JP4413012B2 - ウイルスの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、耐熱性ウイルスの産生の実質的な増加をもたらす、細胞培養温度変化法に基づく、耐熱性ウイルスの産生を最大にするための方法に関する。本明細書に開示されている細胞培養/ウイルス製造方法における温度の操作は、(1)ウイルス感染前の或る時間にわたり、宿主細胞の培養を亜最適温度に変化させ、または(2)それぞれの亜最適温度で宿主細胞培養を接種し増殖させ、ついでそれぞれの宿主細胞へのウイルス感染の時点またはその付近で、より最適な増殖温度に戻すという温度変化法に基づいている。そのような温度変化法の応用は、確立された宿主細胞/ウイルス製造方法における他の培養および/または培地条件を更に操作しなくても、それぞれの宿主細胞/ウイルス製造方法における回収可能ウイルスを実質的に増加させるための単純であるが有効な方法を与える。
本発明は、培養条件下で比較的耐熱性であるウイルス、典型的には任意の無包膜ウイルス、例えばアデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルスおよび/またはピコルナウイルスの産生を最大にするための方法に関する。一般に認められている実施は、培養内の細胞増殖を、典型的には37℃の生理的温度で行い、細胞増殖と同じ温度またはより低い温度に低下させてウイルス増殖を行う、というものである。生理的温度での培養は、最適な細胞増殖を可能にするが、生産性および安定性の改善のためには、多数のウイルスの産生のための最適温度を、通常、より低くするということが、そのような製造方法の基礎となっている。本発明は、耐熱性ウイルスの産生の実質的な増加をもたらす細胞培養/ウイルス産生温度範囲を用いる、直感に反するアプローチに基づくものである。より詳しくは、本発明は、ウイルス感染前の或る時間にわたり、宿主細胞の培養を、亜最適培養温度に変化させ、または凍結保存細胞からの1以上の細胞増殖継代を含む細胞増殖過程の全体にわたり、亜最適レベルで細胞を増殖させ、ついでウイルス産生のための、より最適な温度に戻すという細胞培養/ウイルス産生温度変化法に関する。HIV gagトランスジーン(Ad5gag)をコードする組換えアデノウイルス血清型5の製造が本明細書に例示されている。ウイルス感染前の或る時間にわたり、宿主細胞増殖のための温度を亜最適レベルに低下させると、組換えAd5gagの産生における2〜3倍の増加が生じることが本明細書に示されている。ウイルス感染後には、該温度を最適レベルに再び上昇させる。
材料および方法:
細胞系および維持
ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを使用してヒト胎児網膜芽細胞をアデノウイルス5型E1遺伝子でトランスフェクトすることにより、Crucell(Leiden,The Netherlands)から実施許諾されたヒト胎児網膜芽細胞系であるPER.C6(商標)細胞(Fallauxら,1998,Human Gene Therapy 9:1909−1917;米国特許第5,994,128号も参照されたい)を誘導した。E1遺伝子発現は該細胞に不死化をもたらし、選択マーカーの非存在下でE1(+)遺伝子型の維持を可能にする。該細胞を懸濁培養に適合化させ、ローラーボトル中、4mM L−グルタミン(Mediatech Inc.,Herndon VA)で補足されたEX−Cell(商標)525無血清培地(JRH Biosciences,Lenexa KS)内で、37℃、5% CO2/95% 空気重層において通常に維持した。
37℃で維持されたPER.C6(商標)細胞の2本のローラーボトルをプールし、それを使用して、10本の850cm2 ローラーボトル(Corning,Cambridge,MA)中の、4mM L−グルタミンで補足されたEX−Cell(商標)525無血清培地に、4×105 生細胞/mlおよびローラーボトル当たり200mlの実効容積で播いた。該ボトルを5% CO2/95% 空気で満たし、それぞれ2本のボトルの5群にランダムに分け、4RPMの回転速度、31、33、35、37および39℃の名目温度で3日間インキュベートした。その3日のインキュベーションの終了時に、各温度群からの2本のローラーボトルをプールして、2本の新たなローラーボトルに播き、3日間の第2継代にわたりそれぞれの温度でインキュベートした。33℃の群および37℃の群からの細胞を選択して、1群当たり5本のローラーボトル内で3回目の継代を2日間行い、ついでウイルス感染を行った(図1を参照されたい)。該感染の前に37℃および33℃で増殖させた細胞から導かれた5本のローラーボトルの2群をそれぞれI群およびII群と命名する。
