TW202237831A - 生產腺病毒之方法 - Google Patents

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Abstract

用於生產適合在疫苗中使用的腺病毒之方法、和用於在生產期間提高腺病毒的產量之方法。該等方法包括向培養的細胞群中添加腺病毒；在允許該細胞群被腺病毒感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群；在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和從培養物中收穫腺病毒。

Description

生產腺病毒之方法
本發明關於用於生產腺病毒之方法。更特別地，本發明關於用於生產適合在疫苗中使用的腺病毒之方法，並且關於用於在生產期間提高腺病毒的產量之方法。
腺病毒係雙股DNA病毒，其具有大約為26-46 kb的基因組。腺病毒具有物種特異性並且已從多種哺乳動物物種中分離出不同的血清型。人腺病毒無處不在，大多數人都已感染了一或多種血清型，導致終身免疫。
修飾的腺病毒可用作載體來遞送編碼外源抗原的DNA。此類腺病毒載體通常是複製缺乏型腺病毒載體，其必需的E1A和E1B基因被缺失並被具有高活性啟動子（例如驅動異源基因表現的巨細胞病毒立即早期啟動子）的表現盒替換。
複製缺乏型腺病毒載體已廣泛用於疫苗，因為它們會誘導對由載體編碼的異源基因之強烈的體液和T細胞反應。一項研究基於複製缺乏型Ad5的疫苗用於在治療結核病中使用的臨床試驗之結果似乎有非常好的前景（Smail等人 2013; Sci. Transl. Med. [科學·轉化醫學] 10月2日;5(205):205ra134）。儘管如此，目前生產此類腺病毒之方法效率低且缺乏可擴大性（scalability）。
因此，需要生產腺病毒之改進的方法。
本發明至少部分關於開發改進的腺病毒生產方法，與替代的生產方法相比，該等方法係高度可擴大的並且提供了提高的腺病毒載體滴度。因此，本發明之方法非常有利，特別是在需要大量腺病毒載體的情況（例如用於為流行病和大流行病提供基於腺病毒的疫苗）下。
因此，在一方面，提供了一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被腺病毒感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 從培養物中收穫腺病毒。
在另一方面，提供了一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括在允許第二部分的細胞群被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞群被由該第一部分的腺病毒感染的細胞釋放的腺病毒感染。
在又另一個方面，提供了一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒。
在另一方面，提供了一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 在細胞培養容器中以至少0.5x10 6個細胞/mL的初始細胞密度接種細胞，以提供培養的細胞群； (b) 向該培養的細胞群中添加腺病毒； (c) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (e) 從培養物中收穫腺病毒。
在另一方面，提供了一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被腺病毒感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 從培養物中收穫腺病毒。
在另一方面，提供了一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI，向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒， 其中該方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
在另一方面，提供了一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI，向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群； (c) 在允許該細胞群中之第二部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞被由該第一部分的腺病毒感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (e) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒， 其中該方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
在另一方面，提供了一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 從培養物中收穫腺病毒； (e) 純化該腺病毒；和 (f) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
在另一方面，提供了一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 在允許第二部分的細胞群被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞群被由該第一部分的腺病毒感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染； (b) 從培養物中收穫腺病毒； (c) 純化該腺病毒；和 (d) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
在另一方面，提供了一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒； (e) 純化該腺病毒；和 (f) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
在另一方面，提供了一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 在細胞培養容器中以至少0.5x10 6個細胞/mL的初始細胞密度接種細胞，以提供培養的細胞群； (b) 向該培養的細胞群中添加腺病毒； (c) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (e) 從培養物中收穫腺病毒； (f) 純化該腺病毒；和 (g) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
在另一方面，提供了一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被腺病毒感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 從培養物中收穫腺病毒； (e) 純化該腺病毒；和 (f) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
在另一方面，提供了一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI，向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒； (e) 純化該腺病毒；和 (f) 製備包含純化的腺病毒之疫苗， 其中該方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
在另一方面，提供了一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI，向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群； (c) 在允許該細胞群中之第二部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞被由該第一部分的腺病毒感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (e) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒， (f) 純化該腺病毒；和 (g) 製備包含純化的腺病毒之疫苗， 其中該方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
在另一方面，提供了一種用於在生產腺病毒期間提高腺病毒的產量之方法，該方法包括在腺病毒的存在下在第一溫度下對培養的細胞群進行培養和將該細胞群所暴露的溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
在另一方面，提供了一種用於生產如圖2所示的腺病毒之方法。
在另一方面，提供了一種用於在疫苗中使用的腺病毒，其係藉由本發明之方法可獲得的或藉由本發明之方法獲得的。
在另一方面，提供了一種包含腺病毒的疫苗，其係藉由本發明之方法可獲得的或藉由本發明之方法獲得的。
在本文所描述的任何方面，該方法可以包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
在所附請求項中陳述了本發明之多個方面和實施方式。本文還描述了本發明之該等和其他的方面和實施方式。
腺病毒生產
腺病毒係無包膜病毒，其具有長度在26-46 kb之間的線性雙股DNA（dsDNA）基因組。在多個臨床試驗中，無複製能力的腺病毒載體已被用作疫苗載體以遞送感染性致病抗原。然而，目前用於生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法缺乏可擴大性並且受到其最終腺病毒滴度的限制。本發明之諸位發明人已經令人驚訝地發現了新的腺病毒生產方法，與替代的方法相比，該等新的方法係高度可擴大的並提供了提高的腺病毒載體滴度，使它們成為生產腺病毒載體（以包含在針對流行病和大流行病的基於腺病毒的疫苗中）之適宜選擇。
應當理解，本發明之方法可以用於生產用於在疫苗中使用（例如用於在COVID-19疫苗中使用）的腺病毒。
令人驚訝地，本發明之諸位發明人已示出，以低感染複數（MOI）向細胞群中添加的腺病毒可提供高病毒滴度（參見實例1-2）。此外，源自低MOI製程的產物具有與源自示例性高MOI製程的產物相當的品質（參見實例1）。如將容易理解的，與高MOI製程相比，使用低MOI製程顯著地降低了病毒種子的需求。如本文所用，「MOI」係指細胞群中感染性病毒顆粒的數量與靶細胞數量之比率。
因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括向培養的細胞群中添加腺病毒。在較佳的實施方式中，本發明之方法包括以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI向培養的細胞群中添加腺病毒。在一些實施方式中，該MOI係從約0.003至約1，較佳的是從約0.03至約0.3，最較佳的是約0.1。例如，在一些實施方式中，該MOI係0.025、0.030、0.052、0.075、0.090、0.100、0.120、0.180或0.270。
在一些實施方式中，在向培養的細胞群中添加腺病毒之前，本發明之方法包括將細胞接種在細胞培養容器中以提供培養的細胞群。如本文所用，「細胞培養容器」係指適合用於培養細胞的容器。在一些實施方式中，細胞培養基用於細胞接種。如本文所用，「細胞培養基」意指含有用於初始細胞接種步驟的細胞培養營養物和鹽之液體溶液，該液體溶液設計用於支持培養的細胞之生長和活力。在一些實施方式中，用於細胞接種的細胞培養基係BalanCD ®HEK培養基。在一些實施方式中，用於細胞接種的細胞培養基不是293 SFM II。
在細胞培養容器中接種細胞後，可以在不同的時間點向細胞中添加腺病毒。因此，在一些實施方式中，該方法包括在細胞培養容器中接種細胞後約0-48小時，較佳的是在細胞培養容器中接種細胞後約24小時，向培養的細胞群中添加腺病毒。例如，在細胞培養容器中接種細胞後6小時內、12小時內、18小時內、24小時內、32小時內、或48小時內，可以向培養的細胞群中添加腺病毒。
腺病毒生產的先前技術方法依賴於在感染時使用5x10 5個細胞/mL範圍的細胞密度，因為使用高於此的細胞密度會使感染性顆粒不再產生（於Kamen & Henry 2004 J. Gene Med. [基因醫學雜誌] 2004年2月; 6增刊1:S184-92中綜述）。在此，本發明之諸位發明人已示出，提高接種細胞密度令人驚訝地提高了病毒滴度（參見實例3）。在較佳的實施方式中，該方法包括以至少約0.5x10 6個細胞/mL、較佳的是至少約0.8x10 6個細胞/mL、最較佳的是至少約1.2x10 6個細胞/mL的初始細胞密度，將細胞接種於細胞培養容器中。增加初始細胞接種密度可以在感染時提供細胞群之提高的活細胞密度。在一些實施方式中，該方法包括向具有至少約0.5x10 6個細胞/mL、較佳的是至少約0.75x10 6個細胞/mL、至少約1x10 6個細胞/mL、至少約1.5x10 6個細胞/mL、至少約2x10 6個細胞/mL、或至少2.5x10 6個細胞/mL、最較佳的是至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之培養的細胞群中添加腺病毒。在一些實施方式中，該方法包括向具有從約0.5x10 6個細胞/mL至約1x10 7個細胞/mL、較佳的是從約0.5x10 6個細胞/mL至約5x10 6個細胞/mL、最較佳的是從約0.5x10 6個細胞/mL至約2.5x10 6個細胞/mL的活細胞密度之培養的細胞群中添加腺病毒。
向細胞群中添加腺病毒後，腺病毒顆粒會附著在靶細胞上，然後被內吞，從而感染靶細胞。因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括在允許細胞群被腺病毒感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群。如本文所用，「允許感染的條件」意指允許腺病毒DNA進入細胞之任何合適的細胞培養方式。此類條件將取決於培養的細胞群和用於感染細胞的腺病毒。確定腺病毒DNA進入細胞的技術係本領域所熟知的並且包括qPCR。
當使用低MOI感染細胞群時，可能沒有足夠的病毒顆粒來感染細胞群中的所有細胞。因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群。在一些實施方式中，該方法進一步包括在允許該細胞群中之第二部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞被由該第一部分的感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染。因此，在較佳的實施方式中，該方法的特徵在於第一感染和第二感染，其中該第一感染提供了第一部分的腺病毒感染的細胞並且係藉由向細胞群中添加腺病毒誘導的，並且其中第二感染提供了第二部分的腺病毒感染的細胞並且係藉由由第一部分的腺病毒感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒誘導的。在一些實施方式中，允許第一和第二部分的細胞群被感染的條件係相同的。在一些實施方式中，允許第一和第二部分的細胞群被感染的條件係不同的。在一些實施方式中，該方法包括在允許細胞群中之第三部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一和第二部分的感染的細胞之細胞群，其中該第三部分的細胞被由第一和/或第二部分的腺病毒感染的細胞釋放的腺病毒感染。
在較佳的實施方式中，本發明之方法包括在允許該細胞群中之第二部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞被由該第一部分的感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染。在一些實施方式中，在允許第二部分的細胞群被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群之前，該方法包括在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群。在一些實施方式中，在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群之前，該方法包括向培養的細胞群中添加腺病毒。
