KR20190110108A - 이종 유전자의 발현을 위한 강력한 짧은 프로모터 - Google Patents

이종 유전자의 발현을 위한 강력한 짧은 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 바이러스, 및 세포주와 함께 사용하기 위한 AoHV-1 프로모터를 제공한다. 또한 본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 바이러스, 및 세포주의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

Description

이종 유전자의 발현을 위한 강력한 짧은 프로모터
본 발명은 이종 유전자 발현과 관련된 생물학적 연구 분야, 의학 분야, 및 기타 응용 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 단독으로, 또는 일반적으로 사용되는 프로모터, 예컨대 hCMV 프로모터와 조합되어 사용될 수 있는, 플라스미드, 바이러스 벡터 및 세포주의 발현 카세트에서의 이종 유전자의 발현을 위한 강력한 짧은 프로모터에 관한 것이다.
재조합 발현 벡터는, 예를 들어 유전자 요법 및 백신 접종을 위한 바이러스 벡터로서, 그리고 바이러스 벡터 생성용 세포주를 생성하기 위한, 생물학적 연구를 위한 포유류 유전자 발현 시스템을 비롯한 이종 단백질의 발현을 위한 다양한 분자 생물학 응용에 널리 사용된다. 유전자 요법 및 백신 접종 응용에 있어서, 바이러스 벡터를 포함하는 벡터가 세포 내로 도입될 관심의 대상이 되는 유전자(들)를 위한 캐리어로 사용된다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 원하는 항원을 코딩하는 유전자 또는 이의 일부를 발현시켜 면역 반응을 야기하는 데 사용될 수 있다.
발현 벡터의 일부인 시스-작용 요소는 플라스미드 및 바이러스 벡터의 성공적인 적용에 큰 영향을 줄 수 있다. 프로모터는 발현 벡터의 발현 카세트 내에 위치하고 전체 발현 강도를 좌우하는 주요 시스-작용 요소이다. 프로모터는 전사를 개시하며, 따라서 관심의 대상이 되는 클로닝된 유전자의 발현을 위한 중요한 제어점이다. 발현 벡터에 일반적으로 사용되는 프로모터 서열은 바이러스로부터 또는 진핵 유전자 조절 서열로부터 유래된다.
발현 벡터 및 바이러스 벡터에서 일반적으로 사용되는 인핸서 및 프로모터 서열 중 일부로는 예를 들어 hCMV, CAG, SV40, mCMV, EF-1α 및 hPGK 프로모터가 있다. hCMV 프로모터는, 그의 큰 능력 및 대략 0.8 kB의 중간 크기로 인하여, 이러한 프로모터 중 가장 일반적으로 사용되는 것 중 하나이다. hPGK 프로모터는 작은 크기(대략 0.4 kB)를 특징으로 하지만, hCMV 프로모터보다는 덜 강력하다. 반면에, 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서 요소, 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 억셉터(acceptor)로 이루어진 CAG 프로모터는 hCMV 프로모터에 비견되는 매우 강력한 유전자 발현을 유도할 수 있지만, CAG 프로모터의 큰 크기는 공간 제약이 중요한 관심사일 수 있는 바이러스 벡터에서, 예를 들어 아데노바이러스 벡터(AdV), 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV) 또는 렌티바이러스 벡터(LV)에서 CAG 프로모터가 덜 적합하게 만든다.
특정한 경우에, 적어도 2가지의 항원을 하나의 벡터로부터 발현시키는 것이 바람직하다. 2가지의 상이한 유전자를 발현하기 위하여 2개의 발현 카세트가 벡터 내에 위치하는 상황에서, 일반적으로 발현 카세트, 그리고 구체적으로 프로모터 서열에 있어서의 크기 제약이 특히 중요하다. 크기 제약에 더하여, 2개의 발현 카세트를 하나의 벡터 내에 위치시킬 때 동일하거나 심지어 매우 유사한 프로모터 서열들을 사용하는 것은 생성 중에 벡터의 유전자 불안정성을 초래할 수 있기 때문에 불리한 점이다. 따라서, 2가지의 상이한 유전자를 발현시키기 위하여 2개의 발현 카세트를 하나의 벡터 내에 위치시킬 때 상대적으로 작고 상대적으로 강력한 상이한 이종 프로모터 서열들(서로와의 서열 동일성이 거의 없거나 전혀 없음)을 사용하는 것이 바람직하다.
바이러스 벡터의 생성을 위한 세포주를 만들 때, 바이러스 벡터의 발현 카세트에 일반적으로 사용되는 다른 프로모터, 예컨대 일반적으로 사용되는 hCMV 프로모터와는 상이한 서열을 갖는 강력 프로모터를 갖는 것이 또한 바람직하다. 상기 세포주의 게놈과 그 안에서 생성된 벡터 사이의 상당한 서열 동일성 스트레치는 상동 재조합을 초래할 수 있고 그에 따라, 생성된 벡터 배치(batch)의 유전자 불안정성 또는 이종성을 초래할 수 있으며(예를 들어,
Figure pct00001
1994), 따라서 회피되는 것이 바람직하다(예를 들어 Fallaux et al, 1998; Murakami et al, 2002). 또한 이러한 응용에 있어서, 일반적으로 사용되는 hCMV 프로모터와의 서열 동일성이 거의 없거나 전혀 없는 강력 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 것이다.
따라서, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 벡터 및 세포주에 사용하기 위한, 바람직하게는 크기가 짧고 hCMV 프로모터와의 서열 동일성이 거의 없거나 전혀 없는 강력 프로모터를 확인할 필요성이 여전히 남아있다.
본 발명은 아오틴(Aotine) 헤르페스바이러스-1의 주요 극초기 프로모터 영역(AoHV-1 프로모터)을 포함하는 재조합 핵산 분자, 및 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 벡터(예를 들어, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터를 포함함), 재조합 바이러스, 및 재조합 세포주를 제공한다. 또한 본 발명은 AoHV-1 프로모터로부터의 전사의 조정에 사용될 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
일반적인 실시 형태 및 바람직한 실시 형태는 각각 본원에 첨부된 독립항 및 종속항에 의해 정의되는데, 이는 간결성을 위해 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 양태의 다른 바람직한 실시 형태, 특징, 및 장점은 첨부된 도면과 함께 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]으로부터 명백해질 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 AoHV-1 프로모터를 포함하는 숙주 세포의 게놈에서의, 또는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스를 이용한 트랜스진의 발현을 위하여 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 제공한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 AoHV-1 프로모터를 포함하는 플라스미드 벡터를 제공하며, 상기 플라스미드 벡터는 1 kb 미만의 AoHV-1 DNA를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 제공하며, 상기 트랜스진은 AoHV-1 프로모터에 대하여 이종성이고, 예를 들어, 여기서, 트랜스진은 자연에서는 AoHV-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이 아니고/아니거나 트랜스진은 AoHV-1에서 기원한 것이 아니다. 발현 카세트는 예를 들어 플라스미드, 벡터, 바이러스 게놈, 세포주 등 내로 통합될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 발현 카세트의 제조 방법을 제공하며, 본 방법은 재조합적 수단에 의해 또는 핵산 합성에 의해 발현 카세트를 구축하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은 트랜스진의 발현 방법을 제공하며, 이는 예를 들어 재조합 세포주에서 트랜스진을 본 발명의 발현 카세트로부터 발현시키는 단계를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 세포주를 제공하며, 여기서, AoHV-1 프로모터는 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터는 이로부터의 트랜스진의 발현용으로 구현된 세포주에, 예를 들어 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 또는 재조합 바이러스에 존재할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터는 이로부터의 트랜스진의 발현을 위하여 재조합 세포주의 게놈 내로 통합된다. 특정 실시 형태에서, 트랜스진은 상기 세포주의 게놈 내로 통합되며 테트라사이클린 리프레서(TetR) 단백질을 코딩한다. 이의 특정 실시 형태에서, 상기 세포주는 PER.C6 세포주이다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 또한 세포에서 트랜스진을 발현시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 또한 관심의 대상이 되는 단백질을 생성하는 방법을 제공하며, 여기서, AoHV-1 프로모터는 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 트랜스진에 작동가능하게 연결되고, 본 방법은 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 단백질을 포함하는 세포를 제공하는 단계, 및 관심의 대상이 되는 단백질을 상기 세포로부터 발현시키는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 방법은 관심의 대상이 되는 단백질을 예를 들어 세포로부터 또는 배양 배지로부터 또는 세포 및 배양 배지로부터 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 방법은 관심의 대상이 되는 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 관심의 대상이 되는 단백질은 자연에서는 아오틴 헤르페스바이러스-1에 의해 코딩된 것이 아닌 단백질이며, 즉, 이것은 이종 단백질이다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 AoHV-1 프로모터로부터의 전사를 조정하는 데 사용될 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 제공한다. 이의 특정 실시 형태에서, 이것은 예를 들어 AoHV-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 리프레서 결합 서열에 리프레서가 결합함으로써 억제될 수 있다. 특정 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터는 리프레서의 제거에 의해 또는 유도 신호 또는 유도제의 제공에 의해 유도될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터 서열에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터(tetO 부위)를 제공하여서, 발현이 가역적으로 제어될 수 있게 한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 또한 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스를 생성하는 방법을 제공하며, 본 방법은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 구축물을 제조하는 단계, 및 상기 구축물을 재조합 바이러스의 게놈 내로 포함시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터는 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 트랜스진에 작동가능하게 연결되며, 여기서, 관심의 대상이 되는 단백질은 치료용 단백질 또는 항원이다.
특정 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 바이러스 및 바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스(rAd) 및 rAd 벡터이다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 rAd 및 rAd 벡터, 및 rAd 및 rAd 벡터의 제조 및/또는 사용 방법에 관한 것이며, 여기서, rAd 및 rAd 벡터는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E1 영역에서의 결실을 가지며, 특정 실시 형태에서 이 E1 영역 내에 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 재조합 아데노바이러스의 다른 영역이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 또한 재조합 아데노바이러스의 E4 영역과 우측 ITR 사이에, 게놈의 우측 말단에, 또는 E3 영역 내에 위치할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 rAd 벡터는 바이러스 복제에 요구되는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역, 예를 들어 E1a 영역 및/또는 E1b 영역의 적어도 하나의 필수적인 유전자 기능이 결핍되어 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 필수적이지 않은 E3 영역의 적어도 일부가 결핍되어 있다. 특정 실시 형태에서, 벡터는 E1 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 기능 및 필수적이지 않은 E3 영역의 적어도 일부가 결핍되어 있다. 아데노바이러스 벡터는 "다중적으로 결핍"될 수 있는데, 이는 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 게놈의 둘 이상의 영역들 각각에서 하나 이상의 필수적인 유전자 기능들이 결핍되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 상기 E1-결핍된 또는 E1-, E3-결핍된 아데노바이러스 벡터들은 E4 영역의 적어도 하나의 필수적인 유전자 및/또는 E2 영역(예를 들어, E2A 영역 및/또는 E2B 영역)의 적어도 하나의 필수적인 유전자가 더 결핍되어 있을 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 또한 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 게놈을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.
도 1: HEK293 세포에서의 일시적 형질감염에 의해 평가된 상이한 프로모터 구축물들로부터의 루시퍼라아제의 발현. 루시퍼라아제 발현을 상대적 광 단위(relative light unit; RLU)로 측정하고, SEAP 수준의 측정에 의해 형질감염 효율에 대하여 보정하였다. 표시된 프로모터를 hCMV 프로모터의 제어 하의 루시퍼라제의 양성 대조군 및 비형질감염 세포의 음성 대조군과 비교하여 결과를 나타낸다.
도 2: CLC 작업대를 이용하여 수행한 hCMV와 chCMV short 또는 AoHV-1 short 사이의 서열 정렬. 회색 음영은 정렬된 서열들 사이의 뉴클레오티드 차이를 나타낸다. 정렬은 완전 프로모터 서열을 이용하여 수행되었다. 그러나, 서열들이 정렬된 영역만을 도 2에 나타내며, 그 이유는 이러한 영역들이 잠재적인 상동 재조합 사건과 관련되기 때문이다. -는 정렬이 없는 영역(갭)을 나타낸다. (2a) hCMV와 chCMV short의 정렬 영역. (2b) hCMV와 AoHV-1 short의 정렬 영역.
도 3: 조절 발현을 위한 tTA-반응성 프로모터로서의 적용성에 대한 "7xTetO-AoHV-1"의 테스트. 가우시아 루시퍼라아제 발현이최소 프로모터 활성을 제공하는 7xTetO-AoHV-1(7xTetO가 코어 AoHV-1 프로모터의 상류에 위치함)의 제어 하에 있는 플라스미드로 베로(Vero) 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 프로모터 활성을 유도하기 위하여, 테트라사이클린 트랜스활성자 단백질(tTA)을 발현하는 플라스미드를 공동 형질감염시켰다. tTA 플라스미드로 공동 형질감염된 세포의 배양 배지에 독시사이클린을 첨가하여 프로모터 활성을 턴오프(turn off)하였다. 라우스 육종 바이러스 프로모터(RSV)가 양성 대조군으로 사용되었다.
도 4: 세포에서의 관심의 대상이 되는 유전자(gene of interest; GOI)의 조절 발현에 대한 AoHV-1 short의 TetR-억제성 버전의 테스트. (4a) 일시적 플라스미드 형질감염에서 eGFP 발현을 유도하는 프로모터 hCMV, hPGK 및 AoHV-1 short의 능력의 비교. Evos 형광 현미경으로 촬영한 eGFP 발현의 사진이 예시되어 있다. (4b) 조절 버전의 AoHV-1 short의 설계 및 테스트. PER.C6-hCMV.TetR 세포에서의 AoHV.2xtetO 또는 표준 hCMV 프로모터(pCDNA)에 의한 eGFP의 일시적 발현. (4c) 안정한 세포주에서의 AoHV.2xtetO에 의한 GOI의 조절 발현. 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석법에서의 GOI의 발현이 예시되어 있다. 레인의 라벨링: 레인 1: 클론 11, 레인 2: 클론 11 + 독시사이클린, 레인 3: 클론 73, 레인 4: 클론 73 + 독시사이클린, 레인 5: 양성 발현 대조군, AoHV-1 프로모터의 제어 하에 GOI를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 세포, 레인 6: 음성 대조군(비형질감염 PER.C6 세포).
도 5: (5a) Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL 벡터의 게놈을 개략적으로 나타낸 도면. 개방 화살표는 다음 2개의 트랜스진 카세트 삽입체를 나타낸다: E1 영역 결실 위치에 삽입된 CMV 또는 CMVtetO 프로모터-구동 Gluc 발현 카세트, 및 E4 영역과 RITR 사이에 삽입된 AoHV-1 프로모터-구동 RFL 발현 카세트. 흑색 화살표는 트랜스진 카세트를 구동시키는 프로모터를 나타낸다. 회색 화살표는 코딩 서열을 나타낸다. GLuc, 가우시아 루시퍼라아제. RFL, 레드 반딧불이(red firefly) 루시퍼라아제. LITR 및 RITR, 좌측 및 우측 역 말단 반복체. CMV, 인간 사이토메갈로바이러스 주요 극초기 프로모터(hCMV MIEp). CMVtetO, 2개의 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO) 서열을 갖춘 hCMV MIEp(TetR-억제성 발현을 위하여). AoHV-1 P, AoHV-1 short 프로모터. SV40pA, SV40 바이러스-유래된 폴리아데닐화 신호. BGHpA, 소 성장 호르몬 유전자-유래된 폴리아데닐화 신호. E4, Ad26의 E4 영역. (5b) 아이덴티티(identity) PCR에 의한 Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL 정제 배치에 있어서의 트랜스진(TG) 카세트 완전성의 분석. PCR을 수행하여 E1 내에 삽입된 TG 카세트를 증폭시키고("E1 PCR"), E4와 RITR 사이에 위치된 TG 카세트를 증폭시켰다("E4 PCR1" 및 "E4 PCR2"). 상이한 PCR들에 있어서 예상되는 PCR 생성물 크기가 도 5b의 삽도에 표시되어 있다. L, 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), P1 = pAdApt26 (Abbink et al., 2007), "공" 발현 카세트(즉, hCMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 신호로 이루어지며 TG 코딩 서열을 포함하지 않음)를 포함함. P2, pWE.Ad26.dE3.5orf6 (Abbink et al., 2007), E4 영역과 RITR 사이에 트랜스진 카세트 삽입이 없음. W, DNA 주형 대조군이 없음. V1, Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL 바이러스 DNA. V2, Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 바이러스 DNA. (5c 및 5d) Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL 정제 배치에 의한 트랜스진 발현의 분석. 96웰 플레이트에 접종한 A549 세포를 표시된 바이러스 입자:세포 비(VP/세포)로 삼중으로 감염시키고, 감염시킨지 2일 후 수확한 샘플에서 GLuc 및 RFL 활성을 검출하였다. RLU, 상대적 광 단위. Ad26.CMV(공벡터), GLuc 또는 RFL 코딩 서열을 지니지 않은 매칭 대조 Ad26 바이러스 벡터. *, 10의 VP/세포로 Ad26.CMVtetO_Gluc.AoHV1_RFL을 이용하여 감염시킨 것에 있어서 관찰된 187 RLU의 하나의 이상치를 제거하였다(이러한 삼중 감염에 있어서의 다른 두 값은 14 및 26 RLU였다).