HIV−1由来のp55 gagトランスジーンを発現する第1世代アデノウイルス5型ベクター(E1およびE3欠失体)(WO 01/02607を参照されたい)をPER.C6(商標)細胞内で増幅した。
細胞播種の2日後に、37℃および33℃の群の5本のローラーボトルに感染させた。古くなった培地を遠心分離により除去し、ついで細胞ペレットを、4mM グルタミンで補足された新鮮なEX−Cell 525(商標)培地に再懸濁させた。一定量の該ウイルスストックを加えて各ローラーボトルに感染させて、〜240ウイルス粒子(VP)/細胞の感染多重度(MOI)を得た。ついで各群の5本の感染ボトルを31、33、35、37および39℃の名目温度でインキュベートした。ウイルス感染の2、3および4日後、サンプルを各ローラーボトルから採取し、遠心分離して清澄化した。上清のアリコートを取り出し、細胞外ウイルスのアッセイのために−70℃で保存した。該細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁させて元の培養の10倍の濃度を得、ついで凍結および解凍を3回行った。ついで、得られたライセートを遠心分離により清澄化し、細胞内ウイルス濃度に関するアッセイまで−70℃で保存した。
いくつかの水ジャケット付きインキュベーター(Scientific,Marietta OH)および1つの37℃の温室(Environmental Specialties,Raleigh NC)内で、制御された温度での培養を行った。該実験の開始の9日前に、該インキュベーターおよび温室をそれらの目的温度設定点に調節した。この期間に、温度制御の安定性を確認するために、該インキュベーターおよび温室の温度の精密測定(mapping)を行った。6本のボトルの位置をそれらの各インキュベーターおよび該温室内の回転(ローラー)装置上に定めた。温度測定子を該ローラーボトルの蓋の孔に挿入し、該ボトルを適所に配置し、測定中には回転させた。これらの測定は該研究の培養温度の正確さを保証するものであった。
血球計算盤で細胞濃度を測定し、トリパンブルー排除により生存度を評価した。Shabramら(1997,Human Gene Therapy 8:453−465)から改変した技術を用いて、陰イオン交換HPLC(AEXアッセイ)によりウイルス粒子(VP)濃度を測定した。該陰イオン交換HPLCアッセイの変動係数は典型的には10%未満である。定量的PCRに基づく効力アッセイを用いてウイルスの感染力を推定した。ウイルスサンプルを使用して96ウェル中の293単層培養に感染させた。感染の24時間後、該ウイルスDNAを各ウェルから抽出し、PCR法により定量した。通常のTCID50アッセイにより滴定された標準ウイルスストックから、ウイルスの感染力を推定した。
生細胞濃度の時間積分は、平均細胞濃度に2つの時点間の培養時間を掛け算することにより計算した。比ウイルス生産性は、ウイルス濃度を感染時の生細胞濃度で割り算することにより計算した。
結果:
ウイルス生産性に対する温度の影響
ウイルス感染の2、3および4日後、ウイルス濃度の測定のために全てのローラーボトルをサンプリングした。前実験において、感染の1日後のウイルス濃度はAEXアッセイの検出限界未満であることが示されたため、該ローラーボトルからの培養体積の減少を避けるために、感染の1日後にはサンプルを採取しなかった。該細胞を遠心沈降させ、該感染細胞ペレットを、より小さな体積の培地に再懸濁させることにより、該サンプルを約10倍濃縮した。ウイルスの放出のための3回の凍結/解凍過程の後、該細胞ペレット中のウイルス粒子濃度をHPLCアッセイにより測定した。図4(図4A―I群、図4B−II群)に示すとおり、該細胞ペレット中のウイルス粒子濃度を細胞ごとに正規化した。I群においては、37℃で、感染の2日後に該細胞ペレット中の最高ウイルス濃度が見出されたが、このことは、ウイルス複製速度がこの温度で最高であったことを示唆している。この最適温度の両側にそれると、より遅いウイルス複製が生じた。しかし、該細胞ペレットから測定された細胞内ウイルス濃度は、より高い温度ではより早期にピークに達したようであった。37℃および39℃の両方においては、感染の3日後に該細胞ペレット中のウイルス濃度が減少した。細胞生存度が急速に減少し細胞溶解が生じたことから、この濃度減少は、おそらく、培地内への細胞内ビリオンの放出の結果によるものであった。該ウイルスは35℃ではそれより若干遅く複製されたが、感染の3日後にウイルス濃度は上昇し続け、前日に37℃で到達したピーク濃度を上回った。第4日の最高細胞内ウイルス濃度は、更に下降変化を伴って33℃で認められた。31℃では、細胞内ウイルス濃度は、より高い温度での細胞内ウイルス濃度と比べて微々たるものであったが、それは第4日に上昇し続けた。しかし、複製速度論が好ましくないため、それが有意に高いレベルに達するとは考えにくかった。
