obwohl die vorliegende Erfindung
für einen
rekombinanten Adenovirus 5-Serotyp beispielhaft dargestellt ist,
ist die hier offenbarte Temperaturverschiebungsstrategie auf andere
Adenovirus-Serotypen sowie andere thermostabile Viren, wie z. B.
Picornaviren, anwendbar. Die Erfindung betrifft speziell die erhöhte Produktion
aller Adenovirus-Serotypen unter Verwendung von E1-transformierten
Säugerzelllinien
(293, PER.C6, etc.) in allen Typen von Kulturgefäßen (T-Kolben, Rollflaschen,
Nunc Cell Factories, Cell Cubes, Wave-Bioreaktoren, Spinnerkolben,
Schüttelkolben, Rührtank-Bioreaktoren etc.),
wo eine Temperaturkontrolle implementiert ist. Deshalb, wie oben
festgestellt, beruht die vorliegende Erfindung zum Teil auf einer
Temperaturverschiebungsstrategie für das Zellwachstum, welche
umfasst das Erniedrigen der Kulturtemperatur auf ein suboptimales
Niveau für
eine Zeitspanne vor der Virusaussaat, gefolgt von einer Rückkehr zu
oder nahe der physiologischen Temperatur für die Produktion des speziellen
Virus vor, gleichzeitig mit oder nach der Virusinfektion von Wirtszellen.
Verschiedene Parameter, welche in Zusammenhang mit den hier offenbarten
Temperaturverschiebungsmethoden weiter manipuliert werden können und
vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst werden, schließen ein,
sind jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, (1) Änderung
des Bereichs der Verschiebung zu suboptimalen Kulturbedingungen;
(2) Änderung
der Länge
der Zeit der Wirtszellkultur bei einer suboptimalen Temperatur;
und (3) Koordination des Zeitpunkts der Infektion der Zellkultur
mit Virus mit einer Rückkehr
zu einer optimalen Zellkultubedingung bei dem oder nahe dem bekannten
physiologischen Optimum für das
jeweilige Wirtszell/Virus-System, wobei diese Temperaturverschiebung
zu einem sinnvollen Zeitpunkt in der Nähe des Zeitpunkts der Virusaussaat stattfindet,
nämlich
vor der Virusinfektion der Zellkultur, gleichzeitig mit der Virusinfektion
oder zu einem Zeitpunkt nach der Virusinfektion der Zellkultur.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Zellwachstumstemperatur zuerst von
einer optimalen physiologischen Temperatur (z. B. von 35°C bis 38°C) auf eine
Temperatur bei oder unter 35°C
für eine
Zeitspanne verschoben und dann zu einer Kultur bei einer physiologisch
optimalen Temperatur zu dem oder nahe dem Zeitpunkt der Virusinfektion
der Zellkultur zurückgekehrt.
Dieses Schema führt
zu einer effektiven Erhöhung
der Virusproduktion nach Infektion und Rückkehr zu Kulturbedingungen
auf optimalen Niveaus. Irgendeine „suboptimale" Temperatur bei oder
unterhalb von 35°C wird
zur Durchführung
der Erfindung in Betracht gezogen (mit Bereichen von 31°C bis 35°C, vorzugsweise
31°C bis
34°C und
am meisten bevorzugt von etwa 31°C
bis 33°C,
wobei ein höherer
Bereich von 33°C
bis 35°C
für den
Fachmann immer noch von Nutzen sein kann), solange die „suboptimale" Zellwachstumstemperatur
ein vernünftiges
Zellwachstum unterstützt
und die optimale Temperatur für
das Zellkulturwachstum 35 bis 38°C
beträgt
(wobei wiederum 36–38°C und dann
36,5 bis 37°C
besonders bevorzugte Bereiche repräsentieren) und solange es eine
Erhöhung
der Temperatur vom Zellwachstum bis zur Virusinfektion gibt. Wie
oben festgestellt, beträgt
ein bevorzugter suboptimaler Temperaturbereich 31°C bis 35°C, mit einem
stärker
bevorzugten Bereich von 31°C
bis 34°C,
wobei Unterbereiche von 31°C
bis 33°C
und/oder 33°C
bis 35°C
für den
Fachmann von Nutzen sein können,
während
eine niedrigere suboptimale Temperatur unschwer vom Fachmann getestet
werden kann. Eine bevorzugte Temperaturverschiebungsstrategie ist
eine, welche effektiv die Dauer der Zellexpansion von einem Gefäß bis zu
einem großmaßstäblichen
Produktionsmaßstab minimiert:
Die Zellen werden bei der physiologischen Temperatur von 37°C expandiert
und für
eine bestimmte Zeit auf die suboptimale Temperatur verschoben, gewöhnlich für mindestens
24 Stunden vor der Virusinfektion, mit einer Rückkehr zu der Temperatur des
Zellwachstums (wie z. B. 37°C)
oder leicht geringer, in Abhängigkeit
von der jeweiligen Wirtszelle und/oder dem jeweiligen Virus.
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Wie
im vorherigen Absatz festgestellt, betrifft eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung die Zeitspanne, in der die Kultur suboptimalen Wachstumsbedingungen
unterworfen wird. Die Zeitspanne kann irgendwo im Bereich von mehreren Stunden
bis mehreren Passagen (mehreren Tagen) bis zur gesamten Zellexpansionsperiode
ab Inokulation der Anfangskultur von einem eingefrorenen Gefäß, welches
ein Ausgangsmaterial („Stamm") von Wirtszellen
enthält, liegen.
Vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst ist ein Szenario und
alles dazwischen, wobei die Kultur zunächst bei der suboptimalen Temperatur
inokuliert wird und bei dieser niedrigeren Temperatur gehalten wird,
bis die Impfung mit der Virusstammlösung erfolgt. Es sollte auch verstanden
werden, dass kleinere Manipulationen von einem suboptimalen Temperaturschema
(wie z. B. eine kurzzeitige Erhöhung
der Temperatur gefolgt von einer Verschiebung zurück zur „suboptimalen Temperatur") und die Länge des
suboptimalen Wachstums und der Zeitpunkt der Rückkehr der Temperatur zurück zur optimalen
Temperatur bezüglich des
Zeitpunkts der Virusinfektion (z. B. Erhöhung der Temperatur mehrere
Stunden nach der Virusinfektion oder mehrere Stunden vor der Infektion
etc.) ohne Weiteres im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt.
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Die
Wirtszelle zur Verwendung in dem Temperaturverschiebungsprotokoll,
welches die vorliegende Erfindung umfasst, kann irgendeine Säugerzelllinie
sein, welche die Replikation des jeweiligen thermostabilen Virus
unterstützt,
insbesondere irgendeine im Stand der Technik bekannte Wirtszelllinie,
welche die Infektion und Replikation eines Adenovirus-Vektors der
ersten oder zweiten Generation unterstützen wird. Eine bevorzugte
Wirtszelle ist eine Wirtszelllinie, welche die Infektion und Replikation
eines E1- und/oder E1/E3-deletierten rekombinanten Adenovirus unterstützt. Wie
hier offenbart, erfordert ein solches replikationsunfähiges Virus
(z. B. ein Ad5gag, wie hier beispielhaft dargestellt) eine Helferzelllinie,
welche die Ad5-E1-Deletion komplementiert. Irgendeine solche Zelllinie
kann zur Erzeugung von rekombinantem Virus verwendet werden, wobei bevorzugte,
jedoch nicht beschränkende
Zelllinien 293-Zellen, PER.C6TM-Zellen,
911-Zelllinien aus einer humanen embryonalen Retinazelllinie (Fallaux
et al., 1996, Human Gene Therapy 7: 215–222), E1-transformierte Amniozyten
(Schiedner et al., 2000, Human Gene Therapy 11: 2105–2116);
eine E1-transformierte A549-Zelllinie für ein Human-Lungenkarzinom (Imler et al., 1996,
Gene Therapy 3: 75–84)
und GH329: HeLa (Gao et al., 2000, Human Gene Therapy 11: 213–219) einschließen. Eine
solche Zelllinie wird transformiert, um die Replikation und Verpackung
eines jeweiligen rekombinanten Adenovirus, wie z. B. eines E1- oder
E1/E3-deletierten rekombinanten Adenovirus, zu unterstützen. Zusätzliche
Zelllinien, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können,
sind wiederum Zelllinien, welche adaptiert wurden, um als Wirtszellen für einen
speziellen thermostabilen Virus zu fungieren. Es ist bevorzugt,
dass die Zelllinie eine kontinuierliche Zelllinie ist, und bevorzugter,
dass die Quelle der kultivierten Zellen von einem nicht-neoplastischen
Gewebe stammt. Es ist auch bevorzugt, dass die Quelle eine Sängerquelle
ist, am wahrscheinlichsten mit einem Primatenursprung und insbesondere
menschlichen Ursprungs. Wiederum ist eine bevorzugte Zelllinie eine
Zelllinie, welche für
die Propagation eines E1- oder E1/E3-deletierten rekombinanten Ad-Virus
von Nutzen ist; ein rekombinantes Virus, welches E1-deletierten
Adenovirus-Vektor komplementiert, einschließlich Zelllinien, die mit dem
für Ad-E1
codierenden Gen transformiert wurden, welche für diesen transformierten Phänotyp selektiert wurden,
wie z. B. 293-Zellen (Epithelzellen aus humaner Niere) und PER.6TM (humane embryonale Retinoblasten). Andere
Zelltypen schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, HeLa-Zellen, A549-Zellen, KB-Zellen, CKT1-Zellen, NIH/sT3-Zellen, Vero-Zellen,
Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder irgendwelche
eukaryotische Zellen, welche den Adenovirus-Lebenszyklus unterstützen.
-
Es
ist bevorzugt, jedoch nicht erforderlich, dass die Kultur eine Suspensionskultur
ist; eine Suspensionskultur, die in einem geeigneten Medium gehalten
wird, welches das Zellwachstum, die Virusinfektion und Virusproduktion
unterstützt.
Eine solche Suspensionskultur ist im Stand der Technik wohlbekannt
und kann wiederum auf einer Reihe von Wegen modifiziert werden,
die dem Fachmann bekannt sind, ohne eine geeignete Inkorporation
einer Temperaturverschiebungsstrategie zur Erhöhung der Virusproduktion zu
bewirken. Das Kulturmedium kann verschiedenen Wachstumsbedingungen
unterworfen werden, welche für
die Virusproduktion geeignet sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
diskontinuierliche, „Fed-batch-" oder kontinuierliche Perfusionsvorgänge, um
frisches Medium in das Kulturmedium einzuführen. Wiederum kann das Kulturmedium
jedes geeignete Medium zur Aufrechterhaltung der Zellen und Gestattung
der Propagation des jeweiligen Virus sein. Zahlreiche Beispiele
geeigneter Medien zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden
Erfindung und die Prinzipien zur Herstellung modifizierter oder
neuer geeigneter Medien sind allgemein im Stand der Technik bekannt.
