TWI633188B - 具改變末端之重組腺病毒群 - Google Patents
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Abstract
本發明提供包含複數個重組腺病毒粒子之組合物，該等重組腺病毒粒子係血清型5、26、34、35、48、49或50之重組人類腺病毒、或重組猿腺病毒，該組合物之特徵在於該組合物中之基本上所有腺病毒粒子之基因組皆包含核苷酸序列CTATCTAT作為5'末端核苷酸。本發明亦提供產生該等組合物之方法。
Description
本發明係關於醫學領域及應用於疫苗接種及基因療法中之基因遞送領域。更具體而言，本發明係關於重組腺病毒載體群。
重組人類及動物腺病毒廣泛用於其於基因療法及疫苗接種中之應用。腺病毒載體(vector)用作欲引入宿主細胞中之目標基因的載體(carrier)，例如用以表現編碼期望抗原之基因或其部分以引發免疫反應。
已鑑別出50種以上不同人類腺病毒血清型。其中，在歷史上已最廣泛地研究腺病毒血清型5(Ad5)以用作基因載體。最近，鑒於人類群體中抵抗該等血清型之預先存在之中和抗體的含量較低，已研究若干其他血清型(例如人類Ad11、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49及Ad50)及猿腺病毒作為載體(例如，參見WO 00/70071)。該等載體之有前景之實例係重組Ad35(rAd35)及rAd26，在臨床試驗中對其進行研究。
已詳細研究具有約34-38 kb之雙鏈DNA基因組的腺病毒之分子生物學。所有腺病毒之特徵均在於不同反轉末端重複(ITR)之大小為約100 bp(Dan等人，2001,Virus Genes 22：175-179；Liu等人，2003,Curr Top Microbiol Immunol 272：131-164)，其在不同組之血清型中保留(Shinagawa等人，1987,Gene 55：85-93)。基因組端在基因組之5'端
處共價附接至末端蛋白(TP)。ITR具有複製起點(Bernstein等人，1986,Mol Cell Biol 6：2115-2124；Challberg及Rawlins,1984,Proc Natl Acad Sci USA 81：100-104；Guggenheimer等人，1984,Proc Natl Acad Sci USA 81：3069-3073；Harris及Hay，1988,J Mol Biol 201：57-67；Hay,1985,EMBO J 4：421-426；van Bergen等人，1983,Nucleic Acids Res 11：1975-1989；Wang及Pearson，1985,Nucleic Acids Res 13：5173-5187)且對DNA複製至關重要，含有促進複製之細胞蛋白之結合位點並有利於狹長結構形成。ITR序列具有在核苷酸9-18範圍內之短的高度保留典型「核心區」(Liu等人，同上)。然而，此核心區之前之末端8個核苷酸在腺病毒類型與分離株之間變化(Alestrom等人，1982,Gene 18：193-197；Dan等人，同上；Jacobs等人，2004,J Gen Virol 85：3361-3366；Purkayastha等人，2005,J Clin Microbiol 43：3083-3094；Rademaker等人，2006,J Gen Virol 87：553-562；Shinagawa等人，1987，同上；Shinagawa等人，1983,Virology 125：491-495；Shinagawa及Padmanabhan，1980,Proc Natl Acad Sci USA 77：3831-3835；Tokunaga等人，1982,Gene 18：329-334；Houng等人，2006,J Clin Virol 35：381-387)。儘管大多數腺病毒在末端8個核苷酸中展示CATCATCA序列，但已闡述若干更替序列。
鑒於多種似乎適於使用該等基因轉移媒劑治療或預防之疾病以及大量人受該等疾病影響且世界範圍內人群不斷增長，對重組腺病毒之需求大幅提高。
對於意欲投與人類之臨床群而言，重組腺病毒(rAd)之大規模生產必須安全且有效，且符合優良製造規範(GMP)指南。此方面中重要之一個態樣係該等所產生rAd群之同源性。
現在本文中驚人地報導，在某些rAd之基因組5'端上的8個最末端鹼基之序列中發現變化，從而產生關於該等序列展示異源性之群。
因此，業內仍需要大規模提供rAd群，該等群展示改良之同源性。本發明提供該等群以及其獲得方法。另外，本發明之群中之rAd在生產過程中展示改良複製。
本發明提供包含複數個重組腺病毒粒子之組合物，其中重組腺病毒係血清型5、11a、26、34、35、48、49或50之重組人類腺病毒、或重組猿腺病毒，該組合物之特徵在於該組合物中之基本上所有腺病毒粒子之基因組皆包含核苷酸序列CTATCTAT作為5'末端核苷酸。
本發明進一步提供製備(較佳至少1×107個)重組腺病毒粒子群之方法，基本上所有該等重組腺病毒粒子在其基因組之5'末端中皆具有相同核苷酸序列，該方法包含：a)實施分子選殖步驟以將腺病毒基因組之天然5'末端更換為包含核苷酸序列CTATCTAT作為末端核苷酸之改變5'末端，b)在宿主細胞中使具有改變5'末端之重組腺病毒繁殖，及c)收穫重組腺病毒以獲得重組腺病毒粒子群，基本上所有該等重組腺病毒粒子皆包含核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之5'末端核苷酸。
本發明亦提供製備重組腺病毒粒子群之方法，基本上所有該等重組腺病毒粒子在其基因組之5'末端中皆具有相同核苷酸序列，該方法包含：a)純化腺病毒之噬菌斑純化，其中重組腺病毒係血清型5、11a、26、34、35、48、49或50之重組人類腺病毒、或重組猿腺病毒，以自單噬菌斑分離腺病毒或重組腺病毒，其中該腺病毒或重組腺病毒包含核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之5'末端核苷酸，b)在宿主細胞中使自步驟a)之單噬菌斑獲得之重組腺病毒繁殖，及c)收穫重組腺病毒以獲得重組腺病毒粒子群，基本上所有該等重組腺病毒粒子皆包含核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之5'末端核苷酸。
在某些實施例中，本發明組合物或方法中之重組腺病毒係重組
人類腺病毒，且較佳並非血清型3、4、7、8、9、11p、15、21、29、37或53之人類腺病毒。在某些實施例中，本發明組合物或方法中之重組腺病毒係血清型5、26、35、49或50之重組人類腺病毒。較佳地，重組腺病毒係血清型26或35之重組人類腺病毒。
在某些實施例中，重組腺病毒缺少E1區之至少一部分。
在某些實施例中，重組腺病毒包含轉基因。
在某些實施例中，組合物或重組腺病毒群包含至少1×107個、較佳至少1×108個、較佳至少1×109個、較佳至少1×1010個重組腺病毒粒子。
在某些實施例中，本發明方法之步驟b)係在較佳具有介於約2升與20000升之間之體積之生物反應器中實施。
在某些實施例中，本發明方法進一步包含純化重組腺病毒。
在本發明組合物或方法之某些實施例中，將重組腺病毒調配至醫藥組合物中。
圖1A至D. 更替ITR序列之出現。關於詳情，參見實例3。