在本發明之方法的一些實施方式中，允許該細胞群被腺病毒感染的條件包括向該細胞群中添加細胞培養添加劑。如實例5所示，此類添加劑可提高病毒滴度。因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括向該細胞群中添加細胞培養添加劑。在一些實施方式中，允許該細胞群被腺病毒感染的條件包括在如本文所定義的細胞培養添加劑之存在下培養該細胞群。在一些實施方式中，該方法包括在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群的同時向細胞群中添加細胞培養添加劑。如本文所用，「細胞培養添加劑」意指在初始細胞接種步驟期間不存在的細胞培養添加劑。
在一些實施方式中，細胞培養添加劑包括DMSO。在一些實施方式中，細胞培養添加劑包括丁酸鈉。在一些實施方式中，細胞培養添加劑包括CaCl 2。在較佳的實施方式中，細胞培養添加劑包括DMSO、丁酸鈉、和/或CaCl 2。在特別較佳的實施方式中，細胞培養添加劑包括DMSO、丁酸鈉、和CaCl 2。在一些實施方式中，在向該細胞群中添加細胞培養添加劑後，細胞群暴露於從約0.1%至約4% DMSO、較佳的是從約0.5%至約2% DMSO、最較佳的是約0.5%或約1% DMSO中。在一些實施方式中，在向該細胞群中添加細胞培養添加劑後，細胞群暴露於從約0.2 mM至約10 mM丁酸鈉、較佳的是從約0.5 mM至約2.5 mM丁酸鈉、最較佳的是約1 mM丁酸鈉中。在一些實施方式中，在向該細胞群中添加細胞培養添加劑後，細胞群暴露於從約0.5mM至約10 mM CaCl 2、較佳的是從約1 mM至約5 mM CaCl 2、最較佳的是約2 mM CaCl 2中。
可以在不同的時間點向細胞群中添加細胞培養添加劑。例如，在一些實施方式中，本發明之方法包括向細胞群中添加腺病毒後約0-148小時，較佳的是向細胞群中添加腺病毒後約48-120小時，最較佳的是向細胞群中添加腺病毒後約72-120小時，向該細胞群中添加細胞培養添加劑。在一些實施方式中，該方法包括大約至少每12-96小時，較佳的是大約至少每24-72小時，最較佳的是大約每48小時，向該細胞群中添加細胞培養添加劑。
在本發明之方法的一些實施方式中，允許該細胞群被腺病毒感染的條件包括向該細胞群中添加補料。因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括向細胞群中添加補料。在一些實施方式中，允許該細胞群被腺病毒感染的條件包括在如本文所定義的補料之存在下培養該細胞群。在一些實施方式中，該方法包括在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群的同時向細胞群中添加補料。如本文所用，「補料」意指在初始細胞接種步驟期間不存在的細胞培養營養物（例如胺基酸和/或葡萄糖）。因此，在一些實施方式中，補料包括胺基酸、維生素和/或葡萄糖。在較佳的實施方式中，補料包括胺基酸、維生素和葡萄糖。在一些實施方式中，補料係BalanCD ®HEK293補料。
可以在不同的時間點向細胞群中添加補料。例如，在一些實施方式中，該方法包括向細胞群中添加腺病毒後約0-120小時，較佳的是向細胞群中添加腺病毒後約24-96小時，最較佳的是向細胞群中添加腺病毒後約24-48小時，向該細胞群中添加補料。在一些實施方式中，該方法包括大約至少每12-96小時，較佳的是大約至少每24-72小時，最較佳的是大約每48小時，向該細胞群中添加補料。在一些實施方式中，該方法包括以高達約10% v/v、較佳的是高達約7.5% v/v的最終濃度，最較佳的是以約5% v/v的最終濃度，向該細胞群中添加補料。在較佳的實施方式中，該方法包括向細胞群中添加腺病毒後約24-48小時，以約5% v/v的最終濃度，向該細胞群中添加補料。
在一些實施方式中，允許該細胞群被腺病毒感染的條件係維持細胞活力＞80%、較佳的是＞85%、最較佳的是＞90%的條件。在本發明之方法的一些實施方式中，在維持細胞活力＞80%、較佳的是＞85%、最較佳的是＞90%的條件下培養細胞群。可以藉由本領域已知的多種技術來確定細胞活力。例如，染料排除技術利用指示劑染料來鑒定細胞膜損傷。吸收染料的細胞被染色並被認為是無活力的。常用的染料有台盼藍、赤蘚紅和苯胺黑。細胞活力可以使用自動化機器（例如Vi-CELL TMXR細胞活力分析儀）來計算。
在一些實施方式中，允許該細胞群被腺病毒感染的條件包括攪動該細胞群。因此，在本發明之方法的一些實施方式中，該方法包括攪動該細胞群。例如，在一些實施方式中，細胞群在細胞培養容器（例如，生物反應器）中培養，該細胞培養容器設定為具有產生從約1至約100 W/m 3，例如從約5至約90 W/m 3，較佳的是從約15至約70 W/m 3的輸入功率之攪動速率。
諸位發明人已經令人驚訝地發現了將細胞群暴露於第一和第二溫度（其中第一溫度高於第二溫度）可導致產生更高產量的腺病毒（參見實例6）。如本文所用，「第一溫度」係指向細胞群中添加腺病毒之前培養細胞群的溫度，例如約31ºC-40ºC，較佳的是約35ºC-38ºC，最較佳的是約37ºC，並且「第二溫度」係不同於（例如低於）第一溫度的溫度，例如約27ºC-40ºC，較佳的是約31ºC-35ºC，最較佳的是約33ºC。在一些實施方式中，第二溫度比第一溫度低約1ºC-10ºC，較佳的是比第一溫度低約3ºC-7ºC，最較佳的是比第一溫度低約4ºC。
因此，在本發明之方法的一些實施方式中，該方法包括在第一溫度下培養細胞群。在一些實施方式中，允許細胞群被感染的條件包括在第一溫度下培養細胞群。例如，允許細胞群被感染的條件可以包括在約31ºC-40ºC、較佳的是約35ºC-38ºC、和最較佳的是約37ºC的第一溫度下培養細胞群。在一些實施方式中，該方法包括在第二溫度下培養細胞群。在一些實施方式中，允許細胞群被感染的條件包括在第二溫度下（即，在不同於（例如低於）第一溫度的溫度下），培養細胞群。例如，允許細胞群被感染的條件可以包括在約31ºC-40ºC、較佳的是約31ºC-35ºC、和最較佳的是約33ºC的第二溫度下培養細胞群。在較佳的實施方式中，允許細胞群被腺病毒感染的條件包括在第一溫度下培養細胞群，然後在第二溫度下培養細胞群。
在一些實施方式中，允許細胞群中之第一部分的細胞被感染的條件包括在第一溫度下培養細胞群。例如，在一些實施方式中，允許第一部分的細胞被感染的條件包括在約31ºC-40ºC、較佳的是約35ºC-38ºC、最較佳的是約37ºC的第一溫度下培養細胞群。在一些實施方式中，允許細胞群中之第二部分的細胞被感染的條件包括在第一溫度下培養細胞群。在一些實施方式中，允許細胞群中之第二部分的細胞被感染的條件包括在第二溫度下（即，在不同於（例如低於）第一溫度的溫度下），培養細胞群。例如，在一些實施方式中，允許第二部分的細胞被感染的條件包括在約27ºC-40ºC、較佳的是約31ºC-35ºC、最較佳的是約33ºC的第二溫度下培養細胞群。在較佳的實施方式中，允許第一部分的細胞被感染的條件包括在第一溫度下培養細胞群，並且允許第二部分的細胞被感染的條件包括在第二溫度下培養包含第一部分的感染的細胞之細胞群。
細胞感染後，腺病毒被運送到細胞核。然後釋放病毒DNA，使其進入細胞核並進行複製。在一些實施方式中，本發明之方法包括在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群。如本文所用，「允許腺病毒複製的條件」意指允許腺病毒在細胞內繁殖之任何合適的條件。此類條件可以取決於培養的細胞類型和用於感染細胞的腺病毒。在較佳的實施方式中，培養物的pH維持在約6.5-7.5，更較佳的是約6.9-7.3。較佳的是，將維持pH和/或其他條件以優化細胞對葡萄糖的新陳代謝。可以藉由任何合適的方法，較佳的是以基本上不抑制腺病毒產生的方式來控制細胞培養物的pH。本領域已知幾種合適的用於調節pH之技術，包括添加緩衝液（例如，碳酸氫鹽緩衝液或tris緩衝液）。適當混合培養物係對細胞生長和腺病毒生產很重要的另一種條件。可以考慮的其他因素包括溫度、攪動速率、氧氣濃度、CO 2灌注速率、細胞濃度、培養物中細胞的沈降速率和流速、以及影響細胞生長和代謝速率的特定營養物和/或中間體（例如麩醯胺酸）的水平。用於確定腺病毒在細胞內繁殖的技術係本領域所熟知的並且包括確定基因拷貝數的qPCR、確定感染性病毒滴度的噬斑測定和確定病毒顆粒數的HPLC。
在一些實施方式中，允許腺病毒複製的條件包括向細胞群中添加如本文所定義的細胞培養添加劑。在一些實施方式中，允許腺病毒複製的條件包括在細胞培養添加劑的存在下培養該細胞群。在一些實施方式中，該方法包括在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群的同時向細胞群中添加細胞培養添加劑。
在一些實施方式中，允許腺病毒複製的條件包括向細胞群中添加如本文所定義的補料。在較佳的實施方式中，允許腺病毒複製的條件包括在補料的存在下培養細胞群。在一些實施方式中，該方法包括在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群的同時向細胞群中添加補料。
在一些實施方式中，允許腺病毒複製的條件係維持細胞活力＞80%、較佳的是＞85%、最較佳的是＞90%的條件。在較佳的實施方式中，允許該細胞群被腺病毒感染的條件和允許腺病毒複製的條件係維持細胞活力＞80%、較佳的是＞85%、最較佳的是＞90%的條件。
在一些實施方式中，允許腺病毒複製的條件包括攪動細胞群。例如，在一些實施方式中，細胞群在容器（例如，生物反應器）中培養，該容器設定為具有產生從約1至約100 W/m 3，例如從約5至約90 W/m 3，較佳的是從約15至約70 W/m 3的輸入功率之攪動速率。
在一些實施方式中，允許腺病毒複製的條件包括在如本文所定義的第一溫度下培養細胞群。在較佳的實施方式中，允許腺病毒複製的條件包括在如本文所定義的第二溫度下培養細胞群。在較佳的實施方式中，允許細胞群被腺病毒感染的條件包括在本文定義的第一溫度下培養細胞群，並且允許腺病毒複製的條件包括在本文定義的第二溫度下培養細胞群。
因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度。在較佳的實施方式中，第一溫度允許細胞群被腺病毒感染。在一些實施方式中，第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。在較佳的實施方式中，第一和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。在一些實施方式中，第一溫度允許腺病毒複製。在較佳的實施方式中，第二溫度允許腺病毒複製。在較佳的實施方式中，第一和第二溫度允許腺病毒複製。在較佳的實施方式中，第一溫度允許細胞群被腺病毒感染並且第二溫度允許腺病毒複製。在較佳的實施方式中，第一和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染，並且第一和第二溫度允許腺病毒複製。
在一些實施方式中，本發明之方法包括向細胞群中添加腺病毒後約3-96小時，較佳的是向細胞群中添加腺病毒後約48-96小時，最較佳的是細胞群中添加腺病毒後約72小時，將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度。在一些實施方式中，在第一溫度下將細胞群培養至少約24小時、較佳的是至少約72小時、最較佳的是至少約96小時。在一些實施方式中，在第二溫度下將細胞群培養至少約24小時、較佳的是至少約36小時、最較佳的是至少約48小時。在一些實施方式中，將第一溫度轉換到第二溫度後，該細胞群在該第二溫度下培養直到從培養物中收穫腺病毒。
在本發明之方法的一些實施方式中，將該細胞群暴露於該第二溫度使培養物中的腺病毒之穩定性提高。例如，與僅將該細胞群暴露於第一溫度相比，將該細胞群暴露於該第二溫度可提高培養物中的腺病毒之穩定性。可以藉由任何合適的方法，例如藉由隨時間測量病毒基因組滴度（例如藉由qPCR）或感染性滴度（例如藉由噬斑測定）容易地確定腺病毒穩定性。如果病毒穩定，預期病毒滴度不會降低。相反地，如果病毒不穩定，預期病毒滴度就會降低。在一些實施方式中，將該細胞群暴露於該第二溫度使培養物中的腺病毒顆粒:感染性顆粒比率降低。例如，與僅將該細胞群暴露於第一溫度相比，將細胞群暴露於第二溫度可降低培養物中的腺病毒顆粒:感染性顆粒比率。腺病毒顆粒:感染性顆粒比率的確定可以藉由任何合適的方法（例如藉由分別測量病毒顆粒滴度和感染性滴度，然後取這兩個值的比率）來評估。在較佳的實施方式中，將細胞群暴露於第二溫度使培養物中的腺病毒穩定性提高並且使培養物中的腺病毒顆粒:感染性顆粒比率降低。
有利地，向細胞群中添加腺病毒後，細胞群中的活細胞數量可以提高（參見實例1、2和7）。在本發明之方法的一些實施方式中，第一溫度允許細胞群的生長。在一些實施方式中，第二溫度允許細胞群的生長。在一些實施方式中，第一和第二溫度允許細胞群的生長。因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括在允許細胞群生長的條件下培養該細胞群。如本文所用，「允許細胞群生長」意指允許細胞生長之任何合適的細胞群培養方式。培養此類細胞之方法將取決於所選擇的細胞類型。合適的培養方法係本領域所熟知的，並且通常涉及將pH和溫度維持在適合細胞生長的範圍內。用於培養的較佳的溫度為約27ºC-40ºC，更較佳的是31ºC-37ºC，最佳地約37ºC。較佳的是，培養物的pH值維持在約6-8，更較佳的是在約6.7-7.8，最佳地在約6.9-7.5。在細胞群的整個生長週期中，細胞密度可以提高。可以使用本領域所熟知的多種技術在整個製程中監測培養物中細胞的濃度。聚焦於培養物中細胞總數的技術包括確定培養物的重量、評估培養物的濁度、確定培養物中的代謝活性、電子細胞計數、培養樣本的顯微細胞計數、使用連續稀釋的板計數、膜過濾器計數、和放射性同位素測定。在本發明中，任何允許評估細胞密度的技術都是合適的。例如，培養物的細胞密度可以藉由分光光度法或使用計數盤（例如血球計）來確定。細胞密度可以使用自動化機器（例如Vi-CELL TMXR細胞活力分析儀）來計算。
在一些實施方式中，允許細胞群被感染的條件係允許細胞生長的條件。在一些實施方式中，允許第一部分的細胞群被感染的條件係允許細胞生長的條件。在一些實施方式中，允許第二部分的細胞群被感染的條件係允許細胞生長的條件。在一些實施方式中，允許第三部分的細胞群被感染的條件係允許細胞生長的條件。在一些實施方式中，允許腺病毒複製的條件係允許細胞生長的條件。
在初始細胞感染後，腺病毒可能會經歷幾輪細胞群感染和/或在細胞中的複製。因此，在本發明之方法的一些實施方式中，向細胞群中添加腺病毒後約2-8天，較佳的是向細胞群中添加腺病毒後約3-7天，最較佳的是向細胞群中添加腺病毒後約4-6天，達到峰值病毒滴度。
複製後，可以有利地從培養物中分離腺病毒（例如，出於純化目的，以便可以將腺病毒添加到疫苗中）。因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括從培養物中收穫腺病毒。在一些實施方式中，從培養物中收穫腺病毒的步驟包括從培養該細胞群的細胞培養基中收穫腺病毒。在較佳的實施方式中，從培養物中收穫腺病毒的步驟包括裂解細胞群的細胞。在一些實施方式中，從培養物中收穫腺病毒的步驟包括裂解該細胞群的細胞以及從該細胞群的細胞裂解物中收穫腺病毒。
在較佳的實施方式中，使用細胞裂解劑（例如洗滌劑）裂解細胞群的細胞。使用洗滌劑進行細胞裂解具有以下優點：即，易於實施，並且易於擴大。可用於細胞裂解的洗滌劑係本領域已知的。在本發明所述之方法中用於細胞裂解的洗滌劑可以包括但不限於陰離子洗滌劑、陽離子洗滌劑、兩性離子洗滌劑和非離子洗滌劑。在較佳的實施方式中，洗滌劑係非離子洗滌劑。合適的非離子洗滌劑之實例包括聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80）和Triton（例如Triton-X）。在一個實施方式中，非離子洗滌劑係聚山梨醇酯-20。用於裂解宿主細胞群的非離子洗滌劑之最佳濃度可以例如在約0.005-0.025 kg洗滌劑/kg細胞培養容器、約0.01-0.02 kg洗滌劑/kg細胞培養容器、或約0.011-0.016 kg洗滌劑/kg細胞培養容器的範圍內變化。如本文所用，「kg細胞培養容器」意指細胞培養容器中細胞群和細胞培養基的總質量。在較佳的實施方式中，用於裂解宿主細胞群的非離子洗滌劑（例如，聚山梨醇酯-20）之濃度係約0.013kg洗滌劑/kg細胞培養容器。宿主細胞可以與非離子洗滌劑（例如聚山梨醇酯-20）一起孵育足夠的時間以使宿主細胞群中的所有或基本上所有細胞被裂解。在實施方式中，在核酸酶處理步驟之前，宿主細胞與非離子洗滌劑（例如聚山梨醇酯-20）一起孵育至少約15分鐘。在實施方式中，在核酸酶處理步驟之前，宿主細胞與非離子洗滌劑（例如聚山梨醇酯-20）一起孵育最多30分鐘。在實施方式中，在核酸酶處理步驟之前，宿主細胞與非離子洗滌劑（例如聚山梨醇酯-20）一起孵育不超過30分鐘。
在實施方式中，洗滌劑（例如聚山梨醇酯-20）形成裂解緩衝液的一部分。因此，在一些實施方式中，使用包含至少一種洗滌劑（例如聚山梨醇酯-20）的裂解緩衝液裂解宿主細胞。可以在本發明之方法中使用的示例性裂解緩衝液包括約500 mM tris、約20 mM MgCl 2、約50% (w/v)蔗糖和約10% (v/v)聚山梨醇酯20，並且具有約8的pH。用於裂解細胞群的裂解緩衝液之最佳濃度可以例如在約0.05-0.25 kg裂解緩衝液/kg容器、約0.10-0.20 kg裂解緩衝液/kg容器、或約0.11-0.16 kg裂解緩衝液/kg容器的範圍內變化。在較佳的實施方式中，裂解緩衝液之濃度係約0.13 kg裂解緩衝液/kg容器。