Hinsichtlich eines Überblicks
siehe Kapitel 8 (serumbasierte Medien) und Kapitel 9 (serumfreie
Medien) von Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique;
Hrsg. Freshen, RI., 2000, Wiley-Lisps, Seiten 89–104 bzw. 105–120. Im
Allgemeinen werden entweder serumbasierte oder serumfreie Medien
manipuliert werden, um das Wachstum der jeweiligen Zelllinie in
Kultur zu erhöhen,
mit einem Potential zum Einschluss irgendeines der Folgenden: eine
Auswahl sekretierter zellulärer
Proteine, diffusionsfähiger
Nährstoffe,
Aminosäuren,
organischer und anorganischer Salze, Vitamine, Spurenmetalle, Zucker
und Lipide sowie möglicherweise
anderer Verbindungen wie z. B. wachstumsfördernde Substanzen (z. B. Zytokine).
Wie aus dem „Trade
Index" auf den Seiten
483–515
von Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, (ebd.)
ersichtlich, sind die potentiellen Lieferanten von sowohl Informationen
als auch Zellkulturmedien praktisch unbeschränkt. Ein bevorzugtes Medium, das
im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein definiertes
Medium, wie z. B. das hier als Beispiel angegebene Medium Ex-Cell
525-Medium (von JRH Biosciences, [http//www.jhrbio.com]) und 293
SFM II-Medium (von Invitrogen). Es ist auch wünschenswert, dass solche Medien
mit Glutamin ergänzt
sind, wie hier offenbart.
-
Die
Virustypen, welche der Temperaturverschiebungsstrategie der vorliegenden
Erfindung zugänglich
sind, stammen vorzugsweise aus zwei Virusfamilien, welche nicht-umhüllte DNA-Viren sind, die humane
Zellen infizieren. Diese beiden Virustypen sind die Adenoviridae-Familie
(einschließlich
aller bekannter Adenovirus-Serotypen und rekombinanter Viren, die
von einem solchen Adenovirus-Serotyp generiert wurden) und Mitglieder
der Picornavirus-Familie (z. B. Poliovirus, Rhinovirus, Hepatitis A-Virus,
Maul- und Klauenseuche-Virus). Ein Adenovirus 5-Serotyp, ein Mitglied der Adenoviridae-Familie,
ist hier beispielhaft behandelt. Der Begriff „Virus" wie hier verwendet, soll jedes Virus
umfassen, welches einem Abschluss seines Replikationszyklus in der
Säugerzelllinie
der Wahl zugänglich
ist. Deshalb soll dieser Begriff jedenfalls Wild- Typ-Virus, irgendein genetisch modifiziertes
Virus, wie z. B. ein abgeschwächtes
Virus oder wahrscheinlicher einen rekombinanten Virus-Vektor, der
ein Entwicklungskandidat für
eine potentielle Gentherapie- und/oder DNA-Vakzinierungs-Anwendung
sein kann, einschließen.
Solche Programme haben einen Bedarf für die großmaßstäbliche Herstellung und Reinigung von
Virus klinischen Grades geschaffen. Ein bevorzugtes rekombinantes
Virus, welches den hier offenbarten verbesserten Zellkultur/Virusproduktionsparametern
zugänglich
ist, ist eine Familie von Viren, welche als die Adenoviren bekannt
sind. Die Adenoviren werden in die Familie Adenoviridae eingruppiert,
welche sich aufspaltet in die Gattung Aviadenovirus (Vögel) und
Mastadenovirus (Mensch, Affe, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund
und Opossum). Adenoviren sind im Stand der Technik wohlbekannt und
Gegenstand vieler Reviews, wie sie z. B. in Fundamental Biology,
3. Auflage, Fields, B. N., Knipe, D. M., und Howley, P. M., Hrsg.,
in Kapitel 30, S. 979–1016 (1996),
zu finden sind, hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen. Von
speziellem Interesse bei Genvakzinierungs- und/oder Gentherapie-Anwendungen
ist die Verwendung eines replikationsunfähigen Adenovirus der ersten
Generation, verstümmelt durch
E1- und/oder E3-Gendeletionen, basierend auf irgendeinem aus einer
Reihe von Adenovirus-Serotypen,
wie z. B. Serotyp 5 von Adenovirus. Ein weiterer Vektortyp wird
als Adenovirus-Vektor der zweiten Generation bezeichnet und umfasst
allgemein eine Klasse von Adenovirus-Vektoren, die „gutless" Adenovirus-Vektoren
einschließen. „Gutless" Adenovirus-Vektoren
sind Adenovirus-Vektoren,
denen allgemein virusprotein-codierende Sequenzen fehlen, häufig mit
viralen Proteinen, die in in trans von einem Helfervirus ergänzt werden
(oft ein E1-deletiertes Adenovirus), das mit dem HD-Adenovektor
in einer verpackenden Zelllinie (z. B. PER.C6TM)
gezüchtet wird.
In Abwesenheit viraler Proteine können diese viralen Vektoren
alternativ in trans von einer Zelllinie ergänzt werden, die imstande ist,
die strukturellen und funktionellen adenoviralen Proteine zu exprimieren,
welche für
erfolgreiche Replikation, Verpackung und Freisetzung erforderlich
sind. Die einzigen cis-Elemente, die gewöhnlich auf dem HD-Vektor vorliegen,
sind das Verpackungssignal und die umgekehrten Terminal Repeats
(ITRs). Vorzugsweise hat das Ad-Virion ungefähr mindestens 75% der Wildtyp-Genomlänge, einschließlich Transgen
und etwaiger exogener nicht-transkribierter Nukleinsäure, die
darin inkorporiert ist (Füll-DNA).
