BR112021000274A2 - Vetor adenoviral recombinante expressando antígeno de zika com produtividade melhorada - Google Patents

Abstract

vetor adenoviral recombinante expressando antígeno de zika com produtividade melhorada. a presente invenção refere-se a vetores adenovirais compreendendo sequências de nucleotídeos codificando um antígeno m e env do vírus zika, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno m e env do vírus zika está operavelmente ligada a um promotor do citomegalovírus (cmv) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (teto). também são proporcionadas aqui composições farmacêuticas compreendendo os vetores adenovirais, métodos para produzir os vetores adenovirais, métodos para prevenir o vírus zika ou a progressão do vírus zika em um sujeito necessitado e kits compreendendo os vetores adenovirais e células hospedeiras.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR

ADENOVIRAL RECOMBINANTE EXPRESSANDO ANTÍGENO DE ZIKA COM PRODUTIVIDADE MELHORADA". CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a biotecnologia. Mais parti- cularmente, com o domínio e uso de vetores adenovirais compreen- dendo uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika (ZIKV) operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos compreendendo um promotor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um operador de tetraciclina. Métodos de administração de composições farmacêuticas compreendendo os veto- res de adenovírus ou partículas adenovirais compreendendo os antí- genos M e Env de ZIKV para prevenir ou reduzir a progressão de uma infecção por ZIKV e/ou sintomas causados por uma infecção por ZIKV também são proporcionados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O vírus Zika (ZIKV) é um flavivírus que é responsável por uma epidemia corrente e sem precedentes no Brasil e nas Américas. O ZIKV foi associado de modo causal a microcefalia, restrição do crescimento intrauterino, e outras deficiências congênitas em humanos e em modelos murinos. Se crê que o ZIKV causa neuropatologia em fetos em desenvolvimento ao atravessar a placenta e visar células progenitoras neurais corticais, conduzindo a neurogênese enfraqueci- da e originando microcefalia e outras malformações congênitas.

[0003] A Organização Mundial de Saúde declarou, em 1 de feve- reiro de 2016, que os grupos de microcefalia e distúrbios neurológicos e a sua associação a infecção por ZIKV constituem uma emergência de saúde pública global. O ZIKV também foi associado a afecções neurológicas tais como síndrome de Guillain-Barré. Enquanto o de- senvolvimento rápido de uma vacina segura e eficaz contra o ZIKV é uma prioridade de saúde global, muito pouco é presentemente conhe- cido sobre a imunologia e mecanismos de proteção imune do ZIKV.

[0004] Em conformidade, há uma necessidade não satisfeita no domínio de vacinas contra o ZIKV.

[0005] A discussão anterior é apresentada apenas para proporcionar um melhor entendimento da natureza dos problemas confrontando a téc- nica e não deve ser considerada, de modo nenhum, uma admissão de que tal referência constitui "técnica anterior" do presente pedido.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] São proporcionados aqui vetores adenovirais compreen- dendo uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno M e Env do vírus Zika está operavelmente ligada a um pro- motor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um mo- tivo de operador de tetraciclina (TetO). Em certas modalidades, o antí- geno M e Env do vírus Zika compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, o promotor do CMV com- preendendo pelo menos um motivo TetO compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:3-5.

[0007] Em certas modalidades, o vetor adenoviral é selecionado do grupo consistindo em ChAd3, SAdV, rhAd51, rhAd52, rhAd53, hAda, hAd5, hAd26, e hAd35. Em certas modalidades, o vetor adenoviral compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:9-11 e SEQ ID NO:15.

[0008] Também são proporcionadas células hospedeiras produ- zindo o vetor adenoviral da invenção. Em certas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente uma sequência de nucleotí- deos codificando uma proteína repressora da tetraciclina (TetR). A se- quência de nucleotídeos codificando a proteína TetR pode, por exem- plo, ser integrada no genoma da célula hospedeira. A sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR pode ser integrada no cro- mossomo 1. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira PER.C6º.

[0009] Também são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo um vetor adenoviral da invenção e um veículo farma- ceuticamente aceitável.

[0010] Também são proporcionados métodos para produzir uma partícula adenoviral compreendendo um antígeno M e Env do vírus Zika. Os métodos compreendem (a) contatar uma célula hospedeira da invenção com um vetor adenoviral da invenção; e (b) cultivar a cé- lula hospedeira sob condições em que a partícula adenoviral da inven- ção é produzida.

[0011] Também são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo uma partícula adenoviral da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0012] Também são proporcionados métodos para prevenir uma infecção pelo vírus Zika ou a progressão de uma infecção pelo vírus Zika em um sujeito humano necessitado, os métodos compreendendo administrar ao sujeito as composições farmacêuticas da invenção. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas, por exemplo, pela via intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutâ- nea, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra- articular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intraví- trea, intravaginal, intrarretal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutâ- nea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericardial, intraumbi- lical, intraocular, oral, tópica, local, por inalação, por injeção, por infu- são, por infusão contínua, por perfusão localizada, por cateter, por la- vagem, ou por gavagem.

[0013] Também são proporcionados kits compreendendo (a) um vetor adenoviral da invenção; e (b) uma célula hospedeira da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] O sumário anterior, bem como a seguinte descrição deta- lhada de modalidades preferidas do presente pedido, serão mais bem entendidos quando lidos em conjunção com os desenhos em anexo. No entanto, deve ser entendido que o pedido não está limitado às mo- dalidades precisas mostradas nos desenhos.

[0015] A FIG. 1 mostra uma comparação de sequências de nu- cleotídeos das posições -40 até +40 do promotor do Citomegalovírus (CMV) humano com as posições correspondentes dos promotores de CMV contendo 1x tetO descritos aqui (2A1, 2A2, 2B1, 3A, e 3B). Para cada um destes promotores contendo 1x tetO, apenas são mostrados os nucleotídeos que diferem do CMV; nucleotídeos correspondentes aos do CMV são mostrados como pontos. Para o promotor contendo 1x tetO, a seta branca indica a localização e orientação da sequência tetO única (TOCCTATCAGTGATAGAGA) (SEQ ID NO:20). Inr, ele- mento iniciador; TSS, sítio de início da transcrição (isto é, posição +1); Sacl, localização da inserção da sequência contendo "2x tetO" de 54 pb de comprimento, presente em CMVtetO v1.

[0016] A FIG. 2 mostra gráficos demonstrando a expressão, relati- vamente ao CMV, dos promotores do CMV contendo 1x tetO 2A1, 2A2, 2B1, 3A, e 38 bem como do promotor contendo 2x tetO CMVtetO v1 (CMVtetO) em células sPER.C6€ e células sSPER.C60-TetR.

[0017] A FIG. 3 mostra a produtividade relativa de Ad26.ZIKV.002 em células PER.C60 em suspensão (sSPER.C60) e células PER.C60- TetR em suspensão (sSPER.C608-TetR). Células sPER.C60 e células SPER.C686-TetR foram transduzidas em balões agitados com lotes de pesquisa purificados por CsCI dos vetores Ad26 indicados. Amostras foram recolhidas aos 0, 1, 2, 3, e 4 dias pós-infecção e a concentração de partículas de vetores foi medida por VP-gPCR. A linha ponteada indica o nível do material de entrada. Em ambas as linhas de células,

Ad26.ZIK.002 foi avaliado comparativamente com um bom produtor, um produtor intermédio, e um baixo produtor.

[0018] A FIG. 4 mostra a produtividade de Ad26.ZIKV.002 em cé- lulas PER.C68 em suspensão e em dois clones PER.C60-TetR em suspensão diferentes em um modelo de produção em pequena escala.

[0019] A FIGS. 5A-5B mostram a produtividade de Ad26.ZIKV.001 e Ad26.ZIKV.002 em células PER.C68 em suspensão e células PER.C68-TetR em suspensão a 70 vp/célula e escala de 10 L(A) e 300 vp/célula e escala de 10 L ou 50 L (B).

[0020] A FIG. 6 mostra respostas humorais em soros de NHPs (n= 4 ou 5 por grupo) imunizados com 10º vp de Ad26.ZIKV.002, ou tam- pão de formulação (Pseudo), às 4 semanas pós-imunização. Painel da esquerda: As respostas de anticorpos IgG de ligação específica a Env foram determinadas usando um kit de ELISA comercialmente disponí- vel (Alpha Diagnostics; San Antonio, TX) e expressas como logio da primeira diluição inversa acima de 5x o valor de fundo de soros não manipulados. As respostas médias por grupo estão indicadas com uma linha horizontal. A linha ponteada mostra o limite inferior de de- tecção que é definido como uma diluição abaixo da diluição de início das amostras (0,92 log1o). Painel da direita: Os títulos de neutraliza- ção de ZIKV-PR foram medidos por Testes de Neutralização por Re- dução de Focos (Southern Research; Birmingham, AL) e são relatados como log10 da diluição de soro inversa que reduz o número de vírus de entrada em 50% (ICs5o). As respostas médias por grupo estão indica- das com uma linha horizontal. A linha ponteada mostra o limite inferior de detecção que é definido como uma diluição abaixo da diluição de início das amostras (0,70 log1o).

[0021] A FIG. 7 mostra a eficácia protetora de Ad26.ZIKV.002 con- tra provocação por ZIKV-BR em NHPs. Os animais (n= 4 ou 5 por gru- po) foram imunizados com 10º vp de Ad26.ZIKV.002 (painéis da direi-

ta), ou tampão de formulação (Pseudo, painéis da esquerda). Quatro semanas após a imunização, os animais foram provocados pela via subcutânea com 10º pfu de ZIKV-BR. Plasma e fluido cerebroespinhal (CSF) foram obtidos pré-provocação e em vários momentos após a provocação. A carga viral no plasma (painéis de cima) ou CSF (painéis de baixo) foi determinada por RT-PCR e representada como log1o có- pias de ZIKV/mL. O limite de detecção deste ensaio foi <100 có- pias/mL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0022] Esta descrição é baseada, pelo menos em parte, na identi- ficação de um vetor adenoviral compreendendo uma sequência de nu- cleotídeos codificando antígenos M e Env do vírus Zika operavelmente ligados a uma sequência de nucleotídeos compreendendo um promo- tor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO), que permite a fabricação econômi- ca em larga escala de partículas adenovirais compreendendo os antí- genos M e Env do vírus Zika. Sem pretender ficar limitado pela teoria, se crê que a expressão dos antígenos M e Env do vírus Zika conduz a níveis baixos de produção de partículas adenovirais. A adição do moti- vo TetO ao promotor do CMV permitiu níveis mais elevados de produ- ção de partículas adenovirais.

[0023] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou des- critos nos antecedentes e ao longo do relatório descritivo; cada uma destas referências é incorporada aqui a título de referência na sua to- talidade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, ar- tigos ou similares que foram incluídos no presente relatório descritivo se destina ao propósito de proporcionar contexto para a invenção. Tal discussão não é uma admissão de que qualquer uma ou todas essas matérias fazem parte da técnica anterior no que diz respeito a quais- quer invenções descritas ou reivindicadas.

[0024] A não ser que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significa- do comumente entendido pelo habitualmente perito na técnica à qual esta invenção pertence. De outro modo, certos termos usados neste documento têm os significados como apresentados no relatório descri- tivo.

[0025] Deve ser notado que, conforme usadas neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referências no plural a menos que o contexto determine cla- ramente de outro modo.

[0026] A não ser que afirmado de outro modo, quaisquer valores numéricos, tais como uma concentração ou uma gama de concentra- ções descrita neste documento, devem ser entendido como estando modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Assim, um va- lor numérico inclui tipicamente + 10% do valor apresentado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/mL inclui 0,9 mg/mL até 1,1 mg/mL. Do mesmo modo, uma gama de concentrações de 1% até 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) até 11% (p/v). Conforme usado neste do- cumento, o uso de uma gama numérica inclui expressamente todas as possíveis subgamas, todos os valores numéricos individuais dentro dessa gama, incluindo números inteiros dentro de tais gamas e fra- ções dos valores a não ser que o contexto indique claramente de outro modo.

