BR112019015671A2 - promotor potente e curto para expressão de genes heterológicos - Google Patents
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Abstract
a invenção refere-se a um promotor aohv-1 para utilização com vetores plasmidiais, vetores virais, vírus e linhas celulares compreendendo o promotor aohv-1 operacionalmente ligado a um transgene. a invenção também proporciona métodos de preparação e utilização de vetores recombinantes plasmidiais, vetores virais, vírus e linhas celulares compreendendo o promotor aohv-1 operacionalmente ligado a um transgene.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROMOTOR POTENTE E CURTO PARA EXPRESSÃO DE GENES HETEROLÓGICOS.
CAMPO DA TÉCNICA [001] A invenção se refere às áreas da pesquisa biológica, medicina e outras aplicações relacionadas à expressão gênica heteróloga. Mais particularmente, a invenção se refere a um promotor potente e curto para a expressão de um gene heterólogo em cassetes de plasmídeos, vetores virais e linhas celulares de expressão que podem ser usados isoladamente ou em combinação com os promotores normalmente usados, tais como o promotor de hCMV.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Os vetores de expressão recombinantes são extensivamente usados em uma variedade de aplicações de biologia molecular para a expressão de proteínas heterólogas, incluindo, por exemplo, sistemas de expressão de genes de mamíferos para a pesquisa biológica, para produzir linhas celulares para a produção de vetores virais, e como vetores virais para terapia gênica e vacinação. Para aplicações de terapia gênica e vacinação, vetores, incluindo vetores virais, são usados como transportadores para um gene ou genes de interesse a serem introduzidos em células. Por exemplo, vetores virais podem ser usados para expressar um gene ou parte do mesmo que codifica um antígeno desejado para elicitar uma resposta imunológica.
[003] Os elementos que atuam em cis que fazem parte de vetores de expressão podem ter um grande impacto na aplicação bem sucedida de plasmídeos e vetores virais. Os promotores são os principais elementos que atuam em cis que são colocados nos cassetes de expressão dos vetores de expressão e ditam a força da expressão em geral. O promotor inicia a transcrição e é, portanto, um importante ponto de controle para a expressão do gene clonado de interesse. As se
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2/95 quências promotoras normalmente usadas em vetores de expressão são derivadas de vírus ou de sequências reguladoras de genes eucariotas.
[004] Algumas das sequências de potenciador e promotor comumente usadas em vetores de expressão e vetores virais são, por exemplo, promotores hCMV, CAG, SV40, mCMV, EF-1a e hPGK. Devido à sua elevada potência e tamanho moderado de cerca de 0,8 kB, o promotor hCMV é um dos mais comumente usados destes promotores. O promotor hPGK é caracterizado por um tamanho pequeno (cerca de 0,4 kB), mas é menos potente que o promotor hCMV. Por outro lado, o promotor CAG que consiste em um elemento potenciador precoce de citomegalovírus, promotor, primeiro éxon e intron do gene da beta-actina de galinha e aceitador de junção do gene da beta-globina de coelho, pode dirigir uma expressão gênica muito potente que é comparável ao promotor hCMV, mas o seu tamanho grande torna-o menos adequado em vetores virais onde restrições de espaço podem ser uma preocupação significativa, por exemplo, em vetores adenovirais (AdV), vetores virais adenoassociados (AAV) ou vetores lentivirais (LVs).
[005] Em alguns casos, é desejável expressar pelo menos dois antígenos a partir de um vetor. Em situações em que dois cassetes de expressão são colocados em um vetor de modo a expressar dois genes diferentes, as restrições de tamanho para os cassetes de expressão em geral e as sequências promotoras em particular são especialmente importantes. Para além das restrições de tamanho, quando se colocam dois cassetes de expressão em um vetor, é uma desvantagem utilizar sequências de promotor idênticas ou mesmo muito semelhantes, porque pode conduzir à instabilidade genética do vetor durante a produção. Assim, é desejável utilizar diferentes sequências de promotor heterólogas relativamente pequenas e relativamente poten
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3/95 tes que têm pouca ou nenhuma identidade de sequência uma com a outra quando dois cassetes de expressão são colocados em um vetor de modo a expressar dois genes diferentes.
[006] Quando se preparam linhas celulares para produção de vetores virais é também desejável ter um promotor potente com uma sequência diferente de outros promotores comumente utilizados nos cassetes de expressão dos vetores virais, tal como o promotor hCMV comumente utilizado. Seções significativas de identidade de sequência entre o genoma da linha celular e o vetor nela produzido pode levar a recombinação homóloga e por conseguinte a instabilidade genética ou heterogeneidade dos lotes de vetor produzidos (por exemplo, Lochmüller et al., 1994) e por conseguinte são preferencialmente evitadas (por exemplo Fallaux et al., 1998; Murakami et al., 2002). Também para tais aplicações, será desejável utilizar um promotor potente com pouca ou nenhuma identidade de sequência com o promotor hCMV comumente usado.
[007] Assim, permanece a necessidade de identificar promotores potentes, que preferencialmente seriam de tamanho pequeno e que teriam pouca ou nenhuma identidade de sequência com o promotor hCMV, para utilização, por exemplo, em plasmídeos, vetores virais e linhas celulares.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008] A presente invenção proporciona moléculas de ácido nucleico recombinante compreendendo a região do promotor precoce imediato principal de herpesvírus-1 Aotine (promotor AoHV-1) e vetores, incluindo, por exemplo, vetores plasmidiais, vetores virais, vírus recombinantes e linhas celulares recombinantes que compreendem o promotor AoHV -1 operacionalmente ligado a um transgene. A presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico recombinante compreendendo o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado
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4/95 a sequências reguladoras que podem ser utilizadas para modular a transcrição do promotor AoHV-1.
[009] As modalidades gerais e preferenciais são definidas, respectivamente, pelas reivindicações independentes e dependentes aqui anexas, as quais, visando a brevidade, são incorporadas a título de referência no presente documento. Outras modalidades preferenciais, características e vantagens dos vários aspectos da invenção se tornarão aparentes a partir da descrição detalhada abaixo tomada em conjunto com as figuras de desenho anexas.
[0010] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um promotor AoHV-1, em que o promotor AoHV-1 está ligado operacionalmente a um transgene para a expressão do transgene com vetores plasmidiais, vetores virais ou vírus recombinantes, ou no genoma de células hospedeiras compreendendo o promotor AoHV-1.
[0011] Em determinadas modalidades, a invenção proporciona um vetor plasmidial compreendendo um promotor AoHV-1, cujo vetor plasmidial compreende menos de 1 kb de DNA de AoHV-1.
[0012] Em determinadas modalidades, a invenção proporciona um cassete de expressão, compreendendo um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene, cujo transgene é heterólogo ao promotor AoHV-1, por exemplo, em que o transgene não está operacionalmente ligado ao promotor AoHV-1 na natureza e/ou o transgene não é originário de AoHV-1. O cassete de expressão pode, por exemplo, ser integrado dentro de um plasmídeo, um vetor, um genoma viral, uma linha celular, etc. A invenção também proporciona um método de preparar um tal cassete de expressão, compreendendo a construção do cassete de expressão por meios recombinantes ou por síntese de ácido nucleico. A invenção também fornece um método para a expressão de um transgene, compreendendo expressar o transgene a partir do cassete de expressão da invenção, por exemplo em uma linha celu
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5/95 lar recombinante.
[0013] Em determinadas modalidades, a presente invenção proporciona linhas celulares recombinantes compreendendo o promotor AoHV-1, em que o promotor AoHV-1 está operacionalmente ligado a um transgene. Em determinadas modalidades, o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene pode estar presente na linha celular incorporado em, por exemplo, vetores plasmidiais, vetores virais, ou vírus recombinantes para a expressão do transgene a partir do mesmo. Em determinadas modalidades, o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene é integrado no genoma da linha celular recombinante, para expressar o transgene a partir do mesmo. Em determinadas modalidades, o transgene é integrado no genoma da linha celular e codifica uma proteína repressora de tetraciclina (TetR). Em determinadas modalidades da mesma, a referida linha celular é uma linha celular PER.C6.
[0014] Em outra modalidade, a presente invenção também proporciona um método para expressar um transgene em uma célula, compreendendo o método proporcionar uma célula com um vetor recombinante compreendendo o promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene.
[0015] Em determinadas modalidades, a invenção também proporciona um método para produzir uma proteína de interesse, em que o promotor AoHV-1 está operacionalmente ligado a um transgene que codifica a proteína de interesse, compreendendo o método proporcionar uma célula compreendendo uma proteína AoHV-1 operacionalmente ligada a um sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse e que expressa a proteína de interesse a partir da célula. Em determinadas modalidades, o método compreende adicionalmente a colheita da proteína de interesse, por exemplo a partir das células ou a partir do meio de cultura ou a partir das células e meio de cultura.
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Em determinadas modalidades, o método compreende adicionalmente a purificação da proteína de interesse. Preferencialmente, a proteína de interesse é uma proteína que não é codificado pelo herpesvírus-1 Aotine na natureza, isto é, é uma proteína heteróloga.
[0016] Em determinadas modalidades, a presente invenção proporciona o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a sequências reguladoras que podem ser utilizadas para modular a transcrição do promotor AoHV-1. Em determinadas modalidades da mesma, pode, por exemplo, ser reprimido pela ligação de um repressor a uma sequência de ligação ao repressor que tenha sido operacionalmente ligada ao promotor da AoHV-1. Em determinadas modalidades, o promotor de AoHV-1 pode ser induzido por remoção de um repressor ou proporcionando um sinal indutor ou agente indutor.
[0017] Em determinadas modalidades, a presente invenção proporciona o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências do óperon de tetraciclina (sítios tetO), de tal modo que a expressão pode ser controlada reversivelmente.
[0018] Em outra modalidade, a presente invenção também proporciona um método de produção de um vírus recombinante compreendendo o promotor AoHV-1, o método compreendendo: preparação de um construto compreendendo o promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene, e incorporando o referido construto no genoma do vírus recombinante.
[0019] Em determinadas modalidades da presente invenção, o promotor de AoHV-1 está operacionalmente ligado a um transgene que codifica uma proteína de interesse, em que a proteína de interesse é uma proteína terapêutica ou um antígeno.
[0020] Em determinadas modalidades, os vírus e vetores virais compreendendo o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene são adenovirus recombinantes (rAd) e vetores rAd.
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7/95 [0021] Em determinadas modalidades, a invenção se refere a rAd e vetores rAd compreendendo o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene, e a métodos de fabricação e/ou utilização de rAd e vetores rAd, em que os rAd e vetores rAd compreendem um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene.
[0022] Em determinadas modalidades, um adenovirus recombinante da invenção tem uma deleção na região E1, e em determinadas modalidades compreende o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene nesta região E1. Alternativamente, outras regiões do adenovirus recombinante poderíam ser também usadas. Por exemplo, o cassete de expressão compreendendo o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene também pode ser colocado na região E3, ou na extremidade direita do genoma, entre a região E4 e a ITR direita do adenovirus recombinante.
[0023] Em determinadas modalidades, um vetor rAd, de acordo com a invenção, é deficiente em, pelo menos, uma função de gene essencial da região E1, por exemplo, a região E1a e/ou a região E1b, do genoma adenoviral que é necessária para a replicação viral. Em determinadas modalidades, um vetor adenoviral, de acordo com a invenção, é deficiente em pelo menos parte da região E3 não essencial. Em determinadas modalidades, o vetor é deficiente em pelo menos uma função de gene essencial da região E1 e pelo menos parte da região E3 não essencial. O vetor adenoviral pode ser múltiplo deficiente, o que significa que o vetor adenoviral é deficiente em uma ou mais funções de genes essenciais em cada uma de duas ou mais regiões do genoma adenoviral. Por exemplo, os vetores adenovirais, acima mencionados, deficientes em E1 ou deficientes em E1 e E3, podem ser adicionalmente deficientes em pelo menos um gene essencial da região E4 e/ou pelo menos um gene essencial da região E2 (por exemplo, a região E2A e/ou região E2B).
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8/95 [0024] Em outra modalidade, a presente invenção também proporciona uma molécula de DNA recombinante compreendendo o genoma de um adenovirus recombinante compreendendo o promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0025] Figura 1: Expressão de Luciferase a partir de diferentes construtos de promotores avaliados com transfecções transientes em células HEK293. A expressão de luciferase foi medida como unidades relativas de luz (RLU) e corrigida para a eficiência de transfecção pela medição dos níveis de SEAP. Os resultados são apresentados para os promotores indicados, em comparação com o controle positivo da luciferase sob o controle de um promotor hCMV e um controle negativo de células não transfectadas.
[0026] Fig. 2: Alinhamentos de sequência entre hCMV e chCMV curto ou AoHV-1 curto realizado com CLC workbench. O sombreado cinzento indica as diferenças de nucleotídeos entre as sequências alinhadas. Os alinhamentos foram realizados com a sequência completa do promotor. No entanto, apenas a região na qual as sequências alinham é mostrada na Figura, uma vez que estas regiões são relevantes para potenciais eventos de recombinação homóloga. Traços indicam regiões sem alinhamento (intervalos). (A) Região de alinhamento de hCMV com chCMV curto. (B) Região de alinhamento de hCMV com AoHV-1 curto.
[0027] Fig. 3: Teste de 7xTetO-AoHV-1 para aplicabilidade como um promotor responsive a tTA para expressão regulada. As células Vero foram transfectadas transientemente com um plasmídeo em que a expressão da luciferase de Gaussia está sob o controle de 7xTetOAoHV-1 (7xTetO colocado a montante do promotor nuclear AoHV-1), que dá a atividade do promotor mínimo. A fim de induzir a atividade do promotor, um plasmídeo que expressa a proteína de transativador de
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9/95 tetraciclina (tTA) foi cotransfectada. A doxiciclina foi adicionada ao meio de cultura de células cotransfectadas com o plasmídeo tTA para desligar a atividade do promotor. O promotor do Virus do Sarcoma de Rous (RSV) foi usado como um controle positivo.
[0028] Fig. 4: Teste de uma versão repressível TetR do AoHV-1 curto para expressão regulada de um gene de interesse (GOI) em células. (A) Comparação da potência dos promotores hCMV, hPGK e AoHV-1 curto para induzir a expressão de eGFP em transfecções transientes de plasmídeos. São mostradas as imagens da expressão de eGFP feitas por um microscópio fluorescente Evos. (B) Concepção e teste de uma versão regulada do AoHV-1 curto. A expressão transiente de eGFP por AoHV.2xtetO ou um promotor hCMV padrão (pCDNA) em células PER.C6-hCMV.TetR. (C) Expressão regulada de um GOI por AoHV.2xtetO em uma linha celular estável. É mostrada a expressão do GOI em um ensaio de Western Blot. Marcação das faixas: Faixa 1: clone 11, Faixa 2: clone 11 + Doxiciclina, Faixa 3: Clone 73, Faixa 4: Clone 73 + doxiciclina, Faixa 5: controle positivo da expressão, células transfectadas transientemente com o plasmídeo que expressa o GOI sob o controle de um promotor AoHV-1, Faixa 6: controle negativo (células PER.C6 não transfectadas).
[0029] Fig. 5: (A) Representação esquemática dos genomas do vetor Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e
Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL. As setas abertas indicam as duas inserções de cassete de transgene: um cassete de expressão Gluc dirigida pelo promotor CMV ou CMVtetO inserido na localização da deleção da região E1 e um cassete de expressão RFL dirigido pelo promotor AoHV-1 inserido entre a região E4 e a RITR. Setas pretas representam os promotores que dirigem os cassetes de transgenes. Setas cinza representam sequências codificantes. GLuc, luciferase de Gaussia. RFL, luciferase de vagalume vermelha. LITR e RITR, repeti
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10/95 ções terminais invertidas esquerda e direita. CMV, promotor precoce imediato principal de citomegalovírus humano (hCMV MIEp). CMVtetO, hCMV MIEp equipado com duas sequências do óperon de tetraciclina (TetO) (para expressão repressível por TetR). AoHV-1 P, promotor curto de AoHV-1. SV40pA, sinal de poliadenilação derivado do vírus SV40. BGHpA, sinal de poliadenilação derivado do gene do hormônio de crescimento bovino. E4, região E4 de Ad26. (B) Análise da integridade do cassete do transgene (TG) para os lotes purificados de Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL por PCR de identidade. As PCRs foram realizadas para amplificar o cassete TG inserido em E1 (E1 PCR), e o cassete TG localizado entre E4 e a RITR (E4 PCR1 e E4 PCR2). Os tamanhos esperados do produto de PCR para os diferentes PCRs estão indicados na inserção da figura. L, Marcador de DNA 1 Kb Plus (Invitrogen), P1 = pAdApt26 (Abbink et al., 2007), com um cassete de expressão vazio (isto é, consistindo no promotor hCMV e no sinal de poliadenilação SV40 mas sem uma sequência codificante TG). P2, pWE.Ad26.dE3.5orf6 (Abbink et al., 2007), nenhuma inserção do cassete do transgene entre a região E4 e a RITR. W, sem controle de molde de DNA. V1, Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL DNA viral. V2, Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL DNA viral. (C e D) Análise da expressão do transgene por lotes purificados de Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL. As células A549, inoculadas em placas de 96 poços, foram infectadas em triplicado na razão de partícula viral para células indicada (VP/célula), e atividades de GLuc e RLF foram detectadas em amostras colhidas 2 dias após a infecção. RLU, unidades relativas de luz. Ad26.CMV (vazio), um vetor viral Ad26 de controle correspondente que não contém sequências codificantes GLuc ou RFL. *, um valor atípico de 187 URL que foi observado para a infecção com
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Ad26.CMVtetO_Gluc.AoHV1_RFL a 10 VP/célula foi removido (os outros dois valores para esta infecção em triplicado foram 14 e 26 RLU).
[0030] Fig. 6: (A) Mapa do plasmídeo de pC_AoHV_TetR. As setas cinzas indicam sequências codificantes para a proteína repressora de tetraciclina (TetR), neomicina fosfotransferase II e beta-lactamase; setas pretas indicam outros elementos genéticos. A seta aberta indica a sequência sintética que foi inserida no pcDNA2004Neo(-) para construir o pC_AoHV_TetR. AoHV-1 P, promotor curto de AoHV-1. TetR, sequência codificante do repressor de tetraciclina com códon otimizado. BGH pA, sinal de poliadenilação derivado do gene do hormônio de crescimento bovino. SV40 P, promotor derivado de vírus SV40. pUC ori, origem de replicação pUC. bla P, promotor para dirigir a expressão de beta-lactamase. (B) Estabilidade da expressão de TetR por clones de células PER.C6/TetR após realização de várias passagens por coloração intracelular por citometria de fluxo nas gerações 20, 40 e 60. São mostradas as frações positivas para TetR observadas para cada clone (cultivados com e sem seleção) em cada ponto de tempo. PER.C6, linha celular PER.C6 de controle sem construto TetR, cultivada apenas sem seleção antibiótica. (C) Ensaio da funcionalidade de TetR após realização de várias passagens (60 duplicações da população). Os clones de células PER.C6/TetR foram infectados com Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL, depois do qual foram determinadas as atividades de GLuc e RLF. Por replicado de infecção, as atividades de GLuc dirigidas pelo promotor CMV ou CMVtetO foram normalizadas pelas atividades de RLF dirigidas pelo promotor AoHV-1 observadas para a mesma amostra. Os valores de Gluc normalizados resultantes são expressos nesta figura em relação aos encontrados para a linha celular de controle negativa para TetR (PER.C6). +, as células foram cultivadas com seleção de antibiótico. -, as células foram cultivadas sem seleção de antibiótico. Ctrl (+),
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12/95 uma linha celular de controle positiva para TetR previamente estabelecida derivada de PER.C6 por transfecção estável com pCDNA6/TR (Thermo Fisher Scientific, Número de catálogo: V102520), um plasmídeo que compreende uma sequência de TetR sob o controle de um promotor de CMV humano.
[0031] Fig. 7: (A) Concepção de versões truncadas e alongadas do promotor AoHV-1. É ilustrada uma representação de uma seção de 2774 pb do genoma do herpesvirus Aotine 1 correspondente, da esquerda para a direita, aos números de nucleotídeos 157077 a 154304 do acesso do GenBank NC_016447. As barras marcadas indicam diferentes variantes do promotor AoHV-1 que foram concebidas e testadas aqui. As sequências vOO e v06 representam o promotor AoHV-1 curto, respectivamente com e sem o seu sítio Avrll nativo. D e A, doadores de junção previstos e sítios aceitadores, respectivamente. TATA, caixa TATA putativa. Inr, sequência iniciadora putativa (contendo o sítio de início da transcrição previsto). (B) Os resultados dos testes de potência de diferentes versões de um promotor AoHV-1 em células PER.C6 transfectadas transientemente. Os resultados médios de duas experiências são apresentados em relação ao promotor vOO AoHV-1 curto.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0032] São aqui descritos os resultados experimentais referentes à identificação, concepção e teste de um novo promotor derivado da região de potenciador/promotor precoce imediato de herpesvírus-1 Aotine (promotor AoHV-1). Os resultados mostram que o promotor AoHV-1 proporciona expressão potente de um transgene a que está operacionalmente ligado, com base na transfecção transiente com vetores plasmidiais em diferentes linhas celulares e infecções virais com vírus compreendendo o promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene. O promotor AoHV-1 também é um promotor relativamente curto, por isso é adequado para uso em muitas aplicações onde as
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13/95 restrições de tamanho são uma preocupação. Assim, o promotor AoHV-1 da presente invenção é adequado para utilização em aplicações em que a expressão potente é uma prioridade e/ou onde o pequeno tamanho do promotor AoHV-1 é útil, por exemplo para deixar mais espaço para transgenes no tamanho limitado do vetor ou genoma viral, em comparação com outros promotores mais longos. Além disso, devido à baixa homologia de sequência com outros promotores comumente usados como hCMV, o promotor AoHV-1 também é útil em aplicações onde há uma preocupação sobre a identidade de sequência entre os dois promotores sendo usados juntos ao mesmo tempo, por exemplo, ao expressar dois diferentes transgenes a partir do mesmo vetor viral ou ao gerar vírus com linhas celulares produtoras que também contêm sequências de promotor hCMV. O promotor AoHV-1 é também adequado para utilização com sequências reguladoras que podem ser utilizadas para modular a transcrição a partir do promotor AoHV-1.