在一些實施方式中，向細胞群中添加腺病毒後至少約48小時，較佳的是向細胞群中添加腺病毒後至少約96小時，最較佳的是向細胞群中添加腺病毒後至少約120小時，進行從培養物中收穫腺病毒的步驟。例如，在一些實施方式中，向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，進行從培養物中收穫腺病毒的步驟。
在一些實施方式中，當細胞群中之細胞的活力降低，例如當細胞群中之細胞的活力降低為低於約99%、低於約97%、低於約95%、低於約90%或低於約80%，較佳的是當細胞群的活力降低為低於約95%時，進行從培養物中收穫腺病毒的步驟。例如，在一些實施方式中，當細胞群中少於約99%、約97%、約95%、約90%或約80%的細胞，較佳的是當少於約95%的細胞係活的時，進行從培養物中收穫腺病毒的步驟。在一些實施方式中，當細胞的氧消耗降低時，進行從細胞培養物中收穫腺病毒的步驟。因此，在一些實施方式中，當活細胞密度降低為低於約1.5x10 7個細胞/mL、低於約1x10 7個細胞/mL、低於約6x10 6個細胞/mL、低於約5.5x10 6個細胞/mL、低於約5x10 6個細胞/mL或低於約4x10 6個細胞/mL時，進行從培養物中收穫腺病毒的步驟。
在一些實施方式中，在收穫時，宿主細胞群可具有至少約6x10 5個細胞/mL、至少約8x10 5個細胞/mL、至少約1x10 6個細胞/mL、至少約2x10 6個細胞、至少約4x10 6個細胞、至少約6x10 6個細胞、至少約8x10 6個細胞或至少約1x10 7個細胞的細胞密度（例如活細胞密度）。在較佳的實施方式中，在收穫時，宿主細胞群具有至少約4x10 6細胞的細胞密度（例如活細胞密度）。在一些實施方式中，當細胞的氧消耗降低時，進行從細胞培養物中收穫腺病毒的步驟。
在收穫時，宿主細胞群可具有高達約1 x10 9個細胞/mL、高達約1 x10 8個細胞/mL、高達約8 x10 7個細胞/mL、高達約6 x10 7個細胞/mL、高達約4 x10 7個細胞/mL、高達約2x10 7個細胞/mL、高達約1 x10 7個細胞/mL、高達約8 x10 6個細胞/mL或高達約6 x10 6個細胞/mL的細胞密度（例如活細胞密度）。在一些實施方式中，在收穫時，宿主細胞群具有高達約8x10 6個細胞/mL的細胞密度（例如活細胞密度）。
在收穫時，宿主細胞群可具有約1x10 5個細胞/mL和約1 x10 9個細胞/mL之間、約8x10 5個細胞/mL和約1 x10 8個細胞/mL之間或約1x10 6個細胞/mL和約1x10 7個細胞/mL之間的細胞密度（例如活細胞密度）。
在收穫時，含腺病毒的培養物可以包含至少一種宿主細胞蛋白（HCP）。如本文所用，術語「HCP」係指由宿主細胞群產生或編碼的蛋白質。
含腺病毒的培養物可具有至少約20,000 ng/mL、至少約30,000 ng/mL、至少約40,000 ng/mL、至少約50,000 ng/mL、至少約60,000 ng/mL、至少約70,000 ng/mL、至少約80,000 ng/mL、至少約90,000 ng/mL或至少約100,000 ng/mL的HCP濃度。在較佳的實施方式中，含腺病毒的培養物具有至少約50,000 ng/mL的HCP濃度。
含腺病毒的培養物可具有高達約100,000 ng/mL、高達約90,000 ng/mL、高達約80,000 ng/mL、高達約70,000 ng/mL、高達約60,000 ng/mL、高達約50,000 ng/mL、高達約40,000 ng/mL、高達約30,000 ng/mL、或高達約20,000 ng/mL的HCP濃度。在較佳的實施方式中，含腺病毒的培養物具有高達約75,000 ng/mL的HCP濃度。
含腺病毒的培養物可具有約20,000 ng/mL和約100,000 ng/mL之間、約30,000 ng/mL和約90,000 ng/mL之間或約50,000 ng/mL和約80,000 ng/mL之間的HCP濃度。
在較佳的實施方式中，在收穫時，宿主細胞群具有如上所述之細胞密度（例如活細胞密度）和HCP濃度。例如，宿主細胞群可具有至少約4x10 6個細胞的細胞密度和至少約50,000 ng/mL的HCP濃度。
在本發明之方法的一些實施方式中，當病毒滴度高於閾值時，進行從細胞培養物中收穫腺病毒的步驟。例如，在一些實施方式中，在收穫時，病毒滴度係至少約0.5x10 10GC/mL、較佳的是至少約1x10 11GC/mL、至少約2x10 11GC/mL、至少約3x10 11GC/mL、或至少約4x10 11GC/mL，最較佳的是當病毒滴度係至少約2x10 11GC/mL時。
在腺病毒生產期間，培養的細胞可能需要提供新鮮的營養物，以使細胞保持活力。因此，在一些實施方式中，本發明之方法包括在向細胞群中添加腺病毒後，替換細胞培養基或向細胞群中添加細胞培養基的步驟。然而，替代或添加細胞培養基昂貴而且費時。因此，在較佳的實施方式中，該方法不包括在向細胞群中添加腺病毒後，替換細胞培養基或向細胞群中添加細胞培養基的步驟。
本發明之諸位發明人已示出，本發明所述之方法可以大規模地進行（參見例如實例7）。例如，本發明所述之方法可以適合於從單一培養物中收穫高達約5000升，例如從約3升至約3000升，較佳的是約200升至約2000升的範圍的含腺病毒的材料（例如細胞裂解物和/或細胞培養基，較佳的是細胞裂解物）。因此，在本發明之方法的一些實施方式中，培養過程在生物反應器進行。如本文所用，「生物反應器」意指適於大規模製程的細胞培養容器。例如，在一些實施方式中，生物反應器具有至少約1 L、較佳的是至少約1.2 L、約3 L、約50 L、約1000 L、約2000 L、約3000 L、或約5000 L、最較佳的是至少約2000 L的容量。在一些實施方式中，生物反應器具有至少約7x10 9個活T-REx TM細胞、較佳的是至少約2.1x10 10個活T-REx TM細胞、至少約3.5x10 11個活T-REx TM細胞、至少約5x10 12個活T-REx TM細胞或至少約3x10 13個活T-REx TM細胞、最較佳的是至少約5x10 12個活T-REx TM細胞的容量。 腺病毒載體
在本發明之方法的較佳的實施方式中，腺病毒係腺病毒載體。如本文所用，「腺病毒載體」意指腺病毒的一種形式，其已被修飾以將編碼異源基因的核苷酸序列插入真核細胞中。如本文所用，「異源基因」意指源自與被比較的其餘部分實體相比基因型不同的實體之基因。因此，異源基因係指任何不是分離自、源自或基於天然存在的腺病毒基因之基因。如本文所用，「天然存在的」意指在自然界中發現並且不是合成製備的或修飾的。
在本發明之方法的較佳的實施方式中，腺病毒載體包含編碼目的蛋白（例如治療性蛋白質或免疫原性蛋白質）的異源基因。可替代地，異源基因可以包括報告基因，其在表現時產生可檢測的訊息。此類報告基因包括但不限於編碼以下的DNA序列：β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶（LacZ）、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠螢光蛋白（GFP）、氯黴素乙醯轉移酶（CAT）、螢光素酶、膜結合蛋白（包括例如CD2、CD4、CD8）、流感血球凝集素蛋白、和本領域所熟知的其他針對其存在或可以藉由常規方式產生高親和力抗體的蛋白質、以及包含與來自血球凝集素或Myc及其他的抗原標籤結構域適宜地融合的膜結合蛋白之融合蛋白。該等編碼序列，當與驅動其表現的調節元件相關聯時，提供可藉由常規方法檢測到的訊息，該等常規方法包括酶促、放射線攝影、比色、螢光或其他光譜測定、螢光激活細胞分選測定和免疫學測定，包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（RIA）和免疫組織化學。
在較佳的實施方式中，異源基因係編碼在生物學和醫學中有用的產物（例如蛋白質、RNA、酶或催化性RNA）之序列，例如治療性基因或免疫原性基因。異源基因可用於治療（例如治療遺傳缺乏），用作癌症治療劑，用作疫苗，用於誘導免疫反應，並且/或者用於預防性目的。在較佳的實施方式中，異源基因編碼外源抗原，例如外源抗原的天然存在形式或其修飾形式。如本文所用，「外源抗原」意指誘導宿主免疫反應並且源自與被其誘導免疫反應的宿主相比基因型不同的實體之抗原。如本文所用，外源抗原的修飾形式意指外源抗原的一種形式，其誘導針對天然存在的抗原之宿主免疫反應並且與天然存在的抗原具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%序列同一性。如本文所用，免疫反應的誘導係指蛋白質誘導針對該蛋白質的T細胞和/或體液免疫反應之能力。針對外源抗原的天然存在形式或其修飾形式的宿主免疫反應之確定可以藉由任何合適的方法進行評估，該方法例如以下文獻中所描述的那些：Jeyanathan等人 2020; Immunological considerations for COVID-19 vaccine strategies [COVID-19疫苗策略的免疫學考慮]; Nature Reviews Immunology [免疫學自然綜述] 20, 615-632和Albert-Vega等人 2018; Immune Functional Assays, From Custom to Standardized Tests for Precision Medicine [免疫功能測定，精准醫學從定製到標準化測試]; Frontiers in Immunology [免疫學前沿] 9:2367。在一些實施方式中，天然存在的抗原之修飾形式誘導的宿主免疫反應比由天然存在的抗原誘導的更強。在一些實施方式中，天然存在的抗原之修飾形式誘導的宿主免疫反應比由天然存在的抗原誘導的更弱。
在一些實施方式中，外源抗原源自SARS-CoV2，較佳的是源自SARS-CoV2的刺突蛋白。SARS-CoV2係一種新出現的冠狀病毒，其引起嚴重的急性呼吸道疾病COVID-19。迄今為止，還沒有在全球範圍內可用的疫苗來預防SARS-CoV2感染。由於該病毒利用其刺突糖蛋白與細胞受體ACE2和絲胺酸蛋白酶TMPRSS2相互作用以進入靶細胞，因此該刺突蛋白代表了疫苗治療劑之有吸引力的靶點。因此，在較佳的實施方式中，異源基因編碼SARS-CoV2刺突蛋白的天然存在形式或其修飾版本。SARS-CoV2刺突蛋白的RNA、DNA和胺基酸序列係本領域技術者已知的，並且可以在許多數據庫中（例如，在美國國家生物技術資訊中心（NCBI）的數據庫（在該數據庫中其登錄號為NC_045512.2）中）中發現。例如，在一些實施方式中，異源基因編碼SARS-CoV2刺突蛋白，其包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列。在其他的示例性實施方式中，異源基因編碼SARS-CoV2刺突蛋白的修飾形式，其包含SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列。如將容易地理解的，SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列包含在N末端具有人組織血織維蛋白溶酶原活化物（tPA）的訊息肽之SARS-CoV2刺突蛋白胺基酸序列。N末端tPA序列的存在可能會增強SARS-CoV2刺突蛋白之免疫原性。
除了異源基因之外，載體還可以包括常規控制元件，該等常規控制元件以允許異源基因在被腺病毒感染的細胞中轉錄、翻譯和/或表現的方式與異源基因可操作地連接。如本文所用，「可操作地連接」包括與目的基因鄰接的表現控制序列，和在相反側或在遠端作用以控制目的基因之表現控制序列二者。
表現控制序列可以包括適宜的轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列和強化子序列；高效的RNA加工訊息，例如剪接和多腺苷酸化（多A）訊息；提高翻譯效率的序列；增強蛋白質穩定性的序列；以及在需要時，增強編碼產物分泌的序列。如本文所用，「啟動子」係允許RNA聚合酶的結合並指導基因的轉錄之核苷酸序列。許多表現控制序列（包括內部的、天然的、組成型的、誘導型的和/或組織特異性的啟動子）係本領域已知的並且可以被利用。
腺病毒載體可以源自哺乳動物腺病毒。在本發明之方法的一些實施方式中，腺病毒載體源自人腺病毒。在一些實施方式中，人腺病毒係血清型5人腺病毒。在較佳的實施方式中，人腺病毒不是血清型5人腺病毒。
在較佳的實施方式中，腺病毒載體不源自人腺病毒。因此，腺病毒載體可以源自非人腺病毒，例如，黑猩猩腺病毒。在特別較佳的實施方式中，腺病毒載體源自黑猩猩腺病毒，例如，ChAdOx1（Antrobus等人 2014 Mol. Ther. [分子療法]22(3):668-674）、ChAdOx2（Morris等人 2016 Future Virol. [未來病毒學]11(9):649-659）、ChAd3或ChAd63。在尤其較佳的實施方式中，腺病毒載體源自ChAdOx1。
在本發明之方法的一些實施方式中，腺病毒載體用於在疫苗中使用並且源自與疫苗所針對的物種相同的物種。例如，在一些實施方式中，疫苗針對在人類中發現的疾病並且腺病毒載體源自人腺病毒。然而，在較佳的實施方式中，腺病毒載體用於在疫苗中使用並且源自與疫苗所針對的物種不同的物種。例如，在一些實施方式中，疫苗針對在人類中發現的疾病並且腺病毒載體源自非人腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。據認為，使用源自與疫苗所針對的物種不同的物種之腺病毒載體可提供改進的疫苗，該疫苗在投與時經歷較低的預先存在的抗腺病毒免疫發生率。
腺病毒載體可以被工程化使得它們在投與於宿主後不能複製。因此，在本發明之方法的一些實施方式中，腺病毒載體係複製缺乏型腺病毒載體（例如，源自黑猩猩腺病毒的複製缺乏型腺病毒載體）。如本文所用，「複製缺乏型腺病毒載體」意指缺少一或多個腺病毒複製基因、不能在宿主細胞中複製的腺病毒載體。在一些實施方式中，腺病毒載體缺少E1A基因。在一些實施方式中，腺病毒載體已被修飾以防止宿主免疫系統消除被腺病毒載體感染的細胞。例如，在一些實施方式中，腺病毒載體缺少E1B基因和/或E3基因。在一些實施方式中，腺病毒載體缺少E1B基因。在一些實施方式中，腺病毒載體缺少E3基因。在一些實施方式中，腺病毒載體缺少E1B基因和E3基因。在一些實施方式中，腺病毒載體係極小腺病毒載體，其包含複製起點（ori）和包裝序列。在一些實施方式中，極小腺病毒載體進一步包含編碼目的蛋白之異源基因。 細胞群
在本發明之方法的較佳的實施方式中，細胞群與添加到細胞群中的腺病毒互補。如本文所用，「與所生產的腺病毒互補的細胞群」係如下的細胞群，該細胞群已被工程化以表現所生產的腺病毒不表現的腺病毒因子。例如，在一些實施方式中，向細胞群添加的腺病毒不表現腺病毒DNA複製因子而該細胞群表現腺病毒DNA複製因子。如本文所用，「腺病毒DNA複製因子」係在自然界中形成腺病毒DNA的一部分並且係腺病毒在宿主細胞中複製所必需的因子。因此，在一些實施方式中，向細胞群中添加的腺病毒不表現E1A蛋白、E1B蛋白和/或E4蛋白而該細胞群表現E1A蛋白、E1B蛋白和/或E4蛋白。
細胞群可為從組織中新鮮分離的原代細胞群。在一些實施方式中，該組織係哺乳動物組織。
可替代地，細胞群可以源自經改造用於培養的細胞系。在一些實施方式中，該細胞系係永生化細胞系。在一些實施方式中，該細胞系係哺乳動物細胞系。在一些實施方式中，該細胞群包含哺乳動物細胞。例如，在一些實施方式中，該細胞群包含人胎腎（HEK）細胞或者係HEK細胞系。該等哺乳動物細胞可以表現腺病毒複製因子。例如，在一些實施方式中，該細胞群表現E1A蛋白、E1B蛋白和/或E4蛋白。在一些實施方式中，該細胞群表現四環素阻遏蛋白。在較佳的實施方式中，該細胞群表現T-REx TM細胞。在一些實施方式中，該細胞群由T-REx TM細胞組成。在較佳的實施方式中，該細胞群包含Expi293F誘導型細胞（賽默飛世爾公司（Thermofisher））或改良的T-REX TM細胞。 疫苗生產
包含異源基因的腺病毒可以在免疫原性組成物中投與。如本文所用，「免疫原性組成物」係包含根據本發明所述之方法生產的腺病毒之組成物，在遞送至哺乳動物（較佳的是人）後，該組成物能夠誘導針對由載體遞送的異源基因產物之免疫反應，例如體液（例如抗體）和/或細胞介導的（例如細胞毒性T細胞）反應。因此，根據本發明產生的腺病毒可包含編碼所需免疫原的基因並且因此可用於疫苗中。腺病毒可以用作針對任何病原體的預防性或治療性疫苗，對於該等病原體，已經鑒定出對於誘導免疫反應至關重要並且能夠限制病原體傳播的一或多種抗原並且cDNA係可用的。
因此，在一方面，提供了一種製造疫苗之方法，該方法包括根據本發明所述之方法生產腺病毒、純化腺病毒和製備包含純化的腺病毒之疫苗。純化用於在疫苗中使用的腺病毒之方法係本領域所熟知的，例如，如以下文獻所述：Vellinga等人 2014; Challenges in Manufacturing Adenoviral Vectors for Global Vaccine Product Development [為全球疫苗產品開發製造腺病毒載體的挑戰]; Human Gene Therapy [人類基因治療] 25:318-327。