도 6: (6a) pC_AoHV_TetR의 플라스미드 지도. 회색 화살표는 테트라사이클린 리프레서(TetR) 단백질, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II, 및 베타-락타마아제의 코딩 서열을 나타내며; 흑색 화살표는 다른 유전 요소를 나타낸다. 개방 화살표는 pC_AoHV_TetR을 구축하도록 pcDNA2004Neo(-) 내로 삽입된 합성 서열을 나타낸다. AoHV-1 P, AoHV-1 short 프로모터. TetR, 코돈-최적화된 테트라사이클린 리프레서 코딩 서열. BGH pA, 소 성장 호르몬 유전자-유래된 폴리아데닐화 신호. SV40 P, SV40 바이러스-유래된 프로모터. pUC ori, pUC 복제 기점. bla P, 베타-락타마아제의 발현을 구동시키는 프로모터. (6b) 제20세대, 제40세대, 및 제60세대에서의 유세포 분석법용 세포내 염색에 의한 장시간 계대시의 PER.C6/TetR 세포 클론에 의한 TetR 발현의 안정성. 각각의 시점에서 각각의 클론(선발하여, 그리고 선발하지 않고서 성장시킴)에 대하여 관찰된 TetR-양성의 분율이 예시되어 있다. PER.C6, 단지 항생제 선발 없이 성장시킨, TetR 구축물을 포함하지 않는 대조 PER.C6 세포주. (6c) 장시간 계대(60회의 집단 배가) 후 TetR 기능성 분석. PER.C6/TetR 세포 클론을 Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL로 감염시키고, 그 후 GLuc 및 RFL 활성을 결정하였다. 각 감염 중복에 대하여, CMV 또는 CMVtetO 프로모터-구동 GLuc 활성은 동일 샘플에 대하여 관찰된 AoHV-1 프로모터-구동 RFL 활성에 의해 정규화되었다. 생성된 정규화 Gluc 값은 도 6c에서 TetR-음성 대조 세포주(PER.C6)에 대하여 발견된 것과 비교하여 표현된다. +, 세포를 항생제 선발을 이용하여 성장시킴. -, 세포를 항생제 선발 없이 성장시킴. Ctrl (+), pCDNA6/TR (Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 V102520)(인간 CMV 프로모터의 제어 하의 TetR 서열을 포함하는 플라스미드)을 이용한 안정한 형질감염에 의해 PER.C6으로부터 유래된, 이전에 확립된 TetR-양성 대조 세포주.
도 7: (7a) 절두형 및 연장형 버전의 AoHV-1 프로모터의 설계. 좌측에서 우측으로 GenBank 등록 번호 NC_016447의 뉴클레오티드 번호 157077 내지 154304에 상응하는 아오틴 헤르페스바이러스 1 게놈의 2774-bp 스트레치의 도면이 도시되어 있다. 라벨링된 막대는 본원에서 설계되고 테스트된 상이한 AoHV-1 프로모터 변이체들을 나타낸다. 서열 v00 및 v06은 각각 천연 AvrII 부위를 포함하는, 그리고 이를 포함하지 않는 AoHV-1 short 프로모터를 나타낸다. D 및 A, 각각 예상 스플라이스 도너 및 억셉터 부위. TATA, 추정 TATA 박스. Inr, 추정 개시 서열(예상 전사 시작 부위를 포함함). (7b) 일시적 형질감염 PER.C6 세포에서의 상이한 버전의 AoHV-1 프로모터의 능력 테스트의 결과. 두 실험의 평균 결과가 v00 AoHV-1 short 프로모터와 비교하여 예시되어 있다.
아오틴 헤르페스바이러스-1의 극초기 인핸서 / 프로모터 영역으로부터 유래된 새로운 프로모터(AoHV-1 프로모터)의 확인, 설계, 및 테스트와 관련된 실험 결과가 본원에 개시된다. 이 결과는 AoHV-1 프로모터가 이에 작동가능하게 연결된 트랜스진의 강력한 발현을 제공함을 보여주는데, 이는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 바이러스를 이용한 바이러스 감염 및 상이한 세포주들에서의 플라스미드 벡터를 이용한 일시적 형질감염을 바탕으로 한다. AoHV-1 프로모터는 또한 상대적으로 짧은 프로모터여서 크기 제약이 관심사인 많은 응용에서 사용하기에 적합하다. 따라서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 강력한 발현이 우선 사항이고/이거나 작은 크기의 AoHV-1 프로모터가 다른 더 긴 프로모터와 비교하여 예를 들어 한정된 크기의 벡터 또는 바이러스 게놈에서 트랜스진들을 위한 더 많은 공간을 남기는 데 유용한 응용에서 사용하기에 적합하다. 더욱이, AoHV-1 프로모터는, 다른 일반적으로 사용되는 프로모터, 예컨대 hCMV와의 서열 상동성이 낮음으로 인하여, 함께 동시에 사용되는 두 프로모터들 사이의 서열 동일성에 대한 관심이 있는 응용에서, 예를 들어 2가지 상이한 트랜스진을 동일 바이러스 벡터로부터 발현시킬 때 또는 hCMV 프로모터 서열도 포함하는 생산자 세포주를 이용하여 바이러스를 생성할 때 또한 유용하다. 또한 AoHV-1 프로모터는 AoHV-1 프로모터로부터의 전사를 조정하는 데 사용될 수 있는 조절 서열과 함께 사용하기에 적합하다.
따라서 본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 세포에서 트랜스진을 발현시키기 위한, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 벡터 및 바이러스의 사용에 관한 것이다. 특정한 비제한적 실시 형태에서, 본 발명의 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 인간 인공 염색체, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 이들의 조합 또는 키메라를 포함할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 AoHV-1 프로모터가 유전자 발현 및 유전자 전달 분야에서 이용되는 다른 벡터, 특히, 강력한 발현이 중요하고 발현 카세트의 전체 크기가 관련 요인인 것에서 또한 유용할 것임을 인식할 것이다.
또한 본 발명은 이종 단백질, 또는 관심의 대상이 되는 다른 발현 생성물을 숙주 세포가 생성할 수 있게 하기 위한 벡터의 사용에 관한 것이다. 예를 들어, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 플라스미드 벡터가 세포에서의 이종 단백질의 발현에 사용될 수 있다. 이러한 플라스미드 벡터는 예를 들어, (1) AoHV-1 프로모터; (2)번역의 개시를 위한, 트랜스진을 위한 코작(Kozak) 콘센서스 서열; (3) 트랜스진의 코딩 영역, 예를 들어 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열; (4) 트랜스진의 전체 암호가 판독되었을 경우 번역의 종결을 가능하게 하는 트랜스진에 있어서의 종결 서열; 폴리아데닐화 신호, 및/또는 개재 서열 및 특정 벡터로부터 트랜스진이 발현되게 하기 위한 당업자에게 공지된 기타 요소; 및 (6) 선택적으로, 벡터가 게놈 내로 직접적으로 삽입된 것이 아닐 경우, 일단 전체 벡터가 세포 내에 있으면 이것이 복제되는 것을 가능하게 하는 복제 기점을 포함하는 DNA 서열일 수 있다. 이 벡터는 예를 들어 형질감염, 전기천공, 또는 감염에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 숙주 세포는 트랜스진을 발현하도록 배양될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 플라스미드 벡터는 또한 폴리링커로도 칭해지는 하나 이상의 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함하는데, 이는 몇 개의 제한효소 부위를 포함하는 짧은 DNA 절편이다. MCS 내의 이러한 제한효소 부위는 전형적으로 독특하고, 주어진 플라스미드 내에서 단지 한 번 나타난다. MCS는 분자 클로닝 또는 서브클로닝을 포함하는 절차 동안 일반적으로 사용되며, 생명공학, 생체공학, 및 분자 유전학에서 극도로 유용하고, 그 이유는 예를 들어 세포에서 발현시키기 위한 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 발현 카세트가 삽입되도록 MCS가 MCS의 영역 내로의 한 조각의 DNA 또는 몇 조각의 DNA의 삽입을 허용하기 때문이다.
또한 본 발명은 AoHV-1 프로모터를 포함하는 벡터(본원에 기술됨) 및 재조합 세포주에 의해 형질전환된 세포를 제공하며, 여기서, AoHV-1 프로모터는 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 이와 관련하여, 형질전환은 이종 핵산 물질이 세포 내로 도입되어 세포 내에서 발현되는 임의의 과정을 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 형질전환은 "일시적" 형질감염 절차 및 "안정한" 형질감염 절차를 포함하며, 이는 전기천공, 양이온성 지질/DNA 복합체, 단백질/DNA 복합체, 인산칼슘-매개된 음세포작용, 바이러스 벡터등에 의해 매개되는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 여기서, 숙주 세포 내로 도입된 핵산은 염색체외 핵산으로 존재하거나, 형질감염 핵산은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되었다. 형질감염 절차는 선발가능 마커(예를 들어, 항생제에 대한 내성)를 코딩하는 제2 핵산을 또한 포함할 수 있는데, 이는 AoHV-1 프로모터를 포함하는 형질감염 핵산이 유지되도록 세포의 양성 선발을 가능하게 한다. 따라서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터는 트랜스진의 발현용으로 구현된 세포주에, 예를 들어 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 및 재조합 바이러스에 존재할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터는 재조합 세포주의 게놈 내로 통합되어서 트랜스진을 이로부터 발현시킬 수 있다.
또한 본 발명은 세포에서 트랜스진을 발현시키는 방법을 제공하며, 상기 트랜스진은 예를 들어 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 트랜스진 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 RNA, 예컨대 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA), 또는 안티센스 RNA 등)을 포함하는 트랜스진을 포함하고, 본 방법은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 특정 실시 형태에서 본 발명은 세포에서 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 생성하는 방법을 제공하며, 여기서, AoHV-1 프로모터는 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 코딩하는 트랜스진에 작동가능하게 연결되고, 본 방법은 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 세포를 제공하는 단계, 및 세포에서 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 발현시키는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 발현 생성물은 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 발현 생성물은 테트라사이클린 리프레서(TetR) 단백질이다. 본 방법은 발현 생성물, 예를 들어 관심의 대상이 되는 단백질을 예를 들어 세포로부터 또는 배양 배지로부터 또는 세포 및 배양 배지로부터 수확하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 방법은 예를 들어 진단 목적, 치료 목적, 또는 예방 목적, 연구 등을 비롯한 다양한 목적을 위하여 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 관심의 대상이 되는 정제 단백질은 선택적으로 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 치료용 단백질은 예를 들어 항응고제, 혈액 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 항체, Fc 융합 단백질, 골 형성 단백질, 조작된 단백질 스캐폴드, 효소, 및 사이토카인, 예를 들어, 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 및 종양 괴사 인자 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 바이러스를 생성하는 방법을 제공하며, 이는 상기 바이러스의 증식에서 기능을 갖는 유전자를 발현하는 세포에서 바이러스를 증식시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 유전자는 AoHV-1 프로모터의 제어 하에 있으며, 상기 유전자는 핵산(예를 들어 조절 RNA) 또는 단백질, 예를 들어, 바이러스 복제 주기 또는 기타 바이러스 기능(예를 들어 감염)에서의 결함을 보완하는 단백질을 코딩한다. 바이러스는 야생형 바이러스일 수 있지만, 바람직하게는 재조합 바이러스(예를 들어, 바이러스가 복제 결함성 또는 감염 결함성이 되게 만드는 결함을 가짐)이다. 더욱이, 상기 유전자는 염색체외 요소로부터 또는 바람직하게는 세포의 게놈으로부터 발현될 수 있으며(그러면 상기 세포는 안정한 세포주 유래의 것일 수 있음), 세포는 바이러스가 수확되고 선택적으로 정제되고 그 후 다른 세포의 감염에, 또는 제약 조성물로의 제형화 등에 사용될 수 있도록 배양 배지에서 배양될 수 있다.
본 발명에 따른 "세포" 또는 "숙주 세포"는 AoHV-1 프로모터가 활성일 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 세포는 그의 정상 조직으로부터 단리되며, 예를 들어 배양 배지에서 (시험관 내에서) 배양될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 세포 또는 숙주 세포는 불멸화 세포, 예를 들어 세포주 유래의 것이다. 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 세포 또는 숙주 세포는 포유류 또는 조류 세포, 바람직하게는 포유류 세포이다. 본 발명에 따른 세포 또는 숙주 세포의 일부 비제한적 예로는 설치류 세포, 인간 세포, 원숭이 세포, 개 세포, 닭 세포 등이 있다. 본 발명에 따른 세포 또는 숙주 세포의 일부 비제한적 예로는 베로 세포, MDCK 세포, HEK293 세포, PER.C6 세포, CHO 세포, 닭 배아 섬유모 세포, 하이브리도마 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, HeLa 세포, A549 세포 등이 있다. 당업자라면 AoHV-1 프로모터가 관심의 대상이 되는 발현 생성물의 발현을 유도하기 위하여 많은 상이한 세포에서 사용될 수 있으며, 세포의 유형은 본 발명에 결정적이지 않음을 인식할 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 생산자 세포를 제공하며, 여기서, AoHV-1 프로모터는 TetR 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고, 바람직하게는 AoHV-1 프로모터 및 TetR 코딩 서열은 생산자 세포의 게놈 내로 통합되며, 바람직하게는 상기 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포이고, 특히 바람직한 실시 형태에서 생산자 세포는 PER.C6 세포(예를 들어, 미국 특허 제5,994,128호 참조)의 게놈 내로의 AoHV-1 프로모터 및 TetR 코딩 서열의 통합에 의해 PER.C6 세포로부터 유래된다. 따라서 본 발명은 또한 PER.C6 세포의 게놈 내로 통합된 트랜스진을 포함하는 PER.C6 세포를 제공하며, 여기서, 트랜스진은 TetR 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 핵산을 포함한다. 이의 비제한적 실시 형태에서, 트랜스진은 서열 번호 20에 개시된 서열을 갖는다. 따라서 이러한 세포는 TetR을 발현하며, 예를 들어 TetR에 의해 조절될 수 있는 프로모터, 예를 들어 하나 이상의 tetO 부위에 작동가능하게 연결된 CMV 또는 다른 프로모터의 제어 하의 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 코딩하는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 데 사용될 수 있는데, 이는 아데노바이러스에 의해 코딩되는 관심의 대상이 되는 발현 생성물이 아데노바이러스의 증식 중에 생성될 때 재조합 아데노바이러스의 안정성 또는 수율을 감소시거나 또는 생산자 세포에 대하여 유독할 경우 특히 유리할 수 있다. TetR은 이러한 시스템에서, 생산자 세포에서의 생성 중에 tetO-조절 프로모터, 예를 들어 tetO-조절 hCMV 프로모터를 억제하여서 관심의 대상이 되는 발현 생성물이 재조합 아데노바이러스의 증식 및 생성 중에 생성되지 않거나 단지 매우 낮은 수준으로 생성되게 하여 재조합 아데노바이러스의 향상된 수율 및/또는 안정성을 생성 중에 초래한다. 일 양태에서, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 조합물을 제공한다: (i) TetR 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 생산자 세포, 및 (ii) 하나 이상의 tetO 부위에 작동가능하게 연결된 프로모터에 작동가능하게 연결된, 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
또한 본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 벡터 및 바이러스를 이용하여 유전 질환, 대사 질환 또는 후천성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 세포를 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 충분한 양의 본 발명의 벡터 또는 바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 세포는 트랜스진이 세포에서 발현되도록 형질전환된다. 세포는 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 형질전환될 수 있다.
벡터가 DNA 벡터, 예컨대 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터일 경우 벡터의 중요한 측면은 이들 벡터가 원하는 트랜스진 서열을 수용하는 능력이다. 그러한 능력은 상기 벡터의 크기 제약에 의해 제한될 수 있는데, 이는 예를 들어 특정 크기 제한이 초과될 경우 불안정하게 되거나 심지어 생성이 불가능해질 수 있다. 따라서, 프로모터가 차지하는 공간은 그러한 프로모터가 가져야 하는 기능적 능력 외에도, 새로운 벡터를 설계할 때 중요한 고려 사항이다. 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 상대적으로 짧다는 장점을 가지며, 이는 벡터의 특정한 크기 제한에서 더 많은 공간이 트랜스진을 위하여 남아 있어서 예를 들어 더 큰 크기의 다른 프로모터와 비교하여 더 큰 단백질이 발현되게 하거나 또는 트랜스진이 면역원일 경우 더 많은 에피토프가 포함되게 함을 의미한다. 본 발명의 AoHV-1 프로모터의 추가의 장점은 시스템에서 hCMV 프로모터와 조합될 가능성이다(예를 들어, 하나의 핵산 분자, 예컨대 벡터 상의 상기 둘 다의 프로모터, 또는 세포주에 하나의 프로모터 및 세포주에 존재하는 핵산 분자, 예컨대 벡터 상의 다른 하나의 프로모터)(이때 AoHV-1 프로모터와 hCMV 프로모터 사이의 낮은 서열 상동성으로 인하여 프로모터 서열들 사이의 상동 재조합의 위험은 매우 제한되거나 없음).