[0033] A presente invenção se refere, portanto, a moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendendo um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene. Em determinadas modalidades, a invenção se refere à utilização de vetores e vírus compreendendo o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene para expressar o transgene em uma célula. Em particular, as modalidades não limitativas, os vetores da presente invenção pode compreender um plasmídeo, um cosmídeo, um fagemídeo, um bacteriófago, um cromossoma bacteriano artificial, um cromossoma artificial de levedura, um cromossoma artificial humano, um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adenoviral, um vetor de vírus adenoassociado, um vetor de alfavírus, um vetor de vírus herpes, um vetor de vírus de Epstein-Barr, um vetor de vírus vaccinia, ou suas combinações ou quiméricos. Os especialistas na técnica reconhecerão que o promotor
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AoHV-1 da presente invenção também será útil em outros vetores utilizados nos campos de expressão gênica e transferência de genes, especialmente aqueles em que a expressão potente é importante e o tamanho global do cassete de expressão é um fator relevante.
[0034] A presente invenção também se refere à utilização de vetores para permitir que as células hospedeiras produzam proteínas heterólogas, ou outros produtos de expressão de interesse. Por exemplo, vetores plasmidiais compreendendo o promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene pode ser utilizado para expressar uma proteína heteróloga na célula. Tais vetores plasmidiais podem ser sequências de DNA contendo, por exemplo, (1) o promotor AoHV-1; (2) uma sequência de consenso de Kozak para o transgene para a iniciação da tradução; (3) uma região codificante para o transgene, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica para um polipeptídeo desejado; (4) uma sequência de terminação para o transgene que permite que a tradução seja terminada quando todo o código para o transgene tiver sido lido; sinais de poliadenilação, e/ou ou sequências intervenientes e outros elementos conhecidos dos especialistas na técnica para expressar transgenes a partir de certos vetores; e (6) opcionalmente, se o vetor não é inserido diretamente no genoma, uma origem de replicação que permite que todo o vetor seja reproduzido uma vez dentro da célula. O vetor pode ser introduzido na célula hospedeira, por exemplo, por transfecção, eletroporação ou infecção, e as células hospedeiras podem ser cultivadas para expressar o transgene.
[0035] Os vetores plasmidiais da presente invenção, em determinadas modalidades incluem também um ou mais sítios de clonagem múltipla (MCS), também chamados de poliligantes, que são segmentos curtos de DNA contendo vários sítios de restrição. Estes sítios de restrição dentro do MCS são tipicamente únicos, ocorrendo apenas uma vez dentro de um dado plasmídeo. MCSs são comumente usados
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15/95 durante procedimentos envolvendo clonagem molecular ou subclonagem e são extremamente úteis em biotecnologia, bioengenharia e genética molecular, porque permitem a inserção de uma unidade de DNA ou várias unidades de DNA na região do MCS, por exemplo, para inserir um cassete de expressão compreendendo um promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene que codifica uma proteína de interesse para a expressão em uma célula.
[0036] A presente invenção também proporciona células transformadas pelos vetores aqui descritos e linhas celulares recombinantes compreendendo o promotor AoHV-1, em que o promotor AoHV-1 está operacionalmente ligado a um transgene. Neste contexto, transformação se refere a qualquer processo pelo qual o material de ácido nucleico heterólogo é introduzido e expresso dentro de uma célula. Assim, a transformação tal como aqui utilizado inclui procedimentos de transfecção transiente e estável, incluindo, mas não limitados àqueles mediados por eletroporação, complexos de lipídeo catiônico/DNA, complexos de proteína/DNA, pinocitose mediada por fosfato de cálcio, vetores virais, etc, onde um ácido nucleico introduzido na célula hospedeira existe extracromossomicamente ou em que os ácidos nucleicos transfectados foram integrados no genoma da célula hospedeira. Os procedimentos de transfecção também podem incluir um segundo ácido nucleico que codifica um marcador selecionável (por exemplo resistência a um antibiótico), que permite a seleção positiva de células de tal modo que o ácido nucleico transfectado contendo o promotor AoHV-1 é mantida. Assim, o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene pode estar presente na linha celular incorporado em, por exemplo, vetores plasmidiais, vetores virais, ou vírus recombinantes para a expressão do transgene a partir do mesmo. Em determinadas modalidades, o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene pode ser integrado no genoma da linha celular recombi
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16/95 nante para expressar o transgene a partir do mesmo.
[0037] A presente invenção também fornece um método para expressar um transgene em uma célula, o transgene compreendendo, por exemplo, um transgene que codifica uma proteína de interesse ou um transgene compreendendo uma sequência não codificante (por exemplo, RNA regulador, tal como um microRNA, RNA de interferência curto (siRNA), ou RNA antissenso, etc.), o método compreendendo proporcionar uma célula com um vetor que compreende o promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene. Em particular, em determinadas modalidades a invenção proporciona um método para a produção de um produto de expressão de interesse em uma célula, em que o promotor AoHV-1 está operacionalmente ligado a um transgene que codifica o produto de interesse expressão, o método compreendendo proporcionar uma célula compreendendo um promotor AoHV -1 operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica o produto de expressão de interesse, e expressando o produto de expressão de interesse na célula. Em determinadas modalidades, o produto de expressão é uma proteína. Em determinadas modalidades, o produto de expressão é a proteína repressora de tetraciclina (TetR). O método pode compreender adicionalmente a colheita do produto de expressão, por exemplo proteína, de interesse, por exemplo a partir das células ou a partir do meio de cultura ou a partir das células e do meio de cultura. O método pode também compreender a purificação da proteína para vários propósitos, incluindo, por exemplo, propósitos de diagnóstico, terapêuticos ou profiláticos, pesquisa, etc. Além disso a proteína purificada de interesse pode ser opcionalmente formulada em uma composição farmacêutica. As proteínas terapêuticas podem incluir, por exemplo, anticoagulantes, fatores de coagulação sanguínea, fatores de crescimento, hormônios, anticorpos, proteínas de fusão Fc, proteínas morfogenéticas ósseas, estrutu
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17/95 ras proteicas modificadas, enzimas e citocinas, por exemplo, quimiocinas, interferons, interleucinas, linfocinas e fatores de necrose tumoral, etc.
[0038] A invenção também proporciona um método para a produção de um vírus, compreendendo a propagação do vírus em uma célula que expressa um gene que tem uma função na propagação referido vírus, em que o referido gene está sob controle de um promotor AoHV1 e em que o referido gene codifica um ácido nucleico (por exemplo, RNA regulador) ou proteína, por exemplo uma proteína que complementa uma deficiência no ciclo de replicação viral ou outra função do vírus (por exemplo, infecção). O vírus pode ser um vírus do tipo selvagem, mas preferencialmente é um vírus recombinante, por exemplo com uma deficiência que torne a replicação deficiente ou a infecção deficiente. Além disso, o referido gene pode ser expresso a partir de um elemento extracromossômico ou preferencialmente a partir do genoma da célula (tal célula pode ser então de uma linha celular estável) e a célula pode ser cultivada em meio de cultura de tal modo que o vírus pode ser colhido e opcionalmente purificado e então usado para infectar outras células, ou formulado em composição farmacêutica, etc. [0039] Uma célula ou uma célula hospedeira de acordo com a invenção pode ser qualquer célula em que o promotor AoHV-1 pode ser ativo. Em determinadas modalidades, a célula é isolada do seu tecido normal e, por exemplo, pode ser cultivada em um meio de cultura (in vitro). Em determinadas modalidades, uma célula ou célula hospedeira de acordo com a invenção é uma célula imortalizada, por exemplo de uma linha celular. Em determinadas modalidades, uma célula ou célula hospedeira de acordo com a invenção é uma célula de mamífero ou de ave, preferencialmente uma célula de mamífero. Alguns exemplos não limitativos de células ou células hospedeiras de acordo com a invenção são células de roedor, células humanas, células de
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18/95 símio, células de cão, células de galinha, etc. Alguns exemplos não limitativos de células ou células hospedeiras de acordo com a invenção são células Vero, uma célula MDCK, uma célula HEK293, uma célula PER.C6, uma célula CHO, uma célula de fibroblasto de embrião de galinha, uma célula de hibridoma, uma célula renal de hamster bebê (BHK), uma célula HeLa, uma célula A549 e similares. O especialista reconhecerá que o promotor AoHV-1 pode ser utilizado em muitas células diferentes para dirigir a expressão de um produto de expressão de interesse e que o tipo de célula não é crítico para a presente invenção.
[0040] Em certos aspectos, a invenção proporciona uma célula produtora em que um promotor AoHV-1 está operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína TetR, preferencialmente em que o promotor AoHV-1 e a sequência que codifica TetR estão integrados no genoma da célula produtora, preferencialmente em que a referida célula é uma célula de mamífero, preferencialmente uma célula humana, e em modalidades particularmente preferidas a célula produtora é derivada de uma célula PER.C6 (consulte, por exemplo, US 5,994,128), por integração no genoma do promotor AoHV-1 e sequência codificante de TetR. Assim, a invenção também fornece uma célula PER.C6 que compreende um transgene integrado no genoma da referida célula, em que o transgene compreende ácido nucleico que compreende um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a uma sequência que codifica TetR. Em uma sua modalidade não limitativa, o transgene tem uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 20. Tais células expressam assim TetR, e podem por exemplo ser utilizadas para a produção de adenovirus recombinante que codifica um produto de expressão de interesse sob o controle de um promotor que pode ser regulada por TetR, por exemplo um CMV ou outro promotor operacionalmente ligado a um ou mais sítios tetO,
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19/95 que pode ser particularmente vantajoso se o produto de expressão de interesse que é codificado pelo adenovirus iria ser tóxico para a célula produtora ou reduziría a estabilidade ou o rendimento do adenovirus recombinante quando produzido durante a propagação do adenovirus. O TetR pode em tais sistemas reprimir o promotor regulado por tetO, por exemplo um promotor hCMV regulado por tetO, durante a produção na célula produtora de modo a que o produto de expressão de interesse não é, ou apenas a níveis muito baixos, produzido durante a propagação e produção de adenovirus recombinante, conduzindo a rendimentos e/ou estabilidade do adenovirus recombinante melhorados durante a produção. Em um aspecto, a invenção também proporciona uma combinação compreendendo: (i) uma célula produtora que compreende um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a uma sequência que codifica TetR, e (ii) um adenovirus recombinante que compreende uma sequência que codifica um produto de expressão de interesse operacionalmente ligado a um promotor que está operacionalmente ligado a um ou mais sítios tetO.
[0041] A presente invenção também proporciona métodos para o tratamento de doenças genéticas, metabólicas ou adquiridas com vetores e vírus compreendendo o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene. O método compreendendo o contato de uma célula com uma quantidade suficiente de vetor ou vírus da presente invenção compreendendo o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene em que a célula é transformada de tal forma que o transgene é expresso na célula. A célula pode ser transformada in vitro, ex vivo, ou in vivo.
[0042] Um aspecto importante de vetores, sejam vetores de DNA como vetores de plasmídeos ou vetores virais, tais como vetores adenovirais, é a capacidade de estes vetores acomodarem sequências transgênicas desejadas. Uma tal capacidade pode ser limitada por li
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20/95 mitações de tamanho dos vetores, que podem, por exemplo, tornar-se instáveis ou mesmo impossíveis de produzir se certos limites de tamanho forem excedidos. O espaço ocupado por um promotor é, portanto, uma consideração importante ao conceber novos vetores, além das capacidades funcionais que tais promotores devem ter. O presente promotor AoHV-1 tem a vantagem de ser relativamente curto, significando que com um determinado limite de tamanho de um vetor, fica mais espaço para o transgene, por exemplo permitindo incluir mais epítopos se um transgene for um imunogênio ou permitindo expressão de proteínas maiores, em comparação com outros promotores de maior tamanho. Uma outra vantagem do promotor AoHV-1 da presente invenção é a possibilidade de combiná-lo com o promotor hCMV em um sistema, por exemplo ambos os promotores em uma molécula de ácido nucleico tal como um vetor, ou um promotor em uma linha celular e o outro promotor em uma molécula de ácido nucleico tal como um vetor presente na linha celular, com risco muito limitado a nenhum risco de recombinação homóloga entre as sequências do promotor devido à baixa homologia de sequência entre o promotor AoHV-1 e o promotor hCMV.
[0043] Tal como aqui utilizado, os termos baixa homologia de sequência e baixa identidade de sequência como se relacionam com a sequência do promotor hCMV, se referem a sequências de promotor com menos do que cerca de 50% de identidade com o promotor hCMV, e preferencialmente com menos do que cerca de 40% de identidade com o promotor hCMV. Além disso, as sequências do promotor com baixa homologia de sequência e baixa identidade de sequência preferencialmente também não têm seções de alinhamento idêntico contínuo mais longas do que cerca de 15 ácidos nucleicos, ou mais preferencialmente não têm seções de alinhamento idêntico mais longas do que cerca de 14 ácidos nucleicos. Em uma determinada moda
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21/95 lidade preferida, o promotor é o promotor AoHV-1 curto (SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NQ:30) e a identidade com o promotor hCMV é de 36% e não existem seções de alinhamento idêntico contínuo superior a 14. ácidos nucleicos. Em outras modalidades preferidas, o promotor compreende um fragmento da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NQ:30 que tem atividade de promotor, por exemplo SEQ ID NO:25 ou SEQ ID NO:26. Tal como aqui utilizado, o alinhamento se refere a métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, por exemplo, utilizando algoritmos tais como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para alinhar e comparar diferentes sequências de nucleotídeos ou proteínas (Altschul, Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990).
[0044] A presente invenção também proporciona células ou organismos transgênicos transformadas por vetores ou vírus que compreendem o promotor hCMV e o promotor AoHV-1, em que o promotor hCMV e o promotor AoHV-1 estão operacionalmente ligados a transgenes, de modo a que ambos os transgenes são expressos nas células ou no organismo transgênico. O promotor hCMV e o promotor AoHV-1 podem estar presentes em moléculas separadas (por exemplo, um promotor em um plasmídeo ou em um vírus e o outro promotor no genoma da célula, ou ambos os promotores em um plasmídeo diferente, ou ambos os promotores no genoma da célula), ou ambos os promotores podem estar presentes em uma única molécula (por exemplo, em um cromossomo do genoma, ou em um plasmídeo, ou em um genoma de um vírus).
[0045] A invenção também proporciona um método para a produção de um vírus recombinante, em que um transgene é potentemente expresso quando o vírus é introduzido em uma célula alvo, o método compreendendo: preparação de um construto compreendendo um promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene, e incorporando o referido construto no vírus recombinante e, em seguida, intro
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22/95 duzindo o vetor em uma célula, por exemplo, por infecção com o vírus. A preparação do construto propriamente dita abrange o uso de métodos padrão de clonagem molecular que são bem conhecidos (consulte, por exemplo, (Holterman et al., 2004; Lemckert et al., 2006; Vogeis etaL, 2003); Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.- edição, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al., eds, 1987; a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995), como são conhecidos pelo especialista na técnica e realizados de rotina no campo da tecnologia de vetor recombinante ou vírus recombinante, e exemplificados no presente documento. O promotor AoHV-1 tem as características tal como descrito acima, e em vista da presente descrição, podem ser obtido por métodos de rotina, tais como PCR ou de novo síntese de ácido nucleico. Para conveniência, o especialista na técnica pode manipular um genoma viral por clonagem em fragmentos menores, por exemplo, uma primeira parte para a parte esquerda do genoma de um adenovirus até à região E1 para manipulação fácil e introdução dos transgenes em forma de plasmídeo e uma segunda parte maior para o restante do genoma que pode, por recombinação com a primeira parte, resultar em um genoma adenoviral completo (consulte, por exemplo, WO 99/55132).
[0046] Ácido nucleico heterólogo ou um gene heterólogo (também aqui referido como um transgene, ou gene de interesse), por exemplo em vetores ou vírus ou células da invenção é ácido nucleico que não está naturalmente presente no vetor ou vírus ou célula, ou que não está operacionalmente ligado ao promotor AoHV-1 na natureza. É introduzido no vetor ou vírus ou célula, por exemplo, por técnicas padrão de biologia molecular. Pode, em determinadas modalidades, codificar uma proteína de interesse ou parte da mesma. Em tais casos,
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23/95 a proteína de interesse pode ser referida como uma proteína heteróloga, uma vez que não é naturalmente codificada por uma sequência operacionalmente ligada ao promotor AoHV-1 na natureza. Um transgene pode, por exemplo, ser clonado em um vetor plasmidial ou em uma região E1 ou E3 deletada de um vetor adenoviral. Em algumas modalidades da invenção, o cassete de expressão com um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene é colocado na região E1 de um genoma adenoviral. Em algumas modalidades da invenção, o cassete de expressão com um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene é colocado na região E3 de um genoma adenoviral. Em algumas modalidades da invenção, o cassete de expressão com um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene é colocado entre a região E4 e a ITR direita de um genoma adenoviral. Em outras modalidades, o cassete de expressão com um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene está presente em um vetor plasmidial. Em outras modalidades, o cassete de expressão com um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene é integrado no genoma de uma célula. Tais células ou linhas celulares podem ser utilizadas para expressar de forma recombinante o transgene, por exemplo cultivando as células sob condições em que o promotor é ativo (se a versão não regulada do promotor for utilizada, isto é, se não forem adicionados elementos reguladores ao promotor, esta expressão ocorrerá automaticamente após a cultura) e conduzirá a expressão do transgene.
[0047] Como usado no presente documento, os termos promotor ou região promotora ou elemento promotor são usados indistintamente e referem-se a um segmento de uma sequência de ácido nucleico, tipicamente, mas não limitado a, DNA, que controla a transcrição da sequência de ácido nucleico à qual está operacionalmente ligado. A região promotora inclui sequências específicas que são sufici
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24/95 entes para o reconhecimento, ligação e início da transcrição pela RNA polimerase. Além disso, a região promotora pode incluir, opcionalmente, sequências que modulam essa atividade de reconhecimento, ligação e início da transcrição da RNA polimerase. Essas sequências podem ser cis-atuantes ou podem ser responsivas a fatores transatuantes. Além disso, os promotores podem ser constitutivos ou regulados, dependendo do tipo de regulação.
[0048] Um especialista na técnica estará ciente de que os promotores são construídos a partir de trechos de sequências de ácido nucleico e frequentemente compreendem elementos ou unidades funcionais nesses trechos de sequências de ácido nucleico, tais como um sítio de início da transcrição, um sítio de ligação da RNA polimerase, sítios de ligação de fatores de transcrição gerais, tais como uma TATA box, sítios de ligação de fatores de transcrição específicos, e similares. Outras sequências reguladoras também podem estar presentes, tais como potenciadores, e às vezes introns ao final de uma sequência de promotor. Tais unidades funcionais podem ser diretamente adjacentes uma à outra, mas também podem estar separadas por seções de ácido nucleico que não têm um papel direto na função do promotor. O especialista na técnica pode referir-se aos exemplos aqui para testar se os nucleotídeos na seção do ácido nucleico são relevantes para a função do promotor, e testar o efeito de remover ou adicionar nucleotídeos a uma determinada sequência de promotor por métodos padrão de biologia molecular, por exemplo para minimizar seu comprimento enquanto retém a atividade do promotor ou para otimizar a atividade. Também podem ser introduzidas mutações no promotor para reduzir (seções de) identidade para outros promotores (por exemplo, hCMV) se estes promotores estão destinados a estar presentes ou utilizados simultaneamente na mesma célula.
[0049] Como usado no presente documento, o termo potenciador
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25/95 se refere a sequências de DNA reguladoras, por exemplo, de 50 a 1500 pb, às quais proteínas (proteínas ativadoras) se podem ligar para estimular ou potenciar a transcrição de um gene ou vários genes. Essas proteínas ativadoras (também conhecidas como fatores de transcrição) interagem com o complexo mediador e recrutam a polimerase II e os fatores de transcrição gerais que então começam a transcrição dos genes. Os potenciadores são geralmente cis-atuantes, mas podem estar localizados a montante ou a jusante do sítio de iniciação do gene ou genes que regulam. Além disso, um potenciador pode se encontrar no sentido direto ou reverso e não precisa estar localizado próximo ao sítio de iniciação da transcrição para afetar a transcrição, pois alguns foram encontrados localizados várias centenas de milhares de pares de bases a montante ou a justante do sítio de iniciação. Intensificadores podem ser também encontrados dentro de introns.
[0050] As sequências no presente documento são fornecidas na direção 5' para 3', como é costume na técnica. Note também que os termos a montante e a jusante são em relação ao sentido da transcrição como são comumente usados na técnica. Por exemplo, por convenção, os termos a montante e a jusante referem-se ao sentido 5' a 3' no qual a transcrição de RNA ocorre. A montante é em direção à extremidade 5' da molécula de RNA e a jusante é em direção à extremidade 3'. No caso de DNA de fita dupla, a montante é em direção à extremidade 5' da fita codificante para o gene em questão e a jusante é em direção à extremidade 3'. Devido à natureza antiparalela do DNA, isso significa que a extremidade 3' da fita molde está a montante do gene e a extremidade 5' está a jusante.
[0051] Um promotor AoHV-1, de acordo com a invenção, contém preferencialmente uma sequência de caixa TATA, tal como uma sequência localizada nas posições 251 a 258 na SEQ ID NO: 25. Uma caixa TATA, como definida no presente documento, é uma sequência
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26/95 de DNA que pode ser ligada pela proteína de ligação a TATA (TBP) e que tem a sequência de consenso TATAWAWR (em que W é A ou T e R é A ou G). Geralmente está localizada a cerca de 25-35 pares de bases a montante do sítio de iniciação da transcrição. Em determinadas modalidades, um promotor AoHV-1 da invenção compreende a sequência TATATAAG da caixa TATA (posições 251-258 na SEQ ID NO: 25). O especialista apreciará que a referida sequência de caixa TATA (isto é, TATATAAG) de um promotor AoHV-1 pode ser substituída por uma sequência de caixa TATA canônica semelhante, isto é uma que corresponde à sequência de consenso TATAWAWR (em que W é A ou T e R é A ou G), sem uma redução significativa antecipada da atividade do promotor.
[0052] Um promotor AoHV-1, de acordo com a invenção, pode também conter um (putativo) elemento iniciador (Inr) tal como situado nas posições 280 a 286 na SEQ ID NO: 25 (sequência: CCATTCG). Em modalidades onde um Inr está presente, a substituição da referida sequência Inr (ou seja, CCATTCG) de um promotor AoHV-1 por outra sequência em grande parte aderente à sequência Inr YYANWYY (onde Y representa C ou T, N é A, C, G, ou T e W é A ou T) não é esperada que afete significativamente a atividade do referido promotor. [0053] Em determinadas modalidades em que está presente um putativo Inr, um promotor AoHV-1 compreende uma caixa TATA correspondente às posições 251-258, bem como as sequências até cerca do nt 286, na SEQ ID NO: 25. Sem querer estar limitado pela teoria, pode ser benéfico para certas modalidades de um promotor AoHV-1 da invenção compreender uma caixa TATA e um Inr, em que a sequência Inr está localizada a cerca de 25-40, por exemplo cerca de 2936 nt a jusante do primeiro nt da caixa TATA.