Das Ad-Virion weist Berichten nach im Wesentlichen eine untere Verpackungsgrenze
von etwa 75% der Wildtyp-Genomlänge
auf; siehe Parks & Graham,
1997, J. Virology 71(4): 3293–3298.
Adenovirus-Vektor-Genome, die kleiner als 27,7 kb sind, wurden befunden,
ineffizient verpackt zu werden und häufig eine Umlagerung zu erfahren.
Ein Adenovirus hat einen breiten Zelltropismus, einschließlich professioneller
antigen-präsentierender
Zellen wie Makrophagen und dendritischer Zellen, kann Zellen aus
den meisten tierischen Spezies infizieren (wenn schon nicht darin
replizieren) und kann in großen
Mengen in geeigneten humanen Zelllinien produziert werden, welche
zur Bereitstellung des E1-Genprodukts in trans konstruiert wurden.
-
In
einer Reihe von Experimenten, welche effektiv die vorliegende Erfindung
beispielhaft darstellen, jedoch in keiner Weise eine Beschränkung ihres Umfangs
nahe legen, wurden PER.C6TM-Zellen, die bei
33 und 37°C
gezüchtet
worden waren, mit einem Adenovirus-Vektor der ersten Generation,
welcher HIV-1-gag exprimierte, bei Temperaturen von 31, 33, 35,
37 und 39°C
für die
Virusproduktion infiziert. Die Wirkungen der Temperatur auf den
Metabolismus der infizierten Zellen und die Adenovirus-Produktion
wurden studiert. Es wurde beobachtet, dass das PER.C6TM-Zellwachstum
nach der Adenovirus-Infektion viel sensitiver für die Kulturtemperatur wurde (2A und 2B in
Beispiel 1). Selbst bei niedrigen Temperaturen wuchsen PER.C6-Zellen
immer noch gut, wenn auch bei einer geringeren Rate, und behielten
eine hohe Lebensfähigkeit
bei niedrigen Temperaturen. Als Folge der Virusinfektion und schnellen
Replikation bei hohen Temperaturen kam das Zellwachstum zum Stillstand
und die Zelllebensfähigkeit
nahm infolge der Virusinfektion und schnellen Replikation schnell
ab (3A und 3B in Beispiel
1). Die Temperatur beeinflusste auch die Replikationskinetik und
Produktivität
des Adenovirus. Die physiologische Temperatur von 37°C unterstützte die
schnellste Virusreplikation, unabhängig von der Zellwachstumstemperatur
vor der Infektion. Die maximale Viruskonzentration trat früher bei
höheren Temperaturen
auf. Bei Zellen, die vor der Infektion bei 37°C gezüchtet worden waren, trat die
höchste
intrazelluläre
Viruskonzentration bei 35°C
auf. Sie trat bei 37°C
mit Zellen auf, die vor der Infektion bei 33°C gezüchtet worden waren. Es wurde
gezeigt, dass Zellexpansionsgeschichte vor der Virusinfektion eine
kritische Rolle beim Metabolismus der infizierten Zellen und bei
der Virusproduktion spielt. Zellen, die vor der Infektion bei 33°C gezüchtet worden
waren, hatten eine signifikant höhere
(60% bis 200%) Virusproduktivität
bei allen Temperaturen nach der Infektion. Die Ergebnisse demonstrieren,
dass die Kulturtemperatur ein sehr kritischer Prozessparameter bei
der Adenovirus-Produktion ist. Die Temperaturverschiebungsverbesserung
wurde sowohl in kleinmaßstäblichen
Rollflaschen- als auch in 2-Liter-Rührtank- oder Gefäß-Bioreaktor-Studien
beispielhaft untersucht. Wie hier gezeigt, wiederum als Beispiel
und keineswegs als Beschränkung,
ist die Zellwachstumsrate bei einer Temperatur unter 35°C signifikant
reduziert, jedoch ist diese suboptimale Temperatur für das Zellwachstum
vor der Virusinfektion optimal für
eine nachfolgende Virusproduktion bei einer höheren Temperatur (d. h. einer
Temperaturverschiebung nach oben). Hier wird auch gezeigt, dass
eine bis zwei Passagen von Zellwachstum bei einer solchen suboptimalen
Temperatur für
die Adenovirus-Vektor-Produktion gut geeignet ist bzw. sind. Die
hier offenbarte Temperaturverschiebungsstrategie kann unschwer auf
jeden Produktionsmaßstab
angewandt werden, indem die Temperatur auf verschiedene Niveaus
während
des Verfahrens eingestellt wird. Bei einer großmaßstäblichen Produktion wird festgestellt,
dass die Zellwachstumstemperatur während der frühen Zellexpansion
vor dem Zellwachstum und der Virusinfektion in der großmaßstäblichen
Produktion auf die optimale physikalische Temperatur eingestellt
werden kann, um die schnellste Zellexpansion für die Verringerung der Ansatzzelldauer
zu erreichen. Jedoch haben die Erfinder gezeigt, dass bei einer
Verschiebung der Temperatur nach unten während einer Vorinfektionszellkultur
(z. B. 7 bis 16 Tage vor der geplanten Virusinfektion) die Temperatur
für das
Zellwachstum auf 31–35°C herunter
verschoben werden kann, bevorzugter von 31°C bis 34°C, wobei Unterbereiche von 31°C bis 33°C und/oder
33°C bis 35°C sehr nützlich bleiben,
in Abhängigkeit
von der jeweiligen Zellkulturbedingungen (dies könnte in dem Impfgefäß für das endgültige Produktionsgefäß und in
dem endgültigen
Produktionsgefäß geschehen). Unmittelbar
nach der Virusinfektion wird die Temperatur nach oben auf 35 bis
38°C, vorzugsweise
von 36°C
bis 38°C
und am meisten bevorzugt von 36°C bis
37°C, verschoben,
um eine optimale Virusproduktion zu erzielen, wie in den folgenden,
nicht beschränkenden
Beispielen beispielhaft dargestellt. Diese nicht-beschränkenden
Beispiele werden zur besseren Illustration der Erfindung gegeben.