본원에서 사용되는 바와 같이, hCMV 프로모터 서열과 관련될 경우 용어 "낮은 서열 상동성" 및 "낮은 서열 동일성"은 프로모터 서열들의 hCMV 프로모터와의 동일성이 약 50% 미만이고 바람직하게는 hCMV 프로모터와의 동일성이 약 40% 미만임을 지칭한다. 게다가, "낮은 서열 상동성" 및 "낮은 서열 동일성"을 갖는 프로모터 서열들은 바람직하게는 또한 약 15개 핵산보다 더 긴 연속 동일성 정렬의 스트레치는 갖지 않거나, 또는 더 바람직하게는 약 14개 핵산보다 더 긴 동일성 정렬의 스트레치는 갖지 않는다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 프로모터는 AoHV-1 short 프로모터(서열 번호 1 또는 서열 번호 30)이며, hCMV 프로모터와의 동일성은 36%이고, 14개 핵산보다 더 긴 연속 동일성 정렬의 스트레치는 없다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 프로모터는 프로모터 활성을 갖는 서열 번호 1 또는 서열 번호 30의 단편, 예를 들어 서열 번호 25 또는 서열 번호 26을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 정렬은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 상이한 뉴클레오티드 또는 단백질 서열들을 정렬 및 비교하기 위한 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)와 같은 알고리즘을 사용한 방법을 지칭한다(Altschul, Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990).
또한 본 발명은 hCMV 프로모터 및 AoHV-1 프로모터를 포함하는 벡터 또는 바이러스에 의해 형질전환된 세포 또는 트랜스제닉 유기체를 제공하며, 여기서, hCMV 프로모터 및 AoHV-1 프로모터는 트랜스진들에 작동가능하게 연결되어서, 두 트랜스진이 세포 또는 트랜스제닉 유기체에서 발현되게 된다. hCMV 프로모터 및 AoHV-1 프로모터는 별개의 분자 상에(예를 들어, 하나의 프로모터는 플라스미드 상에 또는 바이러스 내에, 그리고 다른 하나의 프로모터는 세포의 게놈 내에, 또는 둘 다의 프로모터가 상이한 플라스미드 상에, 또는 둘 다의 프로모터가 세포의 게놈 내에) 존재할 수 있거나, 또는 둘 다의 프로모터는 단일 분자 내에(예를 들어, 하나의 게놈 염색체 내에, 또는 하나의 플라스미드 내에, 또는 하나의 바이러스 게놈 내에) 존재할 수 있다.
또한 본 발명은 재조합 바이러스를 생성하는 방법을 제공하며, 여기서, 트랜스진은 바이러스가 표적 세포 내로 도입된 경우 강력하게 발현되고, 본 방법은 다음 단계를 포함한다: 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 구축물을 제조하는 단계, 및 상기 구축물을 재조합 바이러스 내로 포함시키고 그 후 벡터를 예를 들어 바이러스를 이용한 감염에 의해 세포 내로 도입하는 단계. 이와 같이 구축물의 제조는 잘 알려진 표준 분자 클로닝 방법의 이용을 포함하며(예를 들어 (Holterman et al., 2004; Lemckert et al., 2006; Vogels et al., 2003); Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al, eds, 1987; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995 참조), 이는 당업자에게 공지되고 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스 기술 분야에서 일상적으로 수행되고 본원에 예시된 바와 같다. AoHV-1 프로모터는 상기에 설명된 바와 같은 특징을 가지며, 본 발명의 개시 내용을 고려하면, 일상적인 방법, 예컨대 PCR 또는 드노보(de novo) 핵산 합성에 의해 수득될 수 있다. 편의상, 당업자는 바이러스 게놈을 더 작은 단편, 예를 들어 플라스미드 형태에서의 트랜스진들의 용이한 조작 및 도입을 위한 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분에서 E1 영역까지를 위한 제1 부분, 및 제1 부분과의 재조합시 전 아데노바이러스 게놈을 생성할 수 있는 나머지 게놈을 위한 더 큰 제2 부분으로 클로닝함으로써 조작할 수 있다(예를 들어 국제 공개 제99/55132호 참조).
예를 들어 본 발명의 벡터 또는 바이러스 또는 세포 내의 "이종 핵산" 또는 "이종 유전자"(본원에서 "트랜스진" 또는 "관심의 대상이 되는 유전자"로도 지칭됨)는, 벡터 또는 바이러스 또는 세포 내에 자연적으로는 존재하지 않는, 또는 자연에서는 AoHV-1 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않는 핵산이다. 이것은 예를 들어 표준 분자 생물학 기술에 의해 본 벡터 또는 바이러스 또는 세포 내로 도입된다. 특정 실시 형태에서, 이것은 관심의 대상이 되는 단백질 또는 이의 부분을 코딩할 수 있다. 이러한 경우에, 관심의 대상이 되는 단백질은 "이종 단백질"로 지칭될 수 있으며, 그 이유는 이것이 자연에서는 AoHV-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열에 의해 자연적으로 코딩된 것이 아니기 때문이다. 트랜스진은 예를 들어 아데노바이러스 벡터의 결실된 E1 또는 E3 영역 내로 또는 플라스미드 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역 내에 위치된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 아데노바이러스 게놈의 E3 영역 내에 위치된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 아데노바이러스 게놈의 E4 영역과 우측 ITR 사이에 위치된다. 다른 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 플라스미드 벡터 내에 존재한다. 다른 실시 형태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 세포의 게놈 내로 통합된다. 이러한 세포 또는 세포주는 트랜스진을 재조합적으로 발현시키는 데 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 프로모터가 활성을 갖고 (비-조절 버전의 프로모터가 사용되는 경우, 즉, 조절 요소가 프로모터에 부가되지 않은 경우, 이 발현은 배양시에 자동적으로 일어남) 트랜스진의 발현을 구동시키는 조건 하에 세포를 배양함에 의한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터" 또는 "프로모터 영역" 또는 "프로모터 요소"라는 용어는 상호교환가능하게 사용되며, 핵산 서열(그러나 전형적으로 DNA에 한정되는 것은 아님)의 절편으로서 그 핵산 서열의 전사를 제어하는 절편을 나타내는데, 상기 핵산 서열에 상기 절편이 작동되게 연결되어 있다. 프로모터 영역은 RNA 폴리머라아제의 인식, 결합 및 전사 개시에 충분한 특정 서열들을 포함한다. 게다가, 프로모터 영역은 RNA 폴리머라아제의 이러한 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열들을 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 서열들은 시스-작용성(cis-acting)일 수 있거나 트랜스-작용(trans-acting) 인자에 대하여 반응성일 수 있다. 더욱이, 프로모터는 조절의 성질에 따라 구성적 프로모터 또는 조절 프로모터일 수 있다.
당업자라면 프로모터가 핵산 서열의 스트레치로부터 만들어지고 종종 핵산 서열의 상기 스트레치 내에 요소 또는 기능성 단위, 예컨대 전사 개시 부위, RNA 폴리머라아제의 결합 부위, 일반 전사 인자 결합 부위, 예컨대 TATA 박스, 특정 전사 인자 결합 부위 등을 포함함을 알 것이다. 추가의 조절 서열, 예컨대 인핸서, 및 때때로 프로모터 서열의 말단에 인트론이 또한 존재할 수 있다. 이러한 기능성 단위들은 서로에 바로 인접할 수 있지만 또한 프로모터 기능에서 직접적인 역할이 없는 핵산의 스트레치에 의해 분리되어 있을 수 있다. 당업자라면 핵산의 스트레치에서의 뉴클레오티드들이 프로모터 기능에 관련이 있는지를 테스트하기 위한, 그리고 예를 들어 프로모터 활성을 유지하면서 프로모터의 길이를 최소화하거나 활성을 최적화하기 위하여 표준 분자 생물학적 방법에 의해 뉴클레오티드를 주어진 프로모터 서열 내로 부가하거나 제거하는 것의 효과를 테스트하기 위한 본원에서의 실시예를 참고할 수 있다. 또한 돌연변이를 프로모터 내로 도입하여 다른 프로모터(예를 들어 hCMV)에 대한 동일성(동일성의 스트레치)을 감소시킬 수 있다(이러한 프로모터들이 동일 세포 내에서 동시에 존재하거나 사용되는 것으로 의도되는 경우).
본원에서 사용되는 바와 같이, "인핸서 "라는 용어는 하나의 유전자 또는 몇몇 유전자들의 전사를 자극하거나 향상시키는 단백질(활성화 단백질(activator protein))이 결합될 수 있는 조절 DNA 서열, 예를 들어 50 내지 1500 bp를 지칭한다. 이러한 활성화 단백질(전사 인자로도 공지됨)은 매개 복합체(mediator complex)와 상호작용하여 폴리머라아제 II 및 일반 전사 인자를 모집하는데, 그 후 이것은 유전자를 전사시키기 시작한다. 일반적으로 인핸서는 시스-작용성이지만, 그가 조절하는 유전자(들)의 시작 부위의 상류 또는 하류 중 어느 하나에 위치할 수 있다. 더욱이, 인핸서는 정방향 또는 역방향 중 어느 하나일 수 있고, 전사에 영향을 주도록 전사 개시 부위 근처에 위치할 필요는 없으며, 그 이유는 일부가 상기 개시 부위에서 수 십만개 염기쌍의 상류 또는 하류에 위치함이 발견되었기 때문이다. 인핸서는 또한 인트론 내에서 발견될 수 있다.
본원에서 서열들은 본 기술 분야의 관행인 바와 같이, 5'에서 3'의 방향으로 제공된다. 또한, '상류' 및 '하류'라는 용어는 본 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 전사 방향과 관련됨을 주지하도록 한다. 예를 들어, 관례상 상류 및 하류라는 용어는 RNA 전사가 일어나는 5'에서 3'으로의 방향에 관련된다. 상류는 RNA 분자의 5' 말단 쪽이며 하류는 3' 말단 쪽이다. 이중 가닥 DNA를 고려할 때, 상류는 당해 유전자의 코딩 가닥의 5' 말단 쪽이며 하류는 3' 말단 쪽이다. DNA의 역평행 성질로 인하여, 이것은 주형 가닥의 3' 말단이 유전자의 상류에 있고 5' 말단이 하류에 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 AoHV-1 프로모터는 바람직하게는 TATA 박스 서열, 예컨대 서열 번호 25에서 위치 251 내지 258에 위치하는 서열을 포함한다. 본원에서 정의된 바와 같이 "TATA 박스"는 TATA 결합 단백질(TBP)이 결합할 수 있고 콘센서스 서열 TATAWAWR(여기서, W는 A 또는 T이며, R은 A 또는 G임)을 갖는 DNA 서열이다. 이것은 대개 전사 개시 부위의 약 25~35 bp 상류에 위치한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 TATA 박스 서열 TATATAAG(서열 번호 25에서 위치 251~258)를 포함한다. 당업자라면 AoHV-1 프로모터의 상기 TATA 박스 서열(즉, TATATAAG)이, 프로모터 활성의 예상되는 유의한 감소 없이, 유사한 표준 TATA 박스 서열, 즉, 콘센서스 서열 TATAWAWR(여기서, W는 A 또는 T이며, R은 A 또는 G임)에 상응하는 것으로 대체될 수 있음을 알 것이다.
본 발명에 따른 AoHV-1 프로모터는 또한 (추정) 개시 요소(Inr), 예컨대 서열 번호 25에서 위치 280 내지 286에 위치하는 것(서열: CCATTCG)을 포함할 수 있다. Inr이 존재하는 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터의 상기 Inr 서열(즉, CCATTCG)을, 대체로 Inr 서열 YYANWYY(여기서, Y는 C 또는 T이며; N은 A, C, G, 또는 T이고; W는 A 또는 T임)을 고수하는 또 다른 서열로 대체하는 것은 상기 프로모터의 활성에 유의하게 영향을 줄 것으로는 예상되지 않는다.
추정 Inr이 존재하는 특정 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25에서 대략 nt 286까지의 서열뿐만 아니라 위치 251~258에 상응하는 TATA 박스도 포함한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명의 AoHV-1 프로모터의 특정 실시 형태에 있어서 TATA 박스 및 Inr 둘 다를 포함하는 것이 유익할 수 있으며, 여기서, Inr 서열은 TATA 박스의 제1 nt에서 약 25~40, 예를 들어 약 29~36 nt 하류에 위치한다.
또한, Inr이 존재하지 않는 실시 형태에서, TATA 박스의 적어도 약 25~35 bp 하류 및 관심의 대상이 되는 작동되게 연결된 유전자의 코딩 서열의 상류를 포함하는 것이 바람직하다. 본 출원은 TATA 박스의 제1 nt에서 약 29~35 nt 하류의 천연 위치의 콘센서스 Inr 서열을 더 이상 포함하지 않는 AoHV-1 프로모터의 적어도 하나의 예를 포함하지만, 이러한 프로모터는 여전히 활성을 가지며, 이는 상기 위치의 Inr 서열이 기능성 프로모터에 필수적이지 않음을 보여주는 것이다.
본 발명에 따른 AoHV-1 프로모터는 본원에서 프로모터 활성을 갖고 서열 번호 25의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 또는 350개 뉴클레오티드의 단편에 대하여 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 서열을 포함하는 서열로 정의된다. 바람직하게는, 상기 단편은 서열 번호 25의 nt 237~286에 대하여 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 적어도 50개 nt의 단편을 포함하며, 바람직하게는 상기 적어도 50개 nt는 서열 번호 25에서 대략 nt 251~258에 상응하는 위치의 서열 TATAWAWR(TATA 박스 콘센서스 서열)을 포함한다.
그에 따른 바람직한 특정 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 nt 237~286에 대하여 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 발명의 AoHV-1 프로모터의 3' 절두부는 서열 번호 25에서 대략 nt 286 하류(즉, 이 서열에서 뉴클레오티드 282에서 존재할 것으로 예상되는 예상 전사 개시 부위를 포함하는 추정 Inr의 하류)에서, 프로모터 활성에 강한 영향을 주지 않고서 만들어질 가능성이 있을 수 있으며, 반면에, 추정 Inr/전사 개시 부위가 제거되거나, 또는 특히, 상기 추정 Inr/전사 개시 부위 및 상기 TATA 박스 둘 다가 제거된 더 큰 3' 절두부는 프로모터 활성의 유의한 감소로 이어질 것으로 예상된다. 실제로, 3' 절두 버전의 AoHV-1 short 프로모터 (서열 번호 30)(이는 뉴클레오티드 399의 하류의 AoHV-1 서열을 포함하지 않음(즉, 추정 Inr의 하류의 단지 1개 AoHV-1 뉴클레오티드를 포함함, 이때 서열 번호 30을 참조하며, 이는 서열 번호 25에서 뉴클레오티드 287에 상응함))는 프로모터로서 여전히 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
TATA 박스 상류에 단지 120개 뉴클레오티드를 포함하는 상대적으로 짧은 프로모터 단편(서열 번호 26)이 여전히 유의한 프로모터 활성을 가짐이 본원에서 입증되는데, 상기 프로모터 활성은 약간의 추가의 상류 서열을 부가함으로써 약간 더 증가될 수 있다(예를 들어 서열 번호 25에서와 같이). 이와는 대조적으로, (예를 들어 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29에서와 같이) 특정한 추가의 하류 서열의 포함에 의한 3' 말단(즉, 추정 Inr/전사 개시 부위의 하류)에서의 AoHV-1 short 프로모터 (서열 번호 30)의 연장은 많은 활성을 더하는 것으로 보이지 않는다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 201 내지 286과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 단편을 포함한다.
더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 187 내지 286과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 단편을 포함한다.
더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 137 내지 286과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 단편을 포함한다.
더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 131 내지 286과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 단편을 포함한다.
더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 87 내지 286과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 단편을 포함한다.
더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 37 내지 286과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 단편을 포함한다.