圖2A至D. 具有更替及初始ITR序列之Ad35及Ad5載體之複製動力學。關於詳情，參見實例5。
本文中闡述，在最初含有其他末端序列之不同重組腺病毒的若干傳代後，驚人地發現具體5'末端序列(CTATCTAT)，且此序列之存在可促使改良之腺病毒產生。
本發明者藉由構築及/或包括用以獲得血清型重組腺病毒之主動選擇步驟將此驚人觀察轉化為實際使用，該等血清型重組腺病毒據報導在其野生型基因組中具有不同末端序列，其中基因組包含核苷酸序列CTATCTAT作為5'末端核苷酸。
因此，本發明係關於在重組腺病毒基因組之末端處之特定序列(CTATCTAT)及其用於產生重組腺病毒之用途。此末端序列可用於在其野生型基因組之5'末端處不含有此序列之任一腺病毒血清型中。
原則上，本發明之腺病毒組合物(群)可在其100% 5'末端基因組端處含有序列CTATCTAT(此乃因已根據本發明主動產生及/或選擇起始腺病毒)。鑒於可偶爾且隨機發生於任一生物系統中之一些天然突變，實際數目可能稍微低於100%，但在較佳實施例中，除CTATCTAT外之末端序列之量低於本發明腺病毒群中之檢測極限。因此，根據本發明，重組腺病毒粒子之組合物或群中之基本上所有腺病毒基因組皆包含核苷酸序列CTATCTAT作為5'末端序列。本文所用術語「基本上所有」係指至少90%、較佳至少98%、更佳至少99%、仍更佳至少99.9%、至多100%(組合物中之腺病毒粒子)。舉例而言，此可藉由諸如PCR等方法測定，該方法可在1000個粒子中容易地檢測1個粒子，且在本發明之重組腺病毒粒子之組合物中，未檢測到具有初始末端序列之腺病毒。
本發明之腺病毒「群」意指在單一生產容器中在一個生產過程中產生之組合物，或者其可指存於單一容器(例如，生物反應器、袋、燒瓶、瓶子、多劑量小瓶、單劑量小瓶、注射器等)中之組合物中的複數個腺病毒粒子。本發明之腺病毒群或本發明之包含腺病毒之組合物較佳包含至少107個重組腺病毒粒子，且在某些實施例中包含至少108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018個或更多個腺病毒粒子，至多1020個腺病毒粒子(例如，如在大規模生物反應器中在單一生產過程中產生)。群或組合物可包含或可不包含除重組腺病毒外之其他組份。
本文所用之針對腺病毒之術語「重組」暗指，其係由人工加以修飾，例如其具有於其中主動選殖之改變末端及/或其包含異源基
因，亦即，其並非天然野生型腺病毒。
如業內慣例，本文中之序列係自5'至3'方向提供。
「腺病毒衣殼蛋白」係指腺病毒之衣殼上參與測定特定腺病毒之血清型及/或向性的蛋白質。腺病毒衣殼蛋白通常包括纖維、五鄰體及/或六鄰體蛋白。屬於(或「基於」)本發明某一血清型之腺病毒通常包含該某一血清型之纖維、五鄰體及/或六鄰體蛋白，且較佳包含該某一血清型之纖維、五鄰體及六鄰體蛋白。該等蛋白質通常係由重組腺病毒之基因組編碼。某一血清型之重組腺病毒可視情況包含及/或編碼其他腺病毒血清型之其他蛋白質。
重組腺病毒係藉由至少在序列上衍生自野生型而「基於」如本文所用之腺病毒。此可藉由分子選殖使用野生型基因組或其部分作為起始材料來完成。亦可使用野生型腺病毒基因組之已知序列以藉由DNA合成重新生成基因組(之部分)，其可使用常規程序由從事於DNA合成及/或分子選殖領域之服務公司(例如GeneArt、GenScripts、Invitrogen、Eurofins)實施。因此，作為非限制性實例，並非基於人類Ad4之重組腺病毒係不包含人類Ad4之五鄰體、六鄰體及纖維之重組腺病毒；將包含Ad35之六鄰體、五鄰體及纖維之重組腺病毒視為基於Ad35之重組腺病毒等。
由於已對腺病毒血清型及其基因組構造實施廣泛研究，故熟習此項技術者瞭解腺病毒基因組中之ITR之界限。序列CTATCTAT在基因組之最遠末端處位於本發明重組腺病毒中。舉例而言，wt Ad5之左ITR之上鏈始於5'-CATCATCA...-3'且該序列根據本發明變為較佳序列5'-CTATCTAT...-3'。熟習此項技術者瞭解以下事實：在右ITR處，自5'至3'之此序列位於下鏈中。
可藉由不同方式將初始(親本)序列變為本發明之改變序列，該等方式本身為彼等熟習此項技術者已知且常用。實例係序列之直接PCR
生成或自經鑑別在末端處含有指定序列之初始腺病毒基因組亞選殖。
在藉由(例如)在質粒/黏粒同源重組程序中使用分子生物學技術改變一個末端之序列(例如，參見WO 99/55132)、同時另一末端仍未改變時，所得腺病毒將在產生及複製期間拷貝左或右ITR，從而產生腺病毒僅具有修改末端及腺病毒僅具有未修改末端之混合群體(如本文中所概述，若由於由此末端序列賦予之生長優勢而在活體外培養並繁殖，則其將朝向具有愈來愈多具有末端序列CTATCTAT之改變末端之群體演化)。較佳地，本發明重組腺病毒包含在左及右基因組末端處包含序列CTATCTAT之基因組。
因此，本發明重組腺病毒包含核苷酸序列CTATCTAT作為基因組之5'末端核苷酸。
本發明載體係重組腺病毒，亦稱作重組腺病毒載體。業內熟知重組腺病毒載體之製備。
在某些實施例中，本發明腺病毒載體缺乏病毒複製所需之腺病毒基因組之E1區(例如E1a區及/或E1b區)的至少一種基本基因功能。在某些實施例中，本發明腺病毒載體缺乏非基本E3區之至少一部分。在某些實施例中，載體缺乏E1區之至少一種基本基因功能及非基本E3區之至少一部分。腺病毒載體可為「多重缺乏」，意指腺病毒載體缺乏腺病毒基因組之兩個或更多個區中之每一者中之一或多種基本基因功能。舉例而言，上述E1缺乏或E1-、E3缺乏性腺病毒載體可進一步缺乏E4區之至少一種基本基因及/或E2區(例如，E2A區及/或E2B區)之至少一種基本基因。
腺病毒載體、其構築方法及其繁殖方法已為業內熟知且闡述於以下中：例如美國專利第5,559,099號、第5,837,511號、第5,846,782號、第5,851,806號、第5,994,106號、第5,994,128號、第5,965,541號、第5,981,225號、第6,040,174號、第6,020,191號及第6,113,913號
及Thomas Shenk,「Adenoviridae and their Replication」,M. S. Horwitz,「Adenoviruses」，分別第67及68章，Virology,B. N. Fields等人編輯，第3版，Raven Press有限公司，New York(1996)及其中提及之其他參考文獻。通常，腺病毒載體之構築涉及使用鏈分子生物技術，例如彼等闡述於以下中者：例如，Sambrook等人，Molecular Cloning,a Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Watson等人，Recombinant DNA，第2版，Scientific American Books(1992)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,NY(1995)以及其中提及之其他參考文獻。