-
BEISPIEL 1
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Ad5HIV-1-gag-Produktion in PER.CTM-Zellen
-
Materialien und Methoden:
-
Zelllinie
und Aufrechterhaltung – PER.C6
TM-Zellen (Fallaux et al., 1998, Human Gene Therapy
9: 1909–1917,
siehe auch
U.S. Patent Nr. 5,994,128 ),
eine humane embryonale Retinoblastenzelllinie, lizensiert von Crucell
(Leiden, Niederlande), wurden durch Transfektion humaner embryonaler Retinoblastenzellen
mit einem Adenovirus Typ 5-E1-Gen unter Verwendung eines Phosphoglyceratkinase-Promotors
erhalten. Die E1-Gen-Expression verleiht den Zellen Unsterblichkeit
und erlaubt eine Beibehaltung des E1(+)-Genotyps in Abwesenheit
eines selektiven Markers. Die Zellen wurden für die Suspensionskultur adaptiert
und routinemäßig in serumfreien
EX-Cell
TM525-Medium (JRH Biosciences, Lenexa
KS), ergänzt
mit 4 mM L-Glutamin (Mediatech Inc., Herndon VA), in Rollflaschen
bei 37°C
und unter 5% CO
2/95% Luft gehalten.
-
Wachstum
von Zellen bei verschiedenen Temperaturen – Zwei Rollflaschen von PER.C6TMZellen, bei 37°C gehalten, wurden vereinigt
und dazu verwendet, um zehn 850-cm2-Rollflaschen (Corning,
Cambridge, MA) mit 4 × 105 lebensfähigen
Zellen pro Milliliter und 200 ml Arbeitsvolumen pro Rollflasche
in serumfreien Ex-CellTM 525-Medium, ergänzt mit
4 mM L-Glutamin,
anzuimpfen. Die Flaschen wurden mit 5% CO2/95%
Luft begast und statistisch in fünf
Gruppen von jeweils zwei Flaschen aufgeteilt und drei Tage lang
mit einer Rotationsrate von 4 UpM bei Nominaltemperaturen von 31°C, 33°C, 35°C, 37°C und 39°C inkubiert.
Am Ende der dreitägigen
Inkubation wurden die beiden Rollflaschen von jeder Temperaturgruppe
vereinigt, um zwei neue Rollflaschen anzuimpfen und bei den jeweiligen
Temperaturen für
eine zweite dreitägige Passage
inkubiert. Die Zellen von den 33°C-
und 37°C-Gruppen
wurden ausgewählt
für eine
dritte Passage in fünf
Rollflaschen pro Gruppe für
2 Tage, gefolgt von Virusinfektion (siehe 1). Die
beiden Gruppen von 5 Rollflaschen, die von den Zellen erhalten wurden,
die vor der Infektion bei 37°C
und 33°C
gezüchtet
worden waren, wurden als Gruppe I bzw. II bezeichnet.
-
Virus-Saatstammlösung– Ein Adenovirustyp 5-Vektor
der ersten Generation (E1- und E3- deletiert), welcher das p55 gag-Transgen
aus HIV-1 exprimierte (siehe
WO
01/02607 ), wurde in PER.C6
TM-Zellen
amplifiziert.
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Virale
Infektion bei verschiedenen Temperaturen – Die 5 Rollflaschen von den
37°C- und 33°C-Gruppen
wurden am zweiten Tag nach dem Animpfen infiziert. Das verbrauchte
Medium wurde durch Zentrifugation entfernt, gefolgt von Resuspension
der Zellpellets in frischem EX-Cell 525TM-Medium,
ergänzt
mit 4 mM Glutamin. Eine festgelegte Menge der Virusstammlösung wurde
zur Infektion einer jeden Rollflasche zugegeben, was zu einer Infektionsmultiplizität (MOI)
von ~240 viralen Partikeln (VP) pro Zelle führte. Die 5 infizierten Flaschen
aus jeder Gruppe wurden dann bei Nominaltemperaturen von 31°C, 33°C, 35°C, 37°C und 39°C inkubiert.
Proben wurden aus jeder Rollflasche 2, 3 und 4 Tage nach der Virusinfektion
entnommen und zur Klärung zentrifugiert.
Aliquots des Überstands
wurden entfernt und bei –70°C für einen
Assay von extrazellulärem
Virus gelagert. Die Zellpellets wurden in frischem Medium resuspendiert,
um eine 10-fache Konzentration von der ursprünglichen Kultur zu ergeben,
gefolgt von dreimaligem Einfrieren und Auftauen. Die resultierenden
Lysate wurden dann durch Zentrifugation geklärt und vor dem Assay hinsichtlich
intrazellulärer
Viruskonzentrationen bei –70°C gelagert.