더 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 1 내지 286과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 단편을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 바람직하게는 서열 번호 26의 적어도 200개 뉴클레오티드(또한 바람직하게는 적어도 Inr 및 이의 상류 서열(TATA 박스 및 더 상류의 서열을 포함함), 예를 들어 서열 번호 25의 적어도 대략 nt 87~286을 포함함)에 대하여 적어도 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하며,더 바람직하게는 서열 번호 26에 대하여 적어도 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호 25에 대하여 적어도 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터는 서열 번호 32의 단편과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 240 내지 1500개 뉴클레오티드, 바람직하게는 240 내지 1000개 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 240 내지 500개 뉴클레오티드의 단편을 포함하며, 여기서, 서열 번호 32의 상기 단편은 서열 번호 25의 뉴클레오티드 201 내지 286(이는 서열 번호 32의 뉴클레오티드 1359 내지 1444에 상응함)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 100% 동일한 단편을 포함한다.
본 발명은 상대적으로 작은 크기를 갖는(이는 트랜스진들을 지닌 벡터의 크기 제한의 맥락에서 매우 유리할 수 있음; 즉, 더 큰 트랜스진들이 수용될 수 있고/있거나 벡터들이 더 안정하게 남아 있을 수 있음) 강력한 AoHV-1 프로모터를 제공한다. 따라서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 바람직하게는 길이가 2000개 뉴클레오티드(2kb) 미만, 바람직하게는 1 kb 미만, 더 바람직하게는 0.8 kb 미만이다. 바람직한 특정 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터는길이가 700개 뉴클레오티드 미만, 650개 뉴클레오티드 미만, 600개 뉴클레오티드 미만, 550개 뉴클레오티드 미만, 500개 뉴클레오티드 미만이다. 바람직한 특정 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터는 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 240개 뉴클레오티드, 적어도 250개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 350개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드이다. 바람직한 특정 실시 형태에서 AoHV-1 프로모터는 길이가 200 내지 500개 뉴클레오티드, 예를 들어 240 내지 485개 뉴클레오티드이다. 본원에 나타낸 바와 같이, 이러한 신규 AoHV-1 프로모터는 상대적으로 짧은 서열을 가짐에도 불구하고, 놀랍게도, 트랜스진(이것에 상기 프로모터가 작동가능하게 연결됨)의 강력한 발현을 유도할 수 있었다.
당업자라면 일상적인 방법에 의해 돌연변이가 제공 서열 내에 만들어질 수 있고 생성된 프로모터가 프로모터 활성에 대하여 테스트될 수 있음을 인식할 것이다. 또한 서열의 변이체가 자연에서, 예를 들어 상이한 바이러스 단리체들에서 존재할 수 있으며, 따라서 이러한 변이체는 뉴클레오티드 서열이 약간 상이할 수 있지만 동일한 기능성을 유지한다. 전형적으로, 표시된 프로모터 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열은 여전히 기능적 활성을 가질 것이며 따라서 AoHV-1 프로모터로 간주될 것이다. 따라서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 바람직하게는 본원에 제공된 바람직한 AoHV-1 프로모터 서열, 예컨대 서열 번호 1, 30, 25, 또는 26 중 어느 하나에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 서열을 포함한다. 또한 당업자라면 제공된 프로모터 서열의 상이한 부분의 서열의 길이를 어느 정도까지 변화시킬 수 있고 본질적으로 유사한 결과를 수득할 수 있음을 알 것이다. 본원에 예시된 프로모터 서열의 단편 또는 돌연변이 서열이 여전히 프로모터 활성을 갖는지를 테스트하는 것은 본원에 개시된 정보를 이용하여 당업자에 의해 과도한 부담 없이 수행될 수 있다.
본 발명의 AoHV-1 프로모터의 바람직한 실시 형태는 서열 번호 26을 포함하는 AoHV-1 프로모터이다. 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 바람직하게는 서열 번호 26의 서열 또는 적어도 50, 100, 150, 또는 200개 뉴클레오티드의 이의 단편에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는다. 바람직한 특정 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터는 서열 번호 26의 서열 또는 적어도 50, 100, 150, 또는 200개 뉴클레오티드의 이의 단편과 100% 동일하다.
추가의 바람직한 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 서열을 포함하는 AoHV-1 프로모터이다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 바람직하게는 서열 번호 25의 서열에 대하여, 또는 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 또는 350개 뉴클레오티드의 이의 단편에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일하다. 바람직한 특정 실시 형태에서 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 서열과, 또는 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 또는 350개 뉴클레오티드의 이의 단편과 100% 동일하다.
추가 실시 형태에서, 바람직한 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 1 또는 서열 번호 30의 서열을 포함하는 AoHV-1 short 프로모터이다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 바람직하게는 서열 번호 1의 서열에 대하여, 또는 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 뉴클레오티드의 이의 단편에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는다. 바람직한 특정 실시 형태에서 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 1의 서열과 100% 동일하거나 서열 번호 30의 서열과 100% 동일하거나, 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 뉴클레오티드의 이들 서열 중 하나의 단편과 100% 동일하다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 22의 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 23의 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 27의 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 28의 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 29의 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖거나 100% 동일한 서열을 포함한다.
특정한 다른 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 전사를 조정하도록 하나 이상의 오퍼레이터 서열 및/또는 인핸서 서열, 예를 들어, tetO 서열, 큐메이트 오페론 유래의 오퍼레이터 서열, SV40 또는 hCMV와 같은 자연 발생 인핸서-프로모터 쌍 유래의 인핸서(Foecking & Hofstetter, 1986), 합성 인핸서(Schlabach, Hu, Li, & Elledge, 2010), 또는 당업자에게 잘 알려진 기타 조절 서열과 작동가능하게 연결된 코어 프로모터(서열 번호 31)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "코어 프로모터"라는 용어는 혼자서는 매우 낮은 프로모터 활성을 갖지만 코어 프로모터로부터의 전사를 조정하기 위하여 하나 이상의 조절 서열, 예를 들어 테트라사이클린-제어 트랜스활성자 단백질(tTA)이 결합할 수 있는 tetO 서열과 조합될 경우 트랜스진의 강력한 발현을 구동시킬 수 있는 프로모터의 최소 기능 단위를 의미하고자 한다. 코어 프로모터 서열에 대한 논의에 대해서는 예를 들어 (Smale, 2001)를 참조한다.
AoHV-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스진은 강력하게 발현될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "강력하게 발현되는" 또는 "강력한 발현"은 예를 들어 웨스턴 블롯, FACS 분석, 또는 발광 또는 형광을 이용한 다른 분석법과 같은 상이한 단백질 검출 기술들 중 하나에 의해 측정할 경우 AoHV-1 프로모터로부터의 발현이 hCMV 프로모터(서열 번호 4를 가짐)로부터의 발현의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 바람직하게는 약 100%이거나, 이보다 더 크다는 것을 의미한다. hCMV 프로모터는 다른 일반적으로 사용되는 프로모터, 예컨대 hPGK, UBI C 또는 RSV LTR 프로모터와 비교하여 훨씬 더 강하다는 점을 주목한다(Prowell, Rivera-Soto, & Gray, 2015). hCMV 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스의 주요 급초기(mIE) 영역으로부터 유래되며, 백신 및 유전자 요법용 벡터에서의 강력한 유전자 발현에 빈번하게 사용된다. 예를 들어, hCMV 프로모터 서열은 hCMV AD169 주의 mIE 유전자좌(X03922)로부터 유래될 수 있으며, NF1 결합 부위, 인핸서 영역, TATA 박스 및 제1 엑손의 일부를 포함할 수 있다. 더 짧을 수 있거나(예를 들어, 단지 인핸서 및 프로모터 영역을 포함하고 NF1 결합 부위는 결여됨) 더 길 수 있는(예를 들어 추가의 세포 인자 결합 부위 및 제1 인트론 서열을 포함함) 다른 hCMV 프로모터 서열이 공지되어 있다. 길이가 상이한 이러한 hCMV 프로모터들은 모두 강력한 편재적 활성 프로모터인 것으로 밝혀졌다. 절두형 hCMV 프로모터의 예는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,407,801호에 개시되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "hCMV 프로모터"는 서열 번호 4의 nt 578~736에 대하여, 바람직하게는 nt 564~736에 대하여 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 서열 번호 4의 nt 578~736의 단편은 본 발명자의 실험실에서의 실험에서 프로모터 활성을 갖는 것으로 밝혀졌으며(예시되어 있지 않음), 서열 번호 4의 nt 564~736에 대하여 약간의 미스매치를 갖는 서열은 다른 이들에 의하면 양호한 발현 수준을 제공하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어 미국 특허 제7,407,801 B2호, 그 안의 서열 번호 1). 특정 실시 형태에서, hCMV 프로모터는 서열 번호 4에 대하여 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이 발현 수준의 비교를 위하여, hCMV 프로모터 서열은 서열 번호 4의 서열이었다. 예를 들어, 바람직하게는 벡터 내의 본 발명의 AoHV-1 프로모터로부터의 발현 수준은 트랜스진이 서열 번호 4의 hCMV 프로모터의 제어 하에 있는 벡터로부터의 발현 수준의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 바람직하게는 약 100%이거나, 이보다 더 크다. 더욱이, 발현이 유의한 T-세포 및 B-세포 면역 반응을 생성하기에 충분함이 hCMV 프로모터의 제어 하에 항원을 발현하는 rAd로부터 공지되어 있다. 이와 유사하게, rAd 유래의 본 발명의 AoHV-1 프로모터에 의해 발현되는 트랜스진의 발현은 트랜스진에 대한 유의한 T-세포 및 B-세포 면역 반응을 생성할 것으로 예상된다. 예를 들어, 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 야기하는 항원을 트랜스진이 코딩할 경우, 트랜스진의 강력한 발현은 항원에 대하여 측정가능한 면역 반응을 생성할 것으로 예상된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 수치에 대하여 '약'이라는 용어는 수치 ± 10%를 의미한다.
"코딩 서열", "~을 코딩하는 서열" 또는 "~을 코딩하는"이라는 용어들은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있을 때 시험관 내에서 또는 생체 내에서 폴리펩티드로 전사(DNA) 및 번역되는(mRNA) 핵산 서열을 지칭한다.
폴리아데닐화 신호, 예를 들어 소 성장 호르몬 폴리A 신호(미국 특허 제5,122,458호) 또는 SV40 폴리A 신호가 트랜스진 뒤에 존재할 수 있다.
추가의 조절 서열이 본 발명의 AoHV-1 프로모터를 포함하는 구축물에 또한 부가될 수 있다. "조절 서열"이라는 용어는 본원에서 "조절 요소"와 상호교환가능하게 사용되고, 핵산 (그러나 전형적으로 DNA에 한정되는 것은 아님)의 절편으로서 그 핵산 서열(상기 핵산 서열에 상기 절편이 작동되게 연결됨)의 전사를 조절하고 그에 따라 전사 조절자로서 작용하는 절편을 나타낸다. 이러한 발현 조절은, 단백질의 발현이 숙주 세포에 유독한 경우, 예를 들어 발현이 숙주 세포에 치명적이거나 세포 성장에 부정적으로 영향을 주고/주거나 단백질 생성을 감소시키거나 없애는 경우에 특히 유용할 수 있다. 더욱이, 발현 조절은 발현이 벡터 불안정성을 야기하거나 발현 타이밍이 시험관 내에서 또는 생체 내에서 행해지는 실험의 고려 사항일 경우에 또한 유용할 수 있다. 조절 서열은 종종 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 단백질 및/또는 전사 인자의 핵산-결합 도메인에 의해 인식되는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 조절 서열은 테트라사이클린 리프레서 단백질(tetR)의 존재 하에 발현이 억제되도록 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 등)의 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(tetO 부위)을 포함할 수 있다(예를 들어 국제 공개 제1999/000510 A1호 참조). 단일 tetO 서열의 예로는 CCCTATCAGTGATAGAG(서열 번호 14)가 있다. 테트라사이클린의 부재 하에 tetR 단백질은 tetO 부위에 결합하여 tetO 부위에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 억제하는 것이 가능하다. 그러나, 테트라사이클린의 존재 하에서는, tetR 단백질에서의 형태 변화가 오퍼레이터 서열에의 상기 tetR 단백질의 결합을 방지하여, 작동가능하게 연결된 유전자의 전사가 일어나게 한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 벡터 또는 rAd는 tetR 단백질이 발현되는 생산자 세포주에서 생성되는 벡터에서의 하나 이상의 트랜스진의 발현이 저해되도록 하나 이상의 tetO 부위가 AoHV-1 프로모터에 작동되게 연결된 것을 선택적으로 포함할 수 있다. 후속적으로, 발현은 벡터가 tetR 단백질을 발현하지 않는 대상체 또는 세포 내로 도입되는 경우 저해되지 않는다(예를 들어, 국제 공개 제07/073513호 참조). 특정한 다른 실시 형태에서, 본 발명의 벡터는 큐메이트 유전자-스위치 시스템을 선택적으로 포함할 수 있으며, 여기서, 발현의 조절은, 예를 들어 오퍼레이터 부위(CuO)를 프로모터의 전사 개시 부위에 가깝게 위치시킴으로써 작동가능하게 연결된 오퍼레이터 부위(CuO)에의 리프레서(CymR)의 결합에 의해 매개된다(예를 들어, (Mullick et al., 2006) 참조). 다른 실시 형태에서, 잘 알려진 lac 리프레서 시스템은 본 발명의 프로모터와 조합되며, 여기서, lac 리프레서 단백질의 결합이 발현 조절에 사용될 수 있도록, 하나 이상의 lac 오퍼레이터 부위가 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "리프레서"라는 용어는 재조합 발현 벡터의 이종 단백질 산물의 생성을 저해, 방해, 지연 및/또는 억제하는 능력을 갖는 실체(예를 들어, 단백질 또는 기타 분자)를 지칭한다. 예를 들어, 이는 발현 카세트에서와 같이, 발현 벡터를 따라 적절한 위치에서 결합 부위를 방해함에 의한 것이다. 리프레서의 예는 tetR, CymR, lac 리프레서, trp 리프레서, gal 리프레서, 람다 리프레서, 및 본 기술 분야에 알려진 다른 적절한 리프레서를 포함한다.
"작동가능하게 연결된" 또는 "작동되게 연결된"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 핵산 서열들과 뉴클레오티드의 조절 서열들, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리프레서 서열, 전사 및 번역 종결 부위, 및 기타 신호 서열과의 기능적 관계를 지칭하고, 둘 이상의 DNA 절편이 함께 연결되어서 이들이 그의 의도된 목적을 위하여 협력하여 기능함을 나타낸다. 예를 들어, 조절 서열 또는 프로모터 영역에의 핵산 서열들, 전형적으로 DNA의 작동적 연결은 상기 DNA와 조절 서열 또는 프로모터 사이의 물리적이고 기능적인 관계를 지칭하여서 그러한 DNA의 전사는 특이적으로 상기 DNA를 인식하고, 이에 결합하고 이를 전사시키는 RNA 폴리머라아제에 의해 조절 서열 또는 프로모터로부터 개시되게 한다. 발현 및/또는 시험관 내 전사의 최적화를 위하여, 핵산 또는 DNA의 발현을 위한 조절 서열을 상기 핵산 또는 DNA가 발현되는 세포 유형에서 변형시키는 것이 가능할 수 있다. 그러한 변형의 바람직함 또는 필요성은 경험적으로 결정될 수 있다.