此類疫苗或其他免疫原性組成物可以在合適的遞送媒介物中配製。可以監測對由腺病毒編碼的異源基因之免疫水平，以確定是否需要加強劑。在評估血清中的抗體滴度後，可能需要進行視需要的加強免疫。
在一些實施方式中，疫苗包含佐劑。如本文所用，「佐劑」意指增強對免疫原的免疫反應之組成物。佐劑的實例包括但不限於無機佐劑（例如無極金屬鹽例如磷酸鋁或氫氧化鋁）、有機佐劑（例如皂苷（如QS21）或角鯊烯）、油基佐劑（例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑）、細胞介素（例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和IFN-γ）、特定佐劑（例如免疫刺激性複合物（ISCOM）、脂質體或生物可降解的微球）、病毒顆粒、細菌佐劑（例如單磷醯基脂質A（如3-去-O-醯化單磷醯基脂質A（3D-MPL））或胞壁肽）、合成佐劑（例如非離子的嵌段共聚物、胞壁肽類似物或合成脂質A）、合成多核苷酸佐劑（例如聚精胺酸或聚賴胺酸）和含未甲基化的CpG二核苷酸（「CpG」）的免疫刺激性寡核苷酸。
在一些實施方式中，佐劑與載劑如脂質體、水包油乳液和/或金屬鹽一起配製。
在本發明之方法的較佳的實施方式中，疫苗係COVID-19疫苗。
除非另外定義，本文所使用的所有技術和科學術語具有與熟悉本揭露所屬領域普通技術者通常所理解的相同的意義。Singleton等人, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY [微生物學和分子生物學詞典], 第20版, John Wiley and Sons [約翰威利父子公司], 紐約 (1994)，以及Hale和Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY [哈珀柯林斯生物學詞典], Harper Perennial [哈珀永久出版社], 紐約州 (1991) 為技術者提供了本揭露中所使用的許多術語的通用詞典。
本揭露並不受本文揭露的示例性方法和材料的限制，並且與本文所述之那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用於本揭露的實施方式之實踐或測試。
除非另有說明，否則任何核酸序列以5'至3'方向從左至右書寫；胺基酸序列分別以胺基至羧基的方向從左至右書寫。
本文提供的標題不是對本揭露的各個方面或實施方式的限制。此外，將理解本文所述之任何實施方式適用於本文所述之任何方面。
濃度、量、體積、百分比和其他數值能以範圍格式來呈現。數值範圍包括限定該範圍的數字。在提供數值範圍的情況中，應理解，該範圍的上限和下限之間的每個中間值（至下限的個位的十分之一，除非上下文另有清楚規定）也被具體揭露。在所陳述的範圍中之任何規定值或中間值與所陳述的範圍中之任何其他規定值或中間值之間的每個較小範圍，被涵蓋在本揭露內。該等較小範圍的上限和下限可獨立地被包括或排除在該範圍中，而且其中任一個、沒有一個或兩個極限值被包括在較小範圍中的每個範圍也被涵蓋在本揭露中，但依據所陳述的範圍中的任何被具體排除的極限值而定。在所陳述的範圍包含極限值的一或兩個的情況下，將那些所包含的極限值之一或兩個排除在外的範圍也包含在本揭露中。還應理解的是，此類範圍格式僅僅是為了方便和簡潔而使用，並且應該被靈活地解釋為不僅包括明確列舉為範圍的限值之數值而且包括包含在該範圍內的所有單獨的數值或子範圍，就像每個數值和子範圍被明確地列舉一樣。
必須注意的是，如本文和所附請求項所用，單數形式「一個/種（a/an）」和「該（the）」包括複數指示物，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一種藥劑」包括多種這樣的藥劑並且提及「該藥劑」包括提及熟悉該項技術者已知的一或多種藥劑及其等效物，等等。
「約」通常可意味著在給定測量值的性質或精度的情況下測量的量之可接受的誤差程度。示例性誤差程度在給定值或值範圍的20%內，通常在10%內，更通常在5%內。較佳的是，術語「約」在本文中應被理解為使用的數字的數值之正或負（±）5%，較佳的是± 4%、± 3%、± 2%、± 1%、± 0.5%、± 0.1%。
本文描述為「包括/包含（comprising）」一或多個特徵的實施方式也可以被認為是「主要由此類特徵組成」或「由此類特徵組成」的相應實施方式之揭露。
上述實施方式被理解為說明性實例。設想了另外的實施方式。應當理解的是，關於任何一個實施方式描述的任何特徵可以單獨使用，或者與所描述的其他特徵結合使用，並且還可以與任何其他實施方式的一或多個特徵，或者任何其他實施方式的任何組合結合使用。此外，在不脫離由所附請求項限定的本發明之範圍的情況下，也可以採用上面未描述的等效物和修改。
本文引用的所有文獻各自藉由引用以其全文併入本文，包括引用文獻中呈現的所有數據、表、附圖和文本。 實例 實例 1 - 使用高和低 MOI 的腺病毒感染
以0.5x10 6活細胞/mL，將T-REx TM細胞接種在3 L的生物反應器中並且基於 圖 1或 圖 2所示的那些進行高或低MOI腺病毒感染方案。簡言之，對於高MOI感染方案，使T-REx TM細胞生長直到達到大約3-5x10 6個細胞/mL的匯合度，此時將它們以1:1稀釋並用腺病毒以MOI為10進行感染。感染後大約24小時，當細胞密度達到1x10 6個活細胞/mL時，用針對HEK 293細胞的可商購的補料飼養感染的細胞。感染後24、48和72小時，收穫單獨的培養物以評估病毒滴度。
相反，對於低MOI方案，以0.7x10 6個活細胞/mL，將T-REx TM細胞接種在3 L的生物反應器中，並在接種後大約24小時，用腺病毒以MOI為0.075進行感染。在第4天飼養感染的細胞，並在接種後72、96、120、148和196小時收穫單獨的培養物以評估病毒滴度。
在此製程期間，使用Vi-Cell確定活細胞密度並使用Vi-Cell測量細胞活力。
收穫後，進行qPCR以確定病毒基因組滴度，其結果給出每mL樣本的基因拷貝。進行qPCR以確定病毒基因組滴度之方法係本領域所熟知的。簡言之，從病毒顆粒中提取病毒DNA，並藉由PCR方法使用對病毒轉基因特異的引物確定病毒DNA的拷貝數。在一些情況中，噬斑測定用於確定感染性滴度，其結果示出每mL樣本的感染單位。進行噬斑測定以確定感染性滴度之方法係本領域所熟知的。在一些情況中，使用HPLC測量病毒顆粒滴度，其結果示出每mL樣本中的病毒顆粒。使用HPLC定量腺病毒之方法係本領域所熟知的，例如，如以下文獻中所述：Blanche等人 2000; An improved anion-exchange HPLC method for the detection and purification of adenovirus particles [一種用於檢測和純化腺病毒顆粒之改進的陰離子交換HPLC方法]; Gene Therapy [基因療法] 7, 1055-1062。
如 圖 3A所示，對於以高MOI感染的細胞，活細胞密度增加，直到感染當天，此時觀察到峰值細胞密度大幅下降。感染後大約24-48小時，活細胞密度恢復至約2-3x10 6個細胞/mL，然後在感染後大約72小時降至1-2x10 6個細胞/mL。
令人驚訝地，對於以低MOI感染的培養物，活細胞密度增加，直到接種後第5-6天，達到大約4-6x10 6個細胞/mL的峰值細胞密度。對於該等細胞，在第7天觀察到峰值細胞密度略有下降。有趣的是，在第3天或第2天和第4天飼養的細胞示出比僅在第4天飼養的細胞更高的峰值細胞密度，這表明飼養細胞的時間可能會影響峰值細胞密度。
如 圖 3B所示，細胞活力不受任何處理方案的影響，並且對於所有測試方案，保持高於90%直到培養的第7天。令人驚訝地， 圖 3C示出以低MOI感染的細胞比以高MOI感染的細胞具有更高的病毒滴度。特別地， 圖 3C示出以低MOI感染的細胞在培養第6天（感染後5天）具有大約為3x10 11GC/mL的峰值病毒滴度，而以高MOI感染的那些細胞在培養的第6天（感染後2天）具有大約為1-1.5x10 11GC/mL的峰值病毒滴度。重要的是，源自低MOI製程的產物具有與源自高MOI製程的產物相當的品質，如 圖 3D所示。
總之，且如 圖 4A所示，與使用高MOI製程相比，使用低MOI製程會導致更高的病毒滴度，如提高的病毒基因組濃度、提高的感染單位/mL和提高的病毒顆粒滴度所表明。如 圖 4B所示，低MOI製程的使用導致與高MOI製程相似的病毒基因組與感染單位比率和相似的產物品質。
總之，該等結果示出，以低MOI感染的細胞比以高MOI感染的那些細胞達到更高的峰值密度並產生更高的病毒滴度。如將容易理解的，與高MOI感染相比，使用低MOI感染顯著地降低了病毒種子的需求。因此，由於所需的起始材料較少，與以高MOI感染細胞相比，以低MOI感染細胞代表了一種更具可擴大性的腺病毒生產方法。 實例 2 - 低 MOI 感染對病毒滴度之影響
接下來，諸位發明人測試了一系列低MOI對峰值活細胞密度、細胞活力和病毒滴度之影響。簡言之，以0.7x10 6個活細胞/mL，將T-REx TM細胞接種在3 L的生物反應器中，並在接種後大約24小時，用腺病毒以MOI為0.026-0.270進行感染。在第2天和第4天飼養感染的細胞，並在接種後大約5、6和7天收穫單獨的培養物。如前所述，每天測量每個培養物的活細胞密度和活力。
如 圖 5A所示，以較低MOI感染的細胞具有較高的峰值活細胞密度。具體地，以MOI為0.026-0.030感染的細胞具有約7-8x10 6個細胞/mL的峰值細胞密度，而以MOI為0.232-0.270感染的細胞具有約3x10 6個細胞/mL的峰值細胞密度。
如 圖 5B所示，細胞活力隨著MOI的增加而傾向於降低。因此，以MOI為0.026-0.030感染的細胞甚至在培養的第7天也具有95%的活力，而以MOI為0.232-0.270感染的那些細胞在感染後大約4天開始，示出活力顯著下降，在培養第7天達到大約75%的活力。
令人驚訝地，如 圖 5C所示，在第7天（感染後6天）病毒滴度與MOI成反比。因此，在第7天，在測試的最低MOI感染的細胞中病毒滴度最高，而在測試的最高MOI感染的細胞中病毒滴度最低。在第6天（感染後5天）觀察到病毒滴度的相似模式，在以較低MOI感染的細胞中傾向於觀察到更高的病毒滴度。相反，除了在第5天最低MOI清楚示出最低病毒滴度外，在所有測試的MOI中，第5天（感染後4天）的病毒滴度大約相等。值得注意的是，在第6天觀察到了最高病毒滴度，而第5天的最高病毒滴度低於第6天或第7天觀察到的最低病毒滴度。 實例 3 - 細胞接種密度對病毒滴度之影響
諸位發明人接下來評估了不同初始細胞接種密度下，在第0天或第1天感染的病毒滴度。簡言之，以0.5-1.2x10 6個細胞/mL，將T-REx TM細胞接種於ambr 250容器中，並且在接種後第0天或第1天，用腺病毒以目標MOI為0.025或0.075進行感染。將細胞培養至感染後多至7天，收穫細胞培養物用於評估病毒滴度。
如 圖 6A所示，提高細胞密度令人驚訝地提高了在細胞接種後第0天感染的培養物之病毒滴度。具體地，當培養物以MOI為0.025感染時，0.5x10 6個細胞/mL的細胞接種密度導致＜1x10 11VG/mL的病毒滴度，而當培養物以相同的MOI感染時，1.2x10 6個細胞/mL的細胞接種密度導致大約為4.5x10 11VG/mL的顯著更高的病毒滴度。對於以MOI為0.075感染的培養物，觀察到了相似的影響。 圖 6B示出細胞接種後第1天感染的培養物有相似結果。 實例 4 - 細胞稀釋對病毒滴度之影響
諸位發明人接下來評估了感染時細胞稀釋是否影響病毒滴度。簡言之，以0.8x10 6個細胞/mL，將T-REx TM細胞接種於ambr 250容器中並且在接種後第0天或第1天，用腺病毒以目標MOI為0.025或0.075進行感染。一些培養物在感染時被稀釋。將細胞培養至感染後多至5天，收穫細胞培養物用於評估病毒滴度。
如 圖 7A 和 7B所示，在感染時稀釋細胞會極大地降低病毒滴度。具體地， 圖 7A示出如果在細胞接種後第0天感染時稀釋細胞，病毒滴度會從大約1.5x10 11VG/mL降低到5x10 10VG/mL。類似地， 圖 7B示出如果在細胞接種後第1天感染時稀釋細胞，病毒滴度會從大約2-2.5x10 11VG/mL降低到5x10 10-1x10 11VG/mL。 實例 5 - 細胞培養添加劑對病毒滴度之影響
諸位發明人接下來評估了細胞培養添加劑（DMSO、丁酸鈉或CaCl 2）是否可以改變病毒滴度。簡言之，以0.7x10 6個活細胞/mL，將T-REx TM細胞接種於ambr 250容器中並且在接種後第1天，用腺病毒以目標MOI為0.075進行感染。如 圖 10所示，在接種後第4天或第5天添加細胞培養添加劑。將細胞培養至感染後多至6天，並且收穫細胞培養物用於評估病毒滴度。
如 圖 8所示，與對照相比，在第4天添加0.5% DMSO或在第4天或第5天添加1% DMSO使病毒滴度提高了。類似地，與對照相比，在第4天添加1 mM丁酸鈉也使病毒滴度提高了。最後，與對照相比，在第4天添加1 mM CaCl 2，而不是在第4天或第5天添加2 mM CaCl 2，使病毒滴度提高了。 實例 6 - 溫度變化對病毒滴度之影響
諸位發明人接下來評估了在感染製程期間，溫度變化是否會改變峰值細胞密度、細胞活力和病毒滴度。因此，將細胞在37°C培養直至感染，並且在向培養物中添加腺病毒後大約3小時將溫度改變為31°C、33°C或35°C。如圖 9A所示，在整個製程中，所有樣本的細胞密度與至少一種在37°C培養的對照培養物非常相似。
令人驚訝地， 圖 9B示出在經受溫度變化的培養物中細胞活力更高，更大的溫度變化與細胞活力提高相關。特別地，即使在培養192小時後，改變為31°C的培養物仍示出大約90%的細胞活力，而與在未經歷溫度變化的培養物中觀察到的類似，改變為33°C的培養物示出大約65%的細胞活力，且改變為35°C的培養物示出大約55%的細胞活力。
最後， 圖 9C示出在未經歷溫度變化的培養物中，感染後2天的病毒滴度最高。然而，該等培養物中的病毒滴度在感染後2-3天之間顯著降低。在一個對照培養物中，病毒滴度從感染後2天的大約2.5x10 11VG/mL降低到感染後3天的＜1.5x10 11VG/mL。令人驚訝地，經歷溫度變化的培養物中的病毒滴度在感染後2-3天之間提高。特別地，經歷33°C的溫度變化的培養物中的病毒滴度在感染後3天提高到＞2x10 11VG/mL。 實例 7 - 可擴大性
為示出低MOI製程係可擴大的，諸位發明人接下來比較了在1000 L和3 L生物反應器中進行的製程。如 圖 10A 和 10B所示，直至培養第5天，1000 L生物反應器中的峰值細胞密度和細胞活力達到可接受的水平，其接近3 L生物反應器中可見的水平。令人驚訝地，如 圖 10C所示，與在3 L生物反應器中相比，第5天，在1000 L生物反應器中的培養物之病毒滴度大約高3倍。
總之，該等結果示出使用低MOI感染為腺病毒的生產提供了高度可擴大的和高效的製程。
無
[ 圖 1]示出了示例性高MOI製程。根據這一方法，使細胞生長直到達到大約3-5x10 6個細胞/mL的匯合度，此時將它們以1:1稀釋並用以MOI為10的腺病毒進行感染。將感染的細胞再培養42±2小時，然後收穫進行腺病毒純化。
[ 圖 2]示出了根據本發明的示例性低MOI製程。接種細胞並且在接種後大約24小時，用腺病毒以最多為1的低MOI進行感染。將感染的細胞培養大約6天，然後收穫進行腺病毒純化。
[ 圖 3]示出了在高和低MOI製程期間，活細胞密度（VCD）、活力和腺病毒滴度之比較。 圖 3AVCD； 圖 3B活力； 圖 3CqPCR滴度； 圖 3DA260: A280比率。
[ 圖 4]提供了高MOI製程和低MOI製程之比較。 圖 4A病毒基因組濃度；感染性滴度；和病毒顆粒滴度。 圖 4B病毒基因組: 感染單位比率和A260: A280比率。
[ 圖 5]示出了MOI對VCD、活力和腺病毒滴度之影響。 圖 5AVCD； 圖 5B活力； 圖 5C腺病毒qPCR滴度。
[ 圖 6]示出了在不同初始細胞接種密度下和不同感染時間點的腺病毒滴度。 圖 6A第0天感染； 圖 6B第1天感染。
[ 圖 7]示出了在不同時間點進行感染的低MOI製程中稀釋對病毒滴度之影響。 圖 7A第0天感染； 圖 7B第1天感染。
[ 圖 8]示出了各種細胞培養添加劑對感染性滴度之影響。
[ 圖 9]示出了溫度變化對VCD、活力和腺病毒滴度之影響。 圖 9AVCD； 圖 9B活力； 圖 9C腺病毒qPCR滴度。
[ 圖 10]示出了示例性低MOI製程之可擴大性。 圖 10AVCD； 圖 10B活力； 圖 10C腺病毒qPCR滴度。
序列表說明
SEQ ID NO: 描述 序列