[0027] A menos que indicado de outro modo, o termo "pelo me- nos" precedendo uma série de elementos é para ser entendido como se referindo a todos os elementos na série. Os peritos na técnica irão reconhecer, ou ser capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades espe- cíficas da invenção descritas no presente documento. Tais equivalen- tes são destinados a ser englobados pela invenção.

[0028] Conforme usado no presente documento, os termos "com- preende", "compreendendo", "incluí", "incluindo", "tem", "tendo", "con- tém" ou "contendo", ou qualquer outra variação dos mesmos, serão entendidos como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros mencionado, mas não a exclusão de qualquer ou- tro número inteiro ou grupo de números inteiros, e pretendem ser não exclusivos ou abertos. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um dispositivo que compreen- de uma lista de elementos não está necessariamente limitado a ape- nas esses elementos, mas pode incluir outros elementos não expres- samente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou dispositivo. Adicionalmente, salvo expressamente mencionado em contrário, "ou" se refere a um ou inclusivo e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é atendida por qual- quer um dos seguintes: A é verdadeira (ou está presente) e B é falsa (ou não está presente), A é falsa (ou não está presente) e B é verda- deira (ou está presente), e tanto A como B são verdadeiras (ou estão presentes).

[0029] Conforme usado no presente documento, o termo conjunti- vo "e/ou" entre múltiplos elementos recitados é entendido como abrangendo tanto as opções individuais como combinadas. Por exem- plo, quando dois elementos são unidos por "e/ou", uma primeira opção se refere à aplicabilidade do primeiro elemento sem o segundo. Uma segunda opção se refere à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção se refere à aplicabilidade dos primeiro e segundo elementos em conjunto. Qualquer uma dessas opções é en- tendida como caindo dentro do significado, e, portanto, satisfaz os re- quisitos do termo "e/ou" conforme usado no presente documento. À aplicabilidade concorrente de mais do que uma das opções também é entendida como caindo dentro do significado, e, desse modo, satisfaz o requisito do termo "e/ou".

[0030] Conforme usado no presente documento, o termo "consiste em" ou variações tais como "consistem em" ou "consistindo em", con- forme usados ao longo do relatório descritivo e das reivindicações, in- dica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números intei- ros mencionado, mas que nenhum número inteiro ou grupo de núme- ros inteiros adicional pode ser adicionado ao método, estrutura ou composição especificado.

[0031] Conforme usado no presente documento, o termo "consiste essencialmente em" ou variações tais como "consistem essencialmen- te em" ou "consistindo essencialmente em", conforme usados ao longo do relatório descritivo e das reivindicações, indica a inclusão de qual- quer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionado, e a in- clusão opcional de qualquer número inteiro ou grupo de números intei- ros mencionado que não mude de forma material as propriedades bá- sicas ou novas do método, estrutura ou composição especificado. Ver M.P.E.P. $2111.03.

[0032] Como usado aqui, "sujeito" ou "paciente" significa qualquer animal, preferencialmente um mamífero, muito preferencialmente um humano, a quem será ou foi administrada uma composição farmacêu- tica e/ou vacina compreendendo um vetor adenoviral/partícula adeno- viral da invenção. O termo "mamífero", conforme usado neste docu- mento, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos incluem, mas não se limitam a, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, macacos, seres humanos, etc., mais preferencialmente um ser humano.

[0033] Como usado aqui, "um método para proporcionar adminis- tração segura" significa um método de administração que é eficaz na geração de uma resposta imune contra um vírus Zika sem causar eventos adversos inaceitáveis, quando administrado a um sujeito.

[0034] Como usadas aqui, as frases "eventos adversos inaceitá- veis" e "reação adversa inaceitável" significam todos os danos ou des- fechos indesejados associados ou causados pela administração de uma composição farmacêutica ou agente terapêutico, e o dano ou des- fecho indesejado alcança um nível tal de gravidade que uma agência regulamentadora considera a composição farmacêutica ou agente te- rapêutico inaceitável para o uso proposto. Exemplos de eventos ou reações adversos inaceitáveis, quando usado no contexto da adminis- tração de partículas adenovirais compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um antígeno do vírus Zika, podem incluir, mas sem limitação, inchaço, dor no sítio da injeção, dor de cabeça, mal-estar, dor muscular, náusea, e febre.

[0035] Em certas modalidades, "tratamento seguro" e "administra- ção segura", quando usados relativamente à administração de vetores adenovirais compreendendo uma molécula de ácido nucleico codifi- cando um antígeno do vírus Zika, significam eventos adversos reduzi- dos incluindo, mas sem limitação, inchaço, dor no sítio da injeção, dor de cabeça, mal-estar, dor muscular, náusea, e febre.

[0036] As palavras "direita", "esquerda", "inferior" e "superior" de- signam direções nos desenhos aos quais é feita referência.

[0037] Deve ser também entendido que os termos "cerca de", "aproximadamente", "geralmente", "substancialmente" e termos simila- res, usados no presente documento quando se referindo a uma di- mensão ou característica de um componente da invenção preferencial, indicam que a dimensão/característica descrita não é um limite ou pa- râmetro estrito e não exclui pequenas variações das mesmas que sejam funcionalmente iguais ou similares, conforme será entendido por uma pessoa de conhecimento comum na técnica. No mínimo, tais referências que incluem um parâmetro numérico incluem variações que, usando princípios matemáticos e industriais aceites na técnica (por exemplo, er-

ros de arredondamento, medição ou outros erros sistemáticos, tole- râncias de fabricação, etc.) não variam o dígito menos significativo.

[0038] Os termos "idênticas" ou percentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídi- cas (por exemplo, vetores adenovirais, polipeptídeos M e Env do vírus Zika e sequências de nucleotídeos que codificam os polipeptídeos M e Env, sequências de nucleotídeos de promotores do citomegalovírus, e sequências de operadores de tetraciclina (TetO)), se relacionam com duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nu- cleotídeos que são iguais, quando comparadas e alinhadas para cor- respondência máxima, medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por inspeção visual.

[0039] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequên- cia atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequências, em se- guida, calcula a percentagem de identidade de sequência para a(s) sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados.

[0040] O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de ali- nhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de procura de semelhança de Pearson & Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A.85:2444 (1988), por implementações com- putadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TEASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (ver ge- ralmente, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., "Current Protocols", um consórcio da Greene Publishing Associa- tes, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1995) (Ausubel)).

[0041] Exemplos de algoritmos que são adequados para a deter- minação da percentagem da identidade de sequência e semelhança de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que estão des- critos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. O sof- tware para realizar análises BLAST está publicamente disponível atra- vés do National Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve primeiramente a identificação de pares de sequência de ele- vada pontuação (HSPs) por identificação de palavras curtas de com- primento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfa- zem alguma pontuação limite de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma base de dados de sequências. T é referido como o limite de pontuação da palavra vizinha (Altschul et a/, supra). Estes acertos de palavras vizinhas iniciais atu- am como sementes para iniciar pesquisas de forma a encontrar HSPs mais longos que as contenham. Os acertos de palavras são então es- tendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo possa ser aumentada.

[0042] Pontuações cumulativas são calculadas usando, para se- quências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompen- sa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontu- ação de penalidade para resíduos com emparelhamento defeituoso; sempre < O). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontua- ção é usada de forma a calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa diminui pela quantidade X des- de o seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa tende para zero ou menor, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou é atingido o fim de qualquer uma das sequências. Os parâmetros W, T, e X do algoritmo BLAST deter- minam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N =-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimen- to de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pon- tuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

[0043] Em adição ao cálculo da identidade de sequência porcen- tual, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Al- tschul, Proc. Nat'. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade de uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade da menor soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,1, mais pre- ferencialmente menor do que cerca de 0,01, e muito preferencialmente menor do que cerca de 0,001.

[0044] Uma indicação adicional de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é quando o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologica- mente reativo de forma cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, conforme descrito abaixo. Desse modo, um polipeptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por substituições conservativas. Outra indicação que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é quando as duas moléculas hibridam uma com a outra sob condições estringentes.

[0045] Como usado aqui, o termo "resposta imune" ou "resposta imune protetora" significa que o sujeito vacinado é capaz de controlar uma infecção (por exemplo, uma infecção pelo vírus Zika (ZIKV)) com o agente patogênico contra o qual a vacinação foi realizada (por exemplo, um antígeno M e Env de ZIKV). O agente patogênico pode, por exemplo, ser um produto de gene antigênico ou proteína antigêni- ca, ou um seu fragmento. Habitualmente, o sujeito tendo desenvolvido uma "resposta imune" ou uma "resposta imune protetora" desenvolve apenas sintomas clínicos ligeiros até moderados ou nenhuns sinto- mas. Habitualmente, um sujeito no qual foi gerada uma "resposta imu- ne" ou "resposta imune protetora" contra um vírus Zika, não irá desen- volver manifestações de doença ou aquelas manifestações de doença serão mais ligeiras, e em última análise o sujeito não morrerá devido à infecção pelo referido vírus. Adicionalmente, um sujeito no qual uma "resposta imune" ou "resposta imune protetora" contra um vírus Zika foi gerada, terá uma probabilidade reduzida de anormalidades cere- brais nos seus lactentes expostos ao vírus in utero.

[0046] Por "gerar uma resposta imune" ou "promover uma respos- ta imune" ou "provocar uma resposta imune" se pretende significar in- duzir uma resposta humoral (por exemplo, a produção de anticorpos) ou uma resposta celular (por exemplo, a ativação de células T, macró- fagos, neutrófilos, e/ou células assassinas naturais) dirigida contra, por exemplo, um ou mais agentes infecciosos (por exemplo, um vírus (por exemplo, um ZIKV)) ou alvos proteicos em um sujeito ao qual foi ad-

ministrada a composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica ou vacina).

[0047] Por "imunógeno" ou "antígeno" se pretende significar qual- quer polipeptídeo que consiga induzir uma resposta imune em um su- jeito por administração. Em algumas modalidades, o imunógeno ou antígeno é codificado por uma molécula de ácido nucleico que pode ser incorporada, por exemplo, em um vetor adenoviral da invenção, para expressão subsequente do imunógeno ou antígeno (por exemplo, um produto de gene de interesse, ou seu fragmento (por exemplo, um polipeptídeo)). Em algumas modalidades, o antígeno é derivado de um ZIKV (por exemplo, um ZIKV da linhagem asiática e/ou africana (por exemplo, ZIKV estirpe BeH815744 (número de acesso KU365780)). Em algumas modalidades, o antígeno é administrado no contexto de uma molécula de ácido nucleico expressando um polipeptídeo que é derivado de um ZIKV (por exemplo, os antígenos M e Env de ZIKV de um ZIKV da linhagem asiática e/ou africana (por exemplo, ZIKV estirpe BeH815744 (número de acesso KU365780)).

[0048] O termo "composição imunogênica" ou "composição farma- cêutica", como usado aqui, é definido como material usado para gerar uma resposta imune e pode conferir imunidade após administração da composição imunogênica a um sujeito.

[0049] Por "isolado" se pretende significar separado, recuperado, ou purificado de um componente do seu ambiente natural. Por exem- plo, uma molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção pode ser isolado de um componente do seu ambiente natural em 1% (2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, ou 90%) ou mais. Adenovírus, Moléculas de Ácidos Nucleicos, e Polipeptídeos da Invenção

[0050] Em WO2017/214596, intitulado "Composições e Métodos para Prevenir e Tratar Infecção pelo Vírus Zika", são descritos polipep- tídeos do vírus Zika (ZIKV) que podem ser usados para induzir respos- tas imunes protetoras contra uma infecção por ZIKV quando adminis- trados a um sujeito (por exemplo, um camundongo ou macaco) infec- tado ou provavelmente exposto a uma infecção por ZIKV. Os polipep- tídeos de ZIKV para uso em composições farmacêuticas preparadas para administração podem incluir um M-Env, prM-Env, prM-Env.dTM, prM-Env.dStem, Env, Env.dTM, e/ou Env.dStem ou uma sua porção. Alternativamente, os polipeptídeos de ZIKV podem ser codificados por uma molécula de ácido nucleico compreendida dentro de um vetor (por exemplo, um vetor adenoviral).

