CN102216449B - 用于培养per.c6细胞以及从中生产产物的可规模化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了培养粘附PER.C6细胞及从中生产产物的方法。

Description

用于培养PER.C6细胞以及从中生产产物的可规模化的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。其特别是涉及培养人类细胞。更特别是涉及贴壁培养PER.C6细胞。
背景技术
哺乳动物细胞根据细胞类型而贴壁培养或者悬浮培养。为了可规模化原因，趋势是使粘附细胞(adherent cell)适应悬浮培养。使许多细胞类型适应悬浮培养的能力以及使用聚合添加剂减少剪切破坏使得能够广泛应用悬浮培养物，这也是大规模应用所选择的系统。(Chu and Robinson，2001)。
实现粘附细胞的规模放大(scale up)是十分困难的，并产生了许多替代的培养系统。一种允许粘附细胞规模放大的特定系统是微载体培养。这种方法学的优势是在小载体上生长时细胞可以作为悬浮培养物，具有大单元规模放大、均质性并且环境条件容易控制的所有优点(Griffiths，2001)。此外，微载体培养提供了高比面值，导致高细胞密度产率以及获得高浓缩细胞产物的潜力。
微载体技术已取得一些进展。已经优化了微载体的电荷基团容量(charge group capacity)和珠大小以增强细胞生长。在微载体表面应用包被材料如胶原蛋白/明胶、玻璃、ProNectin和聚赖氨酸。导入了更多的载体基质材料，包括DEAE葡聚糖、胶原蛋白/明胶、玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和纤维素(Kong等人，1999)。
粘附细胞培养物广泛用于生物药物工业例如用于生产重组凝血因子(例如US2006/0194289)或者生产流感疫苗(Brands等，1999)。这些方法中使用不同的细胞系，包括CHO、BHK、MDCK和Vero(Brühl等，2001；Rourou等，2007)。
大量微载体可商购获得并且必须对每种细胞系测试细胞在微载体上成功增殖的能力。
用于生产抗体、疫苗和重组蛋白的人细胞系PER.C6(Jones等，2003；WO00/63403；WO 01/38362)特别适于悬浮培养(Yallop等，2005)。然而，对于某些产品的生产来说，PER.C6细胞可能更优选贴壁培养。尽管在烧瓶内已经小规模贴壁培养PER.C6细胞，但是迄今为止尚未描述贴壁培养PER.C6细胞的可规模化方法。
贴壁培养PER.C6细胞的可能性与规模放大培养物的能力组合将扩大PER.C6细胞系的应用范围。
发明简述
令人惊讶地发现，除了带正电的微载体，PER.C6细胞在大多数目前可商购获得的微载体上不粘附及不能良好生长。此外，令人惊讶地，PER.C6细胞可以容易地从这些微载体脱离。这使得PER.C6细胞可以从一个生物反应器传代培养至另一个，这对于方法规模放大是优势。
本发明提供了贴壁培养PER.C6细胞的方法，包括：a)使所述细胞附着于一个或多个带正电的微载体的表面；以及b)在培养基中培养所述细胞。
在某些实施方案中，所述带正电的微载体是基于葡聚糖的。在其他实施方案中，本发明的方法还包括步骤：c)使所述细胞与微载体脱离，随后进一步培养所述细胞。
在本发明的另一个实施方案中，所述细胞产生产物。在优选的实施方案中，所述产物是蛋白质。在另一个优选的实施方案中，所述产物是凝血因子。
本发明的另一目的是提供通过PER.C6细胞生产产物的方法，包括本发明的方法以及进一步包括步骤：d)收获所述产物。
本发明也提供了包括附着于微载体的PER.C6细胞的细胞培养物，其中所述微载体带正电。在优选实施方案中，所述带正电的微载体是基于葡聚糖的。
附图简述
图1：培养物图示，其中细胞未附着于载体(参考实施例2)
图2：培养物图示，其中细胞非均质地分布并趋于以附着于一或多个载体的团块(clump)而生长(参考实施例2)
图3：PER.C6细胞在微载体Cytodex-1上的图示。
图4：PER.C6细胞在带正电的微载体Cytodex-1上的生长。
图5：贴壁生长在Cytopore-1微载体上的PER.C6细胞培养物中的代谢物浓度。
图6：贴壁生长在Cytopore-1微载体上的PER.C6细胞培养物中的代谢物浓度。
图7：贴壁生长在Cytopore-2微载体上的PER.C6细胞培养物中的代谢物浓度。
具体实施方式