本發明腺病毒屬於腺病毒科家族且較佳係屬於哺乳動物腺病毒屬者。其可為人類腺病毒，且亦可為感染其他物種之腺病毒，包括但不限於牛腺病毒(例如牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、豬腺病毒(例如PAdV3或5)或猿腺病毒(其包括猴腺病毒及類人猿腺病毒(例如黑猩猩腺病毒))。較佳地，腺病毒係人類腺病毒(HAdV或AdHu；在本發明中，若提及Ad而未指示物種，則意指人類腺病毒，例如簡單標號「Ad5」意指與HAdV5相同，其係人類腺病毒血清型5)或猿腺病毒(例如黑猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV))。
較佳地，本發明重組腺病毒係已報導野生型以在5'末端處具有不同序列(不同於CTATCTAT，例如經常出現之序列CATCATCA)之腺病毒。不同腺病毒血清型之所報導或推斷之5'末端8個核苷酸繪示於表I中。US 2009/227000報導在5'末端處具有CTATCTAT之Ad11p。已使用人類腺病毒實施最先進研究，且根據本發明之某些態樣，人類腺病毒較佳。在某些較佳實施例中，本發明重組腺病毒係基於人類腺病毒，且並非基於人類腺病毒血清型3、4、7、8、9、11p、15、21、29、37或53。在較佳實施例中，重組腺病毒係基於人類腺病毒血清型1、2、
5、6、10、11a、12、14、16、17、18、19、22、26、28、31、34、35、36、40、41、46、48、49、50、53、54、55、56或57。更佳地，重組腺病毒係基於人類腺病毒血清型5、11a、26、34、35、48、49或50。根據本發明之尤佳實施例，腺病毒係血清型26、35、48、49或50中之一者之人類腺病毒。該等血清型之優勢係在人類群體中低血清陽性率及/或低預先存在之中和抗體效價。重組腺病毒之最佳血清型係人類血清型35或人類血清型26，在臨床試驗中對二者進行評價。rAd26載體之製備闡述於(例如)WO 2007/104792及Abbink等人，(2007)Virol 81(9)：4654-63中。Ad26之例示性基因組序列參見GenBank Accession EF 153474及WO 2007/104792之SEQ ID NO：1。rAd35載體之製備闡述於(例如)美國專利第7,270,811號、WO 00/70071及Vogels等人，(2003)J Virol 77(15)：8263-71中。Ad35之例示性基因組序列參見GenBank Accession AC_000019及WO 00/70071之圖6。
猿腺病毒在人類群體中通常亦具有低血清陽性率及/或低預先存在之中和抗體效價，且已報導大量使用黑猩猩腺病毒載體之工作(例如US6083716；WO 2005/071093；WO 2010/086189；WO 2010085984；Farina等人，2001,J Virol 75：11603-13；Cohen等人，2002,J Gen Virol 83：151-55；Kobinger等人，2006,Virology 346：394-401；Tatsis等人，2007,Molecular Therapy 15：608-17；亦參見Bangari及Mittal,2006,Vaccine 24：849-62之綜述及Lasaro及Ertl,2009,Mol Ther 17：1333-39之綜述)。因此，在其他較佳實施例中，本發明重組腺病毒係基於猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些實施例中，重組腺病毒係基於猿腺病毒類型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或SA7P。
已知大多數上述人類及非人類腺病毒之序列，且對於其他序
列，可使用常規程序獲得。
本發明重組腺病毒可為可複製性或複製缺陷性病毒。
在某些實施例中，腺病毒係複製缺陷性病毒，此乃因(例如)其在基因組之E1區中含有缺失。如熟習此項技術者已知，在自腺病毒基因組缺失基本區之情形下，必須較佳由生產細胞反向提供由該等區編碼之功能，亦即，在自腺病毒缺失部分或整個E1、E2及/或E4區時，該等功能必須存於生產細胞中，例如在其基因組中整合或呈所謂輔助腺病毒或輔助質粒形式。腺病毒亦可具有E3區之缺失，其對於複製並非必需的，且因此，不必補償該缺失。
可使用之生產細胞(在業內及本文中有時亦稱作「包裝細胞」或「互補細胞」或「宿主細胞」)可為可繁殖期望腺病毒之任何生產細胞。舉例而言，重組腺病毒載體之繁殖係在補償腺病毒缺陷之生產細胞中完成。該等生產細胞較佳在其基因組中至少具有腺病毒E1序列，且藉此能夠補償具有E1區缺失之重組腺病毒。可使用任何E1補償生產細胞，例如由E1永生化之人類視網膜細胞，例如911或PER.C6細胞(參見美國專利5,994,128)、E1轉換羊水細胞(參見歐洲專利1230354)、E1轉換A549細胞(例如，參見WO 98/39411、美國專利5,891,690)、GH329：HeLa(Gao等人，2000，Human Gene Therapy 11：213-219)、293及諸如此類。在某些實施例中，生產細胞係(例如)HEK293細胞、或PER.C6細胞、或911細胞、或IT293SF細胞及諸如此類。
對於並非衍生自亞群C或E腺病毒之E1缺乏性腺病毒而言，較佳用亞群C腺病毒(例如Ad5)之E4-orf6更換編碼亞群C或E腺病毒之序列之E4-orf6。此允許該等腺病毒在表現Ad5之E1基因之熟知互補細胞系(例如293細胞或PER.C6細胞)中繁殖(例如，參見Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87：2135-2143；WO 03/104467，其全文以引用方式併入本文中)。
在替代實施例中，無需將(例如Ad5之)異源E4orf6區放置於腺病毒載體中，而是使E1缺乏性非亞群C或E載體在表現E1及相容E4orf6之細胞系(例如表現Ad5之E1及E4orf6之293-ORF6細胞系)中繁殖(例如，參見Brough等人，1996,J Virol 70：6497-501，其闡述293-ORF6細胞之生成；Abrahamsen等人，1997,J Virol 71：8946-51及Nan等人，2003,Gene Therapy 10：326-36，其各自闡述使用該細胞系之E1缺失非亞群C腺病毒載體之生成)。
或者，可使用表現來自欲繁殖之血清型之E1的互補細胞(例如，參見WO 00/70071、WO 02/40665)。
對於具有E1區缺失之亞群B腺病毒(例如Ad35)而言，較佳保留腺病毒中之E1B 55K開放讀碼框的3'端，例如在pIX開放讀碼框之正上游之166 bp或包含此之片段(例如在pIX起始密碼子(在5'端處由Ad35基因組中之Bsu36I限制位點標記)之正上游之243 bp片段)，此乃因此由於pIX基因之啟動子部分駐留於此區域中而增加腺病毒之穩定性(例如，參見Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87：2135-2143；WO 2004/001032，其以引用方式併入本文中)。
本發明腺病毒中之「異源核酸」(本文中亦稱作「轉基因」)係非天然存在於腺病毒中之核酸。藉由(例如)標準分子生物學技術將其引入腺病毒中。在某些實施例中，其可編碼目標蛋白或其部分。舉例而言，可將其選殖至腺病毒載體之缺失E1或E3區中。轉基因通常以可操作方式連接至表現控制序列。舉例而言，其作法為放置受啟動子控制下編碼轉基因之核酸可增加其他調節序列。許多啟動子可用於表現轉基因，且已為熟習此項技術者已知。可在真核細胞中獲得表現之合適啟動子之非限制性實例係CMV-啟動子(US 5,385,839)，例如CMV即刻早期啟動子，例如包含來自CMV即刻早期基因增強子/啟動子之nt.-735至+95。聚腺苷酸化信號(例如牛生長激素聚A信號)(US