또한 본 발명은 세포에서의 트랜스진의 발현 방법을 제공하며, 본 방법은 본 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스, 예를 들어 재조합 아데노바이러스를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 재조합 아데노바이러스를 포함하는 세포의 제공은 대상체에게 아데노바이러스를 투여하는 것을 통하여, 또는 시험관 내에서 또는 생체 외에서 아데노바이러스를 세포 내로 도입하는 것(예를 들어 감염)을 통하여 행해질 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 예를 들어 재조합 아데노바이러스를 대상체에게 투여함으로써 세포에서 트랜스진을 발현시키는 데 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 세포에서 트랜스진을 발현시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 관심의 대상이 되는 단백질(예를 들어, 관심의 대상이 되는 단백질은 치료용 단백질 또는 항원임)과 같은 발현 생성물을 코딩하는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스, 예를 들어 재조합 아데노바이러스를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 이는 대상체에게 벡터, 예를 들어 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 투여하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은 항원에 대한 면역 반응의 유도에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 벡터 또는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 AoHV-1 프로모터는 예를 들어, 백신 응용에서 항원에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여 이 항원의 발현을 구동시키는 데 사용될 수 있다. 트랜스진의 아이덴티티는 본 발명에 중요하지 않은데, 이는 예를 들어 임의의 트랜스진을 포함하는 벡터 또는 아데노바이러스에 적합하다. 적합한 트랜스진은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 트랜스진 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 치료 효과를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 유전자 요법 목적을 위한 것임), 또는 면역 반응이 요망되는 폴리펩티드(벡터, 예를 들어 rAd 벡터가 백신 접종 목적으로 사용될 때)를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 이종 핵산들은 항원성 결정부위들(이에 대하여 면역 반응이 일어날 필요가 있음)을 코딩하는 관심의 대상이 되는 유전자들이다. 그러한 항원성 결정부위도 전형적으로 항원으로 지칭된다. 재조합 벡터가 대상체에게 투여될 때, 면역 반응이 항원(들)에 대하여 일어날 것이다. 임의의 원하는 항원이 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명에 따른 전형적인 실시 형태에서, 항원들은 질환 또는 병태를 야기할 수 있는 유기체 유래의 펩티드들, 폴리펩티드들 또는 단백질들이다. 그러므로, 추가의 바람직한 실시 형태에서, 상기 관심의 대상이 되는 이종 핵산은 면역원성(또는 항원성) 결정부위를 코딩한다. 더 바람직하게는, 상기 면역원성 결정부위는 박테리아, 바이러스, 효모 또는 기생충 유래의 항원이다. 그러한 유기체들에 의해 야기된 질환들은 일반적으로 '감염성 질환'으로 지칭된다(그리고 그에 따라, 숙주를 '감염시키는' 유기체들에 한정되지 않고, 숙주에 들어와서 질환을 야기하는 것들도 포함한다). 소위 '자기-항원', 예를 들어, 종양 항원이 또한 선행 기술의 일부를 형성하며, 본 발명에 따른 재조합 벡터에서의 이종 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 항원성 결정부위들(또는 항원들)이 취해지는 비제한적 예로는 플라스모듐팔시파룸(Plasmodium falciparum)과 같은 말라리아-유발 유기체들, 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 결핵-유발 유기체, 효모들 또는 바이러스들이 있다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 플라비바이러스들(예를 들어, 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus), C형 간염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, 지카 바이러스), 에볼라 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 마르부르크 바이러스(Marburg virus)와 같은 바이러스로부터 유래된 항원들이 본 발명에 따른 조성물들에서 이용될 수 있다. 항원의 예시적인 비제한적 실시 형태로는 피. 팔시파룸 유래의 CS 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 엠. 투베르쿨로시스 유래의 몇몇 항원들의 융합 단백질, 또는 하나의 항원의 단백질, 예컨대 Ag85A, Ag85B 및/또는 TB10.4 단백질 또는 이의 면역원성 부분(들), 바이러스 당단백질 또는 이의 면역원성 부분, 예컨대 에볼라 바이러스 또는 마르부르크 바이러스와 같은 필로바이러스 유래의 GP, HIV 단백질, 예컨대 gag, pol, env, nef, 또는 이들의 변이체, 또는 인플루엔자 바이러스 유래의 HA, NA, M, 또는 NP 단백질, 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 부분, 또는 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 항원, 예를 들어 RSV F 단백질 또는 RSV G 단백질, 또는 이들 둘 다, 또는 기타 RSV 단백질, 인간 파필로마바이러스 또는 기타 바이러스 항원 등이 있다. 재조합 벡터, 예를 들어 rAd는 하나의 항원을 코딩할 수 있지만, 또한 선택적으로, 동일 유기체 유래의 2가지 상이한 항원을 코딩하거나 선택적으로, 상이한 유기체 유래의 항원들의 조합, 예를 들어 제1 유기체 유래의 제1 항원 및 제2 유기체 유래의 제2 항원을 코딩할 수 있다. 이것은 항원 및 예를 들어 아쥬반트(동일 벡터, 예컨대 rAd 벡터 내), 예를 들어 항원 및 Toll-유사-수용체(TLR) 작용제, 예컨대 TLR3 작용제, 예컨대 dsRNA 또는 이의 모방체 등을 코딩하는 것이 또한 가능하다(예를 들어 국제 공개 제2007/100908호). 특정 실시 형태에서, 재조합 벡터, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 2가지의 상이한 항원(하나는 AoHV-1 프로모터의 제어 하에 있고 하나는 상이한 프로모터, 예를 들어, hCMV 프로모터의 제어 하에 있음)을 코딩한다. 다른 실시 형태에서, 벡터 또는 재조합 바이러스는 항원 및 면역 조절자를 코딩하는데, 이들 중 하나는 AoHV-1 프로모터의 제어 하에 있고 다른 하나는 상이한 프로모터, 예를 들어, hCMV 프로모터의 제어 하에 있다. 특정 실시 형태에서, AoHV-1 프로모터의 제어 하에 있는 트랜스진 외에, 추가의 이종 서열 또는 트랜스진이 벡터 또는 재조합 바이러스에 존재할 수 있다.
또한 본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 본 발명의 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 또한 본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 게놈을 제공한다. 당업자라면 이것이 또한 본 발명의 단일 재조합 DNA 분자를 함께 형성할 수 있는 적어도 2가지의 상이한 재조합 DNA 분자들의 조합일 수 있음을 알 것이다. 그러한 분자는 게놈의 조작 및 신규 재조합 아데노바이러스의 생성에 유용하다. 게놈은 허용(permissive) 세포에서의 아데노바이러스의 복제 및 패키징에 요구되는 단백질을 코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 재조합 아데노바이러스에 있어서의 '재조합'이라는 용어는 이것이 야생형 아데노바이러스와는 대조적으로 사람 손에 의해 변형되었음을, 예를 들어 이것이 이종 유전자, 유전자들, 또는 이들의 부분 및 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함함을 내포한다.
아데노바이러스 벡터, 이의 구축 방법 및 이의 증식 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,559,099호, 제5,837,511호, 제5,846,782호, 제5,851,806호, 제5,994,106호, 제5,994,128호, 제5,965,541호, 제5,981,225호, 제6,040,174호, 제6,020,191호, 제6,113,913호 및 제8,932,607호, 및 Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", 각각 Virology의 67장 및 68장, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), 및 여기에 언급된 다른 참고문헌에 기술되어 있다. 전형적으로, 아데노바이러스 벡터의 구축은 본 기술 분야에 잘 알려진 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 예를 들어 Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), 및 여기에 언급된 다른 참고문헌에 기술된 것의 사용을 포함한다.
본 발명에 따른 아데노바이러스는 아데노바이러스 과(family of the Adenoviridae)에 속하고, 바람직하게는 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus) 속에 속하는 것이다. 이는 인간 아데노바이러스뿐만 아니라, 소 아데노바이러스(예를 들어, 소 아데노바이러스 3, BAdV3), 개 아데노바이러스(예를 들어, CAdV2), 돼지 아데노바이러스(예를 들어, PAdV3 또는 5), 또는 유인원 아데노바이러스(이는 원숭이 아데노바이러스 및 영장류 아데노바이러스, 예컨대 침팬지 아데노바이러스 또는 고릴라 아데노바이러스를 포함함)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 종들을 감염시키는 아데노바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스(HAdV, 또는 AdHu; 본 발명에서, 인간 아데노바이러스는 종의 표시 없이 Ad로 지칭되는 경우를 의미하고, 예를 들어, "Ad5"라는 간결한 표기는 인간 아데노바이러스 혈청형 5인 HAdV5와 동일한 것을 의미함) 또는 유인원 아데노바이러스, 예컨대 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스(ChAd, AdCh, 또는 SAdV), 또는 레수스 원숭이 아데노바이러스(RhAd)이다.
대부분의 진보된 연구들이 인간 아데노바이러스들을 이용함으로써 수행되었으며, 본 발명의 특정한 양태들에 따르면 인간 아데노바이러스들이 바람직하다. 바람직한 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스를 기반으로 한다. 바람직한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 또는 50을 기반으로 한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시 형태에 따르면, 아데노바이러스는 혈청형 26 및 35 중 하나의 인간 아데노바이러스이다. 이러한 혈청형들의 장점은 인간 집단에서 낮은 혈청 양성률 및/또는 낮은 기존 중화 항체 역가이다. rAd26 벡터의 제조는 예를 들어 국제 공개 제2007/104792호 및 (Abbink et al., 2007)에 기술되어 있다. Ad26의 예시적인 게놈 서열은 GenBank 등록 번호 EF 153474 및 국제 공개 제2007/104792호의 서열 번호 1에서 발견된다. rAd35 벡터의 제조는 예를 들어 미국 특허 제7,270,811호, 국제 공개 제00/70071호, 및 (Vogels et al., 2003)에 기술되어 있다. Ad35의 예시적 게놈 서열은 GenBank 등록 AC_000019 및 국제 공개 제00/70071호의 도 6에서 발견된다.
대부분의 상기 인간 및 비-인간 아데노바이러스의 서열은 알려져 있으며, 기타의 것에 대한 서열은 일상적인 절차를 이용하여 획득될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 복제-적격성(replication-competent) 또는 복제-결함성(replication-deficient)일 수 있다.
특정 실시 형태에서 아데노바이러스는, 예를 들어 게놈의 E1 영역에서의 결실을 포함하기 때문에, 복제 결함성이다. "E1 영역에서의 결실"은 야생형 아데노바이러스와 비교할 경우 이 영역에서의 결실을 의미하며, E1A, E1B 55K 또는 E1B 21K 코딩 영역 중 적어도 하나에서의 결실, 바람직하게는 E1A, E1B 55K 및 E1B21K 코딩 영역의 결실을 의미한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 아데노바이러스 게놈으로부터의 필수 영역의 결실의 경우, 이들 영역에 의해 코딩되는 기능은 트랜스로(in trans), 바람직하게는 생산자 세포에 의해 제공되어야 하며, 즉, E1, E2 및/또는 E4 영역의 일부 또는 전체가 아데노바이러스로부터 결실될 때, 이들은 생산자 세포에 존재해야 하거나, 예를 들어 이의 게놈에 통합되어야 하거나, 또는 소위 헬퍼 아데노바이러스 또는 헬퍼 플라스미드의 형태로 존재하여야 한다. 아데노바이러스는 또한 복제에 불필요한 E3 영역에서의 결실을 가질 수 있고, 따라서 이러한 결실은 보완될 필요가 없다.
사용될 수 있는 생산자 세포(때때로 당해 분야 및 본원에서 '패키징 세포(packaging cell)' 또는 '보완 세포(complementing cell)'로 지칭되기도 함)는 요망되는 아데노바이러스가 증식될 수 있는 임의의 생산자 세포일 수 있다. 예를 들어, 재조합 아데노바이러스 벡터의 증식은 아데노바이러스에서의 결함을 보완하는 생산자 세포에서 행해진다. 이러한 생산자 세포는 바람직하게는 이들의 게놈에 적어도 아데노바이러스 E1 서열을 갖고, 이에 의해 E1 영역에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스를 보완할 수 있다. 임의의 E1-보완 생산자 세포, 예컨대 E1에 의해 불멸화된 인간 망막 세포, 예를 들어 911 또는 PER.C6 세포(예를 들어, 미국 특허 제5,994,128호 참조), E1-형질전환된 양수세포(예를 들어, 유럽 특허 제1230354호 참조), E1-형질전환된 A549 세포(예를 들어 국제 공개 제98/39411호, 미국 특허 제5,891,690호 참조), GH329:HeLa 세포(Gao, Engdahl, & Wilson, 2000), 293 세포 등이 이용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 생산자 세포는, 예를 들어 HEK293 세포, 또는 PER.C6 세포, 또는 911 세포, 또는 IT293SF 세포 등이다.
아데노바이러스에 더하여, 당업자라면 다른 바이러스도 본 발명의 AoHV-1 프로모터를 사용하는 바이러스 벡터로서 사용하기에 적합함을 인식할 것이다. 예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV), 단순 포진 바이러스(HSV), 파라믹소바이러스, 예컨대 홍역 바이러스, 알파바이러스, EBNA 바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스 및 렌티바이러스 등도 본 발명의 AoHV-1 프로모터를 포함하도록 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어 (Heilbronn & Weger, 2010; Robbins & Ghivizzani, 1998; Walther & Stein, 2000)에 논의된 바와 같이 상이한 벡터들에 관한 개관을 참조한다.
인간에게의 투여를 위하여, 예를 들어 벡터, 재조합 바이러스, 또는 본 발명의 방법을 사용하여 발현된 재조합 단백질, 예를 들어 rAd 또는 본 발명의 AoHV-1 프로모터를 사용하여 발현된 재조합 단백질, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 이용할 수 있다. 본 맥락에서, 용어 "제약상 허용가능한"이라는 용어는 담체 또는 부형제가, 이용되는 투여량 및 농도에서, 투여받은 대상체에서 원치 않는 효과 또는 해로운 효과를 야기하지 않음을 의미한다. 이러한 제약상 허용가능한 담체 및 부형제는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000] 참조). 정제된 벡터, 예를 들어 rAd, 또는 단백질은 바람직하게는 살균 용액으로 제형화되어 투여되지만 동결건조된 제제를 이용하는 것이 또한 가능하다. 살균 용액은 살균 여과에 의해 또는 본 기술 분야에서 그 자체가 공지된 다른 방법에 의해 제조된다. 그 후, 상기 용액은 동결건조되거나 약제 투약 용기에 채워진다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5, 예를 들어 pH 5.0 내지 7.5의 범위이다. 전형적으로 벡터 또는 rAd 또는 단백질은 적합한 완충제를 갖는 용액 형태로 존재하며, 용액은 또한 염을 함유할 수 있다. 선택적으로 알부민과 같은 안정화제가 존재할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 세제가 첨가된다. 특정 실시 형태에서, 벡터, rAd 또는 단백질은 주사가능한 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 유효량의 제약 성분, 예를 들어 벡터, rAd, 또는 단백질을 함유하며, 살균 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조된 버전 중 어느 하나이고, 선택적으로 안정화제 또는 부형제를 함유한다. 제약 제제는 상이한 투여 경로용으로, 예를 들어, 근육내 또는 피내 주사, 흡입, 정맥내 투여, 경구 투여 등을 위하여 제조될 수 있다.
아데노바이러스 제형의 예로는 다음의 아데노바이러스 세계 표준(Hoganson et al., 2002)이 있다:20 mM 트리스(pH 8), 25 mM NaCl, 2.5% 글리세롤; 또는 20 mM 트리스, 2 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 수크로스(10%(w/v)), 폴리소르베이트-80(0.02%(w/v)); 또는 10~25 mM 시트레이트 완충제(pH 5.9~6.2), 4~6%(w/w) 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린(HBCD), 70~100 mM NaCl, 0.018~0.035%(w/w) 폴리소르베이트-80, 및 선택적으로 0.3~0.45%(w/w) 에탄올. 명백하게, 많은 다른 완충제가 사용될 수 있고, 정제된 제약 제제의 보관 및 약제 투여를 위한 적합한 제형의 몇 가지 예가 알려져 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 벡터 또는 재조합 바이러스, 예를 들어, rAd를 포함하는 조성물은 하나 이상의 아쥬반트를 추가로 포함한다. 적용된 항원성 결정부위에 대한 면역 반응을 더 증가시키는 아쥬반트가 본 기술 분야에 알려져 있으며, 아데노바이러스 및 적합한 아쥬반트를 포함하는 제약 조성물들은 예를 들어, 본원에 참고로 포함되어 있는 국제 공개 제2007/110409호에 개시되어 있다. 용어 "아쥬반트" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 면역계의 자극을 야기하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이와 관련하여, 아쥬반트는 본 발명의 아데노바이러스 벡터들에 대한 면역 반응을 향상시키는 데 이용된다. 적합한 아쥬반트의 예는 수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염; MF59(예를 들어, 국제 공개 제90/14837호 참조)와 같은 스쿠알렌-물 에멀젼을 비롯한 오일-에멀젼 조성물(또는 수중유 조성물); 예를 들어 QS21 및 면역 자극 복합체(ISCOMS)(예를 들어, 미국 특허 제5,057,540호; 및 국제 공개 제90/03184호, 국제 공개 제96/11711호, 국제 공개 제2004/004762호, 국제 공개 제2005/002620호 참조)와 같은 사포닌 제형; 박테리아 또는 미생물 유도체(이의 예로는 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3-O-탈아실화 MPL(3dMPL), CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, ADP-리보실화 박테리아 독소 또는 이의 돌연변이체, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 열 불안정성 장독소 LT, 콜레라 독소 CT 등이 있음)를 포함한다. 예를 들어 관심의 대상이 되는 항원에의 C4-결합 단백질(C4bp)의 올리고머화 도메인의 융합물을 코딩하는 이종 핵산(Ogun, Dumon-Seignovert, Marchand, Holder, & Hill, 2008), 또는 dsRNA와 같은 TLR3 작용제와 같은 toll-유사 수용체(TLR) 작용제를 코딩하는 이종 핵산(예를 들어 국제 공개 제2007/100908호 참조), 또는 면역자극 사이토카인, 예를 들어 인터류킨, 예를 들어 Il-12(예를 들어 미국 특허 제5,723,127호 참조)를 코딩하는 이종 핵산 등을 이용함으로써 벡터-코딩된 아쥬반트를 이용하는 것이 또한 가능하다.
특정 실시 형태에서 본 발명에 따른 제약 조성물은 백신일 수 있다.
본 발명의 벡터 또는 재조합 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스 조성물의 투여는 표준 투여 경로를 이용하여 수행될 수 있다. 비제한적 실시 형태는 주사, 예를 들어 피내, 근육내 주사 등에 의한 것과 같은 비경구 투여, 또는 피하 또는 경피, 또는 점막 투여, 예를 들어 비강내, 경구 투여 등을 포함한다. 당업자라면 백신에서 항원(들)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 조성물, 예를 들어 백신을 투여하는 다양한 가능성을 알고 있다.