材料および方法は、実施例1に記載されているものと実質的に同じである。簡潔に説明すると、図5は該実験計画の概要を示す。6mM L−グルタミン(Biowhittaker Inc.,Walkersville,MD)で補足された293 SFM II(Invitrogen,Grand Island,NY)無血清培地内のPER.C6(登録商標)細胞を2つのバイオリアクターに33.0℃および36.5℃で播いた。細胞を〜2.5×106 細胞/mlまで増殖させ、新たなバイオリアクター内で適当な温度で希釈した。2継代から4時間までの範囲の33.0℃の「温度変化」を用いる各容器の温度制御法を図5に示す。70ウイルス粒子/生細胞の感染多重度を用いて、HIV−1 gagトランスジーンをコードする複製欠損型アデノウイルスを該細胞に感染させた。感染直後に、すべてのリアクターの温度を36.5℃に変化させた。細胞内ウイルスおよび細胞外ウイルスの両方を含有するTriton−X100細胞溶解全ブロスサンプル(TL)ならびに上清からの、感染後時間(hpi)が48時間のウイルス濃度を、HPLCアッセイにより毎日測定した。ついで、残存細胞内ウイルスを上清内に放出させるための細胞溶解バッファーの添加により、または機械的せん断を用いて細胞内ウイルスを放出させることにより、ウイルスバルク(bulk)を回収した。ついで、細胞残渣、宿主細胞タンパク質およびDNA、未詰込みウイルスタンパク質およびDNAならびに他の不純物を除去するために、得られた全ブロスウイルスバルクを多工程で更に精製した。本実施例は実施例1に記載の結果を反復するものであった。すなわち、ローラーボトルおよび2L バイオリアクターの両方におけるその研究は、細胞増殖(2継代)中は33.0℃に、そして感染中は37.0℃に温度を制御することにより、ウイルス産生が向上したことを示している。33.0℃(培加時間は〜50時間)での細胞増殖は36.5℃の場合(倍加時間は〜30時間)より遅い。これは、バイオリアクターにおいては〜12日から〜17日へと全バッチ時間の延長を招き、これは、工場における単位時間当たりのウイルス産生を低下させる。前記実験で見られたウイルス産生の増強を維持しながら、「亜最適」温度継代から最適なウイルス産生が得られるように、それぞれの系を最適化することが当業者に課されるであろう。
Claims (8)
- a)31℃〜34℃の温度で、宿主細胞を培養し、
b)該宿主細胞にアデノウイルスを感染させて、アデノウイルス感染宿主細胞を得、
c)35℃〜38℃の温度で、該アデノウイルス感染宿主細胞を培養し、
d)アデノウイルスおよび/またはアデノウイルス含有細胞を該培養から回収し、
e)宿主細胞および培養混入物からアデノウイルスを精製して、精製アデノウイルス産物を得ることを含んでなる、アデノウイルスの製造方法。 - a)35℃〜38℃の温度で、適当な培地において宿主細胞を接種及び培養し、
b)工程a)の宿主細胞培養の温度を、31℃〜34℃の温度まで変化させ、
c)工程b)の宿主細胞にアデノウイルスを感染させて、アデノウイルス感染宿主細胞を得、
d)35℃〜38℃の温度で、該アデノウイルス感染宿主細胞を培養し、
e)アデノウイルスおよび/またはアデノウイルス含有細胞を該培養から回収し、
f)宿主細胞および培養混入物からアデノウイルスを精製して、精製アデノウイルス産物を得ることを含んでなる、アデノウイルスの製造方法。 - 該宿主細胞に該アデノウイルスを感染させる前の全細胞継代までにわたり、工程b)の培養温度を31℃〜34℃の温度に低下させる、請求項2記載の製造方法。
- 該宿主細胞に該アデノウイルスを感染させる前の少なくとも24時間、工程b)の培養温度を31℃〜34℃の温度に低下させる、請求項2記載の製造方法。
- 工程a)における細胞増殖のための温度が36℃〜38℃である、請求項3記載の製造方法。
- 工程a)における細胞増殖のための温度が36℃〜38℃である、請求項4記載の製造方法。
- 工程a)における細胞増殖のための温度が36℃〜38℃であり、工程d)における感染宿主細胞の増殖のための温度が36℃〜38℃である、請求項3記載の製造方法。
- 工程a)における細胞増殖のための温度が36℃〜38℃であり、工程d)における感染宿主細胞の増殖のための温度が36℃〜38℃である、請求項4記載の製造方法。
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