根据这些和其他目的，本发明提供了贴壁培养PER.C6细胞的方法，包括以下步骤：将所述细胞附着于带正电的微载体的表面、在培养基中培养所述细胞、使所述细胞从微载体脱离并进一步培养所述细胞。
“粘附细胞”是指附着于表面例如组织培养瓶表面或微载体颗粒表面以在组织培养过程中复制的细胞，包括哺乳动物细胞。
本发明的细胞衍生自E1-永生化的HER细胞，如PER.C6细胞。用于本发明目的的PER.C6细胞已在美国专利5,994,128中有描述，并且是指以保藏号96022940保藏于ECACC的细胞的上游或下游传代细胞或者上游或下游传代细胞的后代。
“微载体”是指在培养中用于粘附细胞的附着和生长的颗粒、珠或丸粒(pellet)。微载体具有以下特性：(a)他们足够小，使得他们可以用于悬浮培养(用对于微载体或细胞不导致显著剪切破坏的搅拌速度)；(b)他们是固体或有固体核，在表面具有多孔包被；以及(c)他们的表面(多孔载体情况中的内和外表面)可以带正电、负电或不带电。微载体可以例如是但不限于聚苯乙烯、纤维素、聚乙烯或基于葡聚糖的，这意味着所述载体的基质可以由不同材料例如聚苯乙烯、纤维素、聚乙烯或葡聚糖制成。此外，微载体可以包被有黏着因子如明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、玻连蛋白或生腱蛋白。这些特别的特点影响不同细胞类型与微载体的结合能力和细胞在微载体上生长的能力。
在一个方面，微载体具有的总颗粒直径在大约150和350μm之间。在一个方面，他们具有的正电荷密度在大约0.8和3.0meq/g之间。在一些实施方案中，由DEAE(N，N，-二乙基氨基乙基)基团提供正电荷。正电荷也可以由其他基团提供，例如已知DEAE基团也用于阴离子交换层析，其中也使用替代的带正电的基团如季铵基。因此可能将这种替代的阳性基团与微载体偶联并根据本发明使用。有用的微载体可商业获得，例如称作Cytodex 1、Cytopore 1和Cytopore 2的(来自GE Healthcare)。在某些实施方案中，所述微载体为固体载体(例如Cytodex-1)。载体颗粒也可以是多孔微载体(例如Cytopore 1和Cytopore 2)。
在本发明中，测试了不同细胞系粘附于几种类型商购可得的微载体的能力。发现CHO细胞可以在每种经测试的微载体类型上成功培养。相反，除了带正电的微载体外PER.C6细胞不能结合任何这些微载体。事实上，令人惊讶地发现PER.C6细胞只结合带正电的微载体。根据本发明的方法使用的微载体因此是带正电的。在某些实施方案中，结合PER.C6细胞的微载体包括用带正电的N，N，-二乙基氨基乙基(DEAE)基团取代的交联葡聚糖基质。带电基团分布在整个微载体基质。包含交联葡聚糖基质的微载体在本文称为“基于葡聚糖的”。在本发明的其他实施方案中，带正电的微载体是“基于纤维素的”。在某些实施方案中，所述微载体没有包被黏着因子。
本发明的方法允许粘附细胞在常规培养基中生长(GE Healthcare.Macrocarrier cell culture.Principle and Methods 18-1140-62)。在优选的实施方案中，所述培养基含有血清。用于补充培养基的血清可来自多种来源并以0.1％到30％(v/v)范围的浓度使用。该血清发挥几种功能。第一，其有助于细胞附着于培养物表面；第二，血清中的生长因子和激素促进细胞增殖。血清对细胞和产物也具有保护作用。血清的另一功能是提供使常规传代培养中所用的蛋白水解酶失活的蛋白酶抑制剂。
细胞在常规容器中培养，如摇瓶、滚瓶、生物反应器等。选择培养基和最佳细胞生长条件如培养基补充物、血清、温度、pH值、搅拌速度、微载体浓度等均在本领域技术人员的知识之内(GE Healthcare.Macrocarriercell culture.Principle and Methods 18-1140-62)。在开始细胞培养时的微载体浓度优选在1-2g/L的范围。培养物优选的细胞密度在0.1和0.3百万活细胞/mL之间。
为规模放大所述方法，优选可以使粘附细胞从载体脱离并在更大体积中传代培养。例如，可通过将蛋白水解酶(例如但不限于分散酶，胶原酶或胰蛋白酶)添加到培养基中使粘附细胞脱离微载体。在某些实施方案中，本发明的蛋白水解酶为胰蛋白酶。
令人惊讶地发现，添加胰蛋白酶后，很容易使PER.C6细胞脱离带正电的微载体。这是非常出乎意料的，因为经过制造商特殊处理的这些特异载体被细胞系强烈结合，因此这些广泛用作末期生产的载体(GE Healthcare.Macrocarrier cell culture.Principle and Methods 18-1140-62)。