[0051] São proporcionados aqui vetores adenovirais compreen- dendo uma sequência de nucleotídeos codificando antígenos M e Env do vírus Zika. As sequências de nucleotídeos codificando os antígenos M e Env do vírus Zika podem ser, por exemplo, operavelmente ligadas a um promotor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO). Em certas modalidades, o promotor do CMV compreende um, dois, três, quatro, ou cinco moti- vos TetO. O promotor do CMV pode ser selecionado, por exemplo, do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:3-5, que são proporcionadas abai- xo na Tabela 1.

[0052] Tabela 1: Promotores do CMV contendo TetO que podem ser usados para controlar a expressão de antígenos M e Env do vírus Zika em um vetor adenoviral. [pemior — ssatno: —

[0053] Em certas modalidades, os antígenos M e Env do vírus Zika compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1. A se-

quência de nucleotídeos codificando os antígenos M e Env do vírus Zika compreende a SEQ ID NO:2.

[0054] As moléculas de ácidos nucleicos têm uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85% (por exemplo, pelo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) de identidade de sequência com a totalidade ou uma porção de qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 ou uma sua sequência complementar. Alternativa- mente, uma molécula de ácido nucleico isolada tem uma sequência de nucleotídeos que codifica um antígeno M e Env de ZIKV com pelo me- nos 85% (por exemplo, pelo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) de identidade de sequência com a totalidade ou uma porção da SEQ ID NO:1.

[0055] As moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem ser adicionalmente otimizadas, tal como por otimização de códons, para expressão em um sujeito mamífero visado (por exemplo, humano).

[0056] As moléculas de ácidos nucleicos também podem ser inse- ridas em vetores de expressão, como um vetor de adenovírus, e incor- poradas em composições da invenção. Os termos "vetor de adenoví- rus" e "vetor adenoviral" e "partículas adenovirais" são usados indistin- tamente e se relacionam com um adenovírus geneticamente manipu- lado que é planejado para inserir um polinucleotídeo de interesse (por exemplo, um polinucleotídeo codificando o antígeno M e Env de ZIKV) em uma célula eucariótica, de modo que o polinucleotídeo é subse- quentemente expresso. Exemplos de adenovírus que podem ser usa- dos como vetor viral da invenção incluem os tendo, ou derivados de, os serótipos Ad2, Ad 4, Ad5, Ad11, Ad12, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad40, Ad48, Ad49, Ad50, Ad52 (por exemplo, RhAd52), e Pan9 (tam- bém conhecido como AdC68); estes vetores podem ser derivados, por exemplo, de adenovírus humano, de chimpanzé (por exemplo, ChAd1,

ChAd3, ChAd7, ChAd8, ChAd21, ChAd22, ChAd23, ChAd24, ChAd25, ChAd26, ChAd27.1, ChAd28.1, ChAd29, ChAd30, ChAd31.1, ChAd32, ChAd33, ChAd34, ChAd35.1, ChAd36, ChAd37.2, ChAd39, ChAd4o.1, ChAd41.1, ChAd42.1, ChAd43, ChAd44, ChAd45, ChAd46, ChAda48, ChAd49, ChAd49, ChAd50, ChAd67, ou SATP), ou rhesus (por exem- plo, rhAd51, rhAd52, ou rhAd53).

[0057] "Molécula de ácido nucleico" ou "polinucleotídeo", como usados indistintamente aqui, se relaciona com polímeros de nucleotí- deos de qualquer comprimento, e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e seus análo- gos. Se presente, a modificação na estrutura de nucleotídeos pode ser efetuada antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nu- cleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a sínte- se, tal como por conjugação com uma etiqueta.

[0058] Por "molécula de ácido nucleico heteróloga" se pretende significar uma sequência de nucleotídeos que pode codificar proteínas derivadas ou obtidas de organismos patogênicos, como vírus, que po- de ser incorporada em um polinucleotídeo ou vetor da invenção. Áci- dos nucleicos heterólogos também podem codificar proteínas sintéti- cas ou artificiais, tais como epítopos imunogênicos, construídas para induzir imunidade. Um exemplo de uma molécula de ácido nucleico heteróloga é uma que codifica um ou mais peptídeos ou polipeptídeos imunogênicos derivados de um vírus Zika (por exemplo, o antígeno M e Env de ZIKV). A molécula de ácido nucleico heteróloga é tal que não está normalmente associada às outras moléculas de ácidos nucleicos presentes no polinucleotídeo ou vetor onde é incorporada a molécula de ácido nucleico heteróloga.

[0059] Uma "vacina de ácido nucleico" ou "vacina de DNA" se re- laciona com uma vacina que inclui uma molécula de ácido nucleico heteróloga sob o controle de um promotor para expressão em um su- jeito. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser incorporada em um vetor de expressão, tal como um vetor adenoviral.

[0060] O termo "vacina", como usado aqui, é definido como mate- rial usado para provocar uma resposta imune e que confere imunidade durante um período de tempo após a administração da vacina a um sujeito.

[0061] Um "promotor" é uma sequência de ácido nucleico permi- tindo a iniciação da transcrição de uma sequência de gene em um RNA mensageiro, tal transcrição sendo iniciada com a ligação de uma RNA polimerase ao promotor ou próximo deste.

[0062] Como proporcionado aqui, em certas modalidades, o pro- motor é um promotor do citomegalovírus compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO). O motivo TetO pode ser referido como "sequência reguladora" ou "elemento regulador", que, como usado aqui, se relaciona com um segmento de ácido nucleico, tipicamente mas sem limitação DNA, que modula a transcrição da se- quência de ácido nucleico à qual é operavelmente ligado, e, assim, atua como modulador da transcrição. Uma sequência reguladora com- preende frequentemente sequências de ácidos nucleicos que são do- mínios de ligação da transcrição que são reconhecidos pelos domínios de ligação a ácidos nucleicos de proteínas de transcrição e/ou fatores de transcrição, potenciadores ou repressores, etc. Por exemplo, é possível acoplar operavelmente uma sequência repressora ao promo- tor, cuja sequência repressora pode ser ligada por uma proteína re- pressora que pode diminuir ou prevenir a expressão do transgene em uma linha celular de produção que expressa a proteína repressora. Tal pode melhorar a estabilidade genética e/ou os níveis de expressão da molécula de ácido nucleico por passagem e/ou quando esta é produzi- da em quantidades elevadas na linha celular de produção. Tais siste- mas foram descritos na técnica. Uma sequência reguladora pode inclu- ir um ou mais motivos/sequências de operador de tetraciclina (TetO), de modo que a expressão é inibida na presença da proteína represso- ra da tetraciclina (TetR). Na ausência de tetraciclina, a proteína TetR é capaz de se ligar aos sítios de TetO e reprimir a transcrição de um transgene (por exemplo, o antígeno M e Env de ZIKV) operavelmente ligado aos motivos/sequências de TetO. Na presença de tetraciclina, no entanto, uma alteração conformacional na proteína TetR impede que se ligue às sequências TetO, permitindo que ocorra a transcrição de transgenes operavelmente ligados. Em certas modalidades, o ácido nucleico codificando o antígeno M e Env de ZIKV, quando presente no vetor adenoviral, é operavelmente ligado a um promotor do citomega- lovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO), de modo que a expressão do antígeno M e Env de ZIKV é inibida em adenovírus recombinantes que são produzidos na linha de células produtoras onde a proteína TetR é expressa. Subse- quentemente, a expressão não será inibida no vetor adenoviral recom- binante se introduzido em um sujeito ou em células que não expres- sam a proteína TetR.

[0063] Como usado aqui, o termo "repressor" se relaciona com moléculas (por exemplo, proteínas) tendo a capacidade de inibir, inter- ferir, retardar, e/ou reprimir a produção de um produto proteico heteró- logo de um vetor de expressão recombinante (por exemplo, um vetor adenoviral). O repressor pode inibir a expressão interferindo com um sítio de ligação em uma localização apropriada ao longo do vetor de expressão, como em um cassete expressão (por exemplo, uma TetR pode se ligar ao motivo TetO no promotor do CMV). A repressão da expressão do transgene do vetor durante a propagação do vetor pode prevenir a instabilidade do transgene, e pode aumentar os rendimen- tos dos vetores tendo o transgene durante a produção.

[0064] Um ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando é colo- cado em uma relação estrutural ou funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um segmento de DNA pode ser opera- velmente ligado a outro segmento de DNA se estiverem posicionados, um relativamente ao outro, na mesma molécula de DNA contígua e tiverem uma relação estrutural ou funcional, como um promotor ou in- tensificador que é posicionado relativamente a uma sequência codifi- cadora de modo a facilitar a transcrição da sequência codificadora; um sítio de ligação no ribossomo que é posicionado relativamente a uma sequência codificadora de modo a facilitar a tradução; ou uma pré- sequência ou líder secretor que é posicionado relativamente a uma sequência codificadora de modo a facilitar a expressão de uma pré- proteína (por exemplo, uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo codificado). Noutros exemplos, as sequências de ácidos nucleicos operavelmente ligadas não são contíguas, mas estão posici- onadas de um modo tal que têm uma relação funcional entre si como ácidos nucleicos ou como proteínas que são expressas por aqueles. Intensificadores, por exemplo, não têm de ser contíguos. A ligação po- de ser efetuada por ligação em sítios de restrição convenientes ou usando adaptadores ou ligadores oligonucleotídicos sintéticos.

[0065] Um adenovírus de acordo com a invenção pertence à famí- lia Adenoviridae e, de preferência, é um que pertence ao gênero Mas- tadenovirus. Pode ser um adenovírus humano, mas também um ade- novírus que infecta outras espécies, incluindo, mas sem limitação, um adenovírus bovino (por exemplo, adenovírus bovino 3, BAdV3), um adenovírus canino (por exemplo, CAdV2), um adenovírus porcino (por exemplo, PAdV3 ou 5) ou um adenovírus de símio (que inclui um ade- novírus de macaco e um adenovírus de símio, tal como um adenovírus de chimpanzé ou um adenovírus de gorila). De preferência, o adenoví- rus é um adenovírus humano (HAdV ou AdHu; na invenção entende- se um adenovírus humano se for feita referência a Ad sem indicação da espécie, por exemplo, a notação breve “Ad5” significa o mesmo que HAdV5, que é o adenovírus humano serótipo 5) ou um adenovírus de símio como adenovírus de chimpanzé ou gorila (ChAd, AdCh ou SAdvV).

[0066] Os estudos mais avançados foram realizados utilizando adenovírus humanos, e adenovírus humanos são preferidos de acordo com certos aspectos da invenção. Em determinadas modalidades pre- ferenciais, o adenovírus recombinante de acordo com a invenção é baseado em um adenovírus humano. Em modalidades preferenciais, o adenovírus recombinante é baseado em um adenovírus humano seró- tipo 4, 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 ou 50. De acordo com uma modalidade particularmente preferencial da invenção, um adenovírus é um adeno- vírus humano de um dos serótipos 26 ou 35.

[0067] Uma vantagem destes serótipos é uma baixa seroprevalên- cia e/ou baixos títulos de anticorpos neutralizantes pré-existentes na população humana. A preparação de vetores rAd26 é descrita, por exemplo, em WO 2007/104792 e em Abbink et al., (2007) Virol 81(9):4654-63, ambos os quais são incorporados a título de referência aqui na sua totalidade. Sequências genômicas exemplificativasde Ad26 se encontram no GenBank com o Acesso EF153474 e na SEQ ID NO:1 de WO 2007/104792. A preparação de vetores rAd35 é des- crita, por exemplo, na Patente US No. 7,270,811, em WO 00/70071 e em Vogels et al, (2003) J Virol 77 (15): 8263-71, todos os quais são incorporados a título de referência aqui na sua totalidade. Sequências genômicas exemplificativas de Ad35 se encontram no GenBank com o

Acesso AC 0000189 e na Fig. 6 de WO 00/70071.