아데노바이러스 조성물들은 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 일 회 투여시 대상체에게 제공된 아데노바이러스의 총 용량은 당업자에게 알려진 바와 같이 변할 수 있으며, 일반적으로 1x107개의 바이러스 입자(vp) 내지 1x1012 vp, 바람직하게는 1x108 vp 내지 1x1011 vp, 예를 들어 3x108 내지 5x1010 vp, 예를 들어 109 내지 3x1010 vp이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체는 바람직하게는 포유류, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스, 또는 비-인간 영장류, 또는 인간이다. 바람직하게는, 대상체는 인간 대상체이다.
하나 이상의 백신의 하나 이상의 추가 투여(booster administration)를 제공하는 것이 또한 가능하다. 추가 백신 접종이 수행되면, 전형적으로, 그러한 추가 백신 접종은 조성물을 대상체에게 최초로 투여(그러한 경우에 있어서, '최초 백신 접종(priming vaccination)'이라고 지칭함)한 이후에 동일한 대상체에게 1주와 1년 사이, 바람직하게는 2주와 4개월 사이의 어느 한 순간에 투여될 것이다. 대안적인 부스팅 요법에서, 상이한 벡터들, 예를 들어 상이한 혈청형의 하나 이상의 아데노바이러스, 또는 다른 벡터, 예컨대 MVA, 또는 DNA, 또는 단백질을 최초 또는 추가 백신 접종으로서 대상체에 투여하는 것이 또한 가능하다.
특허, 공개된 출원, 기술 문헌 및 학술 문헌을 포함할 수 있는 다양한 간행물이 명세서 전체에 걸쳐 괄호 안에 인용되고, 각각의 전체 인용은 본 명세서 끝에서 발견될 수 있다. 이들 인용된 간행물 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
실시 형태
실시 형태 1은 이종 트랜스진에 작동가능하게 연결된 아오틴 헤르페스바이러스 주요 극초기 프로모터(AoHV-1 프로모터)를 포함하는 재조합 핵산 분자이다.
실시 형태 2는 AoHV-1 프로모터 뒤에 다중 클로닝 부위가 오는 것을 포함하는 플라스미드 벡터이다.
실시 형태 3은, AoHV-1 프로모터로부터의 전사를 조정하는 조절 서열에 AoHV-1 프로모터가 작동가능하게 연결된, 실시 형태 1의 재조합 핵산 분자 또는 실시 형태 2의 플라스미드 벡터이다.
실시 형태 4는, 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(tetO 부위)을 포함하는 조절 서열에 AoHV-1 프로모터가 작동가능하게 연결된, 실시 형태 1의 재조합 핵산 분자 또는 실시 형태 2의 플라스미드 벡터이다.
실시 형태 5는 실시 형태 1, 3, 또는 4 중 어느 하나에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스이다.
실시 형태 6은 플라스미드 벡터인 실시 형태 5에 따른 재조합 벡터이다.
실시 형태 7은 아데노바이러스인 실시 형태 5에 따른 재조합 바이러스이다.
실시 형태 8은 게놈 영역에서의 결실을 갖는 실시 형태 7에 따른 재조합 아데노바이러스이다.
실시 형태 9는, 결실이 E1 영역 내에, E3 영역 내에, 또는 E1 영역 및 E3 영역 내에 있는 실시 형태 8의 재조합 아데노바이러스이다.
실시 형태 10은 실시 형태 1, 3 또는 4에 따른 재조합 핵산 분자, 실시 형태 2, 3 또는 4에 따른 플라스미드 벡터, 또는 실시 형태 5 내지 9 중 어느 하나에 따른 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스를 포함하는 세포이다.
실시 형태 11은 게놈 내에 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포이며, 바람직하게는 상기 프로모터는 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다.
실시 형태 12는 다음을 포함하는 세포이다: (i) 제1 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자, 및 (ii) 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 hCMV 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자.
실시 형태 13은 다음을 포함하는 벡터이다: (i) 제1 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자, 및 (ii) 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 hCMV 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자.
실시 형태 14는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 방법이며, 여기서, 트랜스진은 아데노바이러스가 표적 세포를 감염시킨 경우 강력하게 발현되고, 본 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 구축물을 제조하는 단계; 및
b) 상기 구축물을 재조합 아데노바이러스의 게놈 내로 포함시키는 단계.
실시 형태 15는 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 생성하는 방법이며, 본 방법은 AoHV-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 상태의 트랜스진의 분자적 클로닝 단계를 포함한다.
실시 형태 16은 실시 형태 7 내지 9 중 어느 하나에 따른 재조합 아데노바이러스의 게놈을 포함하는 재조합 DNA 분자이다.
실시 형태 17은 실시 형태 11의 세포를 제조하는 방법이며, 이는 AoHV-1 프로모터를 세포 내로 도입하여 AHV-1 프로모터를 게놈 내로 통합시키는 단계를 포함하고, 바람직하게는 상기 프로모터는 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다.
실시 형태 18은 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 생성하는 방법이며, 이는 숙주 세포에서 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 코딩하는 트랜스진을 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서, 트랜스진은 AoHV-1 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시 형태 19는 발현 생성물이 단백질인 실시 형태 18의 방법이다.
실시 형태 20은 관심의 대상이 되는 트랜스진을 발현시키는 방법이며, 이는 숙주 세포에서 실시 형태 1, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나에 따른 재조합 핵산 분자로부터 트랜스진을 발현시키는 단계를 포함한다.
실시 형태 21는 관심의 대상이 되는 트랜스진이 숙주 세포에서 발현되는 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 실시 형태 20의 방법이다.
실시 형태 22는 숙주 세포로부터 또는 숙주 세포가 배양된 배양 배지로부터, 또는 숙주 세포 및 상기 배양 배지 둘 다로부터 관심의 대상이 되는 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 19 또는 21의 방법이다.
실시 형태 24는 바이러스를 생성하는 방법이며, 이는 바이러스를 증식시키는 기능을 갖는 유전자를 발현하는 세포에서 상기 바이러스를 증식시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 유전자는 AoHV-1 프로모터의 제어 하에 있다.
실시 형태 25는 상기 바이러스가 그 자신의 게놈으로부터 상기 유전자를 기능성 형태로 생성하지 않으며, 상기 유전자는 상기 바이러스의 복제에 필수적인 실시 형태 24의 방법이다.
실시 형태 26은 실시 형태 5 내지 9 중 어느 하나에 따른 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
실시 형태 27은 게놈 내의 AoHV-1 프로모터가 테트라사이클린 리프레서(TetR) 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 실시 형태 11에 따른 세포이다.
실시 형태 28은 제1 트랜스진이 TetR을 코딩하는 실시 형태 12에 따른 세포이다.
실시 형태 29는 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 hCMV 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 추가로 포함하는 실시 형태 28에 따른 세포이다.
실시 형태 30은 예를 들어 하나 이상의 tetO 부위에 작동가능하게 연결됨으로써 hCMV 프로모터가 TetR에 의해 조절될 수 있는 실시 형태 29에 따른 세포이다.
실시 형태 31은 세포가 PER.C6 세포인 실시 형태 27, 28, 29, 또는 30에 따른 세포이다.
실시 형태 32는 트랜스진이 TetR을 코딩하는 실시 형태 20에 따른 방법이다.
실시 형태 33은 세포가 PER.C6 세포인 실시 형태 32에 따른 방법이다.
실시 형태 34는 재조합 아데노바이러스를 증식시키는 방법이며, 본 방법은 실시 형태 27, 29, 또는 31에 따른 세포에서 하나 이상의 tetO 부위에 작동가능하게 연결된 hCMV 프로모터의 제어 하에 트랜스진을 코딩하는 재조합 아데노바이러스를 증식시키는 단계, 및 바람직하게는 재조합 아데노바이러스를 단리하는 단계를 포함한다.
실시 형태 35는 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 25의 nt 237~286에 대하여 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 전술한 실시 형태들 중 어느 하나이다.
실시 형태 36은 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 25의 nt 237~286에 대하여 적어도 86%의 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 적어도 96%의 동일성, 바람직하게는 적어도 98%의 동일성, 더 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 전술한 실시 형태들 중 어느 하나이다.
실시 형태 37은 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 25의 nt 131~286에 대하여 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 전술한 실시 형태들 중 어느 하나이다.
실시 형태 38은 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 31의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 전술한 실시 형태들 중 어느 하나이다.
실시 형태 39는 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 32의 240 내지 1500개 뉴클레오티드, 바람직하게는 240 내지 1000개 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 240 내지 500개 뉴클레오티드를 포함하는 전술한 실시 형태들 중 어느 하나이다.
실시 형태 40은 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 26의 서열을 포함하는 전술한 실시 형태들 중 어느 하나이다.
실시 형태 41은 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 25의 적어도 300개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 전술한 실시 형태들 중 어느 하나이다.
실시 형태 42는 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 25의 서열을 포함하는 전술한 실시 형태들 중 어느 하나이다.
실시 형태 43은 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 1의 적어도 400개 뉴클레오티드의 단편과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 전술한 실시 형태들 중 임의의 것이다.
실시 형태 44는 AoHV-1 프로모터가 서열 번호 1 또는 서열 번호 30의 서열을 포함하는 실시 형태 43이다.
실시 형태 45는 서열 번호 20의 서열을, 바람직하게는 세포의 게놈 내에서 포함하는 트랜스진을 포함하는 세포이다.
실시 형태 46은 세포가 PER.C6 세포인 실시 형태 45에 따른 세포이다.
실시예
추가의 설명 없이, 당업자라면 상기 설명 및 하기의 예시적인 방법 및 실시예를 사용하여 본 발명을 만들고 이용하고, 청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서 하기 실시예는 본 발명의 특정 실시 형태, 특징 및 장점을 구체적으로 나타내고, 어떠한 방식으로도 나머지 개시를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 단지 본 발명을 명확하게 하는 역할을 한다.
방법
세포 배양:
HEK293 세포를 10% 우태 혈청(FBS)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에서 유지하였다. 베로 세포를 5% 우태 혈청(FBS)이 보충된 최소 필수 배지(MEM, Life Technologies)에서 배양하였다. PER.C6 세포(Fallaux et al., 1998)를 10 mM MgCl2가 보충된 10% 우태 혈청(FBS)을 포함하는 DMEM에서 배양하였다.
PER.C6-hCMV.TetR 세포(본원에 설명됨)를 2 ug/ml의 블라스티시딘(Blasticidin)(Gibco A11139-03)이 보충된 것을 제외하고는 PER.C6 세포에 대하여 상기에 설명한 바와 같은 유사 배지에서 배양하였다.
상기 세포의 계대배양을 TrypLE Select Enzyme(ThermoFisher, 카탈로그 번호 12563011)을 사용하여 표준 프로토콜에 따라 수행하여 세포를 탈리시켰다.
pAdApt35 플라스미드:
상이한 프로모터 구축물들을 AvrII 및 HindIII 제한효소 부위를 사용하여 pAdApt35(Vogels et al. 2007)로 클로닝하였다. 반딧불이 루시퍼라아제를 코딩하는 유전자를 HindIII 및 XbaI 제한효소 부위를 사용하여 삽입시켜 Luc 유전자가 상기 상이한 테스트되는 프로모터 하에 발현되는 pAdapt 플라스미드(pAdapt35.P.Luc)를 생성하였다. 이러한 플라스미드들을 실시예 1에서 사용하였다.
일시적 형질감염 HEK293 세포에서의 발현 분석.
HEK293 세포를 다중웰 6 폴리-L-라이신(PLL) 코팅 플레이트에서 플레이팅하고, 1 μg의 pAdapt.P.Luc 플라스미드로 형질감염시켰다(제조업자(Life Technologies)에 의해 제공된 사용 설명서에 따라 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용하여). 후속적으로, 상기 플레이트를 37℃, 10% CO2에서 24시간 인큐베이션하였다. 루시퍼라아제 활성을 형질감염시킨지 24시간 후에 Luminoskan™ Ascent 마이크로플레이트 광도계에서 0.1% DTT(1 M)의 존재 하에 세포 용해물에서 측정하였다. 형질감염 효율의 대조군으로서, 분비형 배아 알칼리 포스파타아제를 코딩하는 플라스미드를 공동 형질감염시켰다(80 ng/웰). SEAP 수준을 Clontech Great EscAPe™ SEAP Chemoluminescence Kit 2.0 및 Trilux Microbeta 워크스테이션을 사용하여 측정하였다. 일시적 형질감염 HEK293 세포에서의 발현 분석을 실시예 1에서 사용한다.
일시적 형질감염 베로 세포에서의 tTA-반응성 인공 프로모터 "7xTetO-AoHV-1"의 제어 하에서의 가우시아 루시퍼라아제의 발현 분석
베로 세포를 웰당 1.25x104개의 세포의 접종 밀도로 다중웰 96 플레이트에 접종하였다. 상기 세포를 접종한지 1일 후에 7xtetO-AoHV-1의 제어 하의 가우시아 루시퍼라아제 유전자를 함유하는 pDualLuc-유래된 플라스미드로 형질감염시켰다. 루시퍼라아제 플라스미드 외에, 세포를 테트라사이클린-제어 트랜스활성자(tTA) 단백질을 코딩하는 플라스미드로, 또는 음성 대조 플라스미드(pBluescript)로 공동 형질감염시켰다. 세포 형질감염을 제조업자의 프로토콜(Life Technologies)에 따라 리포펙타민 3000을 사용하여 수행하였다. Luminoskan™ Ascent Microplate Luminometer에서 Pierce Gaussia-Firefly Luciferase Dual Assay kit(Thermo Scientific)를 사용하여, 형질감염 후 24시간에 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 형질감염 효율에 대하여 대조하기 위하여, 측정된 가우시아 루시퍼라아제 단위를 레드 반딧불이 루시퍼라아제의 수준에 대하여 정규화하였다(이를 위하여 AoHV-1 short에 의해 구동되는 발현 카세트를 동일 pDualLuc 플라스미드 상에 위치시켰다). 일시적 형질감염 베로 세포에서의 발현 분석을 실시예 2에서 수행하였다.
일시적 형질감염 PER.C6 세포에서의 AoHV-1 프로모터 변이체의 제어 하에서의 가우시아 루시퍼라아제의 발현 분석
PER.C6 세포를 웰당 5x104개의 세포의 접종 밀도로 다중웰 96 플레이트에 접종하였다. 실시예 6에서 설명한 바와 같이, 상이한 AoHV-1 프로모터 변이체의 제어 하의 가우시아 루시퍼라아제 유전자를 함유하는 pDualLuc 플라스미드를 사용하여, 접종한지 1일 후에 세포를 형질감염시켰다. 세포 형질감염을 제조업자의 프로토콜(Life Technologies)에 따라 리포펙타민 2000 CD를 사용하여 수행하였다. Pierce Gaussia-Firefly Luciferase 이중 분석 키트(Thermo Scientific) 및 Luminoskan™ Ascent Microplate Luminometer를 사용하여 형질감염 후 24시간에 루시퍼라아제 활성을 용해 세포에서 측정하였다. 형질감염 효율에 대하여 대조하기 위하여, 측정된 가우시아 루시퍼라아제 단위를 레드 반딧불이 루시퍼라아제의 수준에 대하여 정규화하였다(이를 위하여 AoHV-1 short에 의해 구동되는 발현 카세트를 동일 pDualLuc 플라스미드 상에 위치시켰다). 이 방법 섹션은 실시예 6에 적용가능하다.
PER.C6-hCMV.TetR 및 PER.C6-AoHV.TetR 세포
여기서 TetR을 안정하게 발현하는 두 유형의 PER.C6 세포를 생성하여 사용하였다.
먼저, hCMV 프로모터의 제어 하에 TetR을 발현하는 PER.C6-hCMV.TetR 세포를, 제조업자의 프로토콜에 설명된 표준 절차에 따라 플라스미드 pCDNA6/TR (Thermo Fisher Scientific 카탈로그 번호 V102520)을 이용한 PER.C6 세포의 안정한 형질감염에 의해 생성하였다.
다음으로, 실시예 5에 설명된 절차 (및 그 안에 언급된 방법 섹션)에 따라 플라스미드 pC_AoHV_TetR을 이용하여 PER.C6 세포를 안정하게 형질감염시킴으로써 AoHV-1 short 프로모터의 제어 하에 TetR을 발현하는 PER.C6-AoHV.TetR 세포를 생헝하였다.