5,122,458)可存於轉基因後方。
在某些實施例中，可能需要自單一腺病毒表現一種以上蛋白質，且在該等情形下可連接更多編碼序列，以自單一表現序列盒形成單一轉錄物，或可在從腺病毒基因組之不同部分中選殖之兩個分開之表現序列盒中存在更多編碼序列。
轉基因之身份對於本發明並不重要，本發明適於包含任一轉基因之腺病毒。適宜轉基因已為熟習此項技術者熟知，且可(例如)包括轉基因開放讀碼框，例如編碼具有治療效應之多肽之開放讀碼框，例如：供基因療法目的，或當以rAd載體用於疫苗接種目的時，則為編碼可針對其誘發所需免疫反應之多肽之開放讀碼框。尤佳異源核酸係編碼抗原決定簇之目標基因，可針對該等抗原決定簇產生所需之免疫反應。該等抗原決定簇亦通常稱作抗原。任一所需抗原皆可由腺病毒載體編碼。在本發明之典型實施例中，抗原係來自可引起疾病或病況之有機體之肽、多肽或蛋白。因此，在進一步較佳實施例中，該目標異源核酸可編碼免疫原性決定簇。更佳地，該免疫原性決定簇係來自細菌、病毒、酵母或寄生蟲之抗原。由該等有機體引起之疾病通常稱作「感染病」(且因此並不限於「感染」之有機體，且亦包括彼等進入宿主且引起疾病者)。所謂「自體抗原」(例如腫瘤抗原)亦構成先前技術之一部分，且可由本發明重組腺病毒中之異源核酸編碼。獲取抗原決定簇(或抗原)之非限制實例係引起瘧疾之有機體(例如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum))、引起分枝桿菌之有機體(例如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))、酵母或病毒。在其他較佳實施例中，來自病毒(例如黃病毒(例如，西尼羅河病毒(West Nile Virus)、C型肝炎病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒(Dengue Virus))、埃博拉病毒(ebola virus)、人類免疫缺陷病毒(HIV)及馬爾堡病毒(Marburg virus))之抗原可用於本發明組合物中。在一個實施例中，該抗原係來
自惡性瘧原蟲之CS蛋白或其免疫原性部分(例如編碼CS之腺病毒載體之CS蛋白或其免疫原性部分，例如，參見Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87：2135-2143；Ophorst等人，2007,Vaccine 25：1426-36；WO 2004/055187，其全部內容皆以引用方式併入本文中)。在另一實施例中，抗原決定簇係來自結核分枝桿菌之一種抗原之蛋白或若干抗原之融合蛋白(例如Ag85A、Ag85B及/或TB10.4蛋白或其免疫原性部分)(關於該等TB疫苗病毒之構築及產生，參見(例如)WO 2006/053871，其以引用方式併入本文中)。在又一實施例中，該抗原決定簇係病毒糖蛋白或其免疫原性部分(例如來自纖絲病毒(例如埃博拉病毒或馬爾堡病毒)之GP)(例如Sullivan等人，(2003)Nature 424(6949)：681-684；Sullivan等人，(2006)PLoS Med 3(6)：e177；Geisbert等人，(2011)J Virol 85：4222-4233)。在又一些實施例中，該免疫原性決定簇係來自HIV蛋白(例如gag、pol、env、nef或其變體)(例如腺病毒基HIV疫苗之蛋白，例如，參見WO 2009/026183、WO 2010/096561、WO 2006/120034、WO 02/22080、WO 01/02607)。在其他實施例中，該抗原決定簇係來自流感病毒之HA、NA、M或NP蛋白或該等中任一者之免疫原性部分(例如Zhou等人，2010,Mol Ther 18：2182-9；Hu等人，2011,Virus Res 155：156-62；由Vemula及Mittal，2010,Expert Opin Biol Ther 10：1469-87綜述)。在其他實施例中，抗原決定簇係來自麻疹病毒之HA蛋白或其免疫原性部分(例如WO 2004/037294)。在其他實施例中，抗原決定簇係狂犬病病毒糖蛋白(例如Zhou等人，2006,Mol Ther 14：662-672)。
本發明亦提供製備重組腺病毒粒子群之方法，基本上所有該等重組腺病毒粒子在其基因組之5'末端中皆具有相同核苷酸序列，該方法包含：a)實施分子選殖步驟以將腺病毒基因組之天然5'末端更換為包含核苷酸序列CTATCTAT作為末端核苷酸之改變5'末端，b)在宿主
細胞中使具有改變5'末端之重組腺病毒繁殖，及c)收穫重組腺病毒以獲得重組腺病毒粒子群，基本上所有該等重組腺病毒粒子皆包含核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之5'末端核苷酸。在此較佳態樣中，藉由分子選殖技術主動改變基因組之5'末端，該等技術因此為彼等熟習分子生物學技術者熟知且常用。本文中此有利的CTATCTAT末端序列之鑑別使得此主動步驟成為可能。此步驟係有利的，只要任何具有不同5'末端序列(亦即，並非CTATCTAT)之腺病毒用作生成本發明重組腺病毒之(群或組合物)(例如如本文所指示之本發明較佳血清型)之起始材料或基礎。優勢係自開篇控制並確定，期望CTATCTAT序列存於步驟b)之種子腺病毒之所有基因組中，且鑒於如本文所報導之此序列之穩定性，步驟c)中所得之腺病毒群將包含基本上所有皆具有相同期望5'末端序列之腺病毒粒子。
然而，作為分子選殖路徑之替代方式，現亦可使用天然誘導之變化形式且選擇在其末端處具有改變序列CTATCTAT之腺病毒，以獲得具有穩定5'末端之必需起始材料，用以以任一期望規模繁殖成腺病毒群。因此，作為替代實施例，本發明亦提供製備重組腺病毒粒子群之方法，基本上所有該等重組腺病毒粒子在其基因組之5'末端中皆具有相同核苷酸序列，該方法包含：a)對腺病毒(並非人類腺病毒血清型3、4、7、8、9、11p、15、21、29、37或53或其重組形式)實施噬菌斑純化，以自單噬菌斑分離腺病毒或重組腺病毒，其中該腺病毒或重組腺病毒包含核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之5'末端核苷酸，b)在宿主細胞中使自步驟a)之單噬菌斑獲得之重組腺病毒繁殖，及c)收穫重組腺病毒以獲得重組腺病毒粒子群，基本上所有該等重組腺病毒粒子皆包含核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之5'末端核苷酸。此處，主動步驟係製備(重組)腺病毒之單噬菌斑及測試/確認其基因組在其5'末端處包含期望序列CTATCTAT。熟練人員將瞭
解，此實施例之步驟a)可利用已經重組之腺病毒或利用仍野生型腺病毒分離株實施，其中在後一情形下，在步驟b)之前，實施用以獲得重組腺病毒(例如藉由選殖，以在基因組中引入轉基因)的步驟。可使用腺病毒操作領域中之熟練人員的完全常規程序實施用以確保用於進一步工作之起始材料係同源的且衍生自單一分離株的噬菌斑純化步驟。之前尚未闡述包含核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之5'末端核苷酸的(重組)腺病毒之主動選擇，且在本發明之前，此也不具有任何意義。相反，在本發明之前，此序列之鑑別會視為異常情況且該噬菌斑會因具有遺傳改變而被棄去。本發明之優點係選擇該(重組)腺病毒作為起始材料以確保遺傳穩定性，從而產生在其基因組中基本上所有皆包含相同期望5'末端核苷酸之重組腺病毒群。本發明重組腺病毒潛在地具有改良之複製特性。