[0068] Os adenovírus de símios em geral, também têm uma baixa seroprevalência e/ou baixos títulos de anticorpos neutralizantes pré- existentes na população humana, e uma quantidade significativa de trabalho foi reportada usando os vetores de adenovírus de chimpanzés (p. ex., US6083716, WO 2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394- 401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17; ver também o artigo de revisão por Bangari e Mittal, 2006, Vaccine 24: 849- 62; e ar- tigo de revisão por Lasaro e Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39). Assim, em outras modalidades preferenciais, o adenovírus recombinante de acordo com a invenção é baseado em um adenovírus de símio, por exemplo, um adenovírus de chimpanzé. Em determinadas modalida- des, o adenovírus recombinante é baseado em um adenovírus de sí- mio do tipo 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 ou SA7P. Vetor Adenoviral rAd26

[0069] Em uma modalidade preferencial de acordo com a inven- ção, os vetores adenovirais compreendem proteínas capsídicas de dois serótipos raros: Ad26 ou Ad35. Na modalidade típica, o vetor é um vírus rAd26.

[0070] O perito reconhecerá que elementos derivados de múltiplos serótipos podem ser combinados em um único vetor de adenovírus recombinante. Desse modo, um adenovírus quimérico que combina propriedades desejáveis de diferentes serótipos pode ser produzido. Assim, em algumas modalidades, um adenovírus quimérico da inven- ção pode combinar a ausência de imunidade pré-existente dos seróti- pos Ad26 com características tais como estabilidade térmica, monta-

gem, ancoragem, rendimento de produção, infecção redirecionada ou melhorada, estabilidade do DNA na célula-alvo, e similares.

[0071] Em certas modalidades, o vetor de adenovírus recombinan- te útil na invenção é derivado maioritária ou totalmente Ad26 (isto é, o vector é rAd26). Em algumas modalidades, o adenovírus é deficiente para replicação, por exemplo, porque contém uma deleção na região E1 do genoma. Para os adenovírus da invenção, sendo derivados de Ad26, é típico trocar a sequência codificadora de E4-orf6 do adenoví- rus pela E4-orf6 de um adenovírus do subgrupo humano C, tal como Ad5. Tal permite a propagação de tais adenovírus em linhas de células de complementação bem conhecidas que expressam os genes E1 de Ad5, tais como, por exemplo, células HEK293, células PER.C60, e similares (ver, por exemplo Havenga et al, 2006, J Gen Virol 87: 2135- 43; WO 03/104467). Em certas modalidades, o adenovírus é um ade- novírus humano do serótipo 35, com uma deleção na região E1 na qual o ácido nucleico que codifica o antígeno foi clonado, e com uma região E4 orf6 de Ad5. Em certas modalidades, o adenovírus é um adenovírus humano do serótipo 26, com uma deleção na região E1 na qual o ácido nucleico que codifica o antígeno foi clonado, e com uma região E4 orf6 de Ad5. Para o adenovírus Ad35, é típico manter a ex- tremidade 3' da fase de leitura aberta de E1B 55K no adenovírus, por exemplo, os 166 pb diretamente a montante da fase de leitura aberta de plX ou um fragmento que compreende este, como um fragmento de 243 pb diretamente a montante do códon de iniciação de plX, marcado na extremidade 5' por um sítio de restrição Bsu36|1, uma vez que isso aumenta a estabilidade do adenovírus, porque o promotor do gene plX é, em parte, residente nessa área (ver, por exemplo, Havenga et al, 2006, supra; WO 2004/001032). A preparação de vetores adenovirais recombinantes é bem conhecida na técnica.

[0072] A preparação de vetores rAd26 é descrita em, por exemplo,

WO 2007/104792 e em Abbink et a/l., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Se- quências genômicas exemplificativasde Ad26 se encontram no GenBank com o Acesso EF153474 e na SEQ ID NO:1 de WO 2007/104792. À preparação de vetores rAd35 é descrita, por exemplo, na Patente US No. 7,270,811, e em Vogels et al, (2003) J Virol 77 (15): 8263-71. Uma sequência genômica exemplificativa de Ad35 se encontra no GenBank Acesso AC 000019.

[0073] Em uma modalidade da invenção, os vetores úteis para a invenção incluem os descritos em WO2012/082918, cuja descrição é incorporada aqui a título de referência na sua totalidade.

[0074] Tipicamente, um vetor útil na invenção é produzido usando um ácido nucleico compreendendo a totalidade do genoma adenoviral recombinante (por exemplo, um vetor plasmídico, cosmídico, ou de baculovírus). Assim, a invenção também proporciona moléculas de ácidos nucleicos isoladas que codificam os vetores adenovirais da in- venção. As moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA obtido por clonagem ou produ- zido sinteticamente. O DNA pode ser de cadeia dupla ou cadeia sim- ples.

[0075] Os vetores de adenovírus úteis na invenção são tipicamen- te deficientes para replicação. Nestas modalidades, o vírus é tornado deficiente para replicação por deleção ou inativação de regiões críticas para a replicação do vírus, como a região E1. As regiões podem ser substancialmente deletadas ou inativadas, por exemplo, inserindo o gene de interesse (habitualmente ligado a um promotor). Em algumas modalidades, os vetores da invenção podem conter deleções noutras regiões, como as regiões E2, E3 ou E4, ou inserções de genes heteró- logos ligados a um promotor. Para adenovírus mutados em E2 e/ou E4, geralmente são usadas linhas de células de complementação de E2 e/ou E4 para gerar adenovírus recombinantes. Não é necessário que mutações na região E3 do adenovírus sejam complementadas pe- la linha de células, uma vez que E3 não é requerido para a replicação.

[0076] Uma linha de células de empacotamento é tipicamente usada para produzir uma quantidade suficiente de vetores de adenoví- rus da invenção. Uma célula de empacotamento é uma célula que compreende aqueles genes que foram deletados ou inativados em um vetor deficiente para replicação, desse modo permitindo que o vírus se replique na célula. Linhas de células adequadas incluem, por exemplo, PER.C60, 911, 293, e E1 A549.

[0077] Em certas modalidades, a linha de células de empacota- mento ou linha de células hospedeiras compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína repressora da tetraciclina (TetR). A sequência de nucleotídeos codificando a pro- teína TetR pode, por exemplo, ser integrada no genoma da linha de células de empacotamento ou linha de células hospedeiras. A título exemplificativo, a sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR pode ser integrada no cromossomo 1. A linha de células de em- pacotamento/linha de células hospedeiras pode, por exemplo, ser uma linha de células de empacotamento/linha de células hospedeiras PER.C60.

[0078] Em certas modalidades, são proporcionados aqui métodos para produzir uma partícula adenoviral compreendendo um antígeno M e Env do vírus Zika. Os métodos compreendem (a) contatar uma célu- la hospedeira da invenção com um vetor adenoviral da invenção e (b) cultivar a célula hospedeira sob condições em que a partícula adenovi- ral compreendendo o antígeno M e Env de Zika é produzida.

[0079] Em certas modalidades, o vetor adenoviral compreende um transgene. Um "transgene" se refere a um ácido nucleico heterólogo, que é um ácido nucleico que não está naturalmente presente no vetor e, de acordo com a presente invenção, o transgene pode codificar um produto de gene antigênico ou proteína antigênica (por exemplo, um antígeno M e Env de ZIKV) que induz uma resposta imune no sujeito. O transgene pode, por exemplo, ser introduzido no vetor por técnicas convencionais de biologia molecular. O transgene pode, por exemplo, ser clonado em uma região E1 ou E3 deletada de um vetor adenoviral, ou na região entre a região E4 e o rITR. Um transgene é, geralmente, operavelmente ligado a sequências de controle da expressão. Em mo- dalidades preferidas, o transgene é inserido em um local de inserção de transgene. Composições Farmacêuticas

[0080] Em outro aspecto geral, a invenção se relaciona com com- posições farmacêuticas compreendendo vetores adenovirais (ou partí- culas adenovirais) da invenção (isto é, vetores adenovirais ou partícu- las adenovirais compreendendo uma molécula ácido nucleico codifi- cando antígenos M e Env do vírus Zika) e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Vetores (ou partículas) adenovirais da invenção e composições compreendendo os mesmos também são úteis na fabri- cação de um medicamento para aplicações terapêuticas mencionadas aqui.

[0081] Por "composição farmacêutica" se pretende significar qual- quer composição que contém um agente terapêutica ou biologicamen- te ativo, como uma composição imunogênica ou vacina da invenção (por exemplo, uma partícula adenoviral compreendendo uma molécula de ácido nucleico de ZIKV e/ou polipeptídeo/antígeno da invenção), preferencialmente incluindo uma sequência de nucleotídeos codifican- do um produto de gene antigênico de interesse, ou seu fragmento, que é adequado para administração a um sujeito e que trata ou previne uma doença (por exemplo, infecção por ZIKV) ou reduz ou melhora um ou mais sintomas da doença (por exemplo, título viral e disseminação viral de ZIKV, infecção e/ou fusão de células por ZIKV)). Para os pro-

pósitos desta invenção, composições farmacêuticas incluem vacinas, e composições farmacêuticas adequadas para administrar um agente terapêutica ou biologicamente ativo podem incluir, por exemplo, com- primidos, cápsulas de gel, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspen- sões, emulsões, soluções, géis, hidrogéis, géis orais, pastas, colírios, pomadas, cremes, emplastros, poções, dispositivos de aplicação, su- positórios, enemas, injetáveis, implantes, pulverizações, ou aerossóis. Quaisquer destas formulações podem ser preparadas por métodos da técnica bem conhecidos e aceites. Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21º ed.), ed. A.R. Gennaro, Lip- pincott Williams & Wilkins, 2005, e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, ed. J. Swarbrick, Informa Healthcare, 2006, cada um dos quais é deste modo incorporado a título de referência.

[0082] Como usado aqui, o termo "veículo" se relaciona com qual- quer excipiente, diluente, agente de enchimento, sal, tampão, estabili- zador, solubilizador, óleo, lipídeo, vesícula contendo lipídeo, microes- fera, encapsulação lipossômica, ou outro material bem conhecido na técnica para uso em formulações farmacêuticas. Será entendido que as características do veículo, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação particular. Como usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se relaciona com um ma- terial não tóxico que não interfere na eficácia de uma composição de acordo com a invenção ou na atividade biológica de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com modalidades particulares, considerando a presente descrição, qualquer veículo farmaceutica- mente aceitável adequado para uso em uma composição farmacêutica pode ser usado na invenção.

[0083] Sais acídicos/aniônicos farmaceuticamente aceitáveis para uso na invenção incluem, e sem limitação, acetato, benzenossulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartarato, brometo, edetato de cálcio, camsila-

to, carbonato, cloreto, citrato, dicloridrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gliceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromidrato, cloridrato, hidroxinaftoato, iodeto, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metilbrometo, metilnitrato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, sali- cilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartarato, teo- clato, tosilato, e trietiodeto. Ácidos orgânicos ou inorgânicos também incluem, e sem limitação, ácido iodídrico, perclórico, sulfúrico, fosfóri- co, propiônico, glicólico, metanossulfônico, hidroxietanossulfônico, oxálico, 2-naftalenossulfônico, p-toluenossulfônico, ciclo-hexanossul- fâmico, sacarínico ou trifluoroacético.

[0084] Sais básicos/catiônicos farmaceuticamente aceitáveis in- cluem, e sem limitação, alumínio, 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3- diol (também conhecido como tris(hidroximetil)aminometano, trometa- no ou "TRIS"), amônia, benzatina, t-butilamina, cálcio, cloroprocaína, colina, ciclo-hexilamina, dietanolamina, etilenodiamina, lítio, L-lisina, magnésio, meglumina, N-metil-D-glucamina, piperidina, potássio, pro- caína, quinina, sódio, trietanolamina, ou zinco.

[0085] Em algumas modalidades da invenção, composições far- macêuticas são proporcionadas compreendendo as partículas adeno- virais da invenção em uma quantidade desde cerca de 1 x 10º, cerca de 2 x 10º, cerca de 3 x 10º, cerca de 4 x 10º, cerca de 5 x 10º, cerca de 6 x 10º, cerca de 7 x 10º, cerca de 8 x 10º, cerca de 9 x 10º, cerca de 1 x 10%, cerca de 2 x 10º), cerca de 3 x 10º, cerca de 4 x 10), ou cerca de 5 x 10º partículas virais por dose. Em certas mo- dalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende cerca de 1 x 10º partículas adenovirais até cerca de 5 x 10*' partículas ade- novirais por dose. Em certas modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende cerca de 1 x 10*º partículas adenovirais até cerca de 1 x 10º? partículas adenovirais por dose. Em certas modali- dades da invenção, a composição farmacêutica compreende cerca de x 10º partículas adenovirais até cerca de 1 x 10*' partículas adeno- virais por dose. Em certas modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende cerca de 5 x 10º partículas adenovirais por dose. Em certas modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende cerca de 1 x 10" partículas adenovirais por dose.