TetR-조절 AoHV-1 short 프로모터의 제어 하에 관심의 대상이 되는 추가 유전자를 발현하는 PER.C6-hCMV.TetR 세포의 세포 클론 생성
PER.C6-hCMV.TetR 세포를 형질감염 1일 전에 T80 배양 플라스크에 접종하였다. 형질감염에 사용한 플라스미드는 AoHV.2xtetO 프로모터(서열 번호 7)의 제어 하의 관심의 대상이 되는 유전자(GOI)를 지녔다. 부가적으로, 이것은 SV40-유래된 프로모터에 의해 제어되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II 유전자 발현 카세트를 포함한다. 몇몇 클로닝 단계를 통하여, AoHV.2xtetO 이후에 GOI의 코딩 서열이 뒤따르는 것을 포함하는 단편에 의한, pcDNA2004Neo(-)(GenBank 등록 번호 FB674876)의 hCMV 프로모터-함유 MfeI-XbaI 단편의 대체에 의해 플라스미드를 구축하였다. 형질감염을 제조업자의 프로토콜(Invitrogen)에 따라 리포펙타민 2000을 이용하여 행하였다. 형질감염 다음 날, 세포를 계대배양하고 1:2, 1:4, 1:8 및 1:16으로 접종하였다(10 cm 배양 디쉬에서). 접종한지 1일 후, 세포 배양 배지를 0.5 mg/ml의 제네티신(Geneticin)(Gibco 10131-019)이 보충된 PER.C6-hCMV.TetR용 배지로 교체하였다. 배지를 주당 2회 교체하였다. 클론을 형질감염시킨지 2~3주 후에 골랐다. 이 방법 섹션은 실시예 3에 적용가능하다.
관심의 대상이 되는 발현의 분석을 위한 웨스턴 블롯
접종한 세포를 독시사이클린 (1 μg/ml)을 이용하거나 이용하지 않고서 2일 동안 인큐베이션하고, RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1% 트리톤 X100, 0.5% 독시콜레이트, 0.1% SDS 50 mM 트리스-HCL) 중에 수확하였다.
샘플을 10% 비스-트리스 겔(Invitrogen NP0301PK2) 상에 로딩하고, MOPS 완충액(Invitrogen NP0001)에서 진행시켰다. 상기 SDS 겔을 iBlot2 시스템(Invitrogen)에서 블로팅하고, 단백질을 니트로셀룰로오스 막(Invitrogen IB23001)으로 이전시켰다. 상기 막을 차단 완충액(LI-COR 927-40000)에서 4℃에서 하룻밤 차단하였다. 상기 웨스턴 블롯 막을 차단 완충액에서 2시간 동안 일차 항체(Ad35 바이러스에 대한 1:200의 마우스 다클론 항체(사내에서))와 함께 인큐베이션하고, TBST로 세척하였다. 웨스턴 블롯을 차단 완충액에서 1시간 동안 이차 항체(1:5000의 염소 항-마우스-800CW)와 함께 인큐베이션하고, TBST로 다회 세척하였다. 가시화를 LI-COR Odessey Imager에서 행하였다. 이 방법 섹션은 실시예 3에 적용가능하다.
이중 루시퍼라아제 플라스미드 pDualLuc의 생성
pDualLuc(서열 번호 21)는 다음의 2개의 발현 카세트를 지닌 플라스미드이다: 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 프로모터의 제어 하에 가우시아 루시퍼라아제(Gluc)를 발현하는 제1 발현 카세트, 및 AoHV-1 short 프로모터의 제어 하에 레드 반딧불이 루시퍼라아제(RFL)를 발현하는 제2 카세트. pDualLuc 내에서, Gluc 및 RFL 발현 카세트는 서로에 대하여 테일-투-테일(tail-to-tail) 배향으로 위치한다.
pDualLuc를 몇 회의 유전자 합성 및 서브클로닝 단계(GeneArt(Life Technologies)에서 수행함)에 의해 생성하였다. 먼저, 합성 단편 "CMV_GLuc_SV"(서열 번호 17) 및 "AoHV1_RFL_BGH"(서열 번호 19)(이는 각각의 발현 카세트를 지님)를 생성하고 표준 GeneArt 플라스미드(pMK-RQ) 내에 클로닝하였다. 후속적으로, 합성 단편 AoHV1_RFL_BGH를 MluI 및 NsiI 제한효소 부위를 사용하여 CMV_GLuc_SV-함유 구축물로 추가로 서브클로닝하였다.
pDualLuc의 가우시아 루시퍼라아제-구동 CMV 프로모터 서열의 측면에는 독특한 제한효소 부위 XhoI 및 HindIII이 있어서, 이 프로모터가 대안적인 프로모터 서열에 의해 대체되게 하며, 이는 본원에서 실시예 2 및 실시예 6에서 행해진 바와 같았다.
Ad26 벡터 게놈 플라스미드 pAd26.dE1.dE3.5orf6의 생성
pAd26.dE1.dE3.5orf6은 E1 결실, E3 결실, 및 Ad26 E4 orf6의, Ad5의 것에 의한 대체를 지닌 전장 Ad26 벡터 게놈을 함유하는 플라스미드이며, 이는 종래에 생성된 Ad26-기반 벡터에 대하여 설명된 바와 같다(Abbink et al., 2007). pAd26.dE1.dE3.5orf6의 플라스미드 백본은 pMB1 복제 기점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하며, pBR322(GenBank 등록 번호 J01749.1)로부터 유래된다. pAd26.dE1.dE3.5orf6은 벡터 게놈의 E1 결실 대신에 독특한 AsiSI 제한효소 부위, 및 벡터 게놈의 E4 영역과 우측 역 말단 반복체(RITR) 사이에 독특한 PacI 제한효소 부위를 추가로 포함한다. 이러한 부위들을 사용하여 트랜스진 카세트를 각각의 위치에 삽입할 수 있다. 마지막으로, pAd26.dE1.dE3.5orf6 내의 아데노바이러스 벡터 게놈의 측면에는 그의 말단 각각에 SwaI 제한효소 부위가 있어서, SwaI 절단에 의한 플라스미드 백본으로부터의 그의 방출을 허용한다.
pAd26.dE1.dE3.5orf6의 구축은 몇 회의 합성 및 클로닝 단계를 포함하였다. (원하는) Ad26 벡터 게놈의 좌측 말단 및 우측 말단 단편을 포함하는 2 kb 서열(서열 번호 16)을 GeneArt/LifeTechnologies에서 합성하였다. 이 서열의 좌측 말단 벡터 게놈 단편은 벡터 게놈의 좌측 역 말단 반복체(LITR)로부터 SfiI 부위(이는 (야생형) Ad26 바이러스 게놈(GenBank 등록 번호 Ef153474.1)의 위치 3755 내지 3767의 SfiI 부위에 상응함)까지 걸쳐 있다. 우측 말단 바이러스 게놈 단편은 야생형 Ad26 바이러스 게놈의 위치 34079 내지 34084의 NheI 부위에 상응하는 NheI 부위로부터 우측 ITR(RITR)까지 걸쳐 있다. 합성 서열은 E1 결실(Ad26의 위치 472로부터 3365까지, GenBank 등록 번호 Ef153474.1)과, 상기에 언급된 제한효소 부위(즉, E1 결실 대신 AsiSI 부위, E4와 RITR 사이의 PacI 부위, 및 벡터 게놈 서열의 바로 측면에 있는 두 SwaI 부위)를 지니도록 설계하였다. 유전자 합성 단편은 다음 2개의 외측 제한효소 부위를 추가로 포함하여서 클로닝을 용이하게 하였다: MfeI 부위를 좌측 말단쪽에 포함시킨 반면 AseI 부위는 우측 말단쪽에 포함시켰다. 합성한 단편을 MfeI-AseI 제한효소 단편으로서 EcoRI- 및 NdeI-절단 pBR322(GenBank 등록 번호 J01749.1)로 라이게이션시켜(이에 의해 pBR322의 2.3 kb, 테트라사이클린 내성 유전자-함유 EcoRI-NdeI 단편을 대체함), 각각의 라이게이션 단편들을 생성하도록 절단한 제한효소 부위의 폐지를 초래하였다. 마지막으로, 벡터 게놈의 좌측 및 우측 말단을 지닌 생성된 플라스미드를 사용하여, 2개의 순차적 클로닝 단계에 의해 pAd26.dE1.dE3.5orf6을 구축하였다. 먼저, pWE.Ad26.dE3.5orf6(Abbink et al., 2007)로부터 유래된 12.7 kb SfiI-NheI Ad26 벡터 게놈 제한효소 단편을 SfiI 및 NheI로 절단되는 "좌측 말단/우측 말단" 플라스미드로 라이게이션시켰다. 다음으로, pWE.Ad26.dE3.5orf6로부터 유래된 13.7 kb SfiI-SfiI Ad26 벡터 게놈 제한효소 단편을, 생성된 부분 벡터 게놈 플라스미드의 SfiI 부위 내로 삽입시켰다.
Ad26 벡터 게놈 플라스미드인 pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL의 생성
pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL은 다음의 2가지 트랜스진 발현카세트를 지니도록 변형시킨, pAd26.dE1.dE3.5orf6(상기 참조)의 Ad26 벡터 게놈을 포함하는 플라스미드이다: (1) (결실된) E1 영역 내에 삽입된 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 프로모터-구동 가우시아 루시퍼라아제(Gluc) 발현 카세트, 및 (2) E4와 RITR 사이에 삽입된 AoHV-1 프로모터-구동 레드 반딧불이 루시퍼라아제(RFL) 발현 카세트.
pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL은 GLuc 발현 카세트의 hCMV 프로모터 내에 2개의 테트라사이클린 오퍼레이터(tetO) 서열을 추가로 지닌다는 것을 제외하고는 pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL과 동일하다.
플라스미드 pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL의 구축은 요구되는 발현 카세트를 지닌 중간 구축물을 생성하는 것, 이어서 이러한 카세트들을 Gibson 어셈블리(Gibson et al., 2009)에 의해 pAd26.dE1.dE3.5orf6의 Ad26 벡터 게놈 내로 삽입하는 것을 포함하였다. 합성 서열 "CMV_GLuc_SV"(서열 번호 17), "CMVtetO_GLuc_SV"(서열 번호 18), 및 "AoHV1_RFL_BGH"(서열 번호 19)를 지닌 중간 구축물은 유전자 합성 서비스 공급자인 GeneArt(LifeTechnologies)에서 생성되었다. 서열 CMV_GLuc_SV는 Gluc의 발현을 위한 발현 카세트를 포함한다. 이것은 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 프로모터(서열 번호 4), Gluc 코딩 서열, 및 SV40-유래된 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 서열 CMVtetO_GLuc_SV는, 그의 hCMV 프로모터-유래된 프로모터 내에 CMVtetO(서열 번호 15), 2개의 테트라사이클린 오퍼레이터(tetO) 서열을 포함하는 54 bp 삽입체를 지닌다는 점에서 서열 CMV_GLuc_SV와는 다르다. 서열 AoHV1_RFL_BGH는 RFL의 발현을 위한 발현 카세트를 포함한다. 이것은 AoHV-1 short(서열 번호 30), RFL 코딩 서열, 및 소 성장 호르몬 유전자-유래된 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 서열 CMV_GLuc_SV 및 CMVtetO_Gluc_SV는 pAd26.dE1.dE3.5orf6의 AsiSI 부위의 바로 측면에 있는 서열에 상응하는 짧은 측면 서열을 추가로 포함하도록 설계하였다. 이러한 측면 서열들은 시험관 내 어셈블리(IVA) 방법(예를 들어 깁슨(Gibson) 등의 (Gibson et al., 2009)에 설명된 바와 같음)에 의해 pAd26.dE1.dE3.5orf6의 AsiSI 부위 내로(즉, Ad 벡터 게놈의 E1 결실 위치에) 관련 발현 카세트를 삽입하는 것을 허용한다. 이와 유사하게, 서열 AoHV1_RFL_BGH는 IVA에 의한 pAd26.dE1.dE3.5orf6의 PacI 부위 내로의(즉, 벡터 게놈의 E4 영역과 RITR 사이로의) 관련 발현 카세트의 삽입을 허용하는 측면 서열을 포함한다. 3가지 서열에는 모두 이러한 서열들을 그의 각각의 플라스미드 백본들(여기서, 이들은 유전자 합성 서비스 공급자에 의해 제공됨)로부터 방출시키기 위하여 측면 외측 제한효소 부위가 추가로 갖추어졌다. pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL은 AsiSI 및 PacI 둘 다로 절단한 플라스미드 pAd26.dE1.dE3.5orf6과, 합성 서열 CMV_GLuc_SV 및 AoHV1_RFL_BGH(이들은 각각 PmlI 및 PshAI에 의한 절단에 의해 이들의 각각의 플라스미드 백본으로부터 방출됨) 사이의 4-단편 Gibson 어셈블리 반응(New England Biolabs)을 수행함으로써 구축하였다. Gibson 어셈블리 반응에서 CMV_Gluc_SV 대신 합성 서열 CMVtetO_GLuc_SV를 사용한 것을 제외하고는 pAd26.dE1.dE3.5orf6과 동일한 방식으로 pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL을 생성하였다.
트랜스진 카세트 완전성의 분석을 위한 프라이머
"E1 PCR" 프라이머 쌍의 서열:
TGGCGCGAAAACTGAATGAG - 정방향 (서열 번호 8)
GCAGGCGGGTTGTCAAATAAG - 역방향 (서열 번호 9)
"E4 PCR1" 프라이머 쌍의 서열:
GACGGGAGCAATCCCTCCAG - 정방향 (서열 번호 10)
CCCCACAAAGTAAACAAAAG - 역방향 (서열 번호 11)
"E4 PCR2" 프라이머 쌍의 서열:
CGTTCTCACTTCCTCGTATC - 정방향 (서열 번호 12)
CAACGCTGATTGGACGAG - 역방향 (서열 번호 13)
이 섹션에서 설명한 플라스미드를 실시예 4에서 사용한다.
TetR-발현 플라스미드 pC_AoHV_TetR
pC_AoHV_TetR을 구축하기 위하여, AoHV-1 short (서열 번호 30), 이어서 코돈-최적화된 TetR-코딩 서열을 포함하는 1.3 Kbp DNA(서열 번호 20) 단편을 합성하고(GeneArt/LifeTechnolgies에서), 후속적으로, MfeI 및 XbaI 제한효소 부위를 사용하여 pcDNA2004Neo(-)(GenBank 등록 번호 FB674876) 내로 서브클로닝하였다. 도 6a는 상기 1.3 Kbp 삽입체의 위치가 표시된 pC_AoHV_TetR의 지도를 나타낸다.
PER.C6-AoHV.TetR 세포주의 생성 절차
안정한 PER.C6-AoHV.TetR 세포주를 표준 세포주 생성 절차에 의해 생성하였다. 간략하게는, 무혈청 성장, 현탁-적응 PER.C6 세포(Fallaux et al., 1998)(4 mM L-글루타민(Lonza)이 보충된 CDM4 PerMAb 배지(HyClone)에서 성장시킴)를 BioRad 전기천공기를 사용하여 전기천공에 의해 플라스미드 pC_AoHV_TetR로 형질감염시켰다. "PerMab 선발 배지", 즉, 4 mM의 L-글루타민 및 125 ug/mL의 제네티신(Gibco)이 보충된 CDM4 PerMAb 배지에서의 회복 및 항생제 선발 후, 형질감염 세포는 단일 세포 클로닝을 위하여, 4 mM의 L-글루타민 및 125 ug/mL의 제네티신이 보충된 Mab 배지(SAFC)에서 웰당 1개의 생존성 세포로 MW96 플레이트에 접종하였다. 세포 콜로니의 형성시에, 단리된 클론을 PerMAb 선발 배지에서의 정적 배양으로 수 회의 계대를 위하여 확장시켰다. 후속적으로, 100개의 클론을 항-TetR 항체(Tet03, MoBiTec)를 사용하여 유세포 분석법용 세포내 염색 절차에 의해 TetR을 발현하는 능력에 대하여 분석하였다. 이러한 제1 스크린에서, 100개의 테스트한 클론 중 94개가 TetR-양성인 것으로 밝혀졌다. 이러한 TetR-양성 클론 중 47개의 클론을 선발하고, 4 mM의 L-글루타민 및 125 ug/mL의 제네티신이 보충된 Permexcis 배지(Lonza)에서의 성장에 대하여 적응시킨 후, 유세포 분석법용 세포내 염색 절차에 의해 TetR 발현에 대하여 다시 테스트하고, 이외에도 TeTr 기능성 분석(본원에 방법 섹션에 설명됨)에 의해 TetR 활성에 대하여 테스트하였다. 그 후, 30시간 이하의 집단 배가 시간을 나타내고 넓은 범위의 TetR 활성 수준을 나타내는 24개의 TetR-양성 클론을 선발하였다. PER.C6-AoHV.TetR 클론 #1 내지 #24로 나타낸 이러한 클론들을 진탕 플라스크에서의 성장에 대하여 (재)적응시키고, 그 후 상기 클론은 마지막으로 소규모 연구용 세포 은행에서 저온보관하였다. 이 방법 섹션은 실시예 5에 적용가능하다.