[0054] Também em modalidades onde não está presente Inr, prefere-se incluir pelo menos cerca de 25-35 pares de bases a jusante da
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27/95 caixa TATA e a montante da sequência codificante do gene de interesse operacionalmente ligado. O presente pedido inclui pelo menos um exemplo de um promotor AoHV-1 que já não compreende uma sequência Inr de consenso na localização natural de cerca de 29-35 nt a jusante do primeiro nt da caixa TATA, mas tal promotor ainda está ativo, demonstrando que a sequência Inr nessa posição não é essencial para um promotor funcional.
[0055] Um promotor AoHV-1 de acordo com a invenção é aqui definido como uma sequência tendo atividade de promotor e compreendendo uma sequência tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade, ou sendo 100% idêntica, a um fragmento de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300 ou 350 nucleotídeos da SEQ ID NO: 25. Preferencialmente, o referido fragmento inclui um fragmento de pelo menos 50 nt tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade, ou sendo 100% idêntico, aos nt 237-286 da SEQ ID NO: 25, e preferencialmente, os referidos pelo menos 50 nt incluem uma sequência TATAWAWR (sequência de caixa TATA de consenso), em uma posição correspondente a cerca de nt 251-258 na SEQ ID NO: 25.
[0056] Em determinadas modalidades preferidas, por conseguinte, um promotor AoHV-1 da invenção compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com os nt 237-286 da SEQ ID NO: 25.
[0057] Os truncamentos 3' dos promotores AoHV-1 desta invenção podem provavelmente ser feitos a jusante de cerca do nt 286 em SEQ ID NO: 25 (isto é, a jusante do Inr putativo, o qual contém o sítio de início da transcrição esperado, que é esperado que seja no nucleotídeo 282 nesta sequência) sem fortes efeitos sobre a atividade do pro
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28/95 motor, enquanto que maiores truncamentos 3' que removem o sítio putativo Inr/início da transcrição ou, especialmente, que removem ambos os referidos sítios putativos Inr/início da transcrição e a referida caixa TATA, estão previstos para resultar em uma redução significativa da atividade do promotor. De fato, versões 3' truncadas do promotor AoHV-1 curto (SEQ ID NO: 30) que não compreendem sequências AoHV-1 a jusante do nucleotídeo 399 (ou seja, incluindo apenas 1 nucleotídeo AoHV-1 a jusante do putativo Inr, com referência a SEQ ID NO: 30, correspondente ao nucleotídeo 287 na SEQ ID NO: 25) mostraram-se ainda ativas como promotores.
[0058] É aqui demonstrado que um fragmento de promotor relativamente curto (SEQ ID NO: 26) compreendendo apenas 120 nucleotídeos a montante da sua caixa TATA ainda tem atividade promotora significativa, que pode ser aumentada um pouco mais pela adição de sequências a montante adicionais (como por exemplo na SEQ ID NO: 25). Em contraste, a extensão do promotor curto AoHV-1 (SEQ ID NO: 30) na sua extremidade 3' (isto é, a jusante do sítio Inr putativo/início da transcrição) por inclusão de determinadas sequências a jusante adicionais (como por exemplo na SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29) não parece adicionar muita atividade.
[0059] Em modalidades preferidas, um promotor AoHV-1 da invenção compreende um fragmento que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntico, ou é 100% idêntico aos nucleotídeos 201 a 286 da SEQ ID NO:25.
[0060] Em modalidades mais preferidas, um promotor AoHV-1 da invenção compreende um fragmento que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntico, ou é 100% idêntico aos nucleotídeos 187 a 286 da SEQ ID NO:25.
[0061] Em modalidades mais preferidas, um promotor AoHV-1 da invenção compreende um fragmento que é pelo menos 95%, 96%,
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97%, 98%, 99% idêntico, ou é 100% idêntico aos nucleotídeos 137 a 286 da SEQ ID NO:25.
[0062] Em modalidades mais preferidas, um promotor AoHV-1 da invenção compreende um fragmento que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntico, ou é 100% idêntico aos nucleotídeos 131 a 286 da SEQ ID NO: 25.
[0063] Em modalidades mais preferidas, um promotor AoHV-1 da invenção compreende um fragmento que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntico, ou é 100% idêntico aos nucleotídeos 87 a 286 da SEQ ID NO:25.
[0064] Em modalidades mais preferidas, um promotor AoHV-1 da invenção compreende um fragmento que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntico, ou é 100% idêntico aos nucleotídeos 37 a 286 da SEQ ID NO:25.
[0065] Em modalidades mais preferidas, um promotor AoHV-1 da invenção compreende um fragmento que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntico, ou é 100% idêntico aos nucleotídeos 1 a 286 da SEQ ID NO:25.
[0066] Em determinadas modalidades, um promotor AoHV-1 da invenção compreende preferencialmente uma sequência possuindo pelo menos 98% de identidade com pelo menos 200 nucleotídeos da SEQ ID NO:26 (compreendendo novamente pelo menos o Inr e sequências a montante incluindo caixa TATA e sequências mais a montante, por exemplo pelo menos cerca de nt 87-286 da SEQ ID NO: 25), mais preferencialmente compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade, ou sendo 100% idêntica, a SEQ ID NO:26, ainda compreende mais preferencialmente uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade, ou sendo 100% idêntica, a SEQ ID NO: 25. Em determinadas modalidades, o promotor AoHV-1 compreende um fragmento entre 240 e 1500 nucleotídeos,
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30/95 preferencialmente entre 240 e 1000 nucleotídeos, mais preferencialmente entre 240 e 500 nucleotídeos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica, ou é 100% idêntica, a um fragmento da SEQ ID NO: 32, em que o referido fragmento da SEQ ID NO: 32 inclui um fragmento que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntico, ou é 100% idêntico, aos nucleotídeos 201 a 286 da SEQ ID NO:25 (que correspondem aos nucleotídeos 1359 a 1444 da SEQ ID NO: 32).
[0067] A presente invenção proporciona um potente promotor AoHV-1 com um tamanho relativamente pequeno, que podem ser altamente vantajosos no contexto de limitações de tamanho de vetores transportando transgenes (ou seja, transgenes maiores podem ser acomodados e/ou os vetores podem permanecer mais estáveis). Assim, o promotor AoHV-1 da presente invenção tem preferencialmente menos de 2000 nucleotídeos (2 kb) em comprimento, preferencialmente menos de 1 kb, mais preferencialmente menos de 0,8 kb. Em determinadas modalidades preferidas, o promotor AoHV-1 tem menos de 700, menos de 650, menos de 600, menos de 550, menos de 500 nucleotídeos de comprimento. Em determinadas modalidades preferidas, o promotor AoHV-1 tem pelo menos 200, pelo menos 240, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400 nucleotídeos de comprimento. Em determinadas modalidades preferidas, o promotor AoHV-1 tem de 200 a 500, por exemplo 240 a 485, nucleotídeos de comprimento. Como mostrado aqui, apesar de ter uma sequência relativamente curta, este novo promotor AoHV-1 foi surpreendentemente capaz de dirigir a expressão potente do transgene ao qual está operacionalmente ligado.
[0068] Um especialista na técnica irá reconhecer que mutações podem ser realizadas nas sequências fornecidas e os promotores resultantes podem ser testados em relação à atividade de promotor por
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31/95 métodos de rotina. Também variantes de sequências podem existir na natureza, por exemplo em diferentes isolados de um vírus, e assim tais variantes podem ter algumas diferenças na sequência nucleotídica, mas mantêm a mesma funcionalidade. Tipicamente, uma sequência que tem pelo menos 90% de identidade com as sequências de promotor indicadas terá ainda atividade funcional e será, portanto, considerada um promotor AoHV-1. Assim, o promotor AoHV-1 da presente invenção compreende preferencialmente uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, ou é 100% idêntica, para as sequências preferidas do promotor AoHV-1 aqui fornecidas, tais como para qualquer uma de SEQ ID NO:1, 30, 25 ou 26. O especialista saberá também que o comprimento das sequências das diferentes porções das sequências do promotor fornecidas pode variar até certo ponto e podem ser obtidos resultados essencialmente semelhantes. O teste se um fragmento ou sequência mutante das sequências do promotor aqui exemplificadas ainda tem atividade de promotor, pode ser realizado sem trabalho desnecessário por um especialista na técnica com a informação aqui divulgada.
[0069] Uma modalidade preferida de um promotor AoHV-1 da presente invenção é o promotor AoHV-1 compreendendo a SEQ ID NO:26. O promotor AoHV-1 da presente invenção tem preferencialmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO:26, ou com um seu fragmento com pelo menos 50, 100, 150 ou 200 nucleotídeos. Em uma determinada modalidade preferida, o promotor AoHV-1 é 100% idêntico a SEQ ID NO:26 ou a um seu fragmento de pelo menos 50, 100, 150 ou 200 nucleotídeos.
[0070] Um promotor AoHV-1 adicional preferido da presente invenção é o promotor AoHV-1 compreendendo a SEQ ID NO:25. Em
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32/95 determinadas modalidades, o promotor AoHV-1 da presente invenção tem preferencialmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, ou é 100% idêntico, a SEQ ID NO:25, ou com um seu fragmento com pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300 ou 350 nucleotídeos. Em uma determinada modalidade preferida, o promotor AoHV-1 é 100% idêntico a SEQ ID NO:25 ou a um seu fragmento de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300 ou 350 nucleotídeos.
[0071] Em uma modalidade adicional, um promotor preferido AoHV-1 da presente invenção é o promotor curto AoHV-1 compreendendo SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NQ:30. Em determinadas modalidades, o promotor AoHV-1 da presente invenção tem preferencialmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com SEQ ID NO:1, ou com um seu fragmento com pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 nucleotídeos. Em uma determinada modalidade preferida, o promotor AoHV-1 é 100% idêntico a SEQ ID NO:1 ou 100% idêntico a SEQ ID NQ:30, ou a um fragmento de uma destas de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 nucleotídeos.
[0072] Em outras modalidades, um promotor AoHV-1 da invenção compreende uma sequência com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade, ou que é 100% idêntica, a SEQ ID NO:22.
[0073] Em outras modalidades, um promotor AoHV-1 da invenção compreende uma sequência com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade, ou que é 100% idêntica, a SEQ ID NO:23.
[0074] Em outras modalidades, um promotor AoHV-1 da invenção compreende uma sequência com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade, ou que é 100% idênti
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33/95 ca, a SEQ ID NO:27.
[0075] Em outras modalidades, um promotor AoHV-1 da invenção compreende uma sequência com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade, ou que é 100% idêntica, a SEQ ID NO:28.
[0076] Em outras modalidades, um promotor AoHV-1 da invenção compreende uma sequência com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade, ou que é 100% idêntica, a SEQ ID NO:29.
[0077] Em determinadas outras modalidades, um promotor AoHV1 da presente invenção compreende um promotor nuclear (SEQ ID NO:31) ligado operacionalmente com uma ou mais sequências do óperon e/ou sequências potenciadoras para modular a transcrição, por exemplo, sequências tetO, sequências do óperon cumato, potenciadores de pares potenciador-promotor de ocorrência natural como SV40 ou hCMV (Foecking & Hofstetter, 1986), potenciadores sintéticos (Schlabach, Hu, Li, & Elledge, 2010), ou outras sequências reguladoras que são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Como aqui utilizado, o termo promotor nuclear pretende significar uma unidade funcional mínima do promotor com uma atividade de promotor muito baixa por si, mas que pode dirigir a expressão potente de um transgene quando o promotor nuclear é combinado com uma ou mais sequências reguladoras para modular a transcrição a partir do promotor nuclear, por exemplo sequências tetO que podem ser ligadas pela proteína transativadora controlada por tetraciclina (tTA). Consulte, por exemplo (Smale, 2001), para uma discussão sobre sequências de promotor nuclear.
[0078] Um transgene operacionalmente ligado ao promotor AoHV1 pode ser expresso de forma potente. Como aqui utilizado, expresso potentemente ou expressão potente significa que a expressão do
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34/95 promotor AoHV-1, medida por exemplo por uma de diferentes técnicas de detecção de proteínas tais como Western Blot, análise FACS, ou outros ensaios usando luminescência ou fluorescência, é pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou preferencialmente cerca de 100%, ou mais do que a expressão do promotor hCMV (tendo SEQ ID NO:4). De notar que o promotor hCMV é muito mais forte em comparação com outros promotores comumente usados tais como promotores hPGK, UBI C ou RSV LTR (Powell, Rivera-Soto, & Gray, 2015). Os promotores hCMV são derivados da região precoce imediata principal (mIE, do inglês major immediate early) do citomegalovírus humano e são frequentemente utilizados para a expressão gênica potente em vetores de vacinas e terapia gênica. Por exemplo, uma sequência de promotor hCMV pode ser derivada do lócus mIE da estirpe AD169 de hCMV (X03922) e incluir sítios de ligação ao NF1, a região de potenciador, TATA box e parte do primeiro éxon. São conhecidas outras sequências de promotor hCMV que podem ser mais curtas (por exemplo, contendo apenas a região do potenciador e promotor e sem sítios de ligação ao NF1) ou mais longas (por exemplo, incluindo sítios de ligação a fatores celulares adicionais e a sequência do primeiro íntron). Foi observado que todos esses promotores hCMV que diferem em termos de comprimento são promotores ubiquamente ativos potentes. Exemplos de promotores hCMV truncados são divulgados na US 7,407,801, aqui incorporada por referência. Como aqui utilizado, um promotor hCMV compreende uma sequência com pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com nt 578-736, preferencialmente com nt 564-736, da SEQ ID NO: 4. Um fragmento de nt 578-736 da SEQ ID NO: 4 mostrou ter atividade de promotor em experiências no nosso laboratório (não mostrado), e uma sequência com alguns desemparelhamentos em nt 564
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736 da SEQ ID NO: 4 demonstrou proporcionar bons níveis de expressão por outros (por exemplo, US 7,407,801 B2, SEQ ID NO: 1 nesta). Em determinadas modalidades, um promotor hCMV compreende uma sequência com pelo menos 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. Nas comparações dos níveis de expressão, como descritas no presente documento, a sequência de promotor hCMV foi SEQ ID NO:4. Por exemplo, o nível de expressão a partir do promotor AoHV-1 da presente invenção em um vetor é preferencialmente pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou preferencialmente 100%, ou mais do nível de expressão a partir do vetor onde o transgene está sob o controle de um promotor hCMV de SEQ ID NO:4. Além disso, sabe-se a partir de rAd que expressa um antígeno sob o controle de um promotor hCMV que a expressão é suficiente para gerar respostas imunológicas de células T e células B significativas. Similarmente, espera-se que a expressão de um transgene expresso por um promotor AoHV-1 da presente invenção a partir de um rAd gere uma resposta imunológica de células T e células B significativa em relação ao transgene. Por exemplo, se o transgene codificava um antígeno para desencadear uma resposta imunológica quando administrado a um sujeito, espera-se que a expressão potente do transgene gere uma resposta imunológica mensurável contra o antígeno.
[0079] O termo cerca de para valores numéricos, como usado na presente descrição, significa o valor ± 10%.
[0080] Os termos sequência codificante, sequência de codificação ou codificante são usados indistintamente no presente documento e referem-se à sequência de ácido nucleico que é transcrita (DNA) e traduzida (RNAm) em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando operacionalmente ligada a sequências reguladoras apropriadas.
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36/95 [0081] Um sinal de poliadenilação, por exemplo, o sinal poliA do hormônio de crescimento bovino (US 5,122,458) ou um sinal poliA de SV40, pode estar presente atrás dos transgenes.
[0082] Sequências reguladoras adicionais podem ser também adicionadas aos construtos compreendendo o promotor AoHV-1 da presente invenção. O termo sequência reguladora é utilizado indistintamente com elemento regulador no presente documento e se refere a um segmento de ácido nucleico, tipicamente, mas não limitado a, DNA, que modula a transcrição da sequência de ácido nucleico à qual está operacionalmente ligado, e assim atua como um modulador transcricional. Esta modulação da expressão pode ser especialmente útil em casos onde a expressão de uma proteína é tóxica para a célula hospedeira, por exemplo, onde a expressão é letal para uma célula hospedeira ou afeta negativamente o crescimento celular e/ou reduz ou elimina a produção de proteína. Além disso, a modulação da expressão também pode ser útil nos casos em que a expressão provoca instabilidade do vetor ou quando o momento da expressão é uma consideração para uma experiência realizada in vitro ou in vivo. Uma sequência reguladora compreende frequentemente sequências de ácidos nucleicos que são reconhecidas pelos domínios de ligação a ácidos nucleicos de proteínas de transcrição e/ou fatores de transcrição que ativam ou reprimem a transcrição. Por exemplo, uma sequência reguladora pode incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, etc.) sequências do óperon de tetraciclina (sítios tetO), de modo que a expressão é inibida na presença da proteína repressora da tetraciclina (tetR), ver por exemplo WO 1999/000510 A1. Um exemplo de uma sequência tetO única é CCCTATCAGTGATAGAG (SEQ ID NO:14). Na ausência de tetraciclina, a proteína tetR é capaz de se ligar aos sítios tetO e reprimir a transcrição de um gene operacionalmente ligado aos sítios tetO. Na presença de tetraciclina, no entanto,
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37/95 uma alteração conformacional na proteína tetR impede que se ligue às sequências do operador, permitindo que ocorra a transcrição de genes operacionalmente ligados. Em determinadas modalidades, um vetor ou rAd da presente invenção pode opcionalmente incluir um ou mais sítios tetO operacionalmente ligados ao promotor AoHV-1, de tal forma que a expressão de um ou mais transgenes é inibida nos vetores que são produzidos na linha celular produtora na qual a proteína tetR é expressa. Subsequentemente, a expressão não seria inibida se o vetor fosse introduzido em um sujeito ou em células que não expressam a proteína tetR (consulte, por exemplo, WO 07/ 073513). Em determinadas outras modalidades, vetores da presente invenção podem opcionalmente incluir um sistema de troca de genes de cumato, no qual a regulação da expressão é mediada pela ligação do repressor (CymR) ao sítio do operador (CuO), operacionalmente ligado, por exemplo colocando-o próximo do sítio de início da transcrição do promotor (consulte, por exemplo, (Mullick et al., 2006)). Em outras modalidades, o sistema repressor lac bem conhecido é combinado com o promotor da invenção, em que um ou mais sítios do óperon lac estão ligados operacionalmente ao promotor, de modo que a ligação da proteína repressora lac pode ser utilizada para regular a expressão.
[0083] Como usado no presente documento, o termo repressor refere-se a entidades (por exemplo, proteínas ou outras moléculas) que têm a capacidade de inibir, interferir, retardar e/ou reprimir a produção de produto proteico heterólogo de um vetor de expressão recombinante. Por exemplo, por interferência com um sítio de ligação em um local apropriado ao longo do vetor de expressão, tal como em um cassete de expressão. Exemplos de repressores incluem tetR, CymR, o repressor lac, o repressor trp, o repressor gal, o repressor lambda, e outros repressores apropriados conhecidos na técnica.
[0084] Os termos operacionalmente ligado ou operativamente
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38/95 ligado são usados indistintamente no presente documento e referemse à relação funcional das sequências de ácido nucleico com sequências nucleotídicas reguladoras, tais como promotores, potenciadores, sequências de repressor, sítios de terminação de transcrição e tradução, e outras sequências sinal e indicam que dois ou mais segmentos de DNA estão unidos de tal forma que funcionem em conjunto para suas finalidades pretendidas. Por exemplo, a ligação operativa de sequências de ácido nucleico, tipicamente DNA, a uma sequência reguladora ou região promotora refere-se à relação física e funcional entre o DNA e a sequência reguladora ou promotor de modo que a transcrição de tal DNA seja iniciada a partir da sequência reguladora ou promotor por uma RNA polimerase que reconhece especificamente, se liga a e transcreve o DNA. De modo a otimizar a expressão e/ou transcrição in vitro pode ser possível modificar a sequência reguladora para a expressão do ácido nucleico ou DNA no tipo celular para o qual é expresso. A conveniência ou necessidade de tal modificação pode ser empiricamente determinada.
[0085] A invenção também proporciona um método para expressar um transgene em uma célula, compreendendo o método proporcionar à célula um vírus recombinante, por exemplo um adenovirus recombinante, compreendendo um promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene. O fornecimento de um adenovirus recombinante a uma célula pode ser realizado por administração do adenovirus a um sujeito ou por introdução (por exemplo, infecção) do adenovirus em uma célula in vitro ou ex vivo. Em determinadas modalidades, a invenção proporciona um vetor adenoviral recombinante para uso na expressão de um transgene em uma célula, por exemplo, por administração do adenovirus recombinante a um sujeito.
[0086] A presente invenção também proporciona um método para expressar um transgene em uma célula, compreendendo o método
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39/95 proporcionar à célula um vírus recombinante, por exemplo um adenovirus recombinante, que compreende o promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene que codifica um produto de expressão, tal como uma proteína de interesse, por exemplo, em que a proteína de interesse é uma proteína terapêutica ou um antígeno.
[0087] A invenção também proporciona um método de indução de uma resposta imunológica contra um antígeno, compreendendo administrar a um sujeito um vetor, por exemplo, um adenovirus recombinante compreendendo um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene. A invenção também proporciona um vetor ou um adenovirus recombinante de acordo com a invenção para uso na indução de uma resposta imunológica contra um antígeno.