[0086] A composição farmacêutica pode ter um pH desde cerca de 3,0 até cerca de 10, por exemplo, desde cerca de 3 até cerca de 7, ou desde cerca de 5 até cerca de 9. A formulação pode adicionalmente compreender pelo menos um ingrediente selecionado do grupo consis- tindo em um sistema tampão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizador(es) e tensoativo(s).

[0087] Em certas modalidades, ao sujeito é administrada uma úni- ca dose da composição farmacêutica. Em certas modalidades, ao su- jeito é administrada uma dose dupla da composição farmacêutica. Na administração de uma dose dupla, a primeira e segunda doses da composição farmacêutica podem ser administradas ao sujeito com um intervalo de cerca de quatro semanas, cerca de oito semanas, cerca de doze semanas, cerca de três meses, cerca de seis meses, cerca de nove meses, cerca de um ano, cerca de dois anos, cerca de três anos, cerca de quatro anos, cerca de cinco anos, ou cerca de dez anos.

[0088] A formulação de ingredientes farmaceuticamente ativos com veículos farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (por exemplo, 21º edição (2005), e quaisquer edições posteriores). Exem- plos não limitadores de ingredientes adicionais incluem: tampões, dilu- entes, solventes, agentes reguladores da tonicidade, conservantes, estabilizadores, e agentes quelantes. Um ou mais veículo farmaceuti- camente aceitáveis podem ser usados na formulação das composi-

ções farmacêuticas da invenção.

[0089] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica é uma formulação líquida. Um exemplo preferencial de uma formu- lação líquida é uma formulação aquosa, isto é, uma formulação com- preendendo água. A formulação líquida pode compreender uma solu- ção, uma suspensão, uma emulsão, uma microemulsão, um gel, e si- milares. Uma formulação aquosa compreende tipicamente pelo menos 50% p/p de água, ou pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou pelo menos 95% p/p de água.

[0090] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser formulada como um injetável que pode ser injetado, por exemplo, via uma seringa ou uma bomba de infusão. A injeção pode ser adminis- trada subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, ou intravenosamente, por exemplo.

[0091] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma formulação sólida, por exemplo, uma composição liofilizada ou seca por pulverização, que pode ser usada como tal, ou à qual o médico ou o paciente adiciona solventes, e/ou diluentes antes do uso. Formas de dosagem sólidas podem incluir comprimidos, tais como comprimidos preparados por compressão, e/ou comprimidos revestidos, e cápsulas (por exemplo, cápsulas de gelatina dura ou mole). A composição far- macêutica também pode estar na forma de saquetas, drágeas, pós, grânulos, pastilhas, ou pós para reconstituição, por exemplo.

[0092] As formas de dosagem podem ser de liberação imediata, em cujo caso podem compreender um veículo solúvel ou dispersível em água, ou podem ser de liberação retardada, liberação sustentada, ou liberação modificada, em cujo caso podem compreender polímeros insolúveis em água que regulam a velocidade de dissolução da forma de dosagem no trato gastrointestinal.

[0093] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode ser administrada intranasal, intrabucal, ou sublingualmente.

[0094] O pH em uma formulação aquosa pode se situar entre pH 3 e pH 10. Em uma modalidade da invenção, o pH da formulação vai desde cerca de 7,0 até cerca de 9,5. Em outra modalidade da inven- ção, o pH da formulação vai desde cerca de 3,0 até cerca de 7,0.

[0095] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um tampão. Exemplos não limitadores de tampões incluem: arginina, ácido aspártico, bicina, citrato, hidrogenofosfato dis- sódico, ácido fumárico, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, ácido ma- leico, ácido málico, acetato de sódio, carbonato de sódio, di- hidrogenofosfato de sódio, fosfato de sódio, succinato, ácido tartárico, tricina, e tris(hidroximetil)-aminometano, e suas misturas. O tampão pode estar presente individualmente ou no agregado, em uma concen- tração desde cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 50 mg/mL, por exem- plo, desde cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compreendendo cada um destes tampões específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0096] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um conservante. Exemplos não limitadores de con- servantes incluem: cloreto de benzetônio, ácido benzoico, álcool ben- Zílico, bronopol, 4-hidroxibenzoato de butila, clorobutanol, clorocresol, cloro-hexidina, clorfenesina, o-cresol, m-cresol, p-cresol, 4-hidroxiben- zoato de etila, imidureia, 4-hidroxibenzoato de metila, fenol, 2-fenoxie- tanol, 2-feniletanol, 4-hidroxibenzoato de propila, desidroacetato de sódio, tiomerosal, e suas misturas. O conservante pode estar presente individualmente ou no agregado, em uma concentração desde cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 50 mg/mL, por exemplo, desde cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas com- preendendo cada um destes conservantes específicos constituem mo- dalidades alternativas da invenção.

[0097] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um agente isotônico. Exemplos não limitadores da modalidade incluem um sal (tal como cloreto de sódio), um aminoácido (tal como glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, e treonina), um alditol (tal como glicerol, 1,2-propanodiol, propilenoglicol), 1,3-propanodiol, e 1,3-butanodiol), polietilenoglicol (por exemplo, PEG400), e suas misturas. Outro exemplo de um agente isotônico inclui um açúcar. Exemplos não limitadores de açúcares po- dem ser mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanas solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, mal- tose, lactose, sacarose, trealose, dextrana, pululana, dextrina, ciclo- dextrina, alfa e beta-HPCD, amido solúvel, hidroxietilamido, e carboxi- metilcelulose sódica. Outro exemplo de um agente isotônico é um ál- cool de açúcar, em que o termo "álcool de açúcar" é definido como um C(4-8) hidrocarboneto tendo pelo menos um grupo -OH. Exemplos não limitadores de álcoois de açúcares incluem manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. O agente isotônico pode estar pre- sente individualmente ou no agregado, em uma concentração desde cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 50 mg/mL, por exemplo, desde cer- ca de 0,1 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compreendendo cada um destes agente isotônicos específicos consti- tuem modalidades alternativas da invenção.

[0098] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um agente quelante. Exemplos não limitadores de agentes quelantes incluem ácido cítrico, ácido aspártico, sais do ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), e suas misturas. O agente quelan- te pode estar presente individualmente ou no agregado, em uma con- centração desde cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 50 mg/mL, por exemplo, desde cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. Compo- sições farmacêuticas compreendendo cada um destes agente quelan-

tes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0099] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um estabilizador. Exemplos não limitadores de esta- bilizadores incluem um ou mais inibidores da agregação, um ou mais inibidores da oxidação, um ou mais tensoativos, e/ou um ou mais inibi- dores de proteases.

[00100] Em outramodalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um estabilizador, em que o referido estabilizador é carboxi-/hidroxicelulose e seus derivados (tais como HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, 2-metiltioetanol, polietilenoglicol (co- mo PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, sais (como cloreto de sódio), substâncias contendo enxofre tais como monotiogli- cerol), ou ácido tioglicólico. O estabilizador pode estar presente indivi- dualmente ou no agregado, em uma concentração desde cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 50 mg/mL, por exemplo, desde cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compre- endendo cada um destes estabilizadores específicos constituem mo- dalidades alternativas da invenção.

[00101] Em modalidades adicionais da invenção, a composição farmacêutica compreende um ou mais tensoativos, preferencialmente um tensoativo, pelo menos um tensoativo, ou dois tensoativos diferen- tes. O termo "tensoativo" se relaciona com quaisquer moléculas ou íons que são compreendidos por uma parte solúvel em água (hidrofí- lica), e uma parte solúvel em gordura (lipofílica). O tensoativo pode, por exemplo, ser selecionado do grupo consistindo em tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos não iônicos, e/ou ten- soativos zwiteriônicos. O tensoativo pode estar presente individual- mente ou no agregado, em uma concentração desde cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. Composições farmacêuticas compre- endendo cada um destes tensoativos específicos constituem modali-

dades alternativas da invenção.

[00102] Em uma modalidade adicional da invenção, a composição farmacêutica compreende um ou mais inibidores de proteases, tais como, por exemplo, EDTA (ácido etilenodiaminotetra-acético), e/ou cloridrato de benzamidina (HCl). O inibidor de proteases pode estar presente individualmente ou no agregado, em uma concentração des- de cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. Composições farma- cêuticas compreendendo cada um destes inibidores de proteases es- pecíficos constituem modalidades alternativas da invenção.

[00103] A composição farmacêutica da invenção pode compreender uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para decrescer a formação de agregados do polipeptídeo durante o armazenamento da composição. O termo "base de aminoácido" se relaciona com um ou mais aminoácidos (tais como metionina, histidina, imidazol, argini- na, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), ou seus análogos. Qualquer aminoácido pode estar presente na sua forma de base livre ou na sua forma de sal. Qualquer estereoisômero (isto é, L, D, ou uma sua mistura) da base de aminoácido pode estar presente. À base de aminoácido pode estar presente individualmente ou na com- binação com outras bases de aminoácidos, em uma concentração desde cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 50 mg/mL, por exemplo, desde cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 20 mg/mL. Composições far- macêuticas compreendendo cada uma destas bases de aminoácidos específicas constituem modalidades alternativas da invenção.

[00104] Também é claro para o perito na técnica que a dose tera- peuticamente eficaz para partículas adenovirais compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um antígeno M e Env do vírus Zika da presente invenção ou uma sua composição farmacêutica irá variar de acordo com o efeito desejado. Em consequência, dosagens ótimas a serem administradas podem ser prontamente determinadas pelo perito na técnica e irão variar com a partícula adenoviral particular usada, o modo de administração, a potência da preparação, e a pro- gressão do estado de doença (por exemplo, infecção pelo vírus Zika). Adicionalmente, fatores associados ao sujeito particular sendo tratado, incluindo idade, peso, dieta e momento da administração do sujeito, farão com que seja necessário ajustar a dose para um nível terapêuti- co apropriado.

[00105] Os sais farmaceuticamente aceitáveis das partículas ade- novirais da invenção incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário que são formados a partir de ácidos ou ba- ses inorgânicos ou orgânicos. Exemplos de tais sais de adição de áci- dos incluem acetato, adipato, benzoato, benzenossulfonato, citrato, canforato, dodecilsulfato, cloridrato, bromidrato, lactato, maleato, me- tanossulfonato, nitrato, oxalato, pivalato, propionato, succinato, sulfato e tartarato. Sais de bases incluem sais de amônio, sais de metais alca- linos tais como sais de sódio e potássio, sais de metais alcalinoterro- sos tais como sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicas tais como sais diciclo-hexilamino e sais com aminoácidos tais como arginina. Além disso, os grupos contendo nitrogênio básico podem ser quaternizados, por exemplo, com haletos de alquila.

[00106] As composições farmacêuticas da invenção podem ser ad- ministradas por quaisquer meios que alcancem o seu propósito pre- tendido. Como usado aqui, por "administrar" se pretende significar um método de fornecer uma dosagem de uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica (por exemplo, uma vaci- na (por exemplo, uma vacina contra o vírus Zika (ZIKV)))) a um sujeito. As composições utilizadas nos métodos descritos aqui podem ser ad- ministradas, por exemplo, pela via intramuscular, intravenosa, intra- dérmica, percutânea, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intra- craniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, in-

tranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tópica, intratumoral, peri- toneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intraperi- cardial, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inalação, por injeção, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada ba- nhando células-alvo diretamente, por cateter, por lavagem, por gava- gem, em cremes, ou em composições lipídicas. O método de adminis- tração preferencial pode variar dependendo de vários fatores (por exemplo, os componentes da composição sendo administrada e a gra- vidade da afecção sendo tratada). Métodos de Uso

[00107] A presente invenção proporciona métodos para gerar uma resposta imune contra um vírus Zika em um sujeito humano necessi- tado. Os métodos compreendem administrar ao sujeito uma composi- ção farmacêutica compreendendo vetores adenovirais compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um antígeno M e Env do vírus Zika e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os métodos se destinam a prevenir, tratar, retardar o surgimento de, ou melhorar uma infecção pelo vírus Zika ou qualquer um ou mais sintomas da referida infecção pelo vírus Zika, o método compreendendo administrar ao su- jeito necessitado uma quantidade eficaz de uma composição farma- cêutica da invenção.