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Temperaturüberwachung
und Kontrolle – Eine
Kultivierung bei kontrollierter Temperatur fand in Inkubatoren mit
einem Wasser-Kühlmantel
statt (Forma Scientific, Marietta, OH) und in einem Warmraum von
37°C (Environmental
Specialities, Raleigh, NC). Neun Tage vor Beginn des Experiments
wurden die Inkubatoren und der Warmraum auf ihre Zieltemperatureinstellungen
eingestellt. Temperaturkartierungen der Inkubatoren und des Warmraums
wurden während
dieses Zeitraums durchgeführt,
um die Stabilität der
Temperaturkontrolle zu bestätigen.
Sechs Flaschenpositionen wurden auf der Rollapparatur in jedem der
Inkubatoren und dem Warmraum definiert. Temperatursonden wurden
durch Löcher
in den Rollflaschenverschlüssen
eingeführt,
wobei sich die Flaschen während
der Messung am Platz befanden und rotierten. Diese Messungen stellten
die Genauigkeit der Kulturtemperatur für die Studie sicher.
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Analytische
Methoden – Zellkonzentrationen wurden
mit einem Hämozytometer
gemessen und die Lebensfähigkeit
wurde mittels Trypanblau-Ausschluss ermittelt. Viruspartikel(VP)-Konzentrationen wurden
durch Anionenaustausch-HPLC (AEX-Assay) unter Verwendung einer Technik,
die von Shabram et al. (1997, Human Gene Therapy 8: 453–465) adaptiert
worden war, gemessen. Der Variationskoeffizient für den Anionenaustausch-HPLC-Assay
beträgt
typischerweise weniger als 10%. Ein quantitativer PCR-basierter
Potenzassay wurde angewandt, um die Virusinfektivität zu bestimmen.
Virusproben wurden zur Infektion von 293-Monoschichtkulturen in 96
Mulden verwendet. Die virale DNA wurde aus jeder Mulde 24 Stunden
nach der Infektion extrahiert und mit einem PCR-Verfahren quantitativ
bestimmt. Die virale Infektivität
wurde anhand einer Standard-Virusstammlösung, getitert mit dem traditionellen
TCID50-Assay, abgeschätzt.
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Berechnungsverfahren – Das Zeitintegral
der Konzentration lebensfähiger
Zellen wurde berechnet durch Multiplikation der mittleren Zellkonzentration mit
der Kulturzeit zwischen zwei Zeitpunkten. Die spezifische Virusproduktivität wurde
berechnet, indem die Viruskonzentration durch die Konzentration lebensfähiger Zellen
bei der Infektion geteilt wurde.
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Ergebnisse:
-
Wirkungen
der Temperatur auf die Virusproduktivität – Bei allen Rollflaschen wurden
am Tag 2, 3 und 4 nach der Virusinfektion Proben entnommen für Viruskonzentrationsmessungen.
In einem vorherigen Experiment wurde gezeigt, dass die Viruskonzentration
am Tag 1 nach der Infektion unterhalb der Nachweisgrenze des REX-Assays
liegt, und somit wurde keine Probe am Tag 1 nach der Infektion entnommen, um
eine Verringerung des Kulturvolumens von den Rollflaschen zu vermeiden.
Die Proben wurden grob 10-fach konzentriert durch Herunterzentrifugieren der
Zellen und Resuspendieren der infizierten Zellpellets in einem kleineren
Volumen an Kulturmedium. Viruspartikelkonzentrationen in den Zellpellets
wurden durch einen HPLC-Assay nach einem dreimaligen Gefrier/Auftau-Prozess
für die
Virusfreisetzung gemessen. Die Viruspartikelkonzentrationen in den Zellpellets
wurden auf eine Basis pro Zelle normalisiert wie in 4 gezeigt
(4A – Gruppe
I; 4B – Gruppe
II). In der Gruppe I trat die höchste Viruskonzentration
in den Zellpellets bei 37°C
am zweiten Tag nach der Infektion auf, was nahe legt, dass die Virusreplikationsrate
bei dieser Temperatur am höchsten
war. Eine Abweichung zu jeder Seite dieser optimalen Temperatur
resultiert in einer langsameren Virusreplikation. Jedoch schien
die intrazelluläre
Viruskonzentration, die von den Zellpellets gemessen wurde, einen
früheren
Gipfel bei höheren Temperaturen
zu haben. Am Tag 3 nach der Infektion nahm die Viruskonzentration
in den Zellpellets sowohl bei 37°C
als auch bei 39°C
ab. Die verringerte Konzentration war mutmaßlich ein Ergebnis der Freisetzung
intrazellulärer
Virionen in das Kulturmedium, da die Zelllebensfähigkeit schnell abnahm und
Zelllyse auftrat. Obwohl sich das Virus bei 35°C etwas langsamer replizierte,
fuhr die Viruskonzentration fort, am Tag 3 nach der Infektion anzusteigen,
wobei die Gipfelkonzentration, die bei 37°C 1 Tag früher erreicht wurde, übertroffen
wurde. Die höchste
intrazelluläre
Viruskonzentration am Tag 4 wurde weiter auf 33°C herunter verschoben. Bei 31°C war die
intrazelluläre
Viruskonzentration nur ein Bruchteil derjenigen bei höheren Temperaturen,
obwohl sie fortfuhr, am Tag 4 anzusteigen. Es war jedoch aufgrund
der schlechten Replikationskinetik unwahrscheinlich, dass sie ein
signifikant höheres
Niveau erreichte.