[0088] O promotor AoHV-1 da invenção pode, em determinadas modalidades, ser usado, por exemplo, para dirigir a expressão de um antígeno, com o objetivo de gerar uma resposta imunológica dos antígenos em uma aplicação de vacina. A identidade do transgene não é material para a presente invenção, que é adequada, por exemplo, com vetores ou adenovirus compreendendo qualquer transgene. Os transgenes adequados são bem conhecidos do especialista na técnica e, por exemplo, podem incluir grelhas de leitura aberta de transgene, por exemplo, grelhas de leitura aberta que codificam polipeptídeos que têm um efeito terapêutico, por exemplo, para fins de terapia gênica, ou polipeptídeos contra os quais é desejada uma resposta imunológica quando o vetor, por exemplo o vetor rAd, é usado para fins de vacinação. Os ácidos nucleicos heterólogos particularmente preferidos são os genes de interesse que codificam determinantes antigênicos contra os quais uma resposta imunológica tem de ser gerada. Tais determinantes antigênicos também são tipicamente chamados de antígenos. Quando o vetor recombinante é administrado a um sujeito, uma resposta imunológica será gerada contra o(s) antígeno(s). Qualquer antí
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40/95 geno desejado pode ser codificado pelo vetor. Em modalidades típicas de acordo com a invenção, os antígenos são peptídeos, polipeptídeos ou proteínas de organismos que podem causar uma doença ou patologia. Portanto, em uma modalidade preferencial adicional, o referido ácido nucleico heterólogo de interesse codifica um determinante imunogênico (ou antigênico). Mais preferencialmente, o referido determinante imunogênico é um antígeno de uma bactéria, um vírus, fungo ou parasita. As doenças causadas por tais organismos são geralmente chamadas de doença infecciosa (e não estão, portanto, limitadas a organismos que infectam, mas também incluem aqueles que entram no hospedeiro e provocam uma doença). Os chamados autoantígenos, por exemplo, antígenos tumorais, também fazem parte do estado da técnica, e podem ser codificados por ácidos nucleicos heterólogos nos vetores recombinantes de acordo com a presente invenção. Exemplos não limitativos, a partir dos quais os determinantes antigênicos (ou antígenos) são tomados, são os organismos causadores de malária, tais como Plasmodium falciparum, um organismo causador de tuberculose, tal como Mycobacterium tuberculosis, fungos ou vírus. Em outras modalidades preferenciais, os antígenos de vírus, tais como flavivírus (por exemplo, vírus do Oeste do Nilo, vírus da hepatite C, vírus da encefalite japonesa, vírus da dengue, vírus zika), vírus da ebola, vírus da imunodeficiência humana (VIH) e vírus de Marburgo, podem ser usados em composições de acordo com a presente invenção. Modalidades exemplificativas não limitativas de antígenos são a proteína CS ou uma sua parte imunogênica de P. falciparum, uma proteína de um antígeno, ou uma proteína de fusão de vários antígenos de M. tuberculosis, tais como o Ag85A, Ag85B e/ou as proteínas TB10.4 ou suas parte(s) imunogênicas, uma glicoproteína viral ou uma sua parte imunogênica, tal_ como GP de um filovírus, tal_ como o vírus Ebola ou vírus de Marburg, uma proteína do HIV, tais como gag, pol,
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41/95 env, nef, ou suas variantes, ou uma proteína HA, NA, M, ou NP, ou parte imunogênica de qualquer uma destas, de virus influenza, ou um antígeno do vírus sincicial respiratório (RSV), por exemplo proteína F de RSV ou proteína G de RSV, ou ambas, ou outras proteínas de RSV, um antígeno do vírus do papiloma humano ou outro vírus, etc. O vetor recombinante, por exemplo rAd pode codificar um antígeno, mas também podem codificar opcionalmente dois antígenos diferentes de um mesmo organismo, ou opcionalmente combinações de antígenos a partir de organismos diferentes, por exemplo um primeiro antígeno a partir de um primeiro organismo e segundo antígeno a partir de um segundo organismo. É também possível codificar um antígeno e, por exemplo, um adjuvante no mesmo vetor tal como um vetor rAd, por exemplo, um antígeno e um agonista de receptor semelhante a Toll (TLR), tal como um agonista de TLR3, tal como um dsRNA ou um seu mimético, ou similar (por exemplo, WO 2007/100908). Em determinadas modalidades, o vetor recombinante, por exemplo adenovirus recombinante, codifica dois antígenos diferentes, um sob o controle do promotor AoHV-1 e um sob o controle de um promotor diferente, por exemplo, o promotor hCMV. Em outras modalidades, o vetor ou vírus recombinante codifica um antígeno e um modulador imunológico, um dos quais está sob controle do promotor AoHV-1 e o outro está sob controle de um promotor diferente, por exemplo, o promotor hCMV. Em determinadas modalidades, sequências heterólogas ou transgenes adicionais podem estar presentes no vetor ou vírus recombinante além do transgene que está sob o controle do promotor AoHV-1.
[0089] A invenção também proporciona uma molécula de DNA recombinante compreendendo o promotor AoHV-1 da presente invenção operacionalmente ligado a um transgene. A invenção também proporciona o genoma de um adenovirus recombinante que compreende o promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene. Um espe
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42/95 cialista na técnica estará ciente de que isso também pode ser uma combinação de pelo menos duas moléculas de DNA recombinante diferentes que juntas podem formar a molécula de DNA recombinante única da invenção. Tais moléculas são úteis na manipulação do genoma e criação de novos adenovirus recombinantes. O genoma codifica as proteínas que são necessárias para a replicação do adenovirus e empacotamento em células permissivas.
[0090] O termo recombinante, no caso de um adenovirus recombinante, como usado no presente documento, implica que foi modificado pelo homem ao contrário dos adenovirus de tipo selvagem, por exemplo, compreendendo um gene, genes ou partes dos mesmos e um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene.
[0091] Vetores adenovirais, métodos de construção dos mesmos e métodos de propagação dos mesmos são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes dos E.U.A. N.os 5.559.099, 5.837.511, 5.846.782, 5.851.806, 5.994.106, 5.994.128, 5.965.541, 5.981.225, 6.040.174, 6.020.191, 6.113.913 e 8.932.607 e Thomas Shenk, Adenoviridae and their Replication M. S. Horowitz, Adenoviruses, Capítulos 67 e 68, respectivamente, em Virology, B. N. Fields et al., eds., 3- ed., Raven Press, Ltd., Nova Iorque (1996), e outras referências mencionadas no presente documento. Tipicamente, a construção de vetores adenovirais envolve a utilização de técnicas de biologia molecular convencionais que são bem conhecidas na técnica, tais como as descritas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2.- ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2- ed., Scientific American Books (1992), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, Nova Iorque (1995), e outras referências mencionadas no presente documento.
[0092] Um adenovirus de acordo com a invenção pertence à famí
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43/95 lia de Adenoviridae e de preferência é um que pertence ao gênero Mastadenovirus. Pode ser um adenovirus humano, mas também um adenovirus que infecta outras espécies, incluindo, mas sem limitação, um adenovirus bovino (por exemplo, adenovirus bovino 3, BAdV3), um adenovirus canino (por exemplo, CAdV2), um adenovirus porcino (por exemplo, PAdV3 ou 5) ou um adenovirus de símio (que inclui um adenovirus de macaco e um adenovirus de símio, tal como um adenovirus de chimpanzé ou um adenovirus de gorila). Preferencialmente, o adenovirus é um adenovirus humano (HAdV ou AdHu; na presente invenção entende-se um adenovirus humano se for feita referência a Ad sem indicação da espécie, por exemplo, a breve notação Ad5 significa o mesmo que HAdV5, que é o adenovirus humano do sorotipo 5) ou um adenovirus de símio como o adenovirus de chimpanzé ou gorila (ChAd, AdCh ou SAdV) ou um adenovirus do macaco rhesus (RhAd). [0093] A maioria dos estudos avançados foram realizados utilizando os adenovirus humanos, e os adenovirus humanos são os preferidos de acordo com determinados aspectos da invenção. Em determinadas modalidades preferenciais, o adenovirus recombinante de acordo com a invenção é baseado em um adenovirus humano. Em modalidades preferenciais, o adenovirus recombinante é baseado em um adenovirus humano do sorotipo 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 ou 50. De acordo com uma modalidade particularmente preferencial da invenção, um adenovirus é um adenovirus humano de um dos sorotipos 26 e 35. Uma vantagem destes sorotipos é uma baixa soroprevalência e/ou baixos títulos de anticorpos neutralizantes pré-existentes na população humana. A preparação de vetores rAd26 é descrita, por exemplo, em WO 2007/104792 e em (Abbink et al., 2007). Sequências genômicas exemplificativas de Ad26 se encontram no GenBank com o Acesso EF 153474 e na SEQ ID NO:1 de WO 2007/104792. A preparação de vetores rAd35 é descrita, por exemplo, em US 7.270.811, em WO
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00/70071 e em (Vogels et al., 2003). Sequências exemplificativas do genoma de Ad35 são encontradas no GenBank com o acesso AC_000019 e na Fig. 6 de WO 00/70071.
[0094] As sequências da maioria dos adenovirus humanos e não humanos acima mencionados são conhecidas, e para outros podem ser obtidas utilizando procedimentos de rotina.
[0095] Um adenovirus recombinante de acordo com a invenção pode ser competente para replicação ou deficiente para replicação.
[0096] Em determinadas modalidades, o adenovirus é deficiente para replicação, por exemplo, porque contém uma deleção na região E1 do genoma. Uma deleção na região E1 significa uma deleção nessa região em comparação a um adenovirus do tipo selvagem e significa uma deleção em pelo menos uma das regiões codificantes E1A, E1B 55K ou E1B 21K, de preferência uma deleção das regiões codificantes E1A, E1B 55K e E1B21K. Tal como é conhecido pelo especialista na técnica, no caso de deleções de regiões essenciais do genoma do adenovirus, as funções codificadas por essas regiões têm de ser fornecidas em trans, de preferência, pela célula produtora, ou seja, quando uma parte ou a totalidade das regiões E1, E2 e/ou E4 são deletadas do adenovirus, estas têm de estar presentes na célula produtora, por exemplo integradas no genoma da mesma, ou sob a forma dos chamados adenovirus auxiliares ou plasmídeos auxiliares. O adenovirus também pode ter uma deleção na região E3, que é dispensável para replicação, e, desse modo essa deleção não tem de ser complementada.
[0097] A célula produtora (por vezes também referida na técnica e aqui como célula de empacotamento ou célula complementar) que pode ser utilizada pode ser qualquer célula produtora em que um adenovirus desejado pode ser propagado. Por exemplo, a propagação de vetores adenovirais recombinantes é realizada em células produtoras
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45/95 que complementam deficiências no adenovirus. Tais células produtoras, de preferência, têm no seu genoma pelo menos uma sequência E1 de adenovirus e, assim, são capazes de complementar adenovirus recombinantes com uma deleção na região E1. Pode ser utilizada qualquer célula produtora complementar de E1, tal como as células de retina humana imortalizadas por E1, por exemplo, células 911 ou PER.C6 (consulte, por exemplo, US 5,994,128), amniócitos transformados com E1 (consulte, por exemplo, EP 1230354), células A549 transformadas com E1 (consulte, por exemplo, WO 98/39411, US 5.891.690), células GH329:Hel_a (Gao, Engdahl e Wilson, 2000), células 293 e similares. Em determinadas modalidades, as células produtoras são, por exemplo, células HEK293 ou células PER.C6 ou células 911 ou células IT293SF e similares.
[0098] Além dos adenovirus, os especialistas na técnica reconhecerão que outros vírus também são apropriados para uso como vetores virais usando o promotor AoHV-1 da presente invenção. Por exemplo, os vírus adenoassociados (AAV), vírus do herpes simples (HSV), paramixovírus tais como o vírus do sarampo, alfavírus, vírus EBNA, retrovirus, poxvirus e lentivírus, e similares, também podem ser manipulados para incluírem o promotor AoHV-1 da presente invenção. Consulte, por exemplo, revisões sobre diferentes vetores como discutidos em (Heilbronn e Weger, 2010; Robbins e Ghivizzani, 1998; Walther e Stein, 2000).
[0099] Para administração a humanos, pode ser empregue composições farmacêuticas, por exemplo, compreendendo um vetor, um vírus recombinante, ou uma proteína recombinante expressa usando métodos da presente invenção, por exemplo, rAd ou uma proteína recombinante expressa usando o promotor AoHV-1 da presente invenção, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. No presente contexto, o termo Farmaceuticamente aceitável significa
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46/95 que o transportador ou excipiente, nas dosagens e concentrações empregues, não causará efeitos indesejados ou prejudiciais nos sujeitos aos quais eles são administrados. Tais transportadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (consulte Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.- edição, A. R. Gennaro, Editor, Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer e L. Hovgaard, Editores, Taylor & Francis [2000]; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3.- edição, A. Kibbe, Editor, Pharmaceutical Press [2000]). Um vetor, por exemplo rAd, ou proteína, purificado é preferencialmente formulado e administrado como uma solução estéril, embora seja também possível utilizar preparações liofilizadas. As soluções esterilizadas são preparadas por filtração esterilizada ou por outros métodos conhecidos per se na técnica. As soluções são então liofilizadas ou colocadas em recipientes de dosagem farmacêutica. O pH da solução está geralmente na gama de pH 3,0 a 9,5, p.ex. pH 5,0 a 7,5. Um vetor ou rAd ou proteína está tipicamente em uma solução com um tampão adequado, e a solução também pode conter um sal. Opcionalmente, o agente estabilizante pode estar presente, tal como a albumina. Em determinadas modalidades, detergente é adicionado. Em determinadas modalidades, vetor, rAd ou proteína pode ser formulado em uma preparação injetável. Estas formulações contêm quantidades eficazes do ingrediente farmacêutico, por exemplo vetor, rAd ou proteína, são soluções estéreis líquidas, suspensões líquidas ou versões liofilizadas e opcionalmente contêm estabilizadores ou excipientes. As preparações farmacêuticas podem ser preparadas para diferentes vias de administração, por exemplo injeção intramuscular ou intradérmica, inalação, administração intravenosa, administração oral, etc.
[00100] Exemplos de formulações de adenovirus são o Padrão Mundial de Adenovirus (Hoganson et al., 2002): Tris a 20 mM, pH 8,
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NaCI a 25 mM, glicerol a 2,5%; ou Tris a 20 mM, MgCh a 2 mM, NaCI a 25 mM, sacarose a 10% p/v, polissorbato-80 a 0,02% p/v; ou tampão citrato a 10-25 mM pH 5,9-6,2, hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HBCD) a 4-6% (p/p), NaCI a 70-100 mM, polissorbato-80 a 0,018-0,035% (p/p) e opcionalmente etanol a 0,3-0,45% (p/p). Obviamente, podem ser utilizados muitos outros tampões e são conhecidos vários exemplos de formulações adequadas para o armazenamento e para a administração farmacêutica de preparações farmacêuticas purificadas.
[00101] Em determinadas modalidades uma composição compreendendo um vetor ou vírus recombinante da invenção, por exemplo, rAd, compreende adicionalmente um ou mais adjuvantes. Adjuvantes são conhecidos na técnica por aumentar ainda mais a resposta imunológica a um determinante antigênico aplicado, e composições farmacêuticas compreendendo adenovirus e adjuvantes adequados são, por exemplo, divulgadas em WO 2007/110409, incorporada no presente documento por referência. Os termos adjuvante e estimulante imunológico são usados indistintamente no presente documento, e são definidos como uma ou mais substâncias que provocam a estimulação do sistema imunológico. Neste contexto, um adjuvante é usado para melhorar uma resposta imunológica aos vetores adenovirais da invenção. Exemplos de adjuvantes adequados incluem sais de alumínio tais como hidróxido de alumínio e/ou fosfato de alumínio; composições de emulsão em óleo (ou composições óleo-em-água), incluindo emulsões de esqualeno-água, tais como MF59 (consulte, por exemplo, WO 90/14837); formulações de saponina, tais como, por exemplo, QS21 e Complexos Imunoestimulantes (ISCOMS) (consulte, por exemplo, US 5,057,540; e WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); derivados bacterianos ou microbianos, exemplos dos quais são o monofosforil lipídeo A (MPL), MPL 3-O-desacilado (3dMPL), oligonucleotídeos contendo motivo CpG, toxinas bacterianas
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ADP-ribosilantes ou seus mutantes, tais como enterotoxina termolábil LT de E. coli, toxina da cólera CT e similares. É também possível utilizar adjuvante codificado por vetor, por exemplo, utilizando ácido nucleico heterólogo que codifica uma fusão do domínio de oligomerização da proteína de ligação a C4 (C4bp) ao antígeno de interesse (Ogun, Dumon-Seignovert, Marchand, Holder e Hill, 2008) ou ácido nucleico heterólogo que codifica um agonista de receptor semelhante a Toll (TLR), tal como um agonista de TLR3, tal como um dsRNA (consulte, por exemplo, WO 2007/100908), ou ácido nucleico heterólogo que codifica uma citocina imunoestimulante, por exemplo, uma interleucina, por exemplo IL-12 (consulte, por exemplo, US 5,723,127) ou similares.
[00102] Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção pode, em determinadas modalidades, ser uma vacina.
[00103] A administração de um vetor ou vírus recombinante da invenção, por exemplo, composições de adenovirus, pode ser realizada usando vias padrão de administração. Modalidades não limitantes incluem a administração parenteral, tal como por injeção, por exemplo, intradérmica, intramuscular, etc., ou por via subcutânea ou transcutânea, ou administração na mucosa, por exemplo, por via intranasal, oral e similares. O especialista conhece as várias possibilidades para administrar uma composição, por exemplo, uma vacina, de modo a induzir uma resposta imunológica ao(s) antígeno(s) na vacina.
[00104] As composições de adenovirus podem ser administradas a um sujeito, por exemplo, um indivíduo humano. A dose total do adenovirus fornecida a um sujeito durante uma administração pode ser variada, como é conhecido pelo profissional especialista, e é geralmente entre 1x107 partículas virais (pv) e 1x1012 pv, de preferência entre 1x108 pv e 1x1011 pv, por exemplo, entre 3x108 e 5x1010 pv, por exemplo, entre 109 e 3x1010 pv.
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49/95 [00105] Um sujeito, como usado no presente documento, é de preferência um mamífero, por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo, ou um primata não humano ou um ser humano. Preferencialmente, o sujeito é um sujeito humano.
[00106] Também é possível proporcionar uma ou mais administrações de reforço de uma ou mais vacinas. Se um reforço de vacinação for realizado, tipicamente, uma tal vacinação de reforço será administrada ao mesmo sujeito a um momento entre uma semana e um ano, de preferência entre duas semanas e quatro meses após a administração da composição ao sujeito pela primeira vez (que, em tais casos, é chamada de vacinação primária). Em regimes alternativos de reforço, também é possível administrar diferentes vetores, por exemplo, um ou mais adenovirus de sorotipo diferente, ou outros vetores, tais como o MVA ou DNA, ou proteína, ao sujeito como uma vacinação primária ou de reforço.
[00107] Várias publicações que podem incluir patentes, pedidos publicados, artigos técnicos e artigos escolares são citadas por todo o relatório descritivo entre parênteses, e as citações completas de cada uma podem ser encontradas no final do relatório descritivo. Cada uma dessas publicações citadas é incorporada por referência no presente documento, em sua totalidade.
Modalidades [00108] A modalidade 1 é uma molécula de ácido nucleico compreendendo um promotor precoce imediato principal de Herpesvirus Aotine (promotor AoHV-1) operacionalmente ligado a um transgene heterólogo.
[00109] A modalidade 2 é um vetor plasmidial compreendendo um promotor AoHV-1 seguido por um sítio de clonagem múltipla.
[00110] A modalidade 3 é a molécula de ácido nucleico recombinante da modalidade 1 ou um vetor plasmidial da modalidade 2, em
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50/95 que o promotor AoHV-1 está operacional mente ligado a uma sequência reguladora que modula a transcrição do promotor AoHV-1.
[00111] A modalidade 4 é a molécula de ácido nucleico recombinante da modalidade 1 ou um vetor plasmidial da modalidade 2, em que o promotor AoHV-1 está operacional mente ligado a uma sequência reguladora compreendendo uma ou mais sequências do óperon de tetraciclina (sítios tetO).
[00112] A modalidade 5 é um vetor recombinante ou um vírus recombinante, compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das modalidades 1,3 ou 4.
[00113] A modalidade 6 é um vetor recombinante, de acordo com a modalidade 5, em que o vetor é um vetor plasmidial.
[00114] A modalidade 7 é um vírus recombinante, de acordo com a modalidade 5, em que o vírus é um adenovirus.
[00115] A modalidade 8 é um adenovirus recombinante, de acordo com a modalidade 7, em que o adenovirus tem uma deleção em uma região do seu genoma.
[00116] A modalidade 9 é o adenovirus recombinante da modalidade 8, em que a deleção é na região E1, na região E3, ou na região E1 e na região E3.
[00117] A modalidade 10 é uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a modalidade 1,3 ou 4, um vetor plasmidial de acordo com a modalidade 2, 3 ou 4, ou um vetor recombinante ou o vírus recombinante de acordo com qualquer uma das modalidades 5-9.
[00118] A modalidade 11 é uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor AoHV-1 no seu genoma, preferencialmente em que o referido promotor está operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse.
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51/95 [00119] A modalidade 12 é uma célula compreendendo: (i) uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um primeiro transgene, e (ii) uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor hCMV operacionalmente ligado a um segundo transgene.
[00120] A modalidade 13 é um vetor compreendendo: (i) uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um primeiro transgene, e (ii) uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor hCMV operacionalmente ligado a um segundo transgene.
[00121] A modalidade 14 é um método de produção de um adenovirus recombinante compreendendo um promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene, em que o transgene é expresso de forma potente quando o adenovirus infecta uma célula alvo, compreendendo o método:
a) preparar um construto compreendendo o promotor AoHV-1 operacionalmente ligado a um transgene; e
b) incorporar o referido construto no genoma do adenovirus recombinante.
[00122] A modalidade 15 é um método de produção de uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor AoHV-1 ligado operacionalmente a um transgene que codifica uma proteína de interesse, o método compreendendo a clonagem molecular do transgene em ligação operável a um promotor AoHV-1.
[00123] A modalidade 16 é uma molécula de DNA recombinante compreendendo o genoma de um adenovirus recombinante, de acordo com qualquer uma das modalidades 7-9.
[00124] A modalidade 17 é um método para a preparação da célula da modalidade 11, compreendendo a introdução de um promotor AoHV-1 dentro da célula e que integra o promotor AoHV-1 no genoma,
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52/95 preferencialmente em que o referido promotor está operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse. [00125] A modalidade 18 é um método para produzir um produto de expressão de interesse, compreendendo a expressão de um transgene que codifica o produto de expressão de interesse em uma célula hospedeira, em que o transgene está operacionalmente ligado a um promotor AoHV-1.
[00126] A modalidade 19 é o método da modalidade 18, em que o produto de expressão é uma proteína.
[00127] A modalidade 20 é um método para a expressão de um transgene de interesse, compreendendo a expressão em uma célula hospedeira do transgene a partir da molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das modalidades 1, 3, 4, 5 ou 6.
[00128] A modalidade 21 é o método da modalidade 20, em que o transgene de interesse codifica uma proteína de interesse que é expressa na célula hospedeira.
[00129] A modalidade 22 é o método da modalidade 19 ou 21, compreendendo adicionalmente a colheita da proteína de interesse a partir da célula hospedeira ou a partir de um meio de cultura em que a célula hospedeira é cultivada, ou da célula hospedeira e do meio de cultura.
[00130] A modalidade 24 é um método para produzir um vírus, compreendendo a propagação do vírus em uma célula que expressa um gene que tem uma função na propagação do referido vírus, em que o referido gene está sob controle de um promotor AoHV-1.
[00131] A modalidade 25 é o método da modalidade 24, em que o referido vírus não produz o referido gene na forma funcional a partir do seu próprio genoma, e em que o referido gene é essencial para a replicação do referido vírus.