[00108] De acordo com modalidades particulares, uma quantidade imunogênica ou eficaz ou protetora se relaciona com a quantidade de um imunógeno que é suficiente para alcançar um, dois, três, quatro, ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da in- fecção pelo vírus Zika a ser tratada ou um sintoma a ela associado; (ii) reduzir a duração da infecção pelo vírus Zika a ser tratada, ou um sin- toma a ela associado; (ili) prevenir a progressão da infecção pelo vírus Zika a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (iv) causar regres- são da infecção pelo vírus Zika a ser tratada, ou um sintoma a ela as-

sociado; (v) prevenir o desenvolvimento ou surgimento da infecção pe- lo vírus Zika a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (vi) prevenir a recorrência da infecção pelo vírus Zika a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (vii) reduzir a hospitalização de um sujeito tendo a infecção ou afecção causada pelo vírus Zika a ser tratada, ou um sin- toma a ela associado; (viii) reduzir a duração da hospitalização de um sujeito tendo a infecção pelo vírus Zika a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (ix) aumentar a sobrevivência de um sujeito com a in- fecção pelo vírus Zika a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (xi) inibir ou reduzir a infecção pelo vírus Zika a ser tratada, ou um sin- toma a ela associado em um sujeito; e/ou (xii) intensificar ou melhorar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia; (xiii) pre- venir a transmissão do vírus Zika através das vias sexual e materna para fetal ; (xiv) prevenir e/ou reduzir a gravidade de anormalidades cerebrais fetais associadas ao vírus Zika.

[00109] “Exemplos de sintomas de doenças causadas por uma in- fecção viral, como ZIKV, que podem ser prevenidos usando as com- posições da invenção incluem, por exemplo, febre, dor nas articula- ções, erupção cutânea, conjuntivite, dor muscular, dor de cabeça, dor retro-orbital, edema, linfadenopatia, mal-estar, astenia, garganta dori- da, tosse, náusea, vômitos, diarreia, e hematospermia. Estes sinto- mas, e a sua resolução durante o tratamento, podem ser medidos, por exemplo, por um médico durante um exame físico ou por outros testes e métodos conhecidos na técnica.

[00110] A quantidade ou dosagem imunogênica ou eficaz pode va- riar de acordo com vários fatores, tais como a infecção pelo vírus Zika a ser tratada, o meio de administração, o sítio-alvo, o estado fisiológico do sujeito (incluindo, por exemplo, idade, peso do corpo, estado de saúde), se o sujeito é um humano ou um animal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosa-

gens de tratamento são otimamente tituladas para otimizar a seguran- ça e eficácia.

[00111] Como usados aqui, é pretendido que todos os termos "tra- tar", "tratando", e "tratamento" se relacionem com uma melhoria ou reversão de pelo menos um parâmetro físico mensurável relacionado com a infecção pelo vírus Zika, que não é necessariamente discernível no sujeito, mas que pode ser discernível no sujeito. Os termos "tratar", "tratando", e "tratamento", também podem se relacionar com causar regressão, prevenir a progressão, ou pelo menos abrandar a progres- são da infecção pelo vírus Zika. Em uma modalidade particular, "tra- tar", "tratando", e "tratamento" se relacionam com um alívio, prevenção do desenvolvimento ou surgimento, ou redução da duração de um ou mais sintomas associados à infecção pelo vírus Zika. Em uma modali- dade particular, "tratar", "tratando", e "tratamento" se relacionam com prevenção da recorrência da infecção pelo vírus Zika. Em uma modali- dade particular, "tratar", "tratando", e "tratamento" se relacionam com um aumento da sobrevivência de um sujeito tendo a infecção pelo ví- rus Zika. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando", e "trata- mento" se relacionam com eliminação da infecção pelo vírus Zika no sujeito.

[00112] Em certas modalidades, a administração de uma quantida- de imunogênica ou eficaz de uma composição farmacêutica da inven- ção reduz as cargas virais no soro de ZIKV determinadas de um sujei- to tendo uma infecção por ZIKV em pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais em comparação com cargas virais determinadas do sujeito antes da administração de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. Em alguns casos, a administração de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção reduz as cargas virais no soro para um nível indetectável em comparação com cargas virais determinadas do sujeito antes da administração de uma quantidade eficaz de uma composição da in- venção. Em alguns casos, a administração de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção origina uma carga viral no soro redu- zida e/ou indetectável que pode ser mantida durante pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dias; 1, 2, 3, 4, semanas; 1, 2, 3,4, 5,6,7,8,9, 10, 11, ou 12 meses; ou 1 ano ou mais.

[00113] Adicionalmente, administrações únicas ou múltiplas das composições da presente invenção podem ser dadas (pré- ou pós- exposição e/ou pré- ou pós-diagnóstico) a um sujeito (por exemplo, uma administração ou administração duas ou mais vezes). Por exem- plo, sujeitos que são particularmente suscetíveis, por exemplo, a infec- ção viral (por exemplo, uma infecção por ZIKV) podem requerer múlti- plas administrações das composições da presente invenção para es- tabelecer e/ou manter proteção contra o vírus. Níveis de imunidade induzida proporcionados pelas composições farmacêuticas descritas aqui podem ser monitorados, por exemplo, medindo quantidades de anticorpos secretores neutralizadores e no soro. As dosagens podem então ser ajustadas ou repetidas consoante o necessário para desen- cadear o nível desejado de resposta imune. Por exemplo, a resposta imune desencadeada por uma única administração (primário) de uma composição da invenção pode não ser suficientemente potente e/ou persistente para conferir proteção eficaz. Em conformidade, em algu- mas modalidades, administração repetida (reforço), de modo que é estabelecido um regime primário reforço, pode intensificar significati- vamente respostas humorais e celulares ao antígeno da composição.

[00114] Alternativamente, a eficácia do tratamento pode ser deter- minada monitorando o nível do produto de gene antigênico ou terapêu- tico, ou seu fragmento, expresso em um sujeito (por exemplo, um hu- mano) após a administração das composições farmacêuticas da in- venção. Por exemplo, o sangue ou linfa de um sujeito pode ser testado quanto ao produto de gene antigênico ou terapêutico, ou seu fragmen- to, usando, por exemplo, ensaios padrão conhecidos na técnica.

[00115] Em alguns casos, a eficácia do tratamento pode ser deter- minada monitorando uma alteração da carga viral no soro de uma amostra do sujeito obtida antes e após a administração de uma quan- tidade eficaz de uma composição farmacêutica da invenção. Uma re- dução da carga viral no soro de pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais em comparação com a carga viral determinada do sujeito antes da administração de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção pode indicar que o sujeito está recebendo benefícios do tratamento. Se uma carga viral não decrescer em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, ou mais após administração de uma composição da invenção, a dosagem da com- posição a ser administrada pode ser aumentada. Por exemplo, por aumento do número de partículas virais (VP) de uma vacina à base de vetor de adenovírus.

[00116] A imunogenicidade das composições farmacêuticas da in- venção pode ser melhorada se forem coadministradas com um agente imunoestimulador e/ou adjuvante. Adjuvantes adequados bem conhe- cidos dos peritos na técnica incluem, por exemplo, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, QS21, Quil A (e seus derivados e componen- tes), fosfato de cálcio, hidróxido de cálcio, hidróxido de zinco, análogos glicolipídicos, ésteres de octodecila de um aminoácido, dipeptídeos muramila, polifosfazeno, lipoproteínas, matriz ISCOM, DC-Col, DDA, citocinas, e outros adjuvantes e seus derivados.

[00117] O termo "agente imunoestimulador" se relaciona com subs- tâncias (por exemplo, fármacos e nutrientes) que estimulam o sistema imune induzindo ativação ou aumentando a atividade de quaisquer dos seus componentes. Um agente imunoestimulador inclui uma citocina (por exemplo, o fator estimulador de colônias de granulócitos-

macrófagos) e interferon (por exemplo, IFN-a e/ou IFN-y).

[00118] O termo "adjuvante" é definido como um agente farmacoló- gico ou imunológico que modifica o efeito de outros agentes (por exemplo, um antígeno de ZIKV) ao mesmo tempo tendo poucos, se quaisquer, efeitos diretos quando administrado isoladamente. Um "ad- juvante" pode consistir em uma ou mais substâncias que causam es- timulação do sistema imune. Neste contexto, um adjuvante é usado para intensificar uma resposta imune às partículas adenovirais da in- venção. Kits

[00119] Também são proporcionados aqui kits compreendendo (a) um vetor adenoviral da invenção e (b) uma célula hospedeira da in- venção. Em certas modalidades, o vetor adenoviral compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno M e Env do vírus Zika é operavelmente ligada a um promotor do citomega- lovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO). O vetor adenoviral pode compreender uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:9-11 e SEQ ID NO:15.

[00120] Em certas modalidades, a célula hospedeira compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína repressora da tetraciclina (TetR). A sequência de nucleotídeos codificando a pro- teína TetR pode, por exemplo, ser integrada no genoma da célula hospedeira. A sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR pode ser integrada no cromossomo 1. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira PER.C60.

MODALIDADES

[00121] A invenção também proporciona as seguintes modalidades não limitadoras.

[00122] A Modalidade 1 é um vetor adenoviral compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno M e Env do vírus Zika é operavelmente ligada a um promotor do citomega- lovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO).

[00123] A Modalidade 2 é o vetor adenoviral da modalidade 1, em que o antígeno M e Env do vírus Zika compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

[00124] A Modalidade 3 é o vetor adenoviral da modalidade 1 ou 2, em que o promotor do CMV compreendendo pelo menos um motivo TetO compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:3-5.

[00125] A Modalidade 4 é o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1 até 3, em que o vetor adenoviral é selecionado do gru- po consistindo em ChAd3, SAdV, rhAd51, rhAd52, rhAd53, hAda4, hAd5, hAd26, e hAd35.

[00126] A Modalidade 5 é o vetor adenoviral da modalidade 4, em que o vetor adenoviral é Ad26.

[00127] A Modalidade 6 é o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1 até 5, em que o vetor adenoviral compreende uma se- quência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:9-11 e SEQ ID NO:15.

[00128] A Modalidade 7 é uma célula hospedeira compreendendo o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1 até 6.

[00129] A Modalidade 38 é a célula hospedeira da modalidade 7, em que a célula hospedeira compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína repressora da tetraciclina (TetR).

[00130] A Modalidade 9 é a célula hospedeira da modalidade 8, em que a sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR é inte- grada no genoma da célula hospedeira.

[00131] A Modalidade 10 é a célula hospedeira da modalidade 9, em que a sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR é integrada no cromossomo 1.

[00132] A Modalidade 11 é a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades 7 até 10, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira PER.C60.

[00133] A Modalidade 12 é uma composição farmacêutica compre- endendo o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1 até 6 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00134] A Modalidade 13 é um método para produzir uma partícula adenoviral compreendendo um antígeno M e Env do vírus Zika, em que o método compreende: a. contatar uma célula hospedeira com um vetor adenovi- ral compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno M e Env do vírus Zika é operavelmente ligada a um promotor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO); e b. cultivar a célula hospedeira sob condições em que a partícula adenoviral compreendendo o antígeno M e Env de Zika é produzida.

[00135] A Modalidade 14 é o método da modalidade 13, em que o antígeno M e Env do vírus Zika compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:1.

[00136] A Modalidade 15 é o método da modalidade 13 ou 14, em que o promotor do CMV compreendendo pelo menos um motivo TetO compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:3-5.

[00137] A Modalidade 16 é o método de qualquer uma das modali- dades 13 até 15, em que o vetor adenoviral é selecionado do grupo consistindo em ChAd3, SAdV, rhAd51, rhAd52, rhAd53, hAd4, hAd5, hAd26, e hAd35.

[00138] A Modalidade 17 é o método da modalidade 16, em que o vetor adenoviral é hAd26.