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In
der Gruppe II trat die maximale intrazelluläre Viruskonzentration bei 37°C am Tag
2, bei 35°C am
Tag 3 und bei 33°C
am Tag 4 auf, was exakt das Gleiche ist wie bei der Gruppe I. Die
intrazelluläre Gipfelkonzentration
trat am Tag 2 bei 37°C
bis 39°C auf,
am Tag 3 bei 33°C
bis 35°C
und am Tag 4 bei 31°C,
welches ebenfalls das Gleiche wie bei Gruppe 1 ist. Es gibt jedoch
größere Unterschiede
zwischen den beiden Gruppen. Zunächst
trat die höchste
intrazelluläre
Viruskonzentration bei 37°C
am Tag 2 in der Gruppe II auf, gegenüber 35°C am Tag 3 in der Gruppe I.
Zweitens war die Virusproduktivität in der Gruppe II bei allen
Temperaturen signifikant höher.
Ein direkter Parallelvergleich ist in 6C gezeigt,
wobei die Virustiterverhältnisse
von Gruppe II zu Gruppe I am selben Tag für alle fünf verschiedenen Temperaturen
graphisch dargestellt sind. Am Tag 2 nach der Infektion waren die
Virustiter in der Gruppe II 60 bis 200% höher als in der Gruppe I. Die
Unterschiede waren bei hohen Temperaturen signifikant größer. Die
Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden am Tag 3 und 4 geringer,
blieben jedoch signifikant.
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Die
Viruskonzentrationen in den Überständen befanden
sich gewöhnlich
unterhalb der Nachweisgrenze des HPLC-Assays. Deshalb wurde ein sensitiverer
Infektivitätsassay
eingesetzt, um dieses Virus zu messen. Proben von Überstand
und Zellpellet wurden parallel im selben Assay gemessen, um die
relative Verteilung intrazellulärer
und extrazellulärer
Viren abzuschätzen.
Wie erwartet, wurde eine signifikante Menge an Virus in das Kulturmedium
freigesetzt, insbesondere in dem späten Stadium der Virusreplikation,
wo die Zelllebensfähigkeit
signfikant reduziert war. Diese Daten bestätigten die Annahme, dass die
Reduktion in der Viruskonzentration, die in den Zellpellets gemessen
wurde, primär
auf die Virusfreisetzung in das Kulturmedium zurückzuführen war. Obwohl die obige
Erörterung
der Virusproduktion lediglich auf Messungen in Zellpellets basierte, wurde
dasselbe allgemeine Bild erhalten, wenn die Prozentsätze an Virus
in den Überständen berücksichtigt
wurden.
-
Die
Wirkungen der Kulturtemperatur auf die Adenovirus-Infektion von
PER.C6TM-Zellen wurden gründlich untersucht.
Es wurden erhebliche Unterschiede im Wachstum infizierter Zellen
und in der Virusproduktion beobachtet. Zellen, die mit derselben MOI
infiziert, jedoch bei verschiedener Temperatur nach der Infektion
inkubiert worden waren, ergaben ein unterschiedliches Wachstumsverhalten.
Bei hohen Temperaturen (35°C–39°C) resultierte
die Adenovirus-Infektion im vollständigen Stillstand des Zellwachstums,
jedoch wurde ein signifikantes Zellwachstum nach der Infektion bei
niedrigeren Temperaturen (31°C–33°C) beobachtet
(2A für
Gruppe I und 2B für Gruppe II). Die Zelllebensfähigkeit nach
der Infektion zeigte auch eine starke Abhängigkeit von der Kulturtemperatur
(3A für
Gruppe I und 3B für Gruppe II). Sie nahm schnell
im Verlauf der Virusreplikation bei höheren Temperaturen ab, blieb
jedoch bei relativ hohen Niveaus bei niedrigeren Temperaturen. Die
für die
Infektion verwendete MOI sollte hoch genug für eine synchronisierte Infektion
sein. Der begrenzte zytopatische Effekt bei niedrigeren Temperaturen
zeigt ein langsame und beeinträchtigte
Virusreplikation an, welches im Einklang steht mit den niedrigen
Viruskonzentrationen, die über
4 Tage nach der Infektion gemessen wurden.
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Die
Temperatur beeinflusste auch die Adenovirus-Replikationsrate dramatisch.
Das Virus wurde befunden, sich bei hohen Temperaturen schneller zu
replizieren, wobei die optimale Temperatur bei 37°C lag. Als
Folge erreichte die Viruskonzentration in Zellpellets bei 37–39°C den Gipfel
früher
als bei 31°C–35°C. Jedoch
fiel die optimale Kinetiktemperatur nicht mit der maximalen Virusproduktivität überein.
Zellen, die vor der Infektion bei 37°C gezüchtet worden waren, ergaben
die höchste
Viruskonzentration bei 35°C,
während
Zellen, die bei 33°C
vor der Infektion gezüchtet
worden waren, die höchste
bei 37°C
ergaben.
-
Es
wurde eine starke Korrelation zwischen der Virusfreisetzung in das
Kulturmedium und der Zelllebensfähigkeit
beobachtet. Diese Korrelation liefert eine einfache und schnelle
Abschätzung
des Virusprozentsatzes im Medium, welche zur Entwicklung von Erntestrategien
eingesetzt werden könnte, insbesondere
in Fällen,
in denen nur intrazelluläres Virus
geerntet werden kann. Die Zellwachstumsgeschichte wurde befunden,
einen signifikanten Einfluss auf Zellwachstum, Metabolismus und
Virusproduktivität
zu haben. Darüber
hinaus gab es signifikante Unterschiede bei der Replikationskinetik
und Produktivität
von Adenovirus. Zellen, die vor der Infektion bei 33°C gezüchtet worden
waren, hatten 60% bis 200% höhere
Produktivitäten
bei allen Temperaturen.