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53/95 [00132] A modalidade 26 é uma composição farmacêutica compreendendo um vetor recombinante ou um vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das modalidades 5-9, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00133] A modalidade 27 é uma célula de acordo com a modalidade
11, em que o promotor AoHV-1 no genoma está operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica uma proteína repressora de tetraciclina (TetR).
[00134] A modalidade 28 é uma célula de acordo com a modalidade
12, em que o primeiro transgene codifica TetR.
[00135] A modalidade 29 é uma célula de acordo com a modalidade
28, que compreende adicionalmente um adenovirus recombinante o qual compreende a molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor hCMV operacionalmente ligada ao segundo transgene.
[00136] A modalidade 30 é uma célula de acordo com a modalidade
29, em que o promotor hCMV pode ser regulado por TetR, por exemplo estando operacionalmente ligado a um ou mais sítios tetO.
[00137] A modalidade 31 é uma célula de acordo com a modalidade 27, 28, 29 ou 30, em que a célula é uma célula PER.C6.
[00138] A modalidade 32 é um método de acordo com a modalidade 20, em que o transgene codifica TetR.
[00139] A modalidade 33 é um método de acordo com a modalidade 32, em que a célula é uma célula PER.C6.
[00140] A modalidade 34 é um método para a propagação de um adenovirus recombinante, o método compreendendo a propagação de um adenovirus recombinante que codifica para um transgene sob o controle de um promotor hCMV que está operacionalmente ligado a um ou mais sítios tetO em uma célula de acordo com a modalidade 27, 29 ou 31, e preferencialmente isolando o adenovirus recombinante.
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54/95 [00141] A modalidade 35 é qualquer uma das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com o nt 237-286 da SEQ ID NO: 25.
[00142] A modalidade 36 é qualquer uma das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que tem pelo menos 86% de identidade, preferencialmente pelo menos 90% de identidade, preferencialmente pelo menos 96% de identidade, preferencialmente pelo menos 98% de identidade, mais preferencialmente 100 % identidade, com o nt 237-286 da SEQ ID NO: 25.
[00143] A modalidade 37 é qualquer uma das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que tem pelo menos 90% de identidade com o nt 131-286 da SEQ ID NO: 25.
[00144] A modalidade 38 é qualquer uma das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:31.
[00145] A modalidade 39 é qualquer uma das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende entre 240 e 1500 nucleotídeos, preferencialmente entre 240 e 1000 nucleotídeos, mais preferencialmente entre 240 e 500 nucleotídeos da SEQ ID NO:32.
[00146] A modalidade 40 é qualquer uma das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende a SEQ ID NO:26.
[00147] A modalidade 41 é qualquer uma das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica a um fragmento de pelo menos 300 nucleotídeos da SEQ ID NO:25.
[00148] A modalidade 42 é qualquer uma das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende a SEQ ID NO:25.
[00149] A modalidade 43 é qualquer das modalidades anteriores, em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica a um fragmento de pelo menos 400 nucleotídeos
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55/95 da SEQ ID N0:1.
[00150] A modalidade 44 é a modalidade 43, em que o promotor AoHV-1 compreende a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NQ:30.
[00151] A modalidade 45 é uma célula compreendendo um transgene que compreende a SEQ ID NO: 20, preferencialmente dentro do genoma da célula.
[00152] A modalidade 46 é uma célula, de acordo com a modalidade 45, em que a célula é uma célula PER.C6.
EXEMPLOS [00153] Sem descrição adicional, acredita-se que uma pessoa de habilidade comum na técnica pode, com o uso da descrição anterior e dos métodos e exemplos ilustrativos a seguir, produzir e utilizar a presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Os exemplos de trabalho a seguir, portanto, apontam especificamente determinadas modalidades, características e vantagens da presente invenção e não devem ser interpretados como limitantes de qualquer modo do restante da revelação. Os exemplos servem meramente para clarificação da invenção.
Métodos Cultura celular:
[00154] As células HEK293 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro fetal bovino (FBS) a 10%. As células Vero foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo (MEM, Life Technologies) suplementado com soro fetal bovino a 5% (FBS). As células PER.C6 (Fallaux et al., 1998) foram cultivadas em meio DMEM com soro fetal bovino (FBS) a 10%, suplementado com MgCh a 10 mM.
[00155] As células PER.C6-hCMV.TetR (aqui descritas) foram cultivadas em meio semelhante ao descrito acima para as células PER.C6 mas suplementadas com 2 pg/mL de Blasticidina (Gibco A11139-03).
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56/95 [00156] A subcultura de células acima foi realizada de acordo com protocolos padrão usando Enzima TrypLE Select (ThermoFisher, CatNo.: 12563011) para separar as células.
plasmídeos pAdApt35:
[00157] Diferentes construtos de promotor foram clonados em pAdApt35 (Vogei et al., 2007), utilizando sítios de restrição Avril e HindiII. Um gene que codifica para a luciferase de vagalume foi inserido usando os sítios de restrição Hindlll e Xbal, resultando em plasmídeos pAdApt em que o gene Luc é expresso sob os diferentes promotores testados (pAdapt35.P.Luc). Estes plasmídeos foram usados no Exemplo
1.
Análise da expressão em células HEK293 transfectadas transientemente.
[00158] As células HEK293 foram plaqueadas em placas de 6 múltiplos poços de Poli-L-lisina (PLL) revestidas e transfectadas com 1 pg de plasmídeo pAdapt.P.Luc usando Lipofectamina de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Life Technologies). Posteriormente, as placas de ensaio foram incubadas 24 horas a 37 Ό, 10% de CO2. A atividade de Luciferase foi medida 24 h após a transfecção em lisados celulares na presença de DTT a 0,1% (1 M) em Luminômetro de Microplacas Luminoskan™ Ascent. Como um controle da eficiência de transfecção, um plasmídeo que codifica a Fosfatase Alcalina embrionária segregada foi cotransfectado (80 ng/poço). Os níveis de SEAP foram medidos utilizando 0 Kit de Quimioluminescência Clontech Great EscAPe™ SEAP 2.0 e uma estação de trabalho Trilux Microbeta. A análise da expressão em células HEK293 transfectadas transientemente é utilizada no Exemplo 1.
Análise de expressão da Luciferase de Gaussia sob o controle do promotor artificial responsivo a tTA 7xTetO-AoHV-1 em células Vero transfectadas transientemente
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57/95 [00159] As células Vero foram inoculadas em placas de 96 múltiplos poços com uma densidade de 1,25x104 células/poço. As células foram transfectadas 1 dia após a inoculação com um plasmídeo derivado de pDuaILuc contendo o gene da luciferase de Gaussia sob o controle de 7xtetO-AoHV-1. Além do plasmídeo de Luciferase, as células foram cotransfectadas com um plasmídeo que codifica a proteína transativadora controlada por tetraciclina (tTA), ou com um plasmídeo de controle negativo (pBluescript). A transfecção das células foi realizada utilizando Lipofectamina 3000 de acordo com o protocolo do fabricante (Life Technologies). A atividade da luciferase foi medida às 24 horas após a transfecção utilizando o kit de Ensaio Duplo da Luciferase Pierce Gaussia-Firefly (Thermo Scientific) em um Luminômetro de Microplacas de Luminoskan™ Ascent. Para controlar a eficiência de transfecção, as unidades de luciferase de Gaussia medidas foram normalizadas para níveis de luciferase de vagalume vermelha (para as quais o cassete de expressão, dirigido por AoHV-1 curto, estava localizado no mesmo plasmídeo pDuaILuc). A análise de expressão em células Vero transfectadas transientemente foi realizada no Exemplo 2.
Análise de expressão da Luciferase de Gaussia sob o controle de variantes do promotor AoHV-1 em células PER.C6 transfectadas transientemente [00160] As células PER.C6 foram inoculadas em placas de 96 múltiplos poços com uma densidade de 5x104 células/poço. As células foram transfectadas 1 dia após a inoculação usando os plasmídeos pDuaILuc contendo o gene da luciferase de Gaussia sob o controle de diferentes variantes do promotor AoHV-1, como descrito no Exemplo
6. A transfecção das células foi realizada utilizando Lipofectamina 2000 CD de acordo com o protocolo do fabricante (Life Technologies). A atividade da luciferase foi medida nos lisados celulares às 24 horas após a transfecção utilizando o kit de Ensaio Duplo da Luciferase Pier
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58/95 ce Gaussia-Firefly (Thermo Scientific) e um Luminômetro de Microplacas de Luminoskan™ Ascent. Para controlar a eficiência de transfecção, as unidades de luciferase de Gaussia medidas foram normalizadas para níveis de luciferase de Red Firefly (para as quais o cassete de expressão, dirigido por AoHV-1 curto, estava localizado no mesmo plasmídeo pDuaILuc). Esta seção de métodos é aplicável para o Exemplo 6.
Células PER.C6-hCMV.TetR e PER.C6-AoHV.TetR [00161] Dois tipos de células PER.C6 expressando estavelmente TetR foram gerados e usados aqui.
[00162] Primeiro, as células PER.C6-hCMV.TetR, que expressam TetR sob o controle de um promotor hCMV, foram geradas por transfecção estável de células PER.C6 com o plasmídeo pCDNA6/TR (Thermo Fisher Scientific Cat. No.: V102520) de acordo com os procedimentos padrão descritos no protocolo do fabricante.
[00163] Em segundo lugar, as células PER.C6-A0HV.TetR, que expressam TetR sob controle do promotor AoHV-1 curto, foram geradas por transfecção estável de células PER.C6 com 0 plasmídeo pC_AoHV_TetR de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 5 (e a seção de métodos referida no mesmo).
Geração de Clone Celular de células PER.C6-hCMV.TetR expressando um gene adicional de interesse sob controle de um promotor AoHV-1 curto regulado por TetR [00164] As células PER.C6-hCMV.TetR foram inoculadas 1 dia antes da transfecção em um frasco de cultura T80. O plasmídeo utilizado para a transfecção carrega um gene de interesse (GOI) sob 0 controle do promotor AoHV.2xtetO (SEQ ID NO: 7). Adicionalmente, contém um cassete de expressão do gene da neomicina-fosfotransferase II controlado pelo promotor derivado de SV40. O plasmídeo foi construído através da substituição, por meio de várias etapas de clonagem, do
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59/95 promotor hCMV contendo fragmento Mfel-Xbal de pcDNA2004Neo(-) (acesso do GenBank FB674876) por um fragmento compreendendo AoHV.2xtetO seguido pela sequência codificante de GOI. A transfecção foi feita com Lipofectamina 2000 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). No dia após a transfecção, as células foram subcultivadas e inoculadas 1:2, 1:4, 1:8 e 1:16 em placas de cultura de 10 cm. Um dia após a inoculação, o meio de cultura de células foi substituído por meio PER.C6-hCMV.TetR suplementado com 0,5 mg/mL de Geneticina (Gibco 10131-019). O meio foi substituído 2x por semana. Os clones foram escolhidos 2-3 semanas após a transfecção. Esta seção de métodos é aplicável para o Exemplo 3.
Western Blot para analisar a expressão de um gene de interesse [00165] As células inoculadas foram incubadas durante 2 dias com ou sem Doxiciclina (1 pg/mL) e colhidas em tampão RIPA (NaCI a 150 mM, Triton X100 a 1%, Doxicolato a 0,5%, SDS a 0,1% tris-HCI a 50mM).
[00166] As amostras foram carregadas em um gel bis-tris a 10% (Invitrogen NP0301PK2) e processadas em tampão MOPS (Invitrogen NP0001). O gel de SDS foi transferido em um sistema iBlot2 (Invitrogen) e as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Invitrogen IB23001). A membrana foi bloqueada durante a noite a 4 Ό em tampão de bloqueio (LI-COR 927-40000). A membrana Western blot foi incubada com anticorpo primário (1:200 de camundongo policlonal contra o vírus Ad35 (interno)) em tampão de bloqueio durante 2 horas e lavada com TBST. Western blot foi incubada com anticorpo secundário (1:5000 de Cabra anti-ratinho-800CW) em tampão de bloqueio durante 1 hora e lavou-se várias vezes com TBST. A visualização foi feita no LI-COR Odessey Imager. Esta seção de métodos é aplicável para o Exemplo 3.
Geração do plasmídeo de luciferase duplo pDuaILuc
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60/95 [00167] O pDualLuc (SEQ ID NO:21) é um plasmídeo portador de dois cassetes de expressão: um primeiro cassete de expressão expressando luciferase de Gaussia (Glue) sob o controle do promotor do citomegalovírus humano (hCMV) e um segundo cassete expressando luciferase de vagalume vermelha (RFL) sob controle do promotor AoHV-1 curto. Dentro do pDualLuc, os cassetes de expressão Glue e RFL estão posicionados em uma orientação cauda para cauda em relação um ao outro.
[00168] O pDualLuc foi gerado por várias etapas de síntese e subclonagem de genes realizadas em GeneArt (Life Technologies). Primeiro, os fragmentos sintéticos CMV_GLuc_SV (SEQ ID NO:17) e AoHV1_RFL_BGH (SEQ ID NO:19), que transportam os respectivos cassetes de expressão, foram gerados e clonados em um plasmídeo GeneArt padrão (pMK-RQ). Subsequentemente, o fragmento sintético AoHV1_RFL_BGH foi adicionalmente subclonado no construto contendo CMV_GLuc_SV, utilizando os sítios de restrição Mlul e Nsil.
[00169] A sequência do promotor de CMV dirigindo luciferase de Gaussia de pDualLuc é flanqueada por sítios de restrição únicos Xhol e Hindlll, o que permite a substituição deste promotor por sequências de promotor alternativas, como aqui foi feito nos Exemplos 2 e 6.
Geração de plasmídeo do genoma do vetor Ad26 pAd26.dE1.dE3.5orf6 [00170] pAd26.dE1 .dE3.5orf6 é um plasmídeo contendo um genoma do vetor Ad26 completo que transporta uma deleção de E1, uma deleção de E3 e uma substituição de Ad26 E4 orf6 pela de Ad5, conforme descrito para vetores baseados em Ad26 gerados anteriormente (Abbink et al., 2007). A estrutura principal do plasmídeo pAd26.dE1 .dE3.5orf6 compreende uma origem de replicação pMB1 e um gene de resistência à ampicilina, e é derivado a partir de pBR322 (acesso do GenBank J01749.1). O pAd26.dE1 .dE3.5orf6 contém ainda
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61/95 um sítio único de restrição AsiSI em vez da deleção E1 no genoma do vetor, e um único sítio de restrição Pad entre a região E4 e a repetição terminal invertida direita (RITR) do genoma do vetor. Estes sítios podem ser usados para inserir cassetes de transgene nos respectivos sítios. Finalmente, o genoma do vetor adenoviral dentro de pAd26.dE1 .dE3.5orf6 é flanqueado em cada um dos seus terminais por um sítio de restrição Swal, permitindo a sua libertação da estrutura principal do plasmídeo por digestão com Swal.
[00171] A construção de pAd26.dE1 .dE3.5orf6 envolveu várias etapas de síntese e clonagem. Uma sequência de 2 kb (SEQ ID NO:16) contendo um fragmento da extremidade esquerda e um da extremidade direita do genoma do vetor Ad26 (desejado) foi sintetizada em Geneart/Life Technologies. O fragmento do genoma do vetor da extremidade esquerda desta sequência abrange a partir da repetição terminal invertida esquerda (LITR) do genoma do vetor até, e incluindo, o sítio Sfil que corresponde ao sítio Sfil nas posições 3755 a 3767 do genoma viral Ad26 (tipo selvagem) (acesso do GenBank EF153474.1). O fragmento do genoma viral da extremidade direita se estende a partir do sítio Nhel correspondente ao sítio de Nhel nas posições 34079 a 34084 do genoma viral Ad26 do tipo selvagem até, e incluindo, a ITR direita (RITR). A sequência sintetizada foi concebida para transportar a deleção de E1 (a partir da posição 472 a 3365 de Ad26, acesso do GenBank EF153474.1) assim como os sítios de restrição mencionados acima (isto é, o sítio AsiSI no lugar da deleção de E1, o sítio Pad e entre E4 e RITR, e os dois sítios Swal flanqueiam diretamente as sequências do genoma do vetor). O fragmento de síntese de genes contendo adicionalmente dois sítios de restrição exteriores para facilitar a clonagem: um sítio Mfel foi incluído no lado da extremidade esquerda, enquanto que um sítio Asei foi incluído no lado da extremidade direita. O fragmento sintetizado foi ligado, como um fragmento de restrição
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Mfel-Asel, ao pBR322 digerido com EcoRI e Ndel (acesso ao GenBank J01749.1) (substituindo assim o fragmento de 2,3 kb EcoRI-Ndel contendo o gene de resistência à tetraciclina de pBR322), levando à abolição dos sítios de restrição que foram digeridos para gerar os respectivos fragmentos de ligação. O plasmídeo resultante, que transporta as extremidades esquerda e direita do genoma do vetor, foi finalmente usado para construir pAd26.dE1 .dE3.5orf6 por duas etapas de clonagem sequenciais. Primeiro, um fragmento de restrição do genoma do vetor Sfil-Nhel Ad26 de 12,7 kb derivado de pWE.Ad26.dE3.5orf6 (Abbink et al., 2007) foi ligado ao plasmídeo extremidade esquerda/extremidade direita digerido por Sfil e Nhel Em segundo lugar, um fragmento de restrição do genoma do vetor Sfil-Sfil Ad26 de 13,7 kb derivado de pWE.Ad26.dE3.5orf6 foi inserido no sítio Sfil do genoma do plasmídeo do vetor parcial resultante.
Geração de plasmídeos do genoma do vetor Ad26 pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e p Ad26.CM VtetO_G Luc. AoH V1 _RFL [00172] O pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL é um plasmídeo contendo o genoma do vetor Ad26 de pAd26.dE1 .dE3.5orf6 (ver acima), modificado para transportar dois cassetes de expressão de transgene: (1) um cassete de expressão de luciferase de Gaussia (Gluc) dirigido pelo promotor de citomegalovírus humano (hCMV) inserido na região E1 (deletada), e (2) um cassete de expressão de luciferase de vagai ume vermelha (RFL) dirigido pelo promotor AoHV-1 inserido entre E4 e a RITR.
[00173] O pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL é idêntico ao pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL, com a exceção de conter adicionalmente duas sequências do óperon de tetraciclina (tetO) no promotor hCMV do cassete de expressão GLuc.
[00174] A construção de plasmídeos
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63/95 pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL envolveu a geração de construtos intermédios que transportam os cassetes de expressão requeridos, seguido por inserção destes cassetes no genoma do vetor Ad26 de pAd26.dE1 .dE3.5orf6 por montagem de Gibson (Gibson et al., 2009). Os construtos intermediários que transportam sequências sintéticas CMV_GLuc_SV (SEQ ID NO:17), CMVtetO_GLuc_SV (SEQ ID NO:18) e AoHV1_RFL_BGH (SEQ ID NO:19) foram gerados pelo fornecedor de serviços de síntese de genes GeneArt (Life Technologies). A sequência CMV_GLuc_SV contém um cassete de expressão para a expressão de GLuc. Este compreende um promotor de citomegalovírus humano (hCMV) (SEQ ID NO:4), uma sequência codificante Gluc, e uma sequência de sinal de poliadenilação derivada de SV40. A sequência CMVtetO_GLuc_SV difere da sequência CMV_GLuc_SV por conter, dentro do seu promotor derivado do promotor hCMV, CMVtetO (SEQ ID NO:15), uma inserção de 54 pb contendo duas sequências do óperon de tetraciclina (tetO). A sequência AoHV1_RFL_BGH contém um cassete de expressão para a expressão de RFL. Este compreende AoHV-1 um curto (SEQ ID NQ:30), uma sequência codificante de RFL, e uma sequência de sinal de poliadenilação derivado do gene do hormônio de crescimento bovino. As sequências CMV_GLuc_SV e CMVtetO_Gluc_SV foram concebidas para conter adicionalmente sequências flanqueadoras curtas correspondendo a sequências flanqueando diretamente o sítio AsiSI de pAd26.dE1 .dE3.5orf6. Estas sequências flanqueadoras permitem a inserção dos cassetes de expressão respetivos no sítio AsiSI de pAd26.dE1 .dE3.5orf6 (isto é, na localização da deleção de E1 do genoma do vetor Ad) por meio de métodos de montagem in vitro (IVA) (como por exemplo, descrito por Gibson et al. (Gibson et al., 2009). De modo similar, a sequência AoHV1_RFL_BGH contém sequências flanqueadoras que permitam a inserção do cassete de expressão respeti
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64/95 vo para o sítio Pad de pAd26.dE1 .dE3.5orf6 (isto é, entre a região E4 e a RITR do genoma do vetor) por IVA. Todas as três sequências foram ainda equipadas com os sítios de restrição exteriores de flanqueamento destinados a libertar estas sequências das suas respectivas estruturas base plasmídicas (nas quais são proporcionadas pelo fornecedor do serviço de síntese de genes). O pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL foi construído através da realização de uma reação de montagem de Gibson de 4 fragmentos (New England Biolabs) entre o plasmídeo pAd26.dE1 .dE3.5orf6, digerido por ambas AsiSI e Pad, e sequências sintetizadas CMV_GLuc_SV e AoHV1_RFL_BGH, que foram libertadas das suas respectivas estruturas base plasmídicas por digestão, respectivamente, por Pmll e PshAI. O pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL foi gerado da mesma forma que pAd26.dE1 .dE3.5orf6, mas usando a sequência sintetizada CMVtetO_GLuc_SV em vez de CMV_Gluc_SV na reação de montagem de Gibson.
Iniciadores para análise da integridade do cassete de transgene Sequências do par de iniciadores E1 PCR:
TGGCGCGAAAACTGAATGAG - direto (SEQ ID NO:8) GCAGGCGGGTTGTCAAATAAG - inverso (SEQ ID NO:9) Sequências do par de iniciadores E4 PCR1 GACGGGAGCAATCCCTCCAG - direto (SEQ ID NQ:10) CCCCACAAAGTAAACAAAAG - inverso (SEQ ID NO:11) Sequências do par de iniciadores E4 PCR2: CGTTCTCACTTCCTCGTATC - direto (SEQ ID NO:12) CAACGCTGATTGGACGAG - inverso (SEQ ID NO:13) [00175] Os plasmídeos descritos nestas seções são usados no Exemplo 4.
Plasmídeo de expressão de TetR, pC_AoHV_TetR [00176] Para construir pC_AoHV_TetR, um fragmento de DNA de
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1,3 Kpb (SEQ ID NQ:20) compreendendo AoHV-1 curto (SEQ ID NO: 30) seguido de uma sequência codificante de TetR com códon otimizado foi sintetizado (em GeneArt/LifeTechnolgies) e subsequentemente subclonado em pcDNA2004Neo(-) (acesso do GenBank FB674876) utilizando sítios de restrição Mfel e Xbal. A Fig. 6A mostra um mapa de pC_AoHV_TetR no qual a localização da inserção de 1,3 Kpb é indicada.