[00139] A Modalidade 18 é o método de qualquer uma das modali- dades 13 até 17, em que o vetor adenoviral compreende uma sequên- cia de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:9-11 e SEQ ID NO:15.

[00140] A Modalidade 19 é o método da modalidade 13, em que a célula hospedeira compreende adicionalmente uma sequência de nu- cleotídeos codificando uma proteína repressora da tetraciclina (TetR).

[00141] A Modalidade 20 é o método da modalidade 19, em que a sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR é integrada no genoma da célula hospedeira.

[00142] A Modalidade 21 é o método da modalidade 20, em que a sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR é integrada no cromossomo 1.

[00143] A Modalidade 22 é o método de qualquer uma das modali- dades 19 até 21, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira PER.C60.

[00144] A Modalidade 23 é uma composição farmacêutica compre- endendo uma partícula adenoviral produzida pelo método de qualquer uma das modalidades 13 até 22 e um veículo farmaceuticamente acei- tável.

[00145] A Modalidade 24 é um método para prevenir uma infecção pelo vírus Zika ou a progressão de uma infecção pelo vírus Zika em um sujeito humano necessitado, o método compreendendo administrar ao sujeito necessitado a composição farmacêutica da modalidade 23.

[00146] A Modalidade 25 é o método da modalidade 24, em que a composição farmacêutica é administrada pela via intramuscular, intra- venosa, intradérmica, percutânea, intra-arterial, intraperitoneal, intrale- sional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intra- traqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tópica, intratu- moral, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inala- ção, por injeção, por infusão, por infusão contínua, por perfusão locali- zada, por cateter, por lavagem, ou por gavagem.

[00147] A Modalidade 26 é um kit compreendendo: a. um vetor adenoviral compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno M e Env do vírus Zika é operavelmente ligada a um promotor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO); e b. uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína repressora da tetraciclina (TetR).

[00148] A Modalidade 27 é o Kit da modalidade 26, em que o antí- geno M e Env do vírus Zika compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

[00149] A Modalidade 28 é o kit da modalidade 26 ou 27, em que o promotor do CMV compreendendo pelo menos um motivo TetO com- preende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consis- tindo nas SEQ ID NOs:3-5.

[00150] A Modalidade 29 é o kit de qualquer uma das modalidades 26 até 28, em que o vetor adenoviral é selecionado do grupo consis- tindo em ChAd3, SAdV, rhAd51, rhAd52, rhAd53, hAd4, hAd5, hAd26, e hAd35.

[00151] A Modalidade 30 é o kit da modalidade 29, em que o vetor adenoviral é hAd26.

[00152] A Modalidade 31 é o kit de qualquer uma das modalidades 26 até 30, em que o vetor adenoviral compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:9-11 e SEQ ID NO:15.

[00153] A Modalidade 32 é o kit de qualquer uma das modalidades 26 até 31, em que a sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR é integrada no genoma da célula hospedeira.

[00154] A Modalidade 33 é o kit da modalidade 32, em que a se- quência de nucleotídeos codificando a proteína TetR é integrada no cromossomo 1.

[00155] A Modalidade 34 é o kit de qualquer uma das modalidades 26 até 33, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira PER.C60.

EXEMPLOS Exemplo 1: Variantes novas e potentes do promotor do CMV con- tendo um único motivo TetO que são fortemente repressíveis por TetR

[00156] Um vetor adenoviral à base de Ad26 com E1 e E3 deleta- dos compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, foi gerado de acordo com métodos previamente descritos por Abbink et al. (J Virol. maio de 2007;81(9): 4654-63). Neste vetor, designado aqui Ad26.ZIKV.001, a expressão do antígeno do vírus Zika é conduzida pelo promotor do citomegalovírus (CMV) forte e constitutivamente ativo que foi usado previamente para conduzir a expressão de antígenos codificados por outros vetores de adenovírus de vacina (Abbink et al. J Virol. maio de 2007;81(9):4654- 63). Infelizmente, não obstante ter sido possível gerar Ad26.ZIKV.001 e produzir lotes para testes pré-clínicos de imunogenicidade, se verifi-

cou que este vetor exibiu crescimento comprometido em células pro- dutoras de complementação de E1 tais como PER.C66 em compara- ção com outros vetores de adenovírus de vacina, originando, por exemplo, títulos de produção de partículas virais que foram cerca de vezes menores do que os de um vetor à base de Ad26 de referên- cia comparativa com boa produção.

[00157] Para abordar a questão de produtividade observada para Ad26.ZIKV.001, uma nova versão deste vetor foi gerada na qual a ex- pressão do antígeno do vírus Zika é controlada por um promotor do CMV que é repressível por TetR. Em células produtoras expressando TetR, tal vetor irá expressar níveis mais baixos do antígeno do vírus Zika e pode, consequentemente, exibir produtividade melhorada pelo fato de evitar qualquer efeito inibidor que a expressão em nível eleva- do do antígeno do vírus Zika possa ter na produção do vetor. Prefe- rencialmente, um promotor do CMV repressível por TetR a ser usado no novo vetor codificando o antígeno do vírus Zika conterá apenas uma modificação mínima em comparação com o promotor do CMV usado em Ad26.ZIKV.001 de modo que as propriedades globais e po- tência do vetor final permanecerão iguais às do Ad26.ZIKV.001. Em consequência, para alcançá-lo, um painel de novos promotores foi planejado e construído de modo a serem repressíveis por TetR devido à introdução de uma única sequência tetO próxima do sítio de início da transcrição do promotor do CMV. Estes promotores foram subsequen- temente testados quanto à repressibilidade por TetR e potência do promotor, comparando-os com o promotor repressível por TetR co- nhecido "CMVtetO" (SEQ ID NO:8), que também é referido aqui como CMVtetO versão 1 (CMVtetO v1). Este promotor é derivado do promo- tor do CMV humano mas é modificado para conter, imediatamente a jusante da sua caixa TATA, uma inserção de sequência de 54 pb compreendendo duas cópias do motivo TetO de 19 pb (TCCCTATCA-

GTGATAGAGA) (SEQ ID NO:20).

[00158] Um painel de variantes do promotor do CMV que foram planejadas para serem repressíveis por TetR por modificações na re- gião do núcleo do promotor do CMV foi testado e se verificou que vá- rias destas eram repressíveis por TetR. A FIG. 1 mostra o planejamen- to da região do núcleo do promotor das variantes do promotor do CMV repressível por TetR 2A1, 2A2, 2B1, 3A, e 3B. Estas variantes diferem do promotor do CMV paterno pelas substituições mostradas na FIG. 1. Cada uma destas variantes contém uma única sequência TetO que foi introduzida por um conjunto de substituições que retiveram o posicio- namento relativo nativo entre elementos conservados do promotor do CMV tais como, por exemplo, a caixa TATA e o elemento iniciador (Inr). Nas variantes 2A1, 2A2, e 2B1, esta sequência TetO única foi introduzida por substituição de resíduos de nucleotídeos rodeando o sítio de início da transcrição (TSS) nativo, ao passo que nas variantes 3A e 3B, tal foi efetuado por substituição de resíduos a jusante do refe- rido TSS. O motivo /nr, com a sequência de consenso YYANWYY, foi deixado parcialmente (2A1, 2A2, 2B1) ou totalmente (3A, 3B) intato. O comprimento destes promotores do CMV contendo TetO único perma- neceu igual ao do promotor do CMV não contendo TetO paterno pre- sente em Ad26.ZIK.001. As sequências completas das variantes do promotor do CMV contendo TetO 2A1, 2A2, 2B1, 3A, e 3B são apre- sentadas, respectivamente, nas SEQ ID NOs:3-7.

[00159] A ser usado para conduzir a expressão de transgenes (TG) em um vetor Ad de vacina, então é considerado vantajoso que os ní- veis de expressão de TG (potência) alcançados não sejam comprometi- dos em comparação com o promotor do CMV não contendo tetO padrão que previamente foi extensamente usado e testado no contexto de veto- res Adenovirais para conduzir a expressão de antígenos, e que está pre- sente em Ad26.ZIK.001. Além disso, é importante que a repressibilidade por TetR dos novos promotores do CMV contendo TetO seja suficien- temente alta para evitar quaisquer efeitos inibidores do antígeno na produção do vetor em células produtoras expressando TetR.

[00160] Em consequência, para pesquisar se os novos promotores com TetO poderão ter utilidade como promotores condutores da ex- pressão de antígenos em vetores Ad de vacina, foram sujeitos a testes quanto à potência do promotor e repressibilidade por TetR usando um ensaio repórter dual baseado em transfecção transiente. Em resumo, as sequências do promotor foram sintetizadas (pela GeneArt) e intro- duzidas, por técnicas moleculares padrão, em pDualLuc, previamente descrito em PCT/EP2018/053201, para conduzir a expressão de lucife- rase de Gaussia (GL). A seguir ao cassete de Luciferase de Gaussia, este plasmídeo contém um cassete de expressão de Luciferase do pi- rilampo vermelha (RFL) a ser usado para a normalização do sinal de Luciferase de Gaussia. Para testar os novos promotores, células PER.C60 e a linha de células expressando TetR PER.C6-hCMV.TetR (descrita previamente em PCT/EP2018/053201) foram transfectadas com os novos construtos repórter ou com construtos de controle nos quais GL é controlada por CMV ou CMVtetO v1. As atividades de GLuc e Luciferase do pirilampo vermelha (RFL) foram subsequentemente de- terminadas como previamente descrito em PCT/EP2018/053201. Para cada uma das variantes do promotor testadas, a FIG. 2 mostra o nível de expressão de GLuc (normalizada por RFL) obtido relativamente ao obtido por CMV, em ambas as células PER.C60 e PER.C68-hCMV.TetR. Os dados mostram que, em PER.C60, os cinco promotores contendo tetO único exibiram níveis de expressão próximos dos do CMV padrão, com os promotores 2A1, 2B1, e 3A originando os valores mais elevados. Estas três variantes exibiram níveis de expressão ligeiramente mais elevados do que os do promotor CMVtetO original (CMVtetO v1), que exibiu consistentemente níveis de expressão ligeiramente menores do que os do CMV (na FIG. 2 e dados não mostrados). Nas células ex- pressando TetR, os níveis de expressão obtidos pelos cinco novos promotores contendo TetO são reduzidos, com o nível de redução ob- servado para 2A1, 2A2, e 2B1 sendo próximo do que é observado pa- ra o promotor contendo 2x TetO CMVtetO versão 1, indicando repres- sibilidade potente por TetR. Em contraste, as variantes 3A e 3B exibi- ram um nível acentuadamente menor de repressibilidade por TetR do que estes três promotores (FIG. 2).

[00161] Em conclusão, os promotores contendo o motivo TetO úni- co 2A1, 2A2, e 2B1 foram identificados como promotores potentes exi- bindo níveis elevados de repressibilidade por TetR. O conjunto limitado de substituições de resíduos de nucleotídeos introduzidas no promotor do CMV para gerar estes promotores aparenta não ter afetado a po- tência dos promotores, e ainda assim foram bem-sucedidas em tornar o promotor do CMV fortemente repressível por TetR. Por estes moti- vos, é considerado que 2A1, 2A2, e 2B1 representam promotores re- pressíveis por TetR úteis, potentes e alternativos que podem ser usa- dos para a condução de transgenes em vetores adenovirais. Em com- binação com células produtoras expressando TetR, como PER.C6- TetR, estes novos promotores devem permitir a produção eficiente de vetores adenovirais codificando transgenes inibidores. Em particular, estes promotores podem ser usados para resolver a questão de produ- tividade observada para Ad26.ZIKV.001 substituindo o promotor do CMV neste vetor por um destes e produzindo o vetor resultante em uma linha de células expressando TetR. Exemplo 2: Geração de vetores adenovirais Produção do vetor pAdApt26.CMVTO2A1.prM-Env

[00162] Para gerar o plasmídeo adaptador pAdApt26.CMVTO?2A1. prM-Env (SEQ ID NO:16) codificando as proteínas M e Env sob o contro- le de um promotor do CMV contendo TetO, o promotor do CMV de pA-

dApt26.ZIK.001 (SEQ ID NO:17) foi substituído pelo promotor do CMV contendo TetO (SEQ ID NO:3) do plasmídeo pMK-RQ.CMVTO2A1- GL Ao RFL (SEQ ID NO:18). Para tal propósito, o fragmento CMVTO 2A1 relevante de pMK-RQ.CMVTO2A1 GL Ao RFL foi amplificado por PCR e o fragmento de DNA resultante e pAdApt26.ZIK.001 foram digeridos usando as enzimas de restrição Hindll|l-HF e Avrll. Um passo de ligação subsequente resultou na geração de pAdApt26.CMVTO2 A1.prM-Env (SEQ ID NO:16). Produção do vetor Ad26.ZIKV.002, que compreende o cassete de ex- pressão de transgenes ME de Zika com o promotor do CMV contendo TetO 2A1 (SEQ ID NO:9)

[00163] O DNA do plasmídeo pAdapt26.CMVTO2A1.prM-Env, onde o gene E1 do adenovírus foi substituído pelo cassete de expressão de M e Env de ZIKV, foi sujeito a limpeza de DNA e análise da sequência de DNA antes da geração do vetor Ad26 em PER.C68-TetR (descritas previamente em PCT/EP2018/053201 como PER.C6-hCMV.TetR ).