本發明方法之宿主細胞可為包裝細胞，其可補償重組腺病毒基因組之缺陷(例如E1)。本發明方法之步驟b)及c)係熟習此項技術者熟知之重組腺病毒群之製備中之標準常規步驟。
在某些實施例中，該等方法之步驟b)係在可具有介於約1升至約20000升之間之體積之生物反應器中實施。此使得能夠獲得足夠量之期望腺病毒組合物以工業規模使用。如本發明中所用針對數值之術語「約」意指該值±10%。在某些實施例中，工作體積介於10 L與10000 L之間，例如介於20 L與2000 L之間。工作體積係生物反應器中之有效培養物體積。生物反應器之體積可由熟習此項技術者端視實際需求來選擇。本發明確保最終產物針對如此產生之群中之基本上所有腺病毒粒子將具有相同末端，亦即，在遺傳上同源，此為醫藥產品所期望。
大多數大規模懸浮培養物係以間歇或進料間歇過程操作，此乃因其對於操作及放大最簡單直接。現在，基於灌注原則之連續過程變
得更常見且亦適宜(例如，參見WO 2010/060719及WO 2011/098592，二者皆以引用方式併入本文中，其闡述適於獲得並純化大量重組腺病毒之方法)。
生產細胞經培養以增加細胞及病毒數目及/或病毒效價。培養細胞以使得其能夠使本發明之目標病毒代謝、及/或生長及/或分裂及/或產生。此可藉由如熟習此項技術者熟知之方法完成，且包括(但不限於)(例如)在適當培養基中為細胞提供營養物。適宜培養基已為熟習此項技術者所熟知且通常可自商業來源大量獲得或根據標準方案常規製得。培養可在(例如)盤、輥瓶或生物反應器中使用間歇、進料間歇、連續系統及諸如此類完成。已知適於培養細胞之條件(例如，參見Tissue Culture、Academic Press、Kruse及Paterson編輯，(1973)，及R.I. Freshney,Culture of animal cells：A manual of basic technique，第4版(Wiley-Liss公司，2000,ISBN 0-471-34889-9)。
腺病毒通常將暴露於培養物中之適當生產細胞，從而容許病毒攝取。最佳攪動通常介於約50 rpm與300 rpm之間，通常約100 rpm至200 rpm，例如約150 rpm；典型DO係20%至60%，例如40%；最佳pH介於6.7與7.7之間；最佳溫度介於30℃與39℃之間，例如34℃至37℃；且最佳MOI介於5與1000之間，例如約50至300。腺病毒通常自發感染生產細胞，且使生產細胞與rAd粒子接觸即足以感染細胞。通常向培養物中添加腺病毒種子儲液以起始感染，且隨後腺病毒在生產細胞中繁殖。此對於熟習此項技術者均係常見的。本發明之該腺病毒種子儲液包含重組腺病毒粒子，其中該種子儲液中之基本上所有腺病毒粒子之基因組皆包含序列CTATCTAT作為5'末端核苷酸。
在腺病毒感染後，病毒在細胞內複製且藉此擴增，即一種在本文中稱作腺病毒之繁殖之過程。腺病毒感染最後引起受感染之細胞裂解。因此，腺病毒之裂解特性容許兩種不同模式之病毒產生。第一模
式係在細胞裂解之前利用外部因素使細胞裂解來收穫病毒。第二模式係在由所產生病毒(幾乎)完全細胞裂解後收穫病毒上清液(例如，參見美國專利6,485,958，其闡述在宿主細胞未由外部因素裂解情況下腺病毒之收穫)。較佳利用外部因素使細胞主動裂解用以收穫腺病毒。
可用於活性細胞裂解之方法已為熟習此項技術者已知，且已(例如)論述於WO 98/22588第28-35頁中。就此而言有用之方法係(例如)冷凍-解凍、固體剪切、高滲及/或低滲裂解、液體剪切、超音波處理、高壓擠出、洗滌劑裂解、上述之組合及諸如此類。在本發明之一個實施例中，使用至少一種洗滌劑使細胞裂解。使用洗滌劑進行裂解之優勢在於其係容易之方法，且易於縮放。
可使用之洗滌劑及其利用方式通常為熟習此項技術者已知。若干實例論述於(例如)WO 98/22588第29-33頁中。洗滌劑可包括陰離子型、陽離子型、兩性離子型及非離子型洗滌劑。洗滌劑之濃度可在(例如)約0.1%-5%(w/w)範圍內變化。在一個實施例中，所用洗滌劑係Triton X-100。
可利用核酸酶來移除雜質(即大部分來自生產細胞)核酸。適用於本發明中之例示性核酸酶包括Benzonase®、Pulmozyme®或業內常用之任何其他DNase及/或RNase。在較佳實施例中，核酸酶係Benzonase®，其藉由水解特定核苷酸之間之內部磷酸二酯鍵快速水解核酸，藉此降低細胞裂解物之黏度。Benzonase®可自Merck KGaA(編碼W214950)商業獲得。所利用核酸酶之濃度較佳在1-100單位/ml範圍內。或者或除核酸酶處理外，亦可在腺病毒純化期間使用選擇性沈澱試劑(例如溴化度米芬(domiphen bromide))自腺病毒製劑選擇性沈澱出宿主細胞DNA(例如，參見US 7,326,555；Goerke等人，2005,Biotechnology and bioengineering，第91卷：12-21；WO 2011/045378；WO 2011/045381)。
自生產細胞之培養物收穫腺病毒之方法已詳盡闡述於WO 2005/080556中。
在某些實施例中，進一步純化所收穫腺病毒。腺病毒之純化可以若干步驟實施，該等步驟包含澄清、超濾、透析或利用層析分離，如(例如)以引用方式併入本文中之WO 05/080556中所述。澄清可藉由過濾步驟完成，從而自細胞裂解物移除細胞碎屑及其他雜質。使用超濾濃縮病毒溶液。使用超濾機之透析或緩衝液更換係移除及更換鹽、糖及諸如此類之方式。熟習此項技術者知曉如何發現每一純化步驟之最佳條件。全文以引用方式併入本文中之WO 98/22588亦闡述產生並純化腺病毒載體之方法。該等方法包含使宿主細胞生長、用腺病毒感染宿主細胞、收穫宿主細胞並使其裂解、濃縮粗製裂解物、更換粗製裂解物之緩衝液、用核酸酶處理裂解物及使用層析進一步純化病毒。
較佳地，純化利用至少一個層析步驟，如(例如)WO 98/22588第61-70頁中所論述。已針對腺病毒之進一步純化闡述許多方法，其中層析步驟包括於該方法中。熟習此項技術者應瞭解該等方法，且可改變利用層析步驟以使方法最佳化之精確方式。舉例而言，可藉由陰離子交換層析步驟純化腺病毒，例如參見WO 2005/080556。已闡述許多其他腺病毒純化方法且其在熟練人員之能力範圍內。用於產生及純化腺病毒之其他方法揭示於(例如)WO 00/32754、WO 04/020971、US 5,837,520、US 6,261,823及WO 2006/108707中，其均以引用方式併入本文中。
對於投與人類而言，本發明可利用包含rAd及醫藥上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。在本發明上下文中，術語「醫藥上可接受的」意指所用劑量及濃度下之載劑或賦形劑將不會在投與其之個體中引起任何不期望或有害效應。該等醫藥上可接受之載劑及賦形劑已為業內所熟知(參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A. R.