Procedimentos de geração da linha celular PER.C6-AoHV.TetR [00177] As linhas celulares estáveis de PER.C6-A0HV.TetR foram geradas por procedimentos de geração de linhas de células padrão. Resumidamente, as células PER.C6, cultivadas isentas de soro e adaptadas a suspensão (Fallaux et al., 1998), cultivadas em meio PerMAb CDM4 (HyClone) suplementado com L-Glutamina a 4 mM (Lonza) foram transfectadas com plasmídeo pC_AoHV_TetR por eletroporação utilizando um eletroporador BioRad. Após a recuperação e seleção de antibióticos em meio de seleção PerMab, isto é, meio CDM4 PerMAb suplementado com L-Glutamina a 4 mM e Geneticina a 125 pg/mL (Gibco), as células transfectadas foram inoculadas para clonagem de célula única em placas MW96 em 1 célula viável por poço em meio MAb (SAFC) suplementado com L-Glutamina a 4 mM e Geneticina a 125 pg/mL. Após formação de colônias de células, os clones isolados foram expandidos durante várias passagens em culturas estáticas em meio de seleção PerMAb. Analisaram-se subsequentemente 100 clones quanto à capacidade de expressar TetR através de um procedimento de coloração intracelular por citometria de fluxo utilizando um anticorpo anti-TetR (Tet03, MoBiTec). Nesta primeira avaliação, verificou-se que 94 dos 100 clones testados eram positivos para TetR. Foram selecionados 47 destes clones positivos para TetR e, após adaptação ao crescimento em meio Permexcis (Lonza) suplementado com L-Glutamina a 4 mM e Geneticina a 125 pg/mL, foram
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66/95 testados novamente para expressão de TetR por coloração intracelular por citometria de fluxo, bem como para a atividade de TetR por um ensaio de funcionalidade TetR (descrito na seção de métodos aqui apresentada). Foram então selecionados 24 clones positivos para TetR que apresentavam tempos de duplicação da população de 30 horas ou menos, e isso representava uma ampla gama de níveis de atividade de TetR. Estes clones, denominados clones #1 a #24 de PER.C6AoHV.TetR, foram (re)adaptados à cultura em frascos em agitação, após isso foram finalmente criopreservados em bancos de células de pesquisa de pequena escala.. Esta seção de métodos é aplicável para o Exemplo 5.
Estabilidade da expressão de TetR a partir de clones PER.C6AoHV.TetR [00178] Análise da estabilidade da expressão de TetR por clones de células PER.C6-A0HV.TetR após a realização de várias passagens. Os clones de células PER.C6-A0HV.TetR foram cultivadas em frascos em agitação, com e sem seleção de antibiótico, por múltiplas passagens até cerca de 60 duplicações da população (ou gerações) serem alcançadas. A expressão de TetR foi analisada por coloração intracelular por citometria de fluxo nas gerações 20, 40 e 60. Em cada um destes pontos no tempo, as células de cada clone foram submetidas a um protocolo de coloração intracelular dupla por citometria de fluxo para detectar TetR e Tubulina. A coloração foi de acordo com procedimentos padrão de coloração intracelular de citometria de fluxo e incluiu duas etapas de incubação de anticorpos: uma primeira com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-TetR (Tet03, MoBiTec) e uma segunda com um conjugado IgG-FITC anti-camundongo (554001, BD Biosciences) em combinação com um anticorpo conjugado antiTubulina-Alexa Fluor 647 (ab195884, Abeam). Por clone, as frações de células positivas e negativas para TetR foram determinadas dentro de
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67/95 um limite rigoroso positivo para Tubulina. Esta seção de métodos é aplicável para o Exemplo 5.
Ensaio da funcionalidade de TetR [00179] O ensaio da funcionalidade de TetR foi realizado após a realização de várias passagens dos clones de células PER.C6AoHV.TetR. Os clones de células PER.C6-A0HV.TetR foram cultivadas em frascos em agitação, com e sem seleção de antibiótico, por múltiplas passagens até cerca de 60 duplicações da população (ou gerações) serem alcançadas. Em seguida, foram inoculados clones de células PER.C6-A0HV.TetR e células PER.C6 de controle em placas múltiplas de 96 poços revestidas com Poli-L-Lisina em meio Permexcis suplementado com L-Glutamina a 4 mM e, após 2 horas de incubação, infectadas em quadruplicado pelos vetores Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL (descrito no Exemplo 4). Um dia após a infecção, as células infectadas foram colhidas em Tampão de Lise Celular Luciferase (Pierce/Thermo Scientific). Usando alíquotas separadas de cada lisado celular, as atividades GLuc e RFL foram subsequentemente medidas de acordo com as instruções do fabricante usando, respectivamente, reagentes Kit de Ensaio BioLux Luciferase de Gaussia (NEB) e Kit de Ensaio da Luciferase Glow (Pierce/Thermo Scientific) e 0 Luminômetro de Microplacas Luminoskan Ascent (Thermo Scientific). Por replicado de infecção, a atividade de Gluc foi normalizada pela atividade de RFL. Esta seção de métodos é aplicável para 0 Exemplo 5.
Exemplo 1: Identificação do AoHV-1 curto como promotor potente para expressão gênica heteróloga [00180] Frequentemente, promotores derivados de vírus ou genomas de animais/seres humanos são utilizados para a expressão de proteínas heterólogas, por exemplo em cassetes de expressão em vetores plasmidiais ou vetores virais para a expressão de um gene de
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68/95 interesse em células ou um organismo hospedeiro. Um promotor comumente usado para este objetivo é um promotor derivado da região precoce imediata do citomegalovírus humano (hCMV) (Powell et al., 2015). Vários citomegalovírus (CMVs) que infectam outros hospedeiros também são conhecidos. Eles infectam, por exemplo, macacos rhesus (rhCMV) (Barry, Alcendor, Power, Kerr & Luciw, 1996; Chan, Chiou, Huang & Hayward, 1996; Chang et al., 1993; Hansen, Strelow, Franchi, Anders & Wong, 2003) e chimpanzés (chCMV) (Chan et al. 1996).
[00181] De modo a identificar um promotor que é preferencialmente potente e curto e que também tem baixa identidade de sequência com o promotor hCMV comumente utilizado, foram identificadas e testadas várias sequências de promotor putativas. Vários promotores putativos que testamos e que foram derivados de herpesvirus mais distantemente relacionados ao hCMV mostraram atividade muito baixa ou nenhuma atividade de promotor. Para alguns outros promotores derivados de diferentes espécies de CMV e que eram conhecidos como promotores potentes, confirmamos a atividade do promotor, mas infelizmente tais promotores apresentam frequentemente uma das seguintes desvantagens: ou são caracterizadas por tamanho maior devido a, por exemplo, a inclusão de sequências potenciadoras e intrônicas e/ou apresentam homologia considerável com a sequência do promotor de hCMV.
[00182] O herpesvirus aotine 1 (AoHV-1) é tentativamente classificado como citomegalovírus. Curiosamente, enquanto que a sequência completa do genoma do AoHV-1 está publicado e as grelhas de leitura abertas (ORFs) estão anotadas na sequência, nenhum promotor precoce imediato principal foi descrito até agora. Foram testadas duas concepções diferentes de diferentes comprimentos de uma região do genoma do AoHV-1, e denominadas sequências putativas de promotor
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AoHV-1 longo e AoHV-1 curto. Com base nos resultados descritos abaixo, onde demonstramos a atividade do promotor para essas sequências, nos referimos a estes e seus derivados como o promotor precoce imediato principal AoHV-1, ou de forma curta a promotor AoHV-1.
[00183] A fim de testar as sequências de promotor putativos identificadas para a potência da expressão do gene heterólogo, tínhamos as sequências de promotor putativos sintetizadas em GeneArt LifeTechnologies e subclonadas em plasmídeos pAdApt35.Luc através de sítios de restrição Avril e HindiII a montante do gene repórter da luciferase de vagalume. Os níveis de luciferase de vagalume foram medidos em células HEK293 transfectadas pós 24 h de transfecção e em comparação com a expressão da luciferase de vagalume induzida pelo promotor hCMV (ID SEQ NO:4).
[00184] Selecionando a partir de um painel de possíveis promotores, escolhemos alguns promotores potentes (dados não mostrados), dos quais o chCMV curto e o AoHV-1 curto seriam preferidos devido ao seu tamanho muito pequeno e potência. Os resultados do teste de potência para o promotor selecionado promotor AoHV-1 curto (SEQ ID NO:1), AoHV-1 longo (SEQ ID NO:2), chCMV curto (SEQ ID NO:3) e hCMV são mostrados na Fig. 1. Todos os promotores AoHV-1 curto, AoHV-1 longo, chCMV curto e hCMV apresentam potência de promotor comparável nesta experiência.
[00185] No entanto, como mostrado na Fig. 2A, o chCMV curto tem uma identidade de sequência muito alta com hCMV na região de alinhamento (identidade de sequência de cerca de 64%), especialmente a porção a jusante do promotor chCMV curto mostra alinhamento significativo e longas seções de identidade de sequência com hCMV (com várias seções idênticas de até 19 nucleotídeos e uma seção homóloga de mais de 100 nucleotídeos com apenas algumas diferenças
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70/95 de nucleotídeos). Em contraste, como mostrado na Fig. 2B, o novo promotor AoHV-1 curto tem baixa identidade de sequência com hCMV na região de alinhamento (identidade de sequência cerca de 36%) e potência que é comparável ao controle de hCMV. No que diz respeito a potenciais recombinações homólogas entre regiões de promotor homólogas, o comprimento de seções idênticas nas duas sequências é mais relevante do que a homologia global da sequência. É de notar que o promotor AoHV-1 curto partilha apenas algumas pequenas seções de sequência idênticas com hCMV com um comprimento máximo de 14 nucleotídeos, o que se acredita resultar em um risco muito baixo de recombinação homóloga entre promotores hCMV e AoHV-1 curto, em comparação com promotores partilhando mais e/ou mais longas seções de nucleotídeos idênticos, por exemplo, (Rubnitz & Subramani, 1984). Portanto, o risco de recombinação homóloga indesejada entre os promotores hCMV e AoHV-1 curto é considerado muito baixo. Se desejado, o nível já muito limitado de identidade de sequência entre estes promotores podería mesmo ser mais reduzida fazendo uma ou mais mutações direcionadas em qualquer promotor e teste por métodos de rotina que estas não anulam a atividade do promotor.
[00186] Em conclusão, o promotor AoHV-1 curto é preferido porque mostrou uma potência muito boa, na gama do padrão de excelência de hCMV, enquanto ao mesmo tempo tem uma sequência muito curta (484 pb) e baixa identidade de sequência com o promotor hCMV.
Exemplo 2: Aplicação do promotor nuclear AoHV-1 em um sistema baseado em transativador controlável por molécula pequena para expressão induzível de um gene de interesse em células de mamíferos [00187] A expressão induzível de genes pode ter alta aplicabilidade no campo da biotecnologia, em particular para a expressão transiente de produtos genéticos tóxicos. Certos sistemas bem estabelecidos pa
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71/95 ra a regulação gênica heteróloga em células de mamífero faz uso de promotores artificiais que consistem em múltiplas cópias da sequência do óperon Tet (TetO) ligada ao promotor nuclear hCMV (Gossen & Bujard, 1992;. Gossen et al, 1995). Nestes sistemas, os referidos promotores artificiais, que exibem nenhuma ou muito baixa atividade transcricional basal, podem ser ativados pela ligação específica às suas sequências TetO de certos fatores de transcrição recombinantes conhecidos como a proteína transativadora controlada por tetraciclina (tTA) ou a proteína transativadora controlada por tetraciclina reversa (rtTA). Aqui testamos se um promotor artificial similar responsive a tTA/rtTA podería ser gerado usando, em vez do promotor nuclear hCMV, um elemento de sequência do promotor AoHV-1.
[00188] Para este propósito foi construído um promotor onde apenas o promotor mínimo putativo (nuclear) AoHV-1 foi colocado imediatamente a jusante de sete operadores Tet (7xTetO-AoHV-1, SEQ ID NO:5). A sequência de promotor foi sintetizada em GeneArt LifeTechnologies e subclonada no plasmídeo pDuaILuc, descrito na seção Métodos, através dos sítios de restrição Xhol e Hindlll, substituindo assim o promotor CMV que controla o gene repórter Luciferase de Gaussia deste plasmídeo. Os níveis de luciferase de Gaussia foram medidos em células Vero transfectadas 24 h após a transfecção e em comparação com a expressão de luciferase de Gaussia pelo mesmo promotor, na presença da proteína transativadora tTA. Os dados de expressão foram normalizados para eficiência de transfecção por meio de medição Luciferase de Vagalume Vermelha (RFL) sob o controle de um promotor AoHV-1 curto, para o qual o cassete de expressão foi localizado no mesmo plasmídeo pDuaILuc. A Fig. 3 representa a expressão do gene da luciferase de Gaussia sob o controle dos promotores 7xTetO-AoHV-1. Em mais de quatro experiências independentes (N=4), o nível de expressão basal do promotor 7xTetO-AoHV-1 estava
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72/95 perto do nível do fundo (células transfectadas apenas com meio, controle negativo) e, em média, 1400 vezes inferior do que quando cotransfectado com um plasmídeo que codifica para a proteína transativadora tTA (7xTetO-AoHV-1+tTA). Após adição de Doxiciclina (realizada duas vezes, N=2), que irá inibir a ligação de tTA às sequências tetO do promotor, os níveis basais de expressão foram novamente observados. O nível de expressão induzida de 7xTetO-AoHV-1 também foi comparado ao promotor RSV (derivado de LTR do vírus Sarcoma de Rous; sendo este outro promotor descrito para uso em sistemas de expressão em biotecnologia), indicando que o promotor 7xTetO-AoHV1 induzido resulta em cerca de 1 log de níveis de expressão maiores de luciferase de Gaussia do que pelo promotor RSV.
[00189] Em conclusão, uma sequência compreendendo promotor nuclear putativo derivada a partir do promotor AoHV-1 pode ser utilizada para construir um promotor artificial que é sensível a uma proteína transativadora controlado por tetraciclina. A aplicação desta sequência neste contexto provou permitir uma regulação rigorosamente controlada da expressão de um gene de interesse. A referida sequência representa, por conseguinte, um verdadeiro promotor nuclear, tal como aqui definido como tendo uma atividade muito baixa por si só, mas sendo capaz de conduzir a expressão potente do gene quando combinada com outras sequências reguladoras, tais como sítios de ligação para fatores de transcrição naturais ou artificiais.
Exemplo 3: Aplicação do promotor AoHV-1 em um sistema baseado em proteína repressora bacteriana controlável por pequenas moléculas para expressão regulada de um gene de interesse em células de mamíferos [00190] Como mencionado no exemplo 2, a expressão regulada de, por exemplo, um gene tóxico de interesse em uma linha celular pode ser essencial para a produção recombinante de proteínas ou vetores
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73/95 virais. No caso de ser utilizado um vetor viral que já contenha um cassete de expressão com um promotor hCMV, é desejável usar um promotor forte com uma sequência diferente para a expressão de um gene de interesse (GOI) na linha celular de produção. De modo a identificar uma alternativa ao promotor hCMV, o promotor AoHV-1 curto e o promotor da fosfoglicerato quinase 1 humana (hPGK) (outro promotor descrito para utilização em sistemas de expressão de biotecnologia) foram testados quanto à expressão transiente de eGFP em células PER.C6. De acordo com os resultados do exemplo 1, o promotor AoHV-1 curto novamente mostrou ser um promotor potente para a expressão de um gene heterólogo, dirigindo níveis de expressão de eGFP semelhantes a hCMV (da SEQ ID NO:4), e muito mais elevados que pelo promotor hPGK (SEQ ID NO:6) (Fig. 4A).
[00191] A seguir, o promotor AoHV-1 curto, que é normalmente constitutivamente ativo (ver exemplo 1 e primeira parte deste exemplo), foi concebido como um promotor regulado pela proteína repressora da tetraciclina (TetR) pela inserção de dois óperons Tet a jusante da caixa TATA e a montante do local de iniciação da transcrição (TSS) do promotor AoHV-1 curto (AoHV.2xtetO, SEQ ID NO:7). Esta concepção foi anteriormente mostrada funcionar para o promotor hCMV (por exemplo, ver WO 1999/000510 A1). O promotor está ativo em células que não expressam TetR. Nesta concepção, a atividade do promotor é reprimida na presença de TetR, por exemplo em linhas celulares que expressam TetR. A repressão pode ser atenuada pela adição de Doxiciclina (Dox), que tem uma alta afinidade pela proteína TetR. A Figura 4B mostra que a expressão de eGFP clonado a jusante de AoHV.2xTetO é de fato reprimida em células PER.C6-hCMV.TetR. A adição de Dox resulta em níveis aumentados da expressão da proteína eGFP, semelhante aos níveis de expressão de eGFP dirigidos pelo hCMV.
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74/95 [00192] Para estabelecer clones estáveis de células exibindo expressão regulada por TetR de um gene de interesse, células PER.C6hCMV.TetR, que expressam TetR sob controle de um promotor hCMV, foram transfectadas com um plasmídeo que expressa o gene de interesse sob o controle de AoHV.2xtetO. Oitenta e cinco clones foram selecionados usando meio de seleção com antibiótico. Dois clones foram selecionados para testar a expressão induzível do gene de interesse (GOI) nesta experiência. A Fig. 4C mostra o teste dos dois clones selecionados para a expressão induzível de GOI. Como pode ser visto no Western Blot, ambos os clones testados mostram um sinal de fundo baixo na ausência de Dox, enquanto que na presença de Dox, o GOI é expresso de forma potente. Como controle positivo, foram utilizadas células transfectadas transientemente com um plasmídeo que expressa o GOI sob o controle do promotor AoHV-1 curto. O controle positivo mostra níveis de expressão mais elevados do GOI do que os clones celulares, o que é geralmente observado quando se geram linhas celulares estáveis.
[00193] Um promotor regulado por repressor bacteriano alternativo no qual a sequência do óperon cumato (CuO) foi colocada diretamente a jusante do elemento iniciador (putativo) do promotor AoHV-1 curto foi também concebido e testado, e também provou ser funcional (dados não mostrados). Nesta concepção de promotor, a proteína repressora CymR pode ligar-se às sequências de CuO e assim inibir a expressão. [00194] Além disso, análogos aos sistemas baseados no promotor AoHV1 regulados por TetR e CymR descritos, um promotor curto contendo AoHV-1 contendo o operador Lac (LacO) foi gerado e provou ser fortemente repressível pelo repressor Lac (LacR) (dados não mostrados).
[00195] Em conclusão, este exemplo confirma a alta potência do promotor AoHV-1 curto em comparação com outros promotores co
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75/95 mumente usados para expressão gênica heteróloga. Além disso, foram geradas versões do promotor AoHV-1 reguladas por TetR-, CymR e LacR que permitem a expressão regulada de GOI em células de mamíferos. Isto pode, por exemplo, ser utilizado para expressão de proteínas que são tóxicas para a célula ou para expressão de proteínas que levam à instabilidade das células ou vetores.
Exemplo 4: Aplicação do promotor AoHV-1 em vetores virais com dois cassetes de expressão [00196] O promotor AoHV-1 curto (AoHV-1 curto) pode ser aplicado em vetores virais para dirigir a expressão de antígenos de vacinas ou outras proteínas de interesse. Isto é ilustrado aqui pela aplicação de um AoHV-1 curto no contexto de vetores adenovirais Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL. Estes são dois vetores adenovirais recombinantes baseados em Ad26 que transportam dois cassetes de expressão, um primeiro cassete que codifica Luciferase de Gaussia (GLuc) inserida em lugar da região E1 (suprimida) e um segundo cassete codificando luciferase de vagalume vermelha (RFL) localizada entre a região E4 e a repetição terminal invertida direita (RITR). Os cassetes de expressão Gluc dos dois vírus são dirigidos pelo promotor hCMV (ID SEQ NO:4) e CMVtetO (SEQ ID NO:15), respectivamente. O CMVtetO difere do promotor hCMV por transportar uma inserção de uma sequência contendo dois motivos de sequência de óperon de tetraciclina (TetO), fazendo com que este promotor seja repressível pela proteína repressora de tetraciclina (TetR). Em ambos os vírus, o cassete de expressão RFL está sob controle de AoHV-1 curto (SEQ ID NQ:30). Consulte a Fig. 5A para uma representação esquemática dos genomas dos dois vetores.
[00197] Os dois vetores acima foram gerados por transfecção de plasmídeos de genoma completo pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL, descrito na seção de Métodos do
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76/95 presente documento, em células PER.C6. Estas transfecções foram realizadas de acordo com procedimentos padrão utilizando reagente de transfecção Lipofectamina 2000 (Invitrogen) e 4 pg de DNA plasmídico digerido com Swal por transfecção em um frasco de cultura de tecidos T25 inoculado com 3x106 células PER.C6 por frasco no dia anterior. (A digestão Swal serve para libertar o genoma do vetor adenoviral da estrutura principal do plasmídeo). Após a colheita das transfecções de resgate de vírus, os vírus foram adicionalmente amplificados por ciclos consecutivos de infecção sucessivos em células PER.C6 até infecções de produção do vírus em grande escala serem efetuadas no número de passagem viral (VPN) 5 após a transfecção. Os vírus foram purificados a partir de colheitas virais em bruto utilizando um procedimento de ultracentrifugação de gradiente de concentração de cloreto de césio (CsCI) de duas etapas como descrito anteriormente (Havenga et al., 2006). Os vírus foram quantificados por um procedimento baseado em espectrofotometria para determinar o título de partículas virais (VP), e por um ensaio TCID50 para determinar o título da unidade infecciosa (UI), em ambos os casos como descrito anteriormente (Maizel, White, & Scharff, 1968).
[00198] Os resultados de quantificação VP e IU para os lotes purificados de Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e
Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL são mostrados na Tabela 1. Os rendimentos virais, assim como as razões VP para IU obtidas para os dois lotes, estão na mesma gama daqueles que são rotineiramente obtidos para vetores baseados em Ad26 contendo cassete de expressão de transgene simples. Por exemplo, as razões VP para IU obtidas para os lotes de Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL, ou seja, 23 e 14, estão dentro da gama de razões VP para IU de 18, 11,24, 10, 12 e 26 que foram relatados anteriormente para um painel de vetores baseados em Ad26
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77/95 com diferentes cassetes de expressão de transgene (simples) (Zahn et al., 2012).