[00164] Para gerar o vetor Ad26.ZIKV.002 (SEQ ID NO:15), o plas- mídeo adaptador foi cotransfectado em conjunto com um cosmídeo contendo as seções remanescentes do genoma de Ad26 nas quais o gene E3 de Ad26 foi parcialmente deletado (pWe.Ad26.dE3.50rf6.cos- mídeo (SEQ ID NO:19)). No mesmo cosmídeo, a fase de leitura aberta de E4 de Ad26 6 (E4orf6) e parte de E4orf6/7 foram trocadas pelas do serótipo de adenovírus 5 (Ad5) para permitir a produção de vetores Ad26 incompetentes para replicação em linhas de células de comple- mentação de E1 de Ad5 tais como células HEK293, PER.C60, PER.C68-TetR ou HER96. Recombinação homóloga entre os 2 veto- res de DNA, pAdapt26 e cosmídeo, levou à formação de um genoma de adenovírus contendo todos os genes de vírus requeridos para a formação de partículas virais intatas.

[00165] Placas únicas foram isoladas por purificação de placas em monocamadas de células PER.C60-TetR cobertas com agarose. As placas foram amplificadas em células PER.C68-TetR e testadas quan- to à integridade e identidade do genoma do adenovírus e expressão correta do transgene. Adenovírus da placa f1 foram adicionalmente expandidos em células PER.C60-TetR e subsequentemente purifica- dos por CsCI. Exemplo 3: Avaliação da capacidade de fabricação do vetor Ad26.ZIKV.002

[00166] A produtividade, definida por títulos de partículas de vírus por mL (vp/mL), é crítica para o escalamento positivo da produção do vetor em biorreatores para proporcionar material suficiente para os di- ferentes passos do processo a jusante. Em consequência, a produtivi- dade em células PER.C68 em suspensão (sPER.C60) e células PER.C68-TetR em suspensão (sSPER.C680-TetR) foi avaliada em ex- periências de pequena escala comparando o vetor Ad26.ZIKV.002 (SEQ ID NO:15) com vários vetores Ad26 de referência comparativa internos codificando diferentes transgenes. sSPER.C68-TetR foi previ- amente descrito em PCT/EP2018/053201 como PER.C6-AoHV.TetR.

[00167] Ad26.ZIKV.002 foi gerado e testado quanto à produtividade relativa no modelo de pequena escala de células sPER.C60 e sPER. C68-TetR (FIG. 3). Células SsPER.C68 e culturas de células sPER. C6E-TeiR, semeadas em balões agitados a uma densidade de 1x10º células/mL em um volume total de 10 mL de meio PERMEXCISO (Lonza; Basileia, Suíça) suplementado com L-Glutamina (Lonza) 4 mM, foram infectadas com os diferentes vetores a diferentes razões partícula de vírus (VP)-célula e então incubadas durante 4 dias. Em resumo, célu- las SsPER.C60€ ou células sPER.C68-TetR foram transduzidas com 70, 300 e 900 vp/célula de partículas adenovirais Ad26.ZIKV.002 purifica- das ou um de três controles de Ad26 internos (referências comparati- vas), dos quais é conhecido, de estudos prévios, serem produtores bons, intermédios ou baixos. Amostras foram recolhidas no dia 0, 1,2,3 e 4 após a infecção e títulos de vetores adenovirais foram determinados por VP-gPCR. Como mostrado na FIG. 3, Ad26. ZIKV.002 mostra produ- tividade comparável à do controle de baixa produção a 70, 300 e 900 vp/célula quando produzido em células sSPER.C66. Quando produzido em células sPER.C60-TetR, Ad26.ZIKV.002 mostra produtividade comparável à do controle com boa produção a 70, 300 e 900 vp/célula. Enquanto o vetor Ad26.ZIKV.002 contendo TetO é comparável a um baixo produtor quando fabricado em células sSPER.C60, o rendimento é aumentado de modo que o vetor Ad26.ZIKV.002 é comparável a um bom produtor quando fabricado em sPER.C60-TetR no modelo de ba- lões agitados em pequena escala.

[00168] Ad26.ZIKV.002 também foi testado quanto à produtividade em células sPER.C660 e sPER.C680-TetR usando um modelo de pe- quena escala, que prevê a produção de vírus em larga escala (FIG. 4). Em resumo, células sSPER.C66 ou células sPER.C60-TetR foram transduzidas com 300 vp/célula de material de lote de pesquisa purifi- cado de Ad26.ZIKV.002 ou Ad26 contendo um transgene de Lucifera- se (não inibidor) sob o controle de um promotor do CMV contendo Te- tO. Os títulos do vírus foram medidos no dia 3 pós-infecção por vp- qPCR (héxon). A produtividade de Ad26.ZIKV.002 em sPER.C68-TetR foi = 1Logio maior do que em células PER.C60. Produtividade de Ad26.ZIKV.002 em sPER.C6-TetR à escala de 10/50 litros

[00169] A produtividade de Ad26.ZIKV.002 em sPER.C608-TetR foi avaliada a uma densidade elevada de células à escala de 10L e 50 L, usando 70 vp/célula e 300 vp/célula em biorreatores de 10 L e usando 300 vp/célula em biorreatores de 50 L (FIG. 5). A recolha foi efetuada no dia 3 pós-infecção e os títulos de partículas virais (vp) foram medi- dos por Eletroforese Capilar. Os títulos de partículas virais alcançados no dia 3 em sSPER.C68-TetR se situaram entre 1,5-2L0g1o mais eleva- dos do que para Ad26.ZIKV.001 em sPER.C60. Exemplo 4: Ad26.ZIKV.002 é imunogênico em primatas não hu- manos e confere proteção contra provocação por ZIKV

[00170] Primatas não humanos (NHPs, espécie macacos rhesus) foram imunizados uma vez intramuscularmente com 10** vp de Ad26. ZIKV.002, ou imunizados com tampão de formulação (Pseudo). Quatro semanas após a imunização, os animais foram sangrados, e provoca- dos subcutaneamente com 10º pfu de ZIKV-BR.

[00171] Ad26.ZIKV.002 induziu respostas imunes humorais em NHPs, mostrado pela indução de títulos de anticorpos de ligação a Env (FIG. 6, painel da esquerda), e títulos de anticorpos neutralizadores de ZIKV-PR (FIG. 6, painel da direita).

[00172] Todos os NHPs Pseudo-injetados exibiram cargas virais no plasma após a provocação. Em contraste, todos os NHPs imunizados com Ad26.ZIKV.002, foram protegidos contra provocação com ZIKV- BR, evidenciado pelas cargas indetectáveis de RNA viral em amostras do plasma destes animais (FIG. 7, painéis de cima).

[00173] Adicionalmente, cargas virais em fluido cerebroespinhal (CSF) foram medidas nos dias 3 e 7 após provocação com ZIKV-BR. Enquanto RNA de ZIKV foi indetectável em amostras de CSF de todos os animais pseudo-imunizados, nenhum vírus foi detectável em amos- tras de CSF de animais imunizados com Ad26.ZIKV.002 (FIG. 7, pai- néis de baixo).

[00174] Será apreciado pelos peritos na técnica que podem ser fei- tas alterações nas modalidades acima descritas sem se afastar do seu amplo conceito inventivo. Em consequência, é entendido que essa in- venção não está limitada às modalidades particulares descritas, sendo pretendido que abranja modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção conforme definidos pela presente descrição.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor adenoviral compreendendo uma sequência de nu- cleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codificando o antí- geno M e Env do vírus Zika é operavelmente ligada a um promotor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO).

2. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o antígeno M e Env do vírus Zika compreen- de a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

3. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o promotor do CMV compreendendo pelo menos um motivo TetO compreende uma sequência de nucleotí- deos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:3-5.

4, Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral é selecionado do grupo consistindo em ChAd3, SAdV, rhAd51, rhAd52, rhAd53, hAd4, hAd5, hAd26 e hAd35.

5. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 4, carac- terizado pelo fato de que o vetor adenoviral é hAd26.

6. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:9-11 e SEQ ID NO:15.

7. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor adenoviral, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6.

8. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 7, ca- racterizada pelo fato de que a célula hospedeira compreende ainda uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína repressora da tetraciclina (TetR).

9. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, ca- racterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codificando a proteína TetR é integrada no genoma da célula hospedeira.

10. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a célula hospedei- ra é uma célula hospedeira PER.C60.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor adenoviral, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

12. Método para produzir uma partícula adenoviral compre- endendo um antígeno M e Env do vírus Zika, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a. contatar uma célula hospedeira com um vetor adenovi- ral compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno M e Env do vírus Zika é operavelmente ligada a um promotor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO); e b. cultivar a célula hospedeira sob condições em que a partícula adenoviral compreendendo o antígeno M e Env de Zika é produzida.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que o antígeno M e Env do vírus Zika compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, carac- terizado pelo fato de que o promotor do CMV compreendendo pelo menos um motivo TetO compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:3-5.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral é sele- cionado do grupo consistindo em ChAd3, SAdV, rhAd51, rhAd52, rhAd53, hAd4, hAd5, hAd26 e hAd35.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o vetor adenoviral é hAd26.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral com- preende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consis- tindo nas SEQ ID NOs:9-11 e SEQ ID NO:15.

18. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira compreende ainda uma se- quência de nucleotídeos codificando uma proteína repressora da tetra- ciclina (TetR).

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codificando a proteí- na TetR é integrada no genoma da célula hospedeira.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 17 a 19, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira PER.C60.

21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma partícula adenoviral produzida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 20, e um veí- culo farmaceuticamente aceitável.

22. Método para prevenir uma infecção pelo vírus Zika ou a progressão de uma infecção pelo vírus Zika em um sujeito humano necessitado do mesmo, caracterizado pelo fato de que o método com- preende administrar ao sujeito a composição farmacêutica, como defi- nida na reivindicação 21.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada pela via intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutânea, intra-arterial, in- traperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarre- tal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intra- vesicular, mucosal, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, oral, tó- pica, local, por inalação, por injeção, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada, por cateter, por lavagem ou por gavagem.

24. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um vetor adenoviral compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um antígeno M e Env do vírus Zika, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno M e Env do vírus Zika é operavelmente ligada a um promotor do citomegalovírus (CMV) compreendendo pelo menos um motivo de operador de tetraciclina (TetO); e b. uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína repressora da tetraciclina (TetR).

25. Kit, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pe- lo fato de que o antígeno M e Env do vírus Zika compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.

26. Kit, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracteri- zado pelo fato de que o promotor do CMV compreendendo pelo menos um motivo TetO compreende uma sequência de nucleotídeos selecio- nada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:3-5.

27. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral é selecionado do grupo consistindo em ChAd3, SAdV, rhAd51, rhAd52, rhAd53, hAd4, hAd5, hAd26 e hAd35.

28. Kit, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe- lo fato de que o vetor adenoviral é hAd26.

29. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:9-11 e SEQ ID NO:15.

30. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codi- ficando a proteína TetR é integrada no genoma da célula hospedeira.

31. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira PER.C60.