Gennaro編輯，Mack Publishing公司[1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,S. Frokjaer及L. Hovgaard編輯，Taylor & Francis[2000]；及Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A. Kibbe編輯，Pharmaceutical Press[2000])。純化rAd較佳以無菌溶液形式調配及投與，但亦可採用凍乾製劑。藉由無菌過濾或業內本身已知之其他方法製備無菌溶液。隨後將溶液凍乾或填充至醫藥劑型容器中。溶液之pH通常在pH 3.0至9.5(例如pH 5.0至7.5)範圍內。rAd通常存於具有適宜緩衝液之溶液中，且rAd溶液亦可含有鹽。視情況可存在穩定劑，例如白蛋白。在某些實施例中，添加洗滌劑。在某些實施例中，可將rAd調配成可注射製劑。該等調配物含有有效量之rAd，係無菌液體溶液、液體懸浮液或凍乾形式且視情況含有穩定劑或賦形劑。亦可將腺病毒疫苗氣溶膠化用於鼻內投與(例如，參見WO 2009/117134)。
舉例而言，腺病毒可儲存於亦用於腺病毒世界標準(Adenovirus World Standard)之緩衝液中(Hoganson等人，Development of a stable adenoviral vector formulation,Bioprocessing，2002年3月，第43-48頁)：20 mM Tris pH 8、25 mM NaCl、2.5%甘油。適於投與人類之另一有用之調配緩衝液係20 mM Tris、2 mM MgCl2、25 mM NaCl、10% w/v蔗糖、0.02% w/v聚山梨醇酯-80。顯而易見，可使用許多其他緩衝液，且適於純化(腺)病毒製劑之儲存及醫藥投與之調配物之若干實例可(例如)參見歐洲專利第0853660號、美國專利6,225,289及國際專利申請案WO 99/41416、WO 99/12568、WO 00/29024、WO 01/66137、WO 03/049763、WO 03/078592、WO 03/061708。
在某些實施例中，包含腺病毒之組合物進一步包含一或多種佐劑。業內已知佐劑可進一步增加對所施加抗原決定簇之免疫反應，且包含腺病毒及適宜佐劑之醫藥組合物揭示於(例如)WO 2007/110409
中，其以引用方式併入本文中。術語「佐劑」及「免疫刺激劑」在本文中可互換使用，且定義為一或多種引起免疫系統刺激之物質。在此上下文中，佐劑用於增強對本發明腺病毒載體之免疫反應。適宜佐劑之實例包括鋁鹽，例如氫氧化鋁及/或磷酸鋁；油-乳液組合物(或水包油組合物)，包括角鯊烯-水乳液，例如MF59(例如，參見WO 90/14837)；皂苷調配物，例如QS21及免疫刺激複合物(ISCOMS)(例如，參見US 5,057,540、WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；細菌或微生物衍生物，其實例係單磷醯脂質A(MPL)、3-O-去醯基化MPL(3dMPL)、含有CpG基因之寡核苷酸、ADP核糖基化細菌毒素或其突變體，例如大腸桿菌熱不穩定腸毒素LT、霍亂毒素CT及諸如此類。亦可藉由(例如)使用編碼C4結合蛋白(C4bp)之寡聚結構域至目標抗原之融合的異源核酸使用編碼載體之佐劑(例如Solabomi等人，2008,Infect Immun 76：3817-23)。在某些實施例中，本發明組合物包含鋁作為佐劑，例如呈氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鋁鉀或其組合形式，濃度為0.05 mg至5 mg(例如0.075 mg至1.0 mg)鋁含量/劑量。
在其他實施例中，組合物不包含佐劑。
腺病毒組合物可投與個體(例如人類個體)。一次投與期間提供至個體之腺病毒之總劑量可如熟習此項技術者已知變化，且通常介於1×107個病毒粒子(vp)與1×1012個vp之間，較佳介於1×108個vp與1×1011個vp之間，例如介於3×108個vp與5×1010個vp之間，例如介於109個vp與3×1010個vp之間。
可使用標準投與路徑實施腺病毒組合物之投與。非限制實施例包括非經腸投與(例如藉由注射，例如皮內、肌內等)，或皮下或經皮，或黏膜投與(例如鼻內、經口及諸如此類)。在一個實施例中，藉由(例如)肌內注射將組合物投與至臂三角肌或股外側肌中。熟習此項
技術者知曉投與組合物(例如疫苗)以誘導疫苗中對抗原之免疫反應的各種可能性。
本文所用個體較佳係哺乳動物，例如齧齒類動物(例如小鼠)、或非人類靈長類或人類。較佳地，個體係人類個體。
亦可提供一或多種腺病毒疫苗之一或多次加強投與。若實施加強疫苗接種，則該免疫疫苗接種通常將在首次投與個體組合物(在該等情形下稱作「引發疫苗接種」)後介於1週與1年之間、較佳介於2週與4個月之間之時間點投與同一個體。在替代加強方案中，亦可向個體投與不同載體(例如一或多種不同血清型腺病毒)、或其他載體(例如MVA或DNA)或蛋白質作為引發或加強疫苗接種。
在以下實例中進一步解釋本發明。該等實例並不以任何方式限制本發明。其僅用於澄清本發明。
對於Ad35及Ad5而言，分別藉由選殖至pAdapt中將更替ITR序列引入左ITR中且藉由選殖至pBr質粒中引入右ITR中(例如，參見Havenga M.等人，2006,J.Gen.Virol.87：2135-2143；Havenga M.等人，2001,J.Virol.75：3335-3342)。為將更替ITR序列引入左ITR中，使用含有ScaI位點(GTGACTGGTGAGTACTC[SEQ ID NO：1])之正向引物、含有AvrII位點(GACCACCTAGGCTGAC[SEQ ID NO：2])之反向引物及具有更替ITR序列(對於1之alt ITR：TTAATTAATCGAT CTATCTATAT AATATACCTTATAG[SEQ ID NO：3]，對於2之alt ITR：GAT CTATCTATAT AATATACCTTATAGATGGAATGG[SEQ ID NO：4]，alt ITR反向：ATT ATATAGATAG ATCGATTAATTAATTCGAACCC
[SEQ ID NO：5])之融合正向及反向引物實施融合PCR。兩個部分重疊ITR正向引物在PCR中用於融合PCR片段之一以增加對模板中極端AT富區之PCR效率。首先將融合PCR產物亞選殖至pTopo載體中以有利於亞選殖且隨後經由具有指示轉基因之AvrII及ScaI位點插入pAdapt35質粒中。
為將更替ITR序列引入右ITR中，使用含有NdeI位點之正向引物及含有NruI位點之反向引物及具有更替ITR序列之融合正向及反向引物使用如針對左ITR所述之相同融合PCR策略實施融合PCR。隨後使用NdeI及NruI將融合PCR產物亞選殖至pTopo中且隨後亞選殖至pBR.Ad35.PR.dE3 orf6/7質粒中。
為生成具有更替ITR之Ad5載體，使用如上文所述之相同策略。
將PER.C6細胞(Fallaux等人，1998)維持於具有補充有10 mM MgCl2之10%胎牛血清(FBS)的杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM)中。A549、HEK293、Hep2、HeLa及MRC5細胞係自ATCC獲得且將其維持於具有10% FBS之DMEM中。
若無另外說明，則所有病毒均係在PER.C6中藉由單一或雙重同源重組生成且如先前所述產生(Havenga等人，2006)。簡言之，在PER.C6中使用Lipofectamine根據由製造商提供之說明書(Life Technologies)轉染質粒。在全CPE後一天收穫細胞，冷凍-解凍，以3,000 rpm離心5 min，且儲存於-20℃下。使用3 ml至5 ml粗製裂解物以接種含有PER.C6細胞之70%鋪滿層的4×T175三層燒瓶。使用兩步驟CsCl純化方法純化病毒。最後，於-85℃下以等份儲存病毒。