1 冠狀病毒SARS-CoV物種SARS-CoV-2株的刺突蛋白胺基酸序列 MFVFLVLLPL VSSQCVNLTT RTQLPPAYTN SFTRGVYYPD KVFRSSVLHS TQDLFLPFFS NVTWFHAIHV SGTNGTKRFD NPVLPFNDGV YFASTEKSNI IRGWIFGTTL DSKTQSLLIV NNATNVVIKV CEFQFCNDPF LGVYYHKNNK SWMESEFRVY SSANNCTFEY VSQPFLMDLE GKQGNFKNLR EFVFKNIDGY FKIYSKHTPI NLVRDLPQGF SALEPLVDLP IGINITRFQT LLALHRSYLT PGDSSSGWTA GAAAYYVGYL QPRTFLLKYN ENGTITDAVD CALDPLSETK CTLKSFTVEK GIYQTSNFRV QPTESIVRFP NITNLCPFGE VFNATRFASV YAWNRKRISN CVADYSVLYN SASFSTFKCY GVSPTKLNDL CFTNVYADSF VIRGDEVRQI APGQTGKIAD YNYKLPDDFT GCVIAWNSNN LDSKVGGNYN YLYRLFRKSN LKPFERDIST EIYQAGSTPC NGVEGFNCYF PLQSYGFQPT NGVGYQPYRV VVLSFELLHA PATVCGPKKS TNLVKNKCVN FNFNGLTGTG VLTESNKKFL PFQQFGRDIA DTTDAVRDPQ TLEILDITPC SFGGVSVITP GTNTSNQVAV LYQDVNCTEV PVAIHADQLT PTWRVYSTGS NVFQTRAGCL IGAEHVNNSY ECDIPIGAGI CASYQTQTNS PRRARSVASQ SIIAYTMSLG AENSVAYSNN SIAIPTNFTI SVTTEILPVS MTKTSVDCTM YICGDSTECS NLLLQYGSFC TQLNRALTGI AVEQDKNTQE VFAQVKQIYK TPPIKDFGGF NFSQILPDPS KPSKRSFIED LLFNKVTLAD AGFIKQYGDC LGDIAARDLI CAQKFNGLTV LPPLLTDEMI AQYTSALLAG TITSGWTFGA GAALQIPFAM QMAYRFNGIG VTQNVLYENQ KLIANQFNSA IGKIQDSLSS TASALGKLQD VVNQNAQALN TLVKQLSSNF GAISSVLNDI LSRLDKVEAE VQIDRLITGR LQSLQTYVTQ QLIRAAEIRA SANLAATKMS ECVLGQSKRV DFCGKGYHLM SFPQSAPHGV VFLHVTYVPA QEKNFTTAPA ICHDGKAHFP REGVFVSNGT HWFVTQRNFY EPQIITTDNT FVSGNCDVVI GIVNNTVYDP LQPELDSFKE ELDKYFKNHT SPDVDLGDIS GINASVVNIQ KEIDRLNEVA KNLNESLIDL QELGKYEQYI KWPWYIWLGF IAGLIAIVMV TIMLCCMTSC CSCLKGCCSC GSCCKFDEDD SEPVLKGVKL HYT   
2 冠狀病毒SARS-CoV物種SARS-CoV-2株的刺突蛋白胺基酸序列，其在N末端具有人組織血織維蛋白溶酶原活化物基因（tPA）的訊息肽 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SASQEIHARF RRFVFLVLLP LVSSQCVNLT TRTQLPPAYT NSFTRGVYYP DKVFRSSVLH STQDLFLPFF SNVTWFHAIH VSGTNGTKRF DNPVLPFNDG VYFASTEKSN IIRGWIFGTT LDSKTQSLLI VNNATNVVIK VCEFQFCNDP FLGVYYHKNN KSWMESEFRV YSSANNCTFE YVSQPFLMDL EGKQGNFKNL REFVFKNIDG YFKIYSKHTP INLVRDLPQG FSALEPLVDL PIGINITRFQ TLLALHRSYL TPGDSSSGWT AGAAAYYVGY LQPRTFLLKY NENGTITDAV DCALDPLSET KCTLKSFTVE KGIYQTSNFR VQPTESIVRF PNITNLCPFG EVFNATRFAS VYAWNRKRIS NCVADYSVLY NSASFSTFKC YGVSPTKLND LCFTNVYADS FVIRGDEVRQ IAPGQTGKIA DYNYKLPDDF TGCVIAWNSN NLDSKVGGNY NYLYRLFRKS NLKPFERDIS TEIYQAGSTP CNGVEGFNCY FPLQSYGFQP TNGVGYQPYR VVVLSFELLH APATVCGPKK STNLVKNKCV NFNFNGLTGT GVLTESNKKF LPFQQFGRDI ADTTDAVRDP QTLEILDITP CSFGGVSVIT PGTNTSNQVA VLYQDVNCTE VPVAIHADQL TPTWRVYSTG SNVFQTRAGC LIGAEHVNNS YECDIPIGAG ICASYQTQTN SPRRARSVAS QSIIAYTMSL GAENSVAYSN NSIAIPTNFT ISVTTEILPV SMTKTSVDCT MYICGDSTEC SNLLLQYGSF CTQLNRALTG IAVEQDKNTQ EVFAQVKQIY KTPPIKDFGG FNFSQILPDP SKPSKRSFIE DLLFNKVTLA DAGFIKQYGD CLGDIAARDL ICAQKFNGLT VLPPLLTDEM IAQYTSALLA GTITSGWTFG AGAALQIPFA MQMAYRFNGI GVTQNVLYEN QKLIANQFNS AIGKIQDSLS STASALGKLQ DVVNQNAQAL NTLVKQLSSN FGAISSVLND ILSRLDKVEA EVQIDRLITG RLQSLQTYVT QQLIRAAEIR ASANLAATKM SECVLGQSKR VDFCGKGYHL MSFPQSAPHG VVFLHVTYVP AQEKNFTTAP AICHDGKAHF PREGVFVSNG THWFVTQRNF YEPQIITTDN TFVSGNCDVV IGIVNNTVYD PLQPELDSFK EELDKYFKNH TSPDVDLGDI SGINASVVNI QKEIDRLNEV AKNLNESLID LQELGKYEQY IKWPWYIWLG FIAGLIAIVM VTIMLCCMTS CCSCLKGCCS CGSCCKFDED DSEPVLKGVK LHYT
無
 

          <![CDATA[<110>  英商阿斯特捷利康英國股份有限公司（ASTRAZENECA UK LIMITED）]]>
          <![CDATA[<120>  生產腺病毒之方法]]>
          <![CDATA[<130>  P68154US]]>
          <![CDATA[<160>  2     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  1273]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  與嚴重急性呼吸道綜合症相關的冠狀病毒]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 
                  35                  40                  45              
          His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 
              50                  55                  60                  
          Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 
              130                 135                 140                 
          Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 
                          165                 170                 175     
          Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 
                          245                 250                 255     
          Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 
                      260                 265                 270         
          Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 
                  275                 280                 285             
          Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 
              290                 295                 300                 
          Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 
                      340                 345                 350         
          Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 
                          405                 410                 415     
          Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 
                      420                 425                 430         
          Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 
                  435                 440                 445             
          Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 
              450                 455                 460                 
          Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 
                          485                 490                 495     
          Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 
                      500                 505                 510         
          Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 
                  515                 520                 525             
          Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 
                          565                 570                 575     
          Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 
                      580                 585                 590         
          Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 
                  595                 600                 605             
          Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 
              610                 615                 620                 
          His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 
                          645                 650                 655     
          Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 
                      660                 665                 670         
          Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 
                  675                 680                 685             
          Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 
              690                 695                 700                 
          Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 
          705                 710                 715                 720 
          Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 
                          725                 730                 735     
          Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 
                      740                 745                 750         
          Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 
                  755                 760                 765             
          Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 
              770                 775                 780                 
          Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 
          785                 790                 795                 800 
          Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 
                          805                 810                 815     
          Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 
                      820                 825                 830         
          Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 
                  835                 840                 845             
          Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 
              850                 855                 860                 
          Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 
          865                 870                 875                 880 
          Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 
                          885                 890                 895     
          Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 
                      900                 905                 910         
          Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 
                  915                 920                 925             
          Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 
              930                 935                 940                 
          Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 
                          965                 970                 975     
          Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 
                      980                 985                 990         
          Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Leu Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys 
              1025                 1030                 1035             
          Arg Val  Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro 
              1040                 1045                 1050             
          Gln Ser  Ala Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val 
              1055                 1060                 1065             
          Pro Ala  Gln Glu Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His 
              1070                 1075                 1080             
          Asp Gly  Lys Ala His Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn 
              1085                 1090                 1095             
          Gly Thr  His Trp Phe Val Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln 
              1100                 1105                 1110             
          Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr  Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro 
              1130                 1135                 1140             
          Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn 
              1145                 1150                 1155             
          His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp Ile Ser  Gly Ile Asn 
              1160                 1165                 1170             
          Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp Arg  Leu Asn Glu 
              1175                 1180                 1185             
          Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu  Gln Glu Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile Trp Leu 
              1205                 1210                 1215             
          Gly Phe  Ile Ala Gly Leu Ile  Ala Ile Val Met Val  Thr Ile Met 
              1220                 1225                 1230             
          Leu Cys  Cys Met Thr Ser Cys  Cys Ser Cys Leu Lys  Gly Cys Cys 
              1235                 1240                 1245             
          Ser Cys  Gly Ser Cys Cys Lys  Phe Asp Glu Asp Asp  Ser Glu Pro 
              1250                 1255                 1260             
          Val Leu  Lys Gly Val Lys Leu  His Tyr Thr 
              1265                 1270             
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  1304]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  與嚴重急性呼吸道綜合症相關的冠狀病毒]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Phe Val Ser Ala Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe 
                          85                  90                  95      
          His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys 
                  115                 120                 125             
          Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr 
                          165                 170                 175     
          His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met 
                  195                 200                 205             
          Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val 
              210                 215                 220                 
          Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro 
                          245                 250                 255     
          Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly 
                  275                 280                 285             
          Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg 
              290                 295                 300                 
          Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser 
                          325                 330                 335     
          Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln 
                      340                 345                 350         
          Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro 
                  355                 360                 365             
          Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp 
              370                 375                 380                 
          Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr 
                          405                 410                 415     
          Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val 
                      420                 425                 430         
          Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys 
                  435                 440                 445             
          Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val 
              450                 455                 460                 
          Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu 
                          485                 490                 495     
          Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn 
                      500                 505                 510         
          Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe 
                  515                 520                 525             
          Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu 
              530                 535                 540                 
          Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly 
                          565                 570                 575     
          Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro 
                      580                 585                 590         
          Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg 
                  595                 600                 605             
          Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly 
              610                 615                 620                 
          Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala 
          625                 630                 635                 640 
          Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His 
                          645                 650                 655     
          Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn 
                      660                 665                 670         
          Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn 
                  675                 680                 685             
          Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser 
              690                 695                 700                 
          Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser 
          705                 710                 715                 720 
          Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val 
                          725                 730                 735     
          Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser 
                      740                 745                 750         
          Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp 
                  755                 760                 765             
          Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu 
              770                 775                 780                 
          Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly 
          785                 790                 795                 800 
          Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val 
                          805                 810                 815     
          Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn 
                      820                 825                 830         
          Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe 
                  835                 840                 845             
          Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe 
              850                 855                 860                 
          Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu 
                          885                 890                 895     
          Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr 
                      900                 905                 910         
          Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro 
                  915                 920                 925             
          Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln 
              930                 935                 940                 
          Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser 
          945                 950                 955                 960 
          Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu 
                          965                 970                 975     
          Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr 
                      980                 985                 990         
          Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn  Phe Gly Ala Ile Ser  Ser Val Leu 
                  995                 1000                 1005             
          Asn Asp  Ile Leu Ser Arg Leu  Asp Lys Val Glu Ala  Glu Val Gln 
              1010                 1015                 1020             
          Ile Asp  Arg Leu Ile Thr Gly  Arg Leu Gln Ser Leu  Gln Thr Tyr 
              1025                 1030                 1035             
          Val Thr  Gln Gln Leu Ile Arg  Ala Ala Glu Ile Arg  Ala Ser Ala 
              1040                 1045                 1050             
          Asn Leu  Ala Ala Thr Lys Met  Ser Glu Cys Val Leu  Gly Gln Ser 
              1055                 1060                 1065             
          Lys Arg  Val Asp Phe Cys Gly  Lys Gly Tyr His Leu  Met Ser Phe 
              1070                 1075                 1080             
          Pro Gln  Ser Ala Pro His Gly  Val Val Phe Leu His  Val Thr Tyr 
              1085                 1090                 1095             
          Val Pro  Ala Gln Glu Lys Asn  Phe Thr Thr Ala Pro  Ala Ile Cys 
              1100                 1105                 1110             
          His Asp  Gly Lys Ala His Phe  Pro Arg Glu Gly Val  Phe Val Ser 
              1115                 1120                 1125             
          Asn Gly  Thr His Trp Phe Val  Thr Gln Arg Asn Phe  Tyr Glu Pro 
              1130                 1135                 1140             
          Gln Ile  Ile Thr Thr Asp Asn  Thr Phe Val Ser Gly  Asn Cys Asp 
              1145                 1150                 1155             
          Val Val  Ile Gly Ile Val Asn  Asn Thr Val Tyr Asp  Pro Leu Gln 
              1160                 1165                 1170             
          Pro Glu  Leu Asp Ser Phe Lys  Glu Glu Leu Asp Lys  Tyr Phe Lys 
              1175                 1180                 1185             
          Asn His  Thr Ser Pro Asp Val  Asp Leu Gly Asp Ile  Ser Gly Ile 
              1190                 1195                 1200             
          Asn Ala  Ser Val Val Asn Ile  Gln Lys Glu Ile Asp  Arg Leu Asn 
              1205                 1210                 1215             
          Glu Val  Ala Lys Asn Leu Asn  Glu Ser Leu Ile Asp  Leu Gln Glu 
              1220                 1225                 1230             
          Leu Gly  Lys Tyr Glu Gln Tyr  Ile Lys Trp Pro Trp  Tyr Ile Trp 
              1235                 1240                 1245             
          Leu Gly  Phe Ile Ala Gly Leu  Ile Ala Ile Val Met  Val Thr Ile 
              1250                 1255                 1260             
          Met Leu  Cys Cys Met Thr Ser  Cys Cys Ser Cys Leu  Lys Gly Cys 
              1265                 1270                 1275             
          Cys Ser  Cys Gly Ser Cys Cys  Lys Phe Asp Glu Asp  Asp Ser Glu 
              1280                 1285                 1290             
          Pro Val  Leu Lys Gly Val Lys  Leu His Tyr Thr 
              1295                 1300
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014

Claims (81)

  1. 一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被腺病毒感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 從培養物中收穫腺病毒。
  2. 如請求項1所述之方法，其中步驟 (a) 包括以約0.01-1的MOI，較佳的是以約0.025-0.4的MOI，最較佳的是以約0.1的MOI，向該細胞群中添加腺病毒。
  3. 如請求項1或請求項2所述之方法，其中步驟 (a) 包括在用細胞群接種細胞培養基後約0-48小時，向該細胞群中添加腺病毒。
  4. 如請求項3所述之方法，其中步驟 (a) 包括在用細胞群接種細胞培養基後約24小時，向該細胞群中添加腺病毒。
  5. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法的特徵在於第一感染和第二感染，其中該第一感染提供了第一部分的腺病毒感染的細胞並且係藉由向細胞群中添加腺病毒誘導的，並且其中該第二感染提供了第二部分的腺病毒感染的細胞並且係藉由由第一部分的腺病毒感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒誘導的。
  6. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括將該細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許該細胞群被腺病毒感染。
  7. 如請求項6所述之方法，其中將該細胞群暴露於該第二溫度使培養物中的腺病毒之穩定性提高。
  8. 如請求項6或請求項7所述之方法，其中將該細胞群暴露於該第二溫度使培養物中的腺病毒顆粒:感染性顆粒比率降低。
  9. 如請求項6-8中任一項所述之方法，其中該第二溫度允許該細胞群的生長。
  10. 如請求項6-9中任一項所述之方法，其中該允許細胞群被腺病毒感染的條件包括在該第一溫度下培養該細胞群並且該允許腺病毒複製的條件包括在該第二溫度下培養該細胞群。
  11. 如請求項6-10中任一項所述之方法，其中該方法包括在向該細胞群中添加腺病毒後約48-96小時，將該細胞群所暴露的溫度從該第一溫度轉換到該第二溫度。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該方法包括在向該細胞群中添加腺病毒後約72小時，將該細胞群所暴露的溫度從該第一溫度轉換到該第二溫度。
  13. 如請求項6-12中任一項所述之方法，其中該第一溫度高於該第二溫度。
  14. 如請求項6-13中任一項所述之方法，其中該第一溫度係約31°C-40°C，較佳的是約35°C-38°C，最較佳的是約37°C。