[00199] Foi anteriormente relatado que o uso de dois promotores idênticos para a expressão de dois transgenes da região E1 de um adenovirus pode dar origem a instabilidade genética, presumivelmente por recombinação homóloga (consulte, por exemplo (Belousova et al., 2006) e exemplo 2 de WO2016166088A1). Para verificar se isto pode ser resolvido utilizando uma combinação do promotor AoHV-1 da invenção no mesmo sistema como o promotor hCMV na posição E1 e E4_rlTR respectivamente, nós testamos a integridade do cassete de transgene para esta combinação. A integridade do cassete de transgene (TG) foi confirmada para os dois lotes purificados de Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL por amplificação baseada em PCR, seguida de sequenciamento das regiões de inserção do cassete de transgene (Fig. 5B). Especificamente, foi realizada uma PCR para amplificar o cassete TG inserido em E1 (PCR E1) e foram realizadas duas PCRs direcionando o cassete TG entre E4 e a RITR (E4 PCR1 e E4 PCR2). Todos os iniciadores utilizados nestas PCR são complementares às sequências específicas de Ad26 (isto é, não emparelham com as sequências localizadas nos próprios cassetes TG correspondentes). Todas as PCRs deram produtos com os tamanhos esperados, enquanto nenhum produto menor indicativo de deleções pôde ser discernido. O sequenciamento dos produtos de PCR também não revelou mutações. Assim, a combinação do promotor AoHV-1 da invenção e do promotor hCMV em um único vetor produziu vetores geneticamente estáveis.
[00200] Finalmente, os lotes purificados
Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL foram testados quanto à capacidade de expressar as duas luciferases que codificam. Para este fim, a linha de células humanas A549 foi in
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78/95 fectada em diferentes multiplicidades de infecções pelos dois vírus, e as atividades de GLuc e RFL foram detectadas em amostras colhidas dois dias depois. Os resultados mostram que ambos os vetores foram capazes de expressar GLuc e RFL (Fig. 5C e D). Isto indica que as configurações relativas ao cassete de expressão transgênico são totalmente funcionais dentro dos contextos genômicos adenovirais em que foram testadas.
[00201] Em conclusão, o AoHV-1 curto pode ser aplicado como um promotor para dirigir a expressão de uma proteína de interesse a partir de cassetes de expressão de transgene inseridos em um vetor viral. Isto é exemplificado acima onde o AoHV-1 curto foi utilizado para expressar RFL no contexto de dois vetores adenovirais cada um compreendendo dois cassetes de expressão de transgene separados inseridos em localizações diferentes dentro do genoma do vetor adenoviral. Estes vetores adenovirais foram prontamente gerados e provados serem produzidos para lotes de vetor purificados de alto título, exibindo boas razões de VP para IU e abrigando cassetes de expressão de transgenes geneticamente e funcionalmente intactos.
Exemplo 5: Aplicação do promotor AoHV-1 em um plasmídeo para expressão estável de um gene de interesse em células [00202] O promotor AoHV-1 pode ser aplicado para dirigir a expressão de genes heterólogos em linhas celulares estáveis. Isto é ilustrado aqui pela geração de linhas celulares que expressam TetR usando pC_AoHV_TetR, um plasmídeo em que a expressão do gene TetR é dirigida pelo promotor AoHV-1.
[00203] pC_AoHV_TetR é representado na Fig. 6A e é descrito na seção de Métodos apresentada no presente documento. Ele compreende um cassete de expressão que codifica TetR sob o controle do promotor AoHV-1, e um cassete de expressão do gene neomicina fosfotransferase II sob o controle de um promotor derivado de SV40. O
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79/95 último cassete permite a seleção de células estavelmente transfectadas utilizando meio de crescimento celular suplementado com Geneticina.
[00204] Como detalhado adicionalmente na seção Métodos aqui apresentada em Procedimentos de geração da linha celular PER.C6AoHV.TetR, foi utilizado pC_AoHV_TetR para transfecções estáveis na linha celular humana PER.C6. Isto resultou, após clonagem de célula única, na geração eficiente de múltiplos clones de células PER.C6-AoHV.TetR que expressam TetR. Verificou-se que 94 dos 100 clones testados resistentes à Geneticina foram positivos para a expressão de TetR em uma primeira etapa de análise baseada em um protocolo de coloração intracelular por citometria de fluxo para detectar TetR (dados não mostrados). Após uma segunda etapa de análise em 47 destes clones positivos para TetR (dados não mostrados), uma seleção de 24 clones foi criopreservada em bancos de células de pesquisa de pequena escala.
[00205] Doze dos clones PER.C6-A0HV.TetR criopreservados foram submetidos a uma avaliação adicional do seu desempenho de crescimento após 0 descongelamento em frascos em agitação e a sua capacidade de expressar TetR (funcional) após realização de várias passagens (até 60 duplicações de populações), ambos no presença e na ausência de seleção com Geneticina. Verificou-se que todos os clones cresceram pelo menos tão eficientemente, e com viabilidades semelhantes, como a linha celular de controle da suspensão progenitora PER.C6 (dados não mostrados). A análise da expressão de TetR por coloração intracelular por citometria de fluxo demonstrou adicionalmente que a fração de células positivas para TetR manteve-se elevada (isto é, 97% ou mais) ao longo da experiência de realização de várias passagens. Isto é mostrado na Fig. 6B para três clones representativos (clones 1-3 de PER.C6-A0HV.TetR). Finalmente, um ensaio
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80/95 de funcionalidade de TetR demonstrou que os doze clones exibiam atividades de repressão significativas mediadas por TetR após as suas várias passagens, como mostrado na Fig. 6C para os clones 1-3 de PER.C6-A0HV.TetR. Especificamente, na geração 60, todos os doze clones PER.C6-A0HV.TetR mantinham a capacidade de reprimir a expressão de um gene repórter codificado pelo vetor adenoviral dirigido por um promotor regulado por TetR. Os níveis de repressão observados para os 12 clones diferentes foram semelhantes (ou superiores a) aos observados para uma linha de células de controle positivo (PER.C6-hCMV.TetR) gerada usando 0 anteriormente descrito plasmídeo pcDNA6/TR que expressa TetR, um plasmídeo que compreende um cassete de expressão TetR controlado pelo promotor CMV humano.
[00206] Em conclusão, foram geradas com sucesso linhas de células sPER.C6-A0HV.TetR estáveis, nas quais a expressão de TetR é dirigida pelo promotor AoHV1. Este é um exemplo não limitative da expressão estável de uma proteína de interesse após a integração de um transgene operacionalmente ligado ao promotor AoHV-1, de acordo com a invenção, no genoma de uma célula hospedeira.
Exemplo 6: Concepção de diferentes versões do promotor AoHV1 [00207] De modo a mapear as partes essenciais da região reguladora precoce imediata principal do AoHV-1 para a expressão de genes heterólogos, foi feito um painel de diferentes versões do promotor AoHV-1. As diferentes concepções são apresentadas na Fig. 7A. Foram feitas duas concepções para truncar a já curta sequência AoHV-1 curta, a fim de mapear as partes essenciais desta sequência promotora curta. Outras concepções incluem domínios putativos adicionais e sítios de ligação de fatores celulares e sequências de íntron previstas de modo a testar se a potência de AoHV-1 curto pode ser aumentada.
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81/95 [00208] As versões testadas do promotor são denominadas versão v00-v09 e estão listadas abaixo:
vOO: SEQ ID NO:30 (com sítios Avrll nativos) v01: SEQ ID NO:22 v02: SEQ ID NO:23 v03: SEQ ID NO:24 v04: SEQ ID NO:25 v05: SEQ ID NO:26 v06: SEQ ID NO:1 (sítio Avrll eliminado com inserção única de nucleotídeo de citosina (c) na posição de nucleotídeo 360) v07: SEQ ID NO:27 v08: SEQ ID NO:28 v09: SEQ ID NO:29 [00209] A atividade do promotor foi testada utilizando transfecção transiente de plasmídeos em células PER.C6. As diferentes versões do promotor dirigem a expressão da luciferase de Gaussia no plasmídeo pDuaILuc descrito na seção de métodos do presente documento. A Figura 7B mostra os resultados do teste de potência do promotor em relação à atividade do AoHV-1 curto (versão 00). A experiência foi realizada duas vezes. Cada valor individual foi calculado em relação à média de vOO na mesma experiência. Valores de duas experiências foram agrupados para calcular a média e desvio padrão, que é exibido em relação ao AoHV-1 curto vOO. A atividade de vOO e v06 (AoHV-1 curto com e sem o sítio Avrll, respectivamente) é considerada na mesma gama.
[00210] Curiosamente, a versão truncada 04 mostra atividade do promotor comparável ao AoHV-1 curto (versão 00 e 06). Esta versão 04 tem um comprimento de apenas 371 nucleotídeos. Em contraste, a versão truncada adicional 05 com um comprimento de 241 nucleotídeos mostra atividade reduzida em comparação com o AoHV-1 curto,
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82/95 o que pode ser explicado pela ausência de vários sítios de ligação de fator celular previstos. Esta versão do promotor 05 ainda pode ser considerada um promotor potente. Espera-se que a atividade do promotor diminua gradualmente com mais truncamentos.
[00211] As potências da maioria das outras versões do promotor, que contêm extensões em comparação com o promotor AoHV-1 curto, estão na gama do promotor AoHV-1 curto. Destas variantes expandidas do promotor AoHV-1 apenas v03 (dados não mostrados) mostra uma queda importante na atividade do promotor em comparação com o AoHV-1 curto, mas isso pode ser explicado pela presença de uma sequência intrônica incompleta em v03: enquanto v03 carrega dentro da sua a extensão de um sítio doador de junção previsto não possui nenhum dos sítios aceitadores de junção previstos localizados mais a jusante. Em contraste, as variantes do promotor AoHV-1 V07, V08 e V09 expandidas em que cada carrega pelo menos um sítio aceitador de junção previsto a jusante de (qualquer) dos seus sítios doadores de junção previstos, cada uma mostrou expressão na gama do promotor AoHV-1 curto. A sequência v09 é um mutante de deleção de v07; em comparação com v07, v09 carrega uma deleção interna que deixa intactas certas sequências doadoras e aceitadoras de junção previstas. Os dados mostram que v09 é um exemplo de uma variante do promotor AoHV-1 curta, mas potente, contendo um íntron previsto. Pode ser previsto que um promotor contendo íntron, de modo similar curto mas potente, possa ser gerado aplicando uma deleção semelhante (como a referida deleção interna aplicada a v07) à variante do promotor AoHV1 v08.
[00212] Duas sequências de promotor AoHV-1 adicionais, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, também foram projetadas e testadas para a capacidade de conduzir a expressão de um gene de interesse. Em comparação com o AoHV-1 curto (isto é, SEQ ID NO: 30), estas duas
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83/95 sequências transportam, cada uma, um truncamento 3' com 84 pb de comprimento e, além disso, transportam respectivamente 2 e 7 substituições de nucleotídeo único na sua região nuclear do promotor AoHV-
1. Devido ao dito truncamento 3', ambas SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34 compreendem apenas 1 nucleotídeo de AoHV-1 a jusante da sequência iniciadora putativa do promotor AoHV-L [00213] SEQ ID NO: 33 foi operacionalmente ligada a uma sequência codificante de TetR, inserindo-a como parte de um fragmento de gene sintetizado no plasmídeo pC_AoHV_TetR (descrito na seção de Métodos do presente documento), substituindo o promotor AoHV-1 curto desse plasmídeo. As transfecções transientes em células PER.C6 seguidas por imunotransferência de lisados celulares utilizando o anticorpo monoclonal anti-TetR (TetR03, MoBiTec) subsequentemente demonstrou que a atividade de promotor da SEQ ID NO:33 foi semelhante à de AoHV-1 curto (dados não mostrados).
[00214] SEQ ID NO: 34 foi operacionalmente ligada a uma sequência codificante de RFL por clonagem de um fragmento de gene sintetizado em pDualLuc (descrito na seção de Métodos do presente documento) utilizando sítios de restrição Avril e Ascl. As experiências de transfecção transiente em células PER.C6, seguidas de medição da atividade de RFL nos lisados celulares subsequentemente demonstraram que a SEQ ID NO:34 é uma sequência de promotor funcional (dados não mostrados).
[00215] A atividade destas variantes de promotor demonstra que para a atividade de promotor não é necessário incluir as sequências de AoHV-1 a jusante do primeiro nucleotídeo 3' do putativo Inr (isto é, o nucleotídeo 399 na SEQ ID NO: 30, corresponde ao nucleotídeo 287 na SEQ ID NO: 25).
Conclusão [00216] Como descrito supra, foi identificado um promotor curto e
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84/95 potente a partir do herpesvírus-1 de Aotine. O promotor AoHV-1 possui uma sequência curta e tem potência comparável ao promotor hCMV. Estas características tornam o promotor AoHV-1 um promotor ideal para usar como substituto em qualquer situação em que o promotor hCMV é usado. Além disso, o promotor AoHV-1 possui baixa identidade de sequência comparativamente com o promotor hCMV, o que o torna adequado para uso em combinação com o promotor hCMV ao expressar dois transgenes diferentes a partir do mesmo vetor viral ou ao gerar vírus com linhas celulares produtoras que também podem conter sequências semelhantes. O promotor AoHV-1 é também adequado para utilização com sequências reguladoras que podem ser utilizadas para modular a transcrição a partir do promotor AoHV-1.
Tabela 1: Tabela mostrando os resultados da quantificação dos lotes purificados para Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL e
Ad26.CMVtetO GLuc.AoHVI RFL.
| Título das partículas virais (VP/mL) | Título das unidades infecciosas (ILJ/mL) | Razão VPpara- IU | Rendimento viral total (VP) * | Rendimento viral relativo (VP/cm2)** | |
| Ad26.CMV_GLuc. AoHV1 RFL | 2,2E+12 | 9,8E+10 | 23 | 7,2E+13 | 3,6E+9 |
| Ad26.CMVtetO_G Luc.AoHV1 RFL | 1,4E+12 | 9,8E+10 | 14 | 2,8E+13 | 2.4E9 |
| * A produção de Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL foi feita em 20 frascos T1000 inoculados com PERC6 (com área de superfície de crescimento de 1000 cm2 por frasco). A produção de Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL foi feita em 20 frascos T600 inoculados com PER.C6 (com área de superfície de crescimento de 600 cm2 por frasco). ** Rendimento viral em relação à área de superfície de crescimento |
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85/95
REFERÊNCIAS
Documentos de Patentes dos E.U.A.:
US5057540A (10/15/1991). Saponin adjuvant. Kensil, Charlotte A.; Marciani, Dante J.
US5122458A (6/16/1992). Use of a bGH gDNA polyadenylation signal in expression of non-bGH polypeptides in higher eukaryotic cells. Post, Leonard E.; Palermo, Daniel P.; Thomsen, Darrell R.; Rottman, Fritz M.; Goodwin, Edward C.; Woychik, Richard P.
US5559099A (9/24/1996). Penton base protein and methods of using same. Wickham, Thomas J.; Kovesdi, Imre; Brough, Douglas E.; McVey, Duncan L.; Brader, Joseph T.
US5837511A (11/17/1998). Non-group C adenoviral vectors. Falck Pedersen, Erik S.; Crystal, Ronald G.; Mastrangeli, Andrea; Abrahamson, Karil
US5837520A (11/17/1998). Method of purification of viral vectors. Shabram, Paul W.; Huyghe, Bernard G.; Liu, Xiaodong; Shepard, H. Michael
US5846782A (12/8/1998). Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs. Wickham, Thomas J.; Roelvink, Petrus W.; Kovesdi, Imre
US5851806A (12/22/1998). Complementary adenoviral systems and cell lines. Kovesdi, Imre; Brough, Douglas E.; McVey, Duncan L.; Bruder, Joseph T.; Lizonova, Alena
US5891690A (4/6/1999). Adenovirus E1-complementing cell lines. Massie, Bernard
US5965541A (10/12/1999). Vectors and methods for gene transfer to cells. Wickham, Thomas J.; Kovesdi, Imre; Brough, Douglas E.
US5981225A (11/9/1999). Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 105/170
86/95 the same and method of use of the same. Kochanek, Stefan; Schiedner, Gudrun
US5994106A (11/30/1999). Stocks of recombinant, replication-deficient adenovirus free of replication-competent adenovirus. Kovesdi, Imre; Brough, Douglas E.; McVey, Duncan L; Bruder, Joseph T.; Lizonova, Alena
US5994128A (11/30/1999). Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy. Fallaux, Frits Jacobus; Hoeben, Robert Cornells; Van der Eb, Alex Jan; Bout, Abraham; Valerio, Domenico
US6020191A (2/1/2000). Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression. Scaria, Abraham; Gregory, Richard J.; Wadsworth, Samuel C.
US6040174A (3/21/2000). Defective adenoviruses and corresponding complementation lines. Imler, Jean Luc; Mehtali, Majid; Pavirani, Andrea
US6083716A (7/4/2000). Chimpanzee adenovirus vectors. Wilson, James M.; Farina, Steven F.; Fisher, Krishna J.
US6113913A (9/5/2000). Recombinant adenovirus. Brough, Douglas E.; Kovesdi, Imre
US6225289B1 (5/1/2001). Methods and compositions for preserving adenoviral vectors. Kovesdi, Imre; Ransom, Stephen C.
US6261823B1 (7/17/2001). Methods for purifying viruses. Tang, John Chu Tay; Vellekamp, Gary; Bondoc, Jr., Laureano L.
US6485958B2 (11/26/2002). Method for producing recombinant adenovirus. Blanche, Francis; Guillaume, Jean Marc
US7326555B2 (2/5/2008). Methods of adenovirus purification. Konz, Jr., John O.; Lee, Ann L.; To, Chi Shung Brian; Goerke, Aaron R
US7501129B2 (3/10/2009). Vectors comprising guinea pig
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 106/170
87/95
CMV regulatory elements. Williams, Steven Geraint; Irvine, Alistair Simpson; Gawn, Jonathan
US8932607B2 (1/13/2015). Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends. Custers, Jerome Η. Η. V.; Vellinga, Jort
Documentos de Patentes Européias:
EP1230354B1 (1/7/2004). PERMANENT AMNIOCYTE CELL LINE, THE PRODUCTION THEREOF AND ITS USE FOR PRODUCING GENE TRANSFER VECTORS. KOCHANEK, Stefan; SCHIEDNER, Gudrun
EP1601776B1 (7/2/2008). EXPRESSION VECTORS
COMPRISING THE MCMV IE2 PROMOTER. CHATELLARD, Philippe; IMHOF, Markus
EP853660B1 (1/22/2003). METHOD FOR PRESERVING INFECTIOUS RECOMBINANT VIRUSES, AQUEOUS VIRAL SUSPENSION AND USE AS MEDICINE. SENE, Claude
Publicações de Pedidos de Patentes Internacionais:
WO1999000510A1 (1/7/1999). REGULATION OF TRANSCRIPTION IN MAMMALIAN CELLS AND VIRAL REPLICATION BY A TETRACYCLIN REPRESSOR. Feng Yao
W02003049763A1 (6/19/2003). COMPOSITION FOR THE PRESERVATION OF VIRUSES. SETIAWAN, Kerrie; CAMERON, Fiona, Helen
W02003061708A1 (7/31/2003). STABILIZED FORMULATIONS OF ADENOVIRUS. PUNGOR, Erno
W02003078592A2 (9/25/2003). METHOD FOR THE PURIFICATION, PRODUCTION AND FORMULATION OF ONCOLYTIC ADENOVIRUSES. MEMARZADEH, Bahram; PENNATHUR-DAS, Rukmini; WYPYCH, Joseph; YU, De Chao
W02003104467A1 (12/18/2003). MEANSAND METHODS
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 107/170
88/95
FOR THE PRODUCTION OF ADENOVIRUS VECTORS. VOGELS, Ronald; BOUT, Abraham
W02004001032A2 (12/31/2003). STABLE ADENOVIRAL VECTORS AND METHODS FOR PROPAGATION THEREOF. VOGELS, Ronald; HAVENGA, Menzo, Jans, Emco; ZUIJDGEEST, David, Adrianus, Theodorus
W02004004762A1 (1/15/2004). ISCOM PREPARATION AND USE THEREOF. MOREIN, Bror; LÕVGREN BENGTSSON, Karin
W02004020971A2 (3/11/2004). CHROMATOGRAPHIC METHODS FOR ADENOVIRUS PURIFICATION. SENESAC, Joseph
W02004037294A2 (5/6/2004). NEW SETTINGS FOR RECOMBINANT ADENOVIRAL-BASED VACCINES. HAVENGA, Menzo, Jans, Emco; HOLTERMAN, Lennart; KOSTENSE, Stefan; PAU, Maria, Grazia; SPRANGERS, Mieke, Caroline; VOGELS, Ronald
W02004055187A1 (7/1/2004). RECOMBINANT VIRALBASED MALARIA VACCINES. PAU, Maria Grazia; HOLTERMAN, Lennart; KASPERS, Jorn; STEGMANN, Antonius, Johannes, Hendrikus
W02005002620A1 (1/13/2005). QUIL A FRACTION WITH LOW TOXICITY AND USE THEREOF. MOREIN, Bror; LÕVGREN BENGTSSON, Karin; EKSTROM, Jill; RANLUND, Katarina
W02005071093A2 (8/4/2005). CHIMPANZEE
ADENOVIRUS VACCINE CARRIERS. CIRILLO, Agostino; COLLOCA, Stefano; ERCOLE, Bruno, Bruni; MEOLA, Annalisa; NICOSIA, Alfredo; SPORENO, Elisabetta
W02005080556A2 (9/1/2005). VIRUS PURIFICATION METHODS. WEGGEMAN, Miranda; VAN CORVEN, Emile Joannes Josephus Maria
W02006053871A2 (5/26/2006). MULTIVALENT VAC
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 108/170
89/95
CINES COMPRISING RECOMBINANT VIRAL VECTORS. HAVENGA, Menzo, Jans, Emco; VOGELS, Ronald; SADOFF, Jerald; HONE, David; SKEIKY, Yasir Abdul Wahid; RADOSEVIC, Katarina
W02006108707A1 (10/19/2006). VIRUS PURIFICATION USING ULTRAFILTRATION. WEGGEMAN, Miranda
W02006120034A1 (11/16/2006). VACCINE COMPOSITION. ERTL, Peter, Franz; TITE, John, Philip; VAN WELY, Catherine Ann
W02007073513A2 (6/28/2007). METHOD FOR PROPAGATING ADENOVIRAL VECTORS ENCODING INHIBITORY GENE PRODUCTS. GALL, Jason, G., D.; BROUGH, Douglas, E.; RICHTER, King, C.
W02007100908A2 (9/7/2007). CHIMERIC ADENOVIRAL VECTORS. TUCKER, Sean, N.