根据本发明的优选实施方案，所述粘附细胞可以从载体脱离并转移至更大体积的容器中。在优选的实施方案中，所述细胞可以再次附着于微载体并进一步培养。此实施方案允许在工业方法中使用粘附细胞，其通常需要几个规模放大步骤。
本发明的另一方面提供了通过PER.C6粘附细胞生产产物的方法，包括如下步骤：将PER.C6细胞附着于微载体表面，在培养基中培养所述细胞，其中所述细胞释放产物并随后收获所生产的产物。
根据所述方法中的一个实施方案，本发明粘附细胞生产的产物可能是蛋白质例如但不限于凝血因子(如因子V、VIII、IX、X、XI、APC-抗性因子V)。对于生产蛋白质，本发明的细胞适当地包含编码所述蛋白的核酸，其与能够驱动所述蛋白表达的元件可操纵地连接(参见例如WO 00/63403)。
此外，本发明的粘附细胞可用于通过所述细胞产生病毒(参见例如WO01/38362)，因为某些病毒在所述细胞为粘附性时可以更有效地感染所述细胞。因此，在一些实施方案中，本发明方法生产的产物可以是病毒。
收获以及进一步纯化所述产物的方法为本领域技术人员已知，其能够设计合适的下游方法以从细胞悬液回收所述产物。
本发明首次揭示了结合微载体的PER.C6细胞。因此，本发明的另一方面提供了附着于微载体的PER.C6粘附细胞的细胞培养物，其中所述微载体是带正电的。在某些实施方案中，所述微载体是基于葡聚糖的。在其他实施方案中，所述微载体是基于纤维素的。这种细胞培养物可以用于本发明的方法和例如在规模放大中。
根据本发明，所述细胞培养物包括培养基和微载体。选择适合培养基成分以允许最大化细胞生长和产物生产在本领域技术人员知识范围内(GEHealthcare.Macrocarrier cell culture.Principle and Methods 18-1140-62)。在某些实施方案中，所述培养基含有血清。血清成分对于趋于不稳定的产物例如抗体或凝血因子(如因子V、VIII、IX、X、XI、APC-抗性因子V)可具有保护功能。所述细胞培养物还可包括所述细胞所生产的产物。
现已一般性地描述了本发明，通过参考以下实施例将理解本发明，本文提供所述实施例只用于说明性目的，除有特别说明，其并不意图是限制性的。
实施例
实施例1：在常用的微载体上培养CHO细胞
测试了CHO细胞粘附几种微载体的能力，所述微载体包括Cytodex-1和Cytodex-3(GE healthcare)；2D Microhex和Biosilon(Nunc)；HyQsphereCGEN 102-L、Pro-F 102-L、P102-L、Fact 102-L(Hyclone)。根据标准方法在所述微载体上培养CHO细胞。将制造商建议的载体量(1-20g/L)灭菌，用培养基洗涤，在自旋烧瓶中以适当设置温育30分钟。通过T烧瓶培养物的胰蛋白酶化而获得的细胞以制造商建议的密度0.1-0.2x10E6细胞/mL接种。在潮湿的孵箱在37℃和5％CO2和30rpm下在含有75ml补加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM:F12培养基的自旋烧瓶中培养细胞。成功进行了结合于上述微载体的CHO-K1细胞的培养。在所有情况下，细胞很好附着于所述载体，在所述载体上实现铺满生长并且获得均质培养物。
实施例2：在常用的微载体上培养PER.C6细胞
如前述实施例所述，根据相同方案在类似微载体上测试了PER.C6细胞(表1)。似乎PER.C6细胞在任何下列载体上不能成功培养：Cytodex-3(GEhealthcare)；2D Microhex和Biosilon(Nunc)；HyQsphere CGEN 102-L，Pro-F102-L，P102-L，Fact 102-L(Hyclone)。在一些情况下，所述细胞不能附着于所述载体(这种培养物的图示示于图1)，在其他情况下，所述细胞非均质地分布并趋向于以附着于一或多个载体的团块生长(这种培养物的图示示于图2)。
实施例3：PER.C6细胞在带正电的微载体上的成功培养
根据实施例1所述方法也在带正电的微载体(Cytodex-1)上测试了PER.C6细胞。在大约4-5天细胞生长铺满(图3示出第3天的亚铺满培养)并且培养物实现了足够的均质性(即细胞均匀分布于微载体)。测试了表达不同糖蛋白的4种不同的PER.C6细胞系。所有都在带正电的微载体上成功培养。