為研究自初始ITR序列至更替ITR序列之轉換，在噬菌斑純化後使用粗製病毒材料使不同病毒連續傳代或如上文所述純化病毒群。為
此，用各別病毒載體感染細胞。全CPE後一天，收穫並冷凍細胞及上清液。藉由解凍自細胞釋放病毒粒子並使用此粗製病毒材料感染新細胞。
如下實施ITR特異性PCR之DNA分離。藉由重複冷凍-解凍循環自粗製病毒材料釋放病毒粒子。其後，藉由DNAse I處理移除宿主細胞DNA。藉由與10% SDS一起培育破壞病毒粒子且用蛋白酶K處理。隨後使用GeneClean Spin Kit(MP Biochemicals)純化病毒DNA並用於PCR分析。
使用粗製裂解物以分離DNA用以ITR序列分析。出於此目的，藉由自20 ml粗製細胞裂解物PEG分離來分離DNA，藉由連續冷凍-解凍循環裂解並用DNAse I(0.01 mg/ml Roche)及Rnase T1(10 U/ml Roche)處理，之後NaCl滅活(1M)。將病毒粒子使用10% PEG 6000(BDH iochemical)在冰上沈澱1 h，之後以9000 xg進行離心步驟且重新懸浮於1 ml SM緩衝液(0.1M NaCl、8 mM MgSO4、50 mM Tris HCl pH 7.5、0.002%明膠)中使用10% SDS破壞病毒衣殼蛋白並進行蛋白酶K處理並藉由苯酚-氯仿沈澱萃取DNA。藉由EcoRI(Ad26)、SphI(Ad48、Ad5)、AgeI(Ad49、Ad11)、NheI(Ad50)消解全長DNA且最後藉由Baseclear、Leiden測序。
由於ITR區係富含AT，故使用鎖定核酸(LNA)引物確保足夠引物結合至模板。引物係購自Eurogentech。使用以下引物。小寫字母指示LNA核苷酸。ori.ITR：CatcaTcaATAATATACC[SEQ ID NO：6]，Ad35alt ITR：CtatcTatATAATATACC[SEQ ID NO：7]，Ad35左ITR反向：CTAAGTAGTTCCGTGAGAAAAG[SEQ ID NO：8]。Ad35右ITR正向：GGTACGTCACATCCCATTAA[SEQ ID NO：9]，Ad5左ITR反向：
CACTTTTGCCACATCCGTC[SEQ ID NO：10]，Ad5右ITR：CCCACGTTACGTCACTTC[SEQ ID NO：11]。在瓊脂糖凝膠上分析PCR產物。
藉由使用1000個VP/細胞感染293及PER.C6細胞3小時來分析複製動力學且隨後洗滌。在藉由VP qPCR感染後之指定時間點分析病毒粒子於細胞及上清液中之存在。為此，使用0.5% Triton X-100(Sigma)使感染細胞裂解，於-80度下培育1小時並解凍。
使用基因表現主混合物(Applied Biosystems)根據製造商之推薦實施對存於所有所用腺病毒載體中之CMV啟動子具有特異性之qPCR。引物/探針組合序列：CMV：TGGGCGGTAGGCGTGTA[SEQ ID NO：12]，CMV反向：CGATCTGACGGTTCACTAAACG[SEQ ID NO：13]，探針5'-VIC-TGGGAGGTCTATATAAGC-MGB-NFQ-3'[SEQ ID NO：14]，購自Applied Biosystems。為測定個別試樣中之病毒粒子之量，生成標準曲線。
腺病毒ITR序列係自BLAST search獲得。使用CLC軟體產生對準。對準係基於已公開序列。然而，對於一些已公開序列而言，尚未對ITR進行特異性測序。相反，假定亞型間保留，此可能導致保留CATCATCA序列比例過高。若公開一種腺病毒血清型之若干序列，若其在末端8個核苷酸中彼此不同，則僅包括該等序列。
對於如前文所述表現結核分枝桿菌抗原Ag85A、Ag85B及TB10.4抗原之Ad35疫苗載體的生成(WO 2006/053871；(Radosevic等人，2007,Infect.Immun.75：4105-4115)，用線性化質粒轉染PER.C6細胞，從而產生能夠在PER.C6細胞中複製之Ad35.TBS病毒。
在產生之前，兩次連續噬菌斑純化確保自單一遺傳上穩定之純系之病毒種子衍生。在生產過程之不同階段藉由一致PCR及西方墨點法表徵所得病毒且在作為種子病毒用於大規模生產之前對其進行完全測序。
基因組序列係穩定的且因此與由挽救質粒編碼之基因組相同，左及右ITR處之末端8個核苷酸除外。質粒編碼序列CATCATCA(下文中命名為初始ITR序列)轉換成序列CTATCTAT(稱作更替ITR序列)，從而導致與質粒序列相比6個核苷酸發生變化。此發現係驚人的，此乃因認為腺病毒基因組高度穩定，藉此促使其適用作疫苗載體。
為進一步研究末端ITR序列中之不一致性，在疫苗載體產生期間之不同步驟時對ITR進行測序：此分析揭示在噬菌斑純化後5個傳代(VPN 5)時，仍存在初始ITR序列。然而，亦檢測具有亞峰之序列，指示不同生產過程之5個傳代次數時的混合序列。除末端8個核苷酸內之亞峰外，剩餘序列皆不展示任何不一致性。在VPN 6時，序列混合，可能包含大約相同比例之初始及更替序列且在在VPN 7時轉化成相異更替序列。
為論述所觀察現象是否係可忽略事件且檢驗自初始CATCATCA轉換成更替CTATCTAT ITR序列之頻率，分析源自相同病毒挽救之四種噬菌斑。自所有噬菌斑繁殖之病毒在重複傳代後轉換成更替ITR序列。
此外，在表現不同轉基因且獨立於pIX啟動子之部分缺失之Ad35載體的傳代期間觀察更替ITR(表II)。
此外，不僅針對基於Ad35之載體、且亦針對Ad35野生型病毒(不包括載體假像)觀察混合序列。
為論述轉換成更替ITR序列在若干病毒傳代中是否穩定，構築具有初始或更替ITR序列之Ad35.TBS(稱作Ad35.TBS.ori ITR及Ad35.TBS.alt ITR)。該等病毒在PER.C6細胞中經受傳代且藉由每一病毒傳代次數之PCR分析監測8個末端ITR核苷酸之序列。為區分初始序列與更替序列，利用使初始或更替ITR序列特異性擴增之不同PCR引物組。每一病毒傳代之分析鑑別在VPN 3與VPN6之間初始序列減少且在Ad35.TBS.ori ITR傳代VPN6時出現更替序列(圖1A)。在4次傳代中保留更替序列(圖1A)。在人工產生之Ad35.TBS.alt傳代期間，在10個病毒傳代中僅更替PCR序列可檢測到(圖1B)，不包括恢復至初始序列或在基因組之此部分中之一般不穩定。
此外，具有原本相同之更替或初始ITR序列之Ad35載體混合亦導致更替ITR序列過度生長，指示更替ITR序列相對於初始ITR序列具有生長優勢。
由於檢測在Ad35(B組載體)中自初始ITR序列至更替ITR序列轉換，另外分析Ad5.空白.ori ITR及Ad35.空白.alt ITR，即具有初始或更替ITR序列之C組載體。與利用Ad35載體之結果相反，Ad5不會在ITR序列中展示轉換，但在10次病毒傳代中保留初始ITR(圖1C)(然而，參見以下實例8，顯示在進一步傳代時亦在Ad5中發現更替序列)。此外，具有更替ITR之人工生成之Ad5在10次病毒傳代中穩定且不會恢復至初始ITR序列(圖1D)。
由於觀察到具有更替ITR之病毒基因組過度生長，故推斷具有更替ITR之病毒應比彼等具有初始ITR者將對Ad35具有更高複製優勢。為測試此點，使用具有初始或更替ITR序列之Ad35病毒且分析其生長動力學。由於由腺病毒感染E1-互補細胞系所誘導之CPE係複製速度