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BEISPIEL 2
-
Wirkung der Passagezeit bei suboptimaler
Temperatur auf die Virusproduktion
-
Materialien
und Verfahren sind im Wesentlichen wie im Beispiel 1 beschrieben.
In Kürze, 5 fasst
den Versuchsaufbau zusammen. Zwei Bioreaktoren wurden mit PER.C6®-Zellen
in serumfreiem 293 SFM II-Medium (Invitrogen, Grand Island, NY),
ergänzt
mit 6 mM L-Glutamin (Biowhittaker Inc., Walkersville, MD), bei 33,0°C und 36,5°C inokuliert.
Die Zellen wurden bis ~2,5 × 106 Zellen/ml gezüchtet und in neue Bioreaktoren
bei der geeigneten Temperatur verdünnt. Das Temperaturkontrollschema
für jeden Reaktor
ist in 5 dargestellt, wobei 33,0°C-„Temperaturverschiebungen" im Bereich von 2
Passagen bis 4 Stunden verwendet wurden. Die Zellen wurden mit einem
replikationsdefekten Adenovirus, codierend für ein HIV-1-gag-Transgen, unter
Einsatz einer Infektionsmultiplizität von 70 viralen Partikeln
pro lebensfähige
Zelle infiziert. Die Temperatur aller Reaktoren wurde unmittelbar
nach der Infektion auf 36,5°C
verändert.
Die virale Konzentration 48 Stunden nach der Infektion (hpi; „hours
post infection") von Überstand
und Triton-X100-lysierten Gesamtbouillon-Proben (TL), enthaltend
sowohl intrazelluläres
als auch extrazelluläres
Virus, wurde täglich
anhand eines HPLC-Assays bestimmt. Die Virusmasse wurde dann geerntet
durch Zugabe eines Zelllysepuffers, um das verbleibende intrazelluläre Virus
in den Überstand
freizusetzen, oder durch Freisetzung von intrazellulärem Virus
unter Einsatz mechanischer Scherkräfte. Die resultierende Gesamtbouillon-Virusmasse
wurde dann weiter gereinigt durch mehrere Schritte zur Entfernung
von Zelltrümmern,
Wirtszellproteinen und -DNA, verpackten Virusproteinen und -DNA
und anderen Verunreinigungen. Dieses Beispiel bestätigt die
im Beispiel 1 präsentierten
Ergebnisse, nämlich
dass Studien in in sowohl Rollflaschen als auch 2-Liter-Bioreaktoren
anzeigen, dass die Kontrolle der Temperatur bei 33,0°C während des Zellwachstums
(für zwei
Passagen) und bei 37,0°C während der
Infektion die Virusproduktion erhöhte. Das Zellwachstum bei 33,0°C ist niedriger
(Verdoppelungszeit ~50 Stunden) als bei 36,5°C (Verdoppelungszeit ~30 Stunden).
Dies führt
zu einer Zunahme der Gesamtansatzzeit von ~12 Tagen in Bioreaktoren auf
~17 Tage, welches die zeitspezifische Virusproduktion einer Anlage
verringert. Es wird dem geschulten Fachmann obliegen, das jeweilige
System so zu optimieren, dass eine optimale Virusproduktion von einer „suboptimalen" Temperaturpassage
generiert wird, während
die in vorherigen Experimenten beobachte erhöhte Virusproduktion beibehalten
wird.
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6 zeigt
eine Virusproduktion unter verschiedenen Temperaturkontrollschemata,
nämlich unterschiedliche
Zeitspannen bei einer suboptimalen Temperatur vor der Virusaussaat
und Erhöhung
der Kulturtemperatur zurück
zu einem physiologischen Optimum. Diese Daten zeigen, dass eine
Temperaturverschiebung von einigen wenigen Stunden keine optimale
Erhöhung
der Virusproduktivität
ergibt. Die Länge
des „suboptimalen
Zellwachstums" bei
einer verringerten Temperatur kann zur Minimierung der Länge des
Produktionsprozesses weiter optimiert werden. Die Daten stehen im
Einklang mit den Ergebnissen, die in Rollflaschen erhalten wurden,
wie im Beispiel 1 beschrieben. Eine 2- bis 3-fache Erhöhung der
Virusproduktivität
wird mit der Temperaturverschiebungsstrategie für suboptimale Inkubationszeiten
im Bereich von 7 bis 16 Tagen im Vergleich zur Kontrolle bei 36,5°C erhalten.
Es wird erkannt werden, dass diese Daten Besonderheiten des speziellen
Experiments reflektieren können,
und dass ein geschulter Fachmann Kulturbedingungen neben der Temperatur
optimieren könnte,
um die für
optimales Viruswachstum erforderliche suboptimale Inkubationszeit
von dem hier gezeigten Bereich zu verkürzen, und zur Einstellung der
Zeit für
die Temperaturverschiebung nach oben relativ zur Virusinfektionszeit.
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Die
vorliegende Erfindung soll durch die hier beschriebenen speziellen
Ausführungsformen
nicht im Umfang beschränkt
werden. In der Tat werden für Fachleute
auf dem Gebiet verschiedene Modifikationen der Erfindung neben den
hier beschriebenen anhand der vorstehenden Beschreibung ersichtlich sein.
Solche Modifikationen sollen vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfasst
sein.
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Verschiedene
Veröffentlichungen
sind hierin zitiert, die hier durch die Bezugnahme in ihrer Gesamtheit
eingeschlossen sind.