因为细胞强力粘附于带正电的微载体，因而制造商建议将这类载体用于最终生产培养(GE Healthcare.Macrocarrier cell culture.Principle andMethods 18-1140-62)。测试了使活细胞从这些微载体脱离的可能性，事实上CHO细胞不能从带正电的微载体移除。
令人惊讶地发现PER.C6细胞可通过胰蛋白酶消化从带正电的载体移除。
表1.实施例1、2和3的结果总结
Figure BPA00001279905500071
一般而言，可以得出结论，除了带正电的微载体之外，PER.C6细胞不能在当前多数商业可获得的微载体上很好生长。此外，PER.C6细胞可通过胰蛋白酶消化从这些载体移除。这使得能够传代培养并因此规模放大所述方法，这是工业化方法所需的。
除了固体带正电微载体Cytodex-1，测试了两种大孔带正电微载体(Cytopore-1和Cytopore-2)，显示出PER.C6细胞在这些替代的带正电的微载体上可以成功培养。图5、6和7显示贴壁生长在带正电的大孔微载体上的PER.C6细胞的葡萄糖消耗和乳酸生产。在每次传代后逐渐减少的葡萄糖浓度和逐渐增加的乳酸产量表明PER.C6细胞在这些微载体上成功培养。
实施例4：在旋转器中PER.C6细胞在带正电载体上的分批培养
在本实施例中，在旋转烧瓶中将PER.C6细胞培养于带正电载体上。细胞以0.1-0.2x10E6细胞/mL的密度接种于添加10％FBS的DMEM培养基中。如图4所示，接种时，每个珠含有的细胞在10和90之间。9天后，细胞浓度达到大约5*10E6vc/mL，有大约1000细胞/珠(铺满培养)。在宽泛的标准操作参数范围内获得了细胞的成功培养，如搅拌速度(20-80RPM)和工作体积(150-250mL)。
实施例5：在生物反应器中PER.C6细胞在带正电载体上的分批培养
在2L生物反应器中将PER.C6细胞培养于带正电载体上。细胞很好地附着于载体，在载体上实现了铺满生长并获得了均质性培养物。
实施例6：在带正电载体上通过PER.C6细胞生产重组蛋白质
测量了在带正电微载体上(在旋转烧瓶中)的PER.C6生产几种产物的生产水平。我们发现这些蛋白的生产水平在参考系统(T-烧瓶)中先前获得的水平范围内。在带正电载体上(在旋转烧瓶中)因子V蛋白的生产水平在1000-2000ng/mL之间(与在T-烧瓶中的1500-3000ng/mL相比)。在相同微载体上(在旋转烧瓶中)因子XI蛋白的生产水平在7000-12000ng/mL之间(与在T烧瓶中大约15000ng/mL相比)。
实施例7：预期的方法
基于上述结果，提出如下方法。用Cytodex-1微载体将PER.C6粘附细胞的预培养物规模放大至生产规模。随后，在更换培养基的一或多次(如3-6)重复分批培养中生产(例如重组蛋白质)。对于这个最终生产步骤，使用Cytodex-1微载体。或者，对于这个步骤也可选用大孔微载体。这可能是有利的，因为可以达到高细胞密度，并且我们观测到在这些载体上PER.C6的生长是有希望的。然而，因为细胞不能从这些载体移除，因此它们不适合于中间预培养/规模放大步骤。
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Claims (8)

1.贴壁培养PER.C6细胞的方法，包括：
a)将PER.C6细胞附着于带正电的微载体，其包含N，N-二乙基氨基乙基基团；及
b)在培养基中培养所述细胞，
其中PER.C6细胞是来自保藏号为ECACC 96022940的细胞的上游或下游传代的细胞或者是来自保藏号为ECACC 96022940的细胞的上游或下游传代的后代的细胞。
2.权利要求1的方法，还包括步骤：
c)使细胞从微载体表面脱离并随后进一步培养所述细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述微载体为基于葡聚糖的微载体。
4.权利要求1的方法，其中所述细胞产生产物。
5.权利要求4的方法，其中所述产物是蛋白质。
6.权利要求4的方法，其中所述产物是凝血因子。
7.权利要求4、5或6任一项的方法，还包括步骤：
d)收获所述产物。
8.一种培养物，其包含附着于微载体上的PER.C6细胞，其中所述微载体带正电并包含N，N-二乙基氨基乙基基团，并且其中PER.C6细胞是来自保藏号为ECACC 96022940的细胞的上游或下游传代的细胞或者是来自保藏号为ECACC 96022940的细胞的上游或下游传代的后代的细胞。
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