之良好指標，故首先感染293細胞，並在以100個VP/細胞及1000個VP/細胞之MOI感染後24 h、48 h、72 h及96 h(hpi)時觀察細胞病變效應。感染後24 h時，100個VP/細胞及1000個VP/細胞均未觀察到CPE。然而，在48 hpi時，針對Ad35.dE1.alt ITR以100個VP/細胞及1000個VPP/細胞觀察到前期CPE，從而在96 hpi時發展成全CPE。反之，在感染後該等時間點Ad35.dE1.ori ITR僅觀察到有限CPE。
為了定量複製動力學之可能差異時，採用qPCR分析法量測感染後不同時間點之基因組複製。更特定而言，以1000個VP/細胞感染293細胞，使其裂解並使用檢測存於病毒載體中之CMV啟動子之TaqMan分析法進行qPCR分析。如圖2中所示，儘管Ad35.ori ITR及Ad35.alt ITR在最後一次量測時間點(90 hpi)時均生長至約1010個VP/ml之相同效價，但Ad35.ori ITR仍顯示延遲生長。在感染後早期時間點，Ad35.alt ITR顯示比Ad35.ori ITR陡峭之基因組擴增曲線，從而達成平穩期(圖2A)。反之，具有更替或初始ITR之病毒的Ad5之複製動力學則無差異(圖2B)。
在PER.C6細胞上確證針對Ad35.alt ITR而非針對Ad5.alt ITR觀察到之此基因組複製優勢(圖2 C-D)，最初在該等細胞上觀察到更替基因組形式過度生長。
分析該更替ITR序列是否已出現在公開腺病毒序列中。此外，由已公開之人類及非人類ITR之核苷酸1-8進行對準排列。人類病毒主要具有初始CATCATCA序列且因此分類為「保留人類序列」(表I)。
另外，1至6個核苷酸與CATCATCA不同之序列經鑑別且稱作「可變人類腺病毒序列」。「可變序列」中之主要序列係亦藉由使Ad35衍生之載體傳代鑑別之更替序列CTATCTAT。非人類序列之對準
(表I)顯示CATCATCA係最常見序列。再次發現更替序列，例如先前鑑別之發現於家禽腺病毒中之更替序列GATGATGT。大多數已公開ITR序列與de Jong(de Jong等人，2003,Curr Top Microbiol Immunol 272：187-211；King及van der Vliet,1994,EMBO J 13：5786-5792)之複製模型一致，具有在複製起始期間跳回機制所需要之小的兩個、三個或四個核苷酸同向重複。
應注意，表I顯示可不為天然ITR序列之平衡表示的已公開ITR序列。在一些情形下，尚未對ITR之末端核苷酸進行測序，而是簡單地推斷為CATCATCA。另外，在測序之前，自診斷交叉之腺病毒之生長係常見的，涉及若干可引起核苷酸變化之複製循環。然而，應注意，在病毒宿主共演化長時段後仍在自然界中檢測到初始序列CATCATCA，且因此更替序列CTATCTAT在細胞培養物中比在自然界中可更有益。
為排除所觀察之自初始ITR至更替ITR之轉換係限於產生E1-互補細胞系之現象，將含有初始ITR序列CATCATCA之Ad35.wt病毒在多種細胞類型上傳代。因此，使用含有完全Ad35野生型基因組之質粒在A549、HEK293、PER.C6、Hep2、HeLa及MRC5細胞上挽救Ad35wt。選擇特定細胞系以呈現癌及非癌起源、上皮及成纖維細胞系及不同倍數性之多種細胞類型，包括衍生自不同組織之細胞系(表III)。
表III中之結果顯示，在VPN 10時對於輔助細胞系HEK293及PER.C6細胞觀察到轉換至更替ITR，但儘管於較遲傳代次數時，對於其他測試細胞系亦觀察到轉換或混合表現型。
研究基於各種血清型之腺病毒載體轉換至更替CTATCTAT序列的
一般性。此處，將Ad26、Ad48、Ad49、Ad11(a)、Ad50及Ad5衍生之腺病毒載體在PER.C6細胞上傳代。在噬菌斑純化後使病毒載體傳代直至VPN 15並藉由在VPN 10及VPN 15時測序進行分析。每一載體血清型包括兩種不同轉基因以另外排除不同轉基因之效應。
此組實驗之結果示於表IV中。驚人地，發現除Ad48外之所有測試載體皆轉換至更替ITR序列或展示混合表現型，表明其可在較遲病毒傳代次數時轉化。與針對Ad5先前所觀察一致，在VPN 10時保留初始ITR序列，然而在VPN15時開始混合。相比而言，Ad48衍生之載體僅係保留初始ITR序列直至VPN 15者。
然而，為保證安全，建議使所有重組腺病毒(包括基於Ad5或甚至Ad48者)配備本發明更替ITR序列，以防止在大體積培養期間或在延長傳代後由於基因組端處之突變而存在潛在群異源性。此將確保獲得重組腺病毒群，其中基本上所有腺病毒粒子之基因組皆包含本發明之5'末端序列CTATCTAT。此外，具有此更替ITR序列之腺病毒載體之挽救可加速疫苗載體產生。
<110> 荷蘭商庫賽爾荷蘭公司
<120> 具改變末端之重組腺病毒群
<130> 0198 EP P00 PRI
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Claims (17)
- 一種包含重組腺病毒粒子之組合物，其中該重組腺病毒係血清型5、11a、26、35、49或50之重組人類腺病毒、或重組猿腺病毒，其特徵在於該組合物中之基本上所有腺病毒粒子之基因組皆具有核苷酸序列CTATCTAT作為5'末端核苷酸。
- 如請求項1之組合物，其中該重組腺病毒係血清型5、26、35、49或50之重組人類腺病毒。
- 如請求項2之組合物，其中該重組腺病毒係血清型26或35之重組人類腺病毒。
- 如請求項1至3中任一項之組合物，其係醫藥組合物。
- 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該重組腺病毒缺少E1區之至少一部分。
- 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該重組腺病毒包含轉基因。
- 如請求項1至3中任一項之組合物，其包含至少1×107個重組腺病毒粒子。
- 一種製備重組腺病毒粒子群之方法，基本上所有該等重組腺病毒粒子在其基因組之5'末端中皆具有相同核苷酸序列，該方法包含：a)進行分子選殖步驟，以將腺病毒基因組之天然5'末端更換為包含核苷酸序列CTATCTAT作為末端核苷酸之改變5'末端，b)使具有該改變5'末端之該重組腺病毒在宿主細胞中繁殖，及c)收穫該重組腺病毒，以獲得重組腺病毒粒子群，基本上所有該等重組腺病毒粒子皆具有該核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之該等5'末端核苷酸。
- 一種製備重組腺病毒粒子群之方法，基本上所有該等重組腺病毒粒子在其基因組之5'末端中皆具有相同核苷酸序列，該方法包含：a)純化腺病毒之噬菌斑，其中該重組腺病毒係血清型5、11a、26、35、49或50之重組人類腺病毒、或重組猿腺病毒，以自單噬菌斑分離腺病毒或重組腺病毒，其中該腺病毒或重組腺病毒具有核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之5'末端核苷酸，b)使自步驟a)之該單噬菌斑獲得之重組腺病毒在宿主細胞中繁殖，及c)收穫該重組腺病毒，獲得重組腺病毒粒子群，基本上所有該等重組腺病毒粒子皆具有該核苷酸序列CTATCTAT作為其基因組之該等5'末端核苷酸。
- 如請求項8或9之方法，其中該群包含至少1×107個重組腺病毒粒子。
- 如請求項8或9之方法，其中該重組腺病毒係血清型5、26、35、49或50之重組人類腺病毒。
- 如請求項8或9之方法，其中該重組腺病毒係血清型26或35之重組人類腺病毒。
- 如請求項8或9之方法，其中該重組腺病毒缺少E1區之至少一部分。
- 如請求項8或9之方法，其中該重組腺病毒包含轉基因。
- 如請求項8或9之方法，其進一步包括純化該重組腺病毒。
- 如請求項15之方法，其進一步包括將該重組腺病毒調配至醫藥組合物中。
- 如請求項8或9之方法，其中步驟b)係在生物反應器中進行。
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