W02007104792A2 (9/20/2007). RECOMBINANT ADENOVIRUSES BASED ON SEROTYPE 26 AND 48, AND USE THEREOF. BAROUCH, Dan H.; HAVENGA, Menzo Jans Emko
W02007110409A1 (10/4/2007). COMPOSITIONS COMPRISING A RECOMBINANT ADENOVIRUS AND AN ADJUVANT. HAVENGA, Menzo Jans Emko; RADOSEVIC, Katarina
W02009026183A1 (2/26/2009). USE OF CHIMERIC HIV/SIV GAG PROTEINS TO OPTIMIZE VACCINE-INDUCED T CELL RESPONSES AGAINST HIV GAG. NABEL, Gary, J.; YANG, ZhiYong; SHI, Wei; BAROUCH, Dan, H.
W02009117134A2 (9/24/2009). AEROSOLIZED GENETIC VACCINES AND METHODS OF USE. ROEDERER, Mario; RAO, Srinivas; NABEL, Gary, J.; ANDREWS, Charla, Anne
W02010085984A1 (8/5/2010). SIMIAN ADENOVIRUS NUCLEIC ACID- AND AMINO ACID-SEQUENCES, VECTORS CONTAINING SAME, AND USES THEREOF. COLLOCA, Stefano;
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 109/170
90/95
NICOSIA, Alfredo; CORTESE, Riccardo; AMMENDOLA, Virginia; AMBROSIO, Maria
WO2010086189A2 (8/5/2010). SIMIAN ADENOVIRUS NUCLEIC ACID- AND AMINO ACID-SEQUENCES, VECTORS CONTAINING SAME, AND USES THEREOF. COLLOCA, Stefano; NICOSIA, Alfredo; CORTESE, Riccardo; AMMENDOLA, Virginia; AMBROSIO, Maria
WO2010096561A1 (8/26/2010). SYNTHETIC HIV/SIV GAG PROTEINS AND USES THEREOF. NABEL, Gary J.; YANG, Zhi-yong; SHI, Wei; BAROUCH, Dan H.
WO2011045378A1 (4/21/2011). METHOD FOR THE PURIFICATION OF ADENOVIRUS PARTICLES. DE VOCHT, Marcel, Leo; VEENSTRA, Marloes
WO2011045381A1 (4/21/2011). PROCESS FOR ADENOVIRUS PURIFICATION FROM HIGH CELL DENSITY CULTURES. DE VOCHT, Marcel, Leo; VEENSTRA, Marloes
WO2013139911A1 (9/26/2013). VACCINE AGAINST RSV. RADOSEVIC, Katarina; CUSTERS, Jerôme H.H.V.; VELLINGA, Jort; WIDJOJOATMODJO, Myra N.
WO2013139916A1 (9/26/2013). VACCINE AGAINST RSV. RADOSEVIC, Katarina; CUSTERS, Jerôme H.H.V.; VELLINGA, Jort; WIDJOJOATMODJO, Myra, N.
WO 2016166088A1 (10/20/2016). RECOMBINANT ADENOVIRUS EXPRESSING TWO TRANSGENES WITH A BIDIRECTIONAL PROMOTER. Kerstin Wunderlich, Jerôme Η Η V CUSTERS, Jort Vellinga, Barbara Petronella SANDERS.
Outras Referências: Livros
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley
Interscience Publishers, NY (1995)
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 110/170
91/95
Ausubel F.M., et al. (editors). Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1987)
Freshney, R.I., Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition, Wiley-Liss Inc., ISBN 0-471-34889-9 (2000)
Frokjaer S. and Hovgaard L. (editores), Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Taylor & Francis (2000)
Gennaro, A.R. (editor), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.- edição, Mack Publishing Company (1990)
Horowitz, M.S., Adenoviruses, Chapter 68, in Virology, (B. N. Fields etal. (editors), 3rd Ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)
Kibbe A. (editor), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3- edição, Pharmaceutical Press (2000)
Kruse and Paterson (editores), Tissue Culture, Academic Press. (1973)
MacPherson M.J., Hams B.D., Taylor G.R. (editores), PCR2: A Practical Approach (1995)
Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual,
2.- edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1989)
Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.- edição, (1989)
Shenk, Thomas, Adenoviridae and their Replication, Capítulo 67, em Virology, B. N. Fields etal. (editores)., 3- edição, Raven Press, Ltd., Nova Iorque (1996)
Watson et al., Recombinant DNA, 2.- edição, Scientific American Books. (1992)
Revistas
Abbink, P., Lemckert, A. A., Ewald, B. A., Lynch, D. M., Denholtz, M., Smits, S., . . . Barouch, D. H. (2007). Comparative sero
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 111/170
92/95 prevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups B and D. J Virol, 81(9), 46544663. doi: 10.1128/JVI.02696-06
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215(3), 403410. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2
Barry, P. A., Alcendor, D. J., Power, M. D., Kerr, H., & Luciw, P. A. (1996). Nucleotide sequence and molecular analysis of the rhesus cytomegalovirus immediate-early gene and the UL121-117 open reading frames. Virology, 215(1), 61-72. doi:
10.1006/viro. 1996.0007
Belousova, N., Harris, R., Zinn, K., Rhodes-Selser, M. A., Kotov, A., Kotova, 0., . . . Alvarez, R. D. (2006). Circumventing recombination events encountered with production of a clinical-grade adenoviral vector with a double-expression cassette. Mol Pharmacol, 70(5), 1488-1493.
Chan, Y. J., Chiou, C. J., Huang, Q., & Hayward, G. S. (1996). Synergistic interactions between overlapping binding sites for the serum response factor and ELK-1 proteins mediate both basal enhancement and phorbol ester responsiveness of primate cytomegalovirus major immediate-early promoters in monocyte and T-lymphocyte cell types. J Virol, 70(12), 8590-8605.
Chang, Y. N., Jeang, K. T., Chiou, C. J., Chan, Y. J., Pizzorno, M., & Hayward, G. S. (1993). Identification of a large bent DNA domain and binding sites for serum response factor adjacent to the NFI repeat cluster and enhancer region in the major IE94 promoter from simian cytomegalovirus. J Virol, 67(1), 516-529.
Foecking, Μ. K., & Hofstetter, H. (1986). Powerful and versatile enhancer-promoter unit for mammalian expression vectors. Gene, 45(1), 101-105.
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 112/170
93/95
Gao, G. P., Engdahl, R. K., & Wilson, J. M. (2000). A cell line for high-yield production of E1-deleted adenovirus vectors without the emergence of replication-competent virus. Hum Gene Ther, //(1), 213-219. doi: 10,1089/10430340050016283
Gibson, D. G., Young, L, Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., 3rd, & Smith, H. O. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 6(5), 343-345. doi: 10.1038/nmeth.1318
Gossen, M., & Bujard, H. (1992). Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA, 89(12), 5547-5551.
Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W., & Bujard, H. (1995). Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science, 266(5218), 1766-1769.
Hansen, S. G., Strelow, L. I., Franchi, D. C., Anders, D. G., & Wong, S. W. (2003). Complete sequence and genomic analysis of rhesus cytomegalovirus. J Virol, 77(12), 6620-6636.
Havenga, M., Vogels, R., Zuijdgeest, D., Radosevic, K., Mueller, S., Sieuwerts, M., . . . Goudsmit, J. (2006). Novel replicationincompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells. J Gen Virol, 87(Pt 8), 2135-2143. doi: 10.1099/vir.0.81956-0
Heilbronn, R., & Weger, S. (2010). Viral vectors for gene transfer: current status of gene therapeutics. Handb Exp Pharmacog 197), 143-170. doi: 10.1007/978-3-642-00477-3_5
Hoganson, D.K., Ma, J.C., Asato, L., Ong, M., Printz, M.A., Huyghe, B.G., . . . D'Andrea, M.J. (2002). Development of a Stable Adenoviral Vector Formulation. BioProcessing J., /(1), 43-48.
Holterman, L, Vogels, R., van der Vlugt, R., Sieuwerts, M., Grimbergen, J., Kaspers, J., . . . Havenga, M. (2004). Novel replication
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 113/170
94/95 incompetent vector derived from adenovirus type 11 (Ad11) for vaccination and gene therapy: low seroprevalence and non-cross-reactivity with Ad5. J Virol, 78(23), 13207-13215. doi: 10.1128/JVI.78.23.1320713215,2004
Lemckert, A. A., Grimbergen, J., Smits, S., Hartkoorn, E., Holterman, L, Berkhout, B., . . . Havenga, M. J. (2006). Generation of a novel replication-incompetent adenoviral vector derived from human adenovirus type 49: manufacture on PER.C6 cells, tropism and immunogenicity. J Gen Virol, 87(Pt 10), 2891-2899. doi:
10.1099/vir.0.82079-0
Maizel, J. V., Jr., White, D. 0., & Scharff, M. D. (1968). The polypeptides of adenovirus. I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2, 7A, and 12. Virology, 36(1), 115-125.
Mullick, A., Xu, Y., Warren, R., Koutroumanis, M., Guilbault, C., Broussau, S., . . . Massie, B. (2006). The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol, 6, 43. doi: 10.1186/1472-6750-6-43
Ogun, S. A., Dumon-Seignovert, L., Marchand, J. B., Holder, A. A., & Hill, F. (2008). The oligomerization domain of C4-binding protein (C4bp) acts as an adjuvant, and the fusion protein comprised of the 19-kilodalton merozoite surface protein 1 fused with the murine C4bp domain protects mice against malaria. Infect Immun, 76(8), 38173823. doi: 10.1128/IAI.01369-07
Powell, S. K., Rivera-Soto, R., & Gray, S. J. (2015). Viral expression cassette elements to enhance transgene target specificity and expression in gene therapy. Discov Med, 19(102), 49-57.
Robbins, P. D., & Ghivizzani, S. C. (1998). Viral vectors for gene therapy. Pharmacol Ther, 80(1), 35-47.
Rubnitz, J., & Subramani, S. (1984). The minimum amount
Petição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 114/170
95/95 of homology required for homologous recombination in mammalian cells. Mol Cell Biol, 4(11), 2253-2258.
Schlabach, M. R., Hu, J. K., Li, M., & Elledge, S. J. (2010). Synthetic design of strong promoters. Proc Natl Acad Sci USA, 107(6), 2538-2543. doi: 10.1073/pnas.0914803107
Smale, S. T. (2001). Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. Genes Dev, 15(^9), 2503-2508. doi: 10.1101/gad.937701
Vogels, R., Zuijdgeest, D., van Rijnsoever, R., Hartkoorn, E., Damen, I., de Bethune, Μ. P., . . . Havenga, M. (2003). Replicationdeficient human adenovirus type 35 vectors for gene transfer and vaccination: efficient human cell infection and bypass of preexisting adenovirus immunity. J Virol, 77(15), 8263-8271.
Walther, W., & Stein, U. (2000). Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases. Drugs, 60(2), 249-271.
Zahn, R., Gillisen, G., Roos, A., Koning, M., van der Helm, E., Spek, D., . . . Rodríguez, A. (2012). Ad35 and ad26 vaccine vectors induce potent and cross-reactive antibody and T-cell responses to multiple filovirus species. PLoS One, 7(12), e44115. doi:
Claims (25)
- REIVINDICAÇÕES1. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende um promotor precoce imediato principal de Herpesvirus Aotine 1 (promotor AoHV-1) operacionalmente ligado a um transgene heterólogo.
- 2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que tem, pelo menos, 80% de identidade com o nt 237-286 da SEQ ID NO: 25, preferencialmente em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que é, pelo menos, 95% idêntica aos nucleotídeos 201 a 286 da SEQ ID NO:25.
- 3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o promotor AoHV-1 está operacionalmente ligado a uma sequência reguladora que modula a transcrição do promotor AoHV-1.
- 4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o promotor AoHV-1 está operacionalmente ligado a uma sequência reguladora compreendendo uma ou mais sequências do óperon de tetraciclina (sítios tetO).
- 5. Vetor ou um vírus, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4.
- 6. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor plasmidial.
- 7. Vírus, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vírus é um adenovirus.
- 8. Adenovirus, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o adenovirus possui, pelo menos, uma deleção no seu genoma, preferencialmente pelo menos em uma região E1 doPetição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 116/1702/4 seu genoma.
- 9. Célula caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4, ou um vetor ou vírus, como definido em qualquer uma das reivindicações 5, 6, 7 ou 8.
- 10. Célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende um promotor AoHV-1 no seu genoma, preferencialmente em que o referido promotor está operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse.
- 11. Célula, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que tem, pelo menos, 80% de identidade com o nt 237-286 da SEQ ID NO: 25, preferencialmente em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que é, pelo menos, 95% idêntica aos nucleotídeos 201 a 286 da SEQ ID NO:25.
- 12. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que o promotor AoHV-1 no genoma está operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica uma proteína repressora de tetraciclina (TetR), preferencialmente em que a referida célula é uma célula PER.C6.
- 13. Célula compreendendo: (i) uma molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende um promotor AoHV1 operacionalmente ligado a um primeiro transgene, e (ii) uma molécula de ácido nucleico compreendendo um promotor hCMV operacionalmente ligado a um segundo transgene.
- 14. Célula, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com o nt 237-286 da SEQ ID NO: 25, preferencialmente em que o promotor AoHV-1 compreende umaPetição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 117/1703/4 sequência que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotídeos 201 a 286 da SEQ ID NO:25, e em que o promotor hCMV compreende uma sequência com, pelo menos, 95% de identidade para nt 578 -736, preferencialmente, para nt 564-736, da SEQ ID N: 4.
- 15. Célula, de acordo com qualquer umas das reivindicações 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que o primeiro transgene codifica TetR, preferencialmente em que a célula é uma célula PER.C6.
- 16. Célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreendendo um promotor hCMV operacionalmente ligado a um segundo transgene é parte de um adenovirus.
- 17. Vetor compreendendo: (i) uma molécula de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende um promotor AoHV1 operacionalmente ligado a um primeiro transgene, e (ii) uma molécula de ácido nucleico compreendendo um promotor hCMV operacionalmente ligado a um segundo transgene.
- 18. Vetor, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que tem, pelo menos, 80% de identidade com o nt 237-286 da SEQ ID NO: 25, preferencialmente em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotídeos 201 a 286 da SEQ ID NO:25.
- 19. Método para produzir um produto de expressão de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende a expressão em uma célula hospedeira do transgene a partir de uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o transgene codifica o produto de expressão de interesse.
- 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizaPetição 870190072930, de 30/07/2019, pág. 118/1704/4 do pelo fato de que o produto de expressão é uma proteína.
- 21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a colheita do produto de expressão de interesse a partir da célula hospedeira ou a partir de um meio de cultura em que a célula hospedeira é cultivada, ou da célula hospedeira e do meio de cultura.
- 22. Método para produzir um vírus, caracterizado pelo fato de que compreende a propagação do vírus em uma célula que expressa um gene heterólogo que tem uma função na propagação do referido vírus, em que o referido gene heterólogo está sob controle de um promotor AoHV-1, e a colheita do vírus a partir da referida célula ou de um meio de cultura em que a referida célula é cultivada, ou das células e do meio de cultura.
- 23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que tem, pelo menos, 80% de identidade com o nt 237-286 da SEQ ID NO: 25, preferencialmente em que o promotor AoHV-1 compreende uma sequência que é, pelo menos, 95% idêntica aos nucleotídeos 201 a 286 da SEQ ID NO:25.
- 24. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um vetor ou um vírus, como definido em qualquer uma das reivindicações 5, 6, 7 ou 8, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
- 25. Método para a preparação de um adenovirus, caracterizado pelo fato de que compreende a propagação de um adenovirus que codifica para um transgene sob o controle de um promotor hCMV que está operacionalmente ligado a um ou mais sítios tetO em uma célula, como definida na reivindicação 12, e preferencialmente isolando o adenovirus.
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|---|---|---|---|---|
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| TW202043256A (zh) | 2019-01-10 | 2020-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
| CR20220220A (es) | 2019-11-18 | 2022-09-20 | Janssen Biotech Inc | Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos |
| WO2021155323A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Compositions and methods for preventing and treating coronavirus infection-sars-cov-2 vaccines |
| TW202144389A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途 |
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| WO2021209897A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Janssen Biotech, Inc. | Psma and steap1 vaccines and their uses |
| EP4267605A2 (en) | 2020-12-23 | 2023-11-01 | Janssen Biotech, Inc. | Neoantigen peptide mimics |
| WO2022204067A1 (en) * | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Dna Twopointo Inc. | Tetracycline-inducible expression systems |
| WO2024092032A1 (en) * | 2022-10-25 | 2024-05-02 | University Of Washington | Conditionally responsive crispra using protein-protein interaction |
Family Cites Families (65)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| HU212924B (en) | 1989-05-25 | 1996-12-30 | Chiron Corp | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
| FR2705686B1 (fr) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| US5571515A (en) | 1994-04-18 | 1996-11-05 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant |
| JP3816518B2 (ja) | 1994-06-10 | 2006-08-30 | ジェンベク、インコーポレイティッド | 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系 |
| US5851806A (en) | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| US5559099A (en) | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| US5965541A (en) | 1995-11-28 | 1999-10-12 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
| AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| US5837520A (en) | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
| DE69638058D1 (de) | 1995-06-15 | 2009-11-26 | Crucell Holland Bv | Verpackungssysteme für humane rekombinante Adenoviren zur Gentherapie |
| US5837511A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
| CA2177085C (en) | 1996-04-26 | 2007-08-14 | National Research Council Of Canada | Adenovirus e1-complementing cell lines |
| CA2258158A1 (fr) | 1996-07-01 | 1998-01-08 | Francis Blanche | Procede de production d'adenovirus recombinants |
| FR2751343B1 (fr) | 1996-07-16 | 1998-12-18 | Transgene Sa | Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament |
| US6083716A (en) | 1996-09-06 | 2000-07-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Chimpanzee adenovirus vectors |
| US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
| JP2000509614A (ja) | 1997-03-04 | 2000-08-02 | バクスター インターナショナル インコーポレイテッド | アデノウイルスｅ１−相補性細胞系 |
| US6020191A (en) | 1997-04-14 | 2000-02-01 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression |
| US5972650A (en) | 1997-06-26 | 1999-10-26 | Brigham And Women's Hospital | Tetracycline repressor regulated mammalian cell transcription and viral replication switch |
| US5981225A (en) | 1998-04-16 | 1999-11-09 | Baylor College Of Medicine | Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same |
| US6670188B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-12-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| US6113913A (en) | 1998-06-26 | 2000-09-05 | Genvec, Inc. | Recombinant adenovirus |
| US6225289B1 (en) | 1998-12-10 | 2001-05-01 | Genvec, Inc. | Methods and compositions for preserving adenoviral vectors |
| AU777041B2 (en) | 1999-05-17 | 2004-09-30 | Crucell Holland B.V. | Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35 |
| US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 2003-03-20 | Stefan Kochanek | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
| JP2005517394A (ja) | 2001-12-12 | 2005-06-16 | エフ エイチ フォールディング アンド カンパニー リミテッド | ウイルス保存のための組成物 |
| EP1465664A1 (en) | 2002-01-18 | 2004-10-13 | Schering Aktiengesellschaft | Stabilized formulations of adenovirus |
| US20030180936A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
| JP4495587B2 (ja) | 2002-04-25 | 2010-07-07 | クルセル ホランド ベー ヴェー | 組換えアデノウイルスベクターおよびその使用 |
| PL208588B1 (pl) | 2002-04-25 | 2011-05-31 | Crucell Holland Bv | Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa |
| ES2357366T3 (es) | 2002-05-14 | 2011-04-25 | MERCK SHARP & DOHME CORP. | Procedimientos de purificación de adenovirus. |
| SE0202110D0 (sv) | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
| WO2004020971A2 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Introgen Therapeutics Inc. | Chromatographic methods for adenovirus purification |
| AU2003288273A1 (en) | 2002-10-23 | 2004-05-13 | Crucell Holland B.V. | New settings for recombinant adenoviral-based vaccines |
| SG156535A1 (en) | 2002-12-17 | 2009-11-26 | Crucell Holland Bv | Recombinant viral-based malaria vaccines |
| KR101180139B1 (ko) | 2003-03-11 | 2012-09-13 | 메르크 세로노 에스.에이. | Ｍｃｍｖ ｉｅ2 프로모터를 포함하는 발현 벡터 |
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| WO2005056762A2 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | University Of Iowa Research Foundation | Truncated cmv promoters and vectors containing same |
| CN107723298A (zh) | 2004-01-23 | 2018-02-23 | Msd意大利有限公司 | 黑猩猩腺病毒疫苗载运体 |
| NZ548495A (en) | 2004-02-23 | 2009-05-31 | Crucell Holland Bv | Virus purification methods |
| BRPI0518933A2 (pt) | 2004-11-16 | 2008-12-16 | Crucell Holland B V E Aeras Gl | adenovÍrus recombinante defeituoso de replicaÇço, vetor de polinucleotÍdeo recombinante, vacina multivalente da tuberculose, e, uso do antÍgeno tb10.4 de mycobacterium |
| GB0504587D0 (en) | 2005-03-05 | 2005-04-13 | Ml Lab Plc | Vectors comprising guinea pig CMV regulatory elements |
| DK1869171T4 (en) | 2005-04-11 | 2016-01-18 | Crucell Holland Bv | Virus cleaning using ultrafiltration |
| JP2008536506A (ja) * | 2005-04-22 | 2008-09-11 | ロンザ・バイオロジクス・ピーエルシー | ｍＣＭＶプロモーターおよびｈＣＭＶ主要最初期遺伝子を含む哺乳類発現ベクター |
| CN101384722A (zh) | 2005-05-12 | 2009-03-11 | 葛兰素集团有限公司 | 疫苗组合物 |
| WO2007073513A2 (en) | 2005-11-10 | 2007-06-28 | Genvec, Inc. | Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products |
| KR101273836B1 (ko) | 2006-02-28 | 2013-06-11 | 박사르트, 인크. | 키메라 아데노바이러스 벡터 |
| US20100143302A1 (en) | 2006-03-16 | 2010-06-10 | Crucell Holland B.V. | Recombinant Adenoviruses Based on Serotype 26 and 48, and Use Thereof |
| EP1998804B1 (en) | 2006-03-27 | 2014-04-16 | Crucell Holland B.V. | Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant |
| WO2009026183A1 (en) | 2007-08-17 | 2009-02-26 | The Government Of The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Use of chimeric hiv/siv gag proteins to optimize vaccine-induced t cell responses against hiv gag |
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| KR101763093B1 (ko) | 2009-02-02 | 2017-07-28 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 시미안 아데노바이러스 핵산- 및 아미노산-서열, 이를 포함하는 벡터 및 이의 용도 |
| WO2010085984A1 (en) | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Okairos Ag | Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof |
| WO2010096561A1 (en) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof |
| WO2011025717A2 (en) * | 2009-08-31 | 2011-03-03 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Promoter system for regulatable gene expression in mammalian cells |
| BR112012008516B1 (pt) | 2009-10-15 | 2021-10-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Método para purificar partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula |
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