  15. 如請求項6-14中任一項所述之方法，其中該第二溫度係約27-40，較佳的是約31°C-35°C，最較佳的是約33°C。
  16. 如請求項6-15中任一項所述之方法，其中該細胞群在該第一溫度下培養至少約72小時。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該細胞群在該第一溫度下培養至少約96小時。
  18. 如請求項6-17中任一項所述之方法，其中該細胞群在該第二溫度下培養至少約48小時。
  19. 如請求項6-18中任一項所述之方法，其中該細胞群在該第二溫度下培養直到從培養物中收穫腺病毒。
  20. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在具有至少約1 L、較佳的是至少約1.2 L、至少約3 L、約50 L、約1000 L、約2000 L、約3000 L、或約5000 L、最較佳的是至少約2000 L的容量之生物反應器中培養該細胞群。
  21. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法不包括在向該細胞群中添加腺病毒後，替換細胞培養基或向該細胞群中添加細胞培養基的步驟。
  22. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括向該細胞群中添加細胞培養添加劑。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該細胞培養添加劑包含DMSO、丁酸鈉和/或CaCl 2。
  24. 如請求項22或23所述之方法，其中在向該細胞群中添加細胞培養添加劑後，將該細胞群暴露於DMSO，較佳的是約0.5%或1% DMSO。
  25. 如請求項22-24中任一項所述之方法，其中在向該細胞群中添加細胞培養添加劑後，將該細胞群暴露於丁酸鈉，較佳的是約1 mM丁酸鈉。
  26. 如請求項22-25中任一項所述之方法，其中在向該細胞群中添加細胞培養添加劑後，將該細胞群暴露於CaCl 2，較佳的是約2 mM CaCl 2。
  27. 如請求項22-26中任一項所述之方法，其中該方法包括在步驟 (c) 期間，向該細胞群中添加該細胞培養添加劑。
  28. 如請求項22-27中任一項所述之方法，其中該方法包括向細胞群中添加腺病毒後約72-120小時，向該細胞群中添加該細胞培養添加劑。
  29. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括向該細胞群中添加補料。
  30. 如請求項29所述之方法，其中該方法包括在向該細胞群中添加腺病毒後約24-48小時，向該細胞群中添加該補料。
  31. 如請求項29-30中任一項所述之方法，其中該方法包括至少每48小時向該細胞群中添加該補料。
  32. 如請求項30或請求項31所述之方法，其中該方法包括以約5% v/v的最終濃度向該細胞群中添加該補料。
  33. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞群與向該細胞群中添加的腺病毒互補。
  34. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞群包含哺乳動物細胞。
  35. 如請求項34所述之方法，其中該哺乳動物細胞表現腺病毒複製因子。
  36. 如請求項34或請求項35所述之方法，其中該細胞群包含HEK細胞。
  37. 如請求項34-36中任一項所述之方法，其中該細胞群包含T-REx細胞。
  38. 如請求項34所述之方法，其中該細胞群由T-REx細胞組成。
  39. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該腺病毒係複製缺乏型腺病毒。
  40. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該腺病毒係猿猴腺病毒。
  41. 如請求項40所述之方法，其中該猿猴腺病毒係複製缺乏型猿猴腺病毒。
  42. 如請求項41所述之方法，其中該複製缺乏型猿猴腺病毒係ChAdOx1、ChAdOx2、ChAdOx3、或ChAd63，較佳的是其中該複製缺乏型猿猴腺病毒係ChAdOx1。
  43. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該腺病毒不是人腺病毒。
  44. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該腺病毒編碼nCov-19刺突蛋白。
  45. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在向該細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，進行從培養物中收穫腺病毒的步驟。
  46. 如請求項45所述之方法，其中在向該細胞群中添加腺病毒後約120小時，進行從培養物中收穫腺病毒的步驟。
  47. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該從培養物中收穫腺病毒的步驟包括裂解該細胞群的細胞和從該細胞群的細胞裂解物中收穫腺病毒。
  48. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該從培養物中收穫腺病毒的步驟包括從培養該細胞群的細胞培養基中收穫腺病毒。
  49. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在步驟 (a) 之前，該方法包括將細胞接種於細胞培養容器中。
  50. 如請求項49所述之方法，其中在步驟 (a) 之前，該方法包括以至少約0.5x10 6個細胞/mL、較佳的是至少約0.8x10 6個細胞/mL、最較佳的是至少約1.2x10 6個細胞/mL的初始細胞密度，將細胞接種於細胞培養容器中以提供培養的細胞群。
  51. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒。
  52. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在向該細胞群中添加腺病毒後約6-8天出現峰值病毒滴度。
  53. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該允許該細胞群被腺病毒感染的條件係允許細胞生長的條件。
  54. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該允許腺病毒複製的條件係允許細胞生長的條件。
  55. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該疫苗係COVID-19疫苗。
  56. 一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括在允許第二部分的細胞群被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞群被由該第一部分的腺病毒感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染。
  57. 如請求項56所述之方法，其中在允許第二部分的細胞群被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群之前，該方法包括在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群。
  58. 如請求項57所述之方法，其中在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群之前，該方法包括向培養的細胞群中添加腺病毒。
  59. 如請求項56-58中任一項所述之方法，該方法進一步包括在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群。
  60. 如請求項56-59中任一項所述之方法，該方法進一步包括從培養物中收穫腺病毒。
  61. 如請求項56-60中任一項所述之方法，其中該方法包括： (a) 向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群； (c) 在允許該細胞群中之第二部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞被由該第一部分的感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 從培養物中收穫腺病毒。
  62. 如請求項56-61中任一項所述之方法，其中該允許第一部分的細胞群被感染的條件係允許細胞生長的條件。
  63. 如請求項56-62中任一項所述之方法，其中該允許第二部分的細胞群被感染的條件係允許細胞生長的條件。
  64. 如請求項56-63中任一項所述之方法，其中該允許第一和第二部分的細胞群被感染的條件係相同的。
  65. 如請求項56-64中任一項所述之方法，其中該允許第一和第二部分的細胞群被感染的條件係不同的。
  66. 如請求項56-65中任一項所述之方法，該方法進一步包括在允許細胞群中之第三部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一和第二部分的感染的細胞之細胞群，其中該第三部分的細胞被由第一和/或第二部分的感染的細胞釋放的腺病毒感染。
  67. 一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒。
  68. 一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 在細胞培養容器中以至少0.5x10 6個細胞/mL的初始細胞密度接種細胞，以提供培養的細胞群； (b) 向該培養的細胞群中添加腺病毒； (c) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (e) 從培養物中收穫腺病毒。
  69. 一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被腺病毒感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 從培養物中收穫腺病毒。
  70. 一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI，向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (d) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144，從培養物中收穫腺病毒， 其中該方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
  71. 一種生產用於在疫苗中使用的腺病毒之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI，向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群； (c) 在允許該細胞群中之第二部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞被由該第一部分的感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (e) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒， 其中該方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
  72. 一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 從培養物中收穫腺病毒； (e) 純化該腺病毒；和 (f) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
  73. 一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 在允許第二部分的細胞群被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的腺病毒感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞群被由該第一部分的感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染； (b) 從培養物中收穫腺病毒； (c) 純化該腺病毒；和 (d) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
  74. 一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 向培養的細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒； (e) 純化該腺病毒；和 (f) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
  75. 一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 在細胞培養容器中以至少0.5x10 6個細胞/mL的初始細胞密度接種細胞，以提供培養的細胞群； (b) 向該培養的細胞群中添加腺病毒； (c) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (e) 從培養物中收穫腺病毒； (f) 純化該腺病毒；和 (g) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
  76. 一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被腺病毒感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 從培養物中收穫腺病毒； (e) 純化該腺病毒；和 (f) 製備包含純化的腺病毒之疫苗。
  77. 一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI，向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群被感染的條件下培養該細胞群以提供包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (c) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群； (d) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒； (e) 純化該腺病毒；和 (f) 製備包含純化的腺病毒之疫苗， 其中該方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
  78. 一種用於製備包含腺病毒的疫苗之方法，該方法包括： (a) 以不足以感染細胞群中所有細胞的MOI，向培養的具有至少約1x10 6個細胞/mL的活細胞密度之細胞群中添加腺病毒； (b) 在允許該細胞群中之第一部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養該細胞群； (c) 在允許該細胞群中之第二部分的細胞被腺病毒感染的條件下培養包含第一部分的感染的細胞之細胞群，其中該第二部分的細胞被由該第一部分的感染的細胞釋放到培養物中的腺病毒感染； (d) 在允許腺病毒複製的條件下培養包含腺病毒感染的細胞之細胞群；和 (e) 向細胞群中添加腺病毒後約96-144小時，從培養物中收穫腺病毒， (f) 純化該腺病毒；和 (g) 製備包含純化的腺病毒之疫苗， 其中該方法包括將細胞群所暴露的溫度從第一溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
  79. 一種用於在生產腺病毒期間提高腺病毒的產量之方法，該方法包括在腺病毒的存在下在第一溫度下對培養的細胞群進行培養和將該細胞群所暴露的溫度轉換到第二溫度，其中該第一溫度和第二溫度允許細胞群被腺病毒感染。
  80. 一種用於在疫苗中使用的腺病毒，其係藉由如請求項1-71中任一項所述之方法可獲得的。
  81. 一種包含腺病毒的疫苗，其係藉由如請求項72-79中任一項所述之方法可獲得的。
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