PER.C6-AoHV.TetR 클론으로부터의 TetR 발현의 안정성
장시간 계대배양시에 PER.C6-AoHV.TetR 세포 클론에 의한 TetR 발현의 안정성의 분석. 대략 60회의 집단 배가(또는 60세대)에 도달할 때까지 다회의 계대배양을 하기 위하여, PER.C6-AoHV.TetR 세포 클론을 항생제 선발을 이용하여, 그리고 항생제 선발을 이용하지 않고서 진탕 플라스크에서 성장시켰다. TetR 발현을 제20세대, 제40세대, 및 제60세대에서 유세포 분석법용 세포내 염색에 의해 분석하였다. 각각의 이러한 시점에, 각각의 클론의 세포는 TetR 및 튜뷸린 둘 다를 탐지하도록 유세포 분석법용 세포내 이중-염색 프로토콜을 거쳤다. 염색은 표준 유세포 분석법용 세포내 절차에 따른 것이었으며, 다음의 2개의 항체 인큐베이션 단계를 포함하였다: 먼저, 항-TetR 마우스 단클론 항체(Tet03, MoBiTec)를 이용함, 다음으로, 항-마우스 IgG-FITC 콘쥬게이트(554001, BD Biosciences)(항-튜뷸린 항체-Alexa Fluor 647 콘쥬게이트(ab195884, Abcam)와 조합됨)를 이용함. 클론당 TetR-양성 및 TetR-음성 세포의 분율을 엄격한 튜뷸린-양성 게이트 내에서 결정하였다. 이 방법 섹션은 실시예 5에 적용가능하다.
TetR 기능성 분석
TetR 기능성 분석을 PER.C6-AoHV.TetR 세포 클론의 장시간 계대배양 후 수행하였다. 대략 60회의 집단 배가(또는 60세대)에 도달할 때까지 다회의 계대배양을 하기 위하여, PER.C6-AoHV.TetR 세포 클론을 항생제 선발을 이용하여, 그리고 항생제 선발을 이용하지 않고서 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 그 후, PER.C6-AoHV.TetR 세포 클론 및 대조 PER.C6 세포를 4 mM L-글루타민이 보충된 Permexcis 배지에서 폴리-L-라이신-코팅된 다중웰 96 플레이트에 접종하고, 2시간의 인큐베이션 후, 벡터 Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL(실시예 4에 설명됨)로 사중으로 감염시켰다. 감염 후 1일에, 감염된 세포를 Luciferase Cell Lysis Buffer(Pierce / Thermo Scientific) 중에 수확하였다. 각각의 세포 용해물의 별개의 분취물을 이용하여, 각각 BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit(NEB) 및 Luciferase Glow Assay Kit(Pierce / Thermo Scientific) 시약과, Luminoskan Ascent Microplate Luminometer(Thermo Scientific)를 사용하여, 제조업자의 사용 설명서에 따라 GLuc 및 RFL 활성을 후속적으로 측정하였다. 감염 반복당, Gluc 활성을 RFL 활성에 의해 정규화하였다. 이 방법 섹션은 실시예 5에 적용가능하다.
실시예 1: 이종 유전자 발현을 위한 강력 프로모터로서의 AoHV-1 short의 확인
종종, 바이러스 또는 동물 / 인간 게놈으로부터 유래된 프로모터가 이종 단백질 발현에, 예를 들어 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 위한 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터에서 발현 카세트에서(세포 또는 숙주 유기체에서) 사용된다. 이러한 목적에 일반적으로 사용되는 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)의 극초기 영역으로부터 유래된 프로모터이다(Powell et al., 2015). 다른 숙주를 감염시키는 몇몇 사이토메갈로바이러스(CMV)가 또한 공지되어 있다. 이것은 예를 들어 레수스 원숭이(rhCMV)(Barry, Alcendor, Power, Kerr, & Luciw, 1996; Chan, Chiou, Huang, & Hayward, 1996; Chang et al., 1993; Hansen, Strelow, Franchi, Anders, & Wong, 2003), 및 침팬지(chCMV)를 감염시킨다(Chan et al. 1996).
바람직하게는 강력하고 짧으며 또한 일반적으로 사용되는 hCMV 프로모터와의 서열 동일성이 낮은 프로모터를 확인하기 위하여, 몇몇 추정 프로모터 서열들을 확인하고 테스트하였다. 테스트한, 그리고 hCMV와 더 멀리 관련된 헤르페스바이러스로부터 유래된 몇몇 추정 프로모터들은 매우 낮거나 전혀 없는 프로모터 활성을 나타냈다. 상이한 CMV 종으로부터 유래되고 강력 프로모터인 것으로 공지된 일부 다른 프로모터에 있어서, 프로모터 활성을 확인하였지만, 불행하게도 이러한 프로모터는 종종 다음의 단점 중 하나를 나타낸다: 상기 프로모터는 예를 들어 인핸서 및 인트론 서열의 포함으로 인하여 더 큰 크기를 특징으로 함 및/또는 상기 프로모터는 hCMV 프로모터 서열에 대하여 상당한 상동성을 나타냄.
아오틴 헤르페스바이러스 1(AoHV-1)은 잠정적으로 사이토메갈로바이러스로 분류된다. 흥미롭게도, AoHV-1의 전 게놈 서열이 공개되어 있고, 오픈 리딩 프레임(ORF)은 서열이 표기되어 있지만, 주요 극초기 프로모터는 지금까지 전혀 설명되지 않았다. 본 발명자는 AoHV-1 게놈의 상이한 길이의 영역의 2가지 상이한 설계를 테스트하고, 각각의 추정 프로모터 서열을 AoHV-1 long 및 AoHV-1 short로 칭하였다. 하기에 기술된 결과를 기반으로 하면, 이러한 서열에 있어서 프로모터 활성을 보여줄 경우, 이러한 서열 및 그 유도체는 AoHV-1 주요 극초기 프로모터, 또는 간략히 AoHV-1 프로모터로 지칭된다.
확인된 추정 프로모터 서열을 이종 유전자 발현의 능력에 대하여 테스트하기 위하여, 추정 프로모터 서열을 GeneArt LifeTechnologies에서 합성하고, 반딧불이 루시퍼라아제 리포터 유전자의 상류의 AvrII 및 HindIII 제한효소 부위를 통하여 pAdapt35.Luc 플라스미드 내로 서브클로닝하였다. 반딧불이 루시퍼라아제 수준을 형질감염시킨지 24시간 후에 형질감염 HEK293 세포에서 측정하고, hCMV 프로모터(서열 번호 4)에 의해 유도된 반딧불이 루시퍼라아제 발현과 비교하였다.
가능한 프로모터들의 패널로부터 선발하여, 일부 강력 프로모터를 선택하며(데이터는 예시되어 있지 않음), 이들 중 chCMV short 및 AoHV-1 short는 그의 매우 작은 크기 및 능력으로 인하여 바람직하다. 선발된 프로모터 AoHV-1 short(서열 번호 1), AoHV-1 long(서열 번호 2), chCMV short(서열 번호 3) 및 hCMV 프로모터에 대한 능력 테스트 결과가 도 1에 예시되어 있다. AoHV-1 short, AoHV-1 long, chCMV short 및 hCMV 프로모터 전부는 이 실험에서 비견되는 프로모터 능력을 나타낸다.
그러나, 도 2a에 나타낸 바와 같이, chCMV short는 정렬 영역에서 hCMV와의 서열 동일성이 매우 높으며(서열 동일성: 대략 64%), 특히, chCMV short 프로모터의 하류 부분은 hCMV와 서열이 동일한 유의한 정렬 및 긴 스트레치를 나타낸다(이때 19개 뉴클레오티드 이하의 몇몇 동일한 스트레치 및 단지 몇 개의 뉴클레오티드가 상이한 100개 뉴클레오티드 초과의 상동성 스트레치가 있음). 이와는 대조적으로, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 신규 프로모터 AoHV-1 short는 정렬 영역에서 hCMV와의 서열 동일성이 낮으며(서열 동일성: 대략 36%) hCMV 대조군과 비견되는 능력을 갖는다. 상동성 프로모터 영역들 사이의 잠재적인 상동 재조합과 관련하여, 두 서열들 내의 동일 스트레치들의 길이는 전체 서열 상동성보다 더 관련성이 있다. 주목할 만하게는, AoHV-1 short 프로모터는 hCMV와 단지 몇 개의 짧은 동일 서열 스트레치를 공유하며(이때 최대 길이는 14개 뉴클레오티드임), 이는 더 많고/많거나 더 긴 동일 뉴클레오티드 스트레치를 공유하는 프로모터들과 비교하여 hCMV 프로모터와 AoHV-1 short 사이의 상동 재조합의 위험성을 매우 낮아지게 하는 것으로 생각된다(예를 들어, (Rubnitz & Subramani, 1984)). 따라서 hCMV 프로모터와 AoHV-1 short 프로모터 사이의 원하지 않는 상동 재조합에 대한 위험성은 매우 낮은 것으로 여겨진다. 원할 경우, 이러한 프로모터들 사이의 이미 매우 제한된 수준의 서열 동일성은 어느 하나의 프로모터에서 하나 이상의 표적화된 돌연변이를 만들고 일상적인 방법에 의해 테스트함으로써 더욱 더 감소될 수 있는데, 이는 프로모터 활성을 없애지 않는다.
결론적으로, AoHV-1 short 프로모터는, 최적 표준인 hCMV의 범위 내에서 매우 양호한 능력을 나타내고 이와 동시에 매우 짧은 서열(484 bp) 및 hCMV 프로모터와의 낮은 서열 동일성을 갖기 때문에 바람직하다.
실시예 2: 포유류 세포에서 관심의 대상이 되는 유전자의 유도성 발현을 위한 소분자-제어성 트랜스활성자-기반 시스템에서의 AoHV-1 코어 프로모터의 적용
유전자의 유도성 발현은 생명공학 분야에서, 구체적으로 독성 유전자 생성물의 일시적 발현에 있어서 높은 적용성을 가질 수 있다. 포유류 세포에서의 이종 유전자 조절을 위한 특정한 잘 확립된 시스템은 hCMV 코어 프로모터에 연결된 Tet 오퍼레이터(TetO) 서열의 다중 카피로 이루어진 인공 프로모터를 이용한다(Gossen & Bujard, 1992; Gossen et al., 1995). 이러한 시스템에서, 기본 전사 활성을 전혀 나타내지 않거나 매우 낮은 기본 전사 활성을 나타내는 상기 인공 프로모터는 테트라사이클린-제어 트랜스활성자 단백질(tTA) 또는 역 테트라사이클린-제어 트랜스활성자 단백질(rtTA)로 공지된 특정한 재조합 전사 인자의 그의 TetO 서열에의 특이적 결합에 의해 활성화될 수 있다. 여기서 본 발명자는 유사한 그러한 tTA/rtTA-반응성 인공 프로모터가 hCMV 코어 프로모터 대신 AoHV-1 프로모터의 서열 요소를 이용하여 생성될 수 있는지를 테스트하였다.
이것을 위하여, 단지 추정 최소(코어) AoHV-1 프로모터가 7개의 Tet 오퍼레이터의 바로 하류에 위치하는 프로모터를 구축하였다(7xTetO-AoHV-1, 서열 번호 5). 프로모터 서열을 GeneArt LifeTechnologies에서 합성하고, XhoI 및 HindIII 제한효소 부위를 통하여, 본원에서 방법 섹션에서 설명한 플라스미드 pDualLuc 내로 서브클로닝함으로써 이 플라스미드의 가우시아 루시퍼라아제 리포터 유전자를 제어하는 CMV 프로모터를 대체하였다. 가우시아 루시퍼라아제 수준을 형질감염시킨지 24시간 후 형질감염 베로 세포에서 측정하고, 트랜스활성자 단백질 tTA의 존재 하에서의 동일 프로모터에 의한 가우시아 루시퍼라아제 발현과 비교하였다. 발현 데이터를 AoHV-1 short 프로모터의 제어 하에서의 레드 반딧불이 루시퍼라아제(RFL)의 측정을 통하여 형질감염 효율에 대하여 정규화하였으며, 이를 위하여 발현 카세트를 동일 pDualLuc 플라스미드 상에 위치시켰다. 도 3은 7xTetO-AoHV-1 프로모터의 제어 하에서의 가우시아 루시퍼라아제 유전자의 발현을 도시한다. 4개의 독립 실험(N=4)에서, 7xTetO-AoHV-1 프로모터의 기본 발현 수준은 배경 수준(배지만으로 형질감염된 세포, 음성 대조군)과 가까웠으며, 트랜스활성자 단백질 tTA를 코딩하는 플라스미드로 공동 형질감염시킨 경우(7xTetO-AoHV-1+tTA)보다 평균 1400배 더 낮았다. 상기 프로모터의 tetO 서열에의 tTA의 결합을 저해하는 독시사이클린의 첨가시에(2회 수행함, N=2), 기본 발현 수준이 다시 관찰되었다. 7xTetO-AoHV-1의 유도된 발현 수준을 또한 RSV 프로모터(라우스 육종 바이러스의 LTR로부터 유래됨; 이것은 생명공학적 발현 시스템에서의 사용용으로 기술된 또 다른 프로모터임)와 비교하였으며, 이는 유도된 7xTetO-AoHV-1 프로모터가 RSV 프로모터에 의한 것보다 대략 1 로그 더 높은 가우시아 루시퍼라아제 발현 수준을 생성함을 나타냈다.
결론적으로, AoHV-1 프로모터로부터 유래된 추정 코어 프로모터-포함 서열은 테트라사이클린-제어 트랜스활성자 단백질에 반응하는 인공 프로모터의 구축에 사용될 수 있다. 이와 관련하여 이 서열의 적용은 관심의 대상이 되는 유전자의 발현의 엄격히 제어된 조절을 허용하는 것으로 입증되었다. 따라서 상기 서열은, 혼자서는 매우 낮은 프로모터 활성을 갖지만 다른 조절 서열, 예컨대 천연 또는 인공 전사 인자의 결합 부위와 조합될 경우에는 강력한 유전자 발현을 구동시킬 수 있는 것으로 본원에 정의된 진성 "코어 프로모터"를 나타낸다.
실시예 3: 포유류 세포에서의 관심의 대상이 되는 유전자의 조절 발현을 위한 소분자-제어성 박테리아 리프레서 단백질-기반 시스템에서의 AoHV-1 프로모터의 적용
실시예 2에서 언급된 바와 같이, 세포주에서의, 예를 들어 관심의 대상이 되는 독성 유전자의 조절 발현은 단백질 또는 바이러스 벡터의 재조합적 생성에 필수적일 수 있다. hCMV 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 이미 함유하는 바이러스 벡터가 사용될 경우, 생산 세포주에서 관심의 대상이 되는 유전자(GOI)의 발현을 위하여 상이한 서열을 갖는 강한 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. hCMV 프로모터에 대한 대안을 확인하기 위하여, AoHV-1 short 프로모터 및 인간 포스포글리세레이트 키나아제 1(hPGK) 프로모터(생명공학적 발현 시스템에서의 사용용으로 기술된 또 다른 프로모터)를 PER.C6 세포에서의 eGFP의 일시적 발현에 대하여 테스트하였다. 실시예 1의 결과와 일치하게, AoHV-1 short 프로모터도 이종 유전자의 발현을 위한 강력 프로모터인 것으로 밝혀졌으며, 이는 hCMV(서열 번호 4)와 유사하고 hPGK 프로모터(서열 번호 6)에 의한 것보다 훨씬 더 높은 eGFP 발현 수준을 유도하였다(도 4a).
하기에서, 보통 구성적으로 활성인 AoHV-1 short 프로모터(실시예 1 및 이 실시예의 첫 번째 부분을 참조)는 AoHV-1 short 프로모터의 전사 개시 부위(TSS)의 상류 및 TATA 박스의 하류에서의 2개의 Tet 오퍼레이터의 삽입에 의해 테트라사이클린 리프레서 단백질(TetR)-조절 프로모터로 표기되었다(AoHV.2xtetO, 서열 번호 7). 이러한 설계는 종래에는 hCMV 프로모터에 있어서 작용하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어 국제 공개 제1999/000510 A1호 참조). 상기 프로모터는 TetR을 발현하지 않는 세포에서 활성을 갖는다. 이 설계에서, 프로모터 활성은 TetR의 존재 하에, 예를 들어 TetR을 발현하는 세포주에서 억제된다. 상기 억제는 TetR 단백질에 대하여 높은 친화성을 갖는 독시사이클린(Dox)의 첨가에 의해 경감될 수 있다. 도 4b는 AoHV.2xTetO의 하류에 클로닝된 eGFP의 발현이 실제로 PER.C6-hCMV.TetR 세포에서 억제됨을 나타낸다. Dox의 첨가는 hCMV에 의해 유도되는 eGFP 발현 수준과 유사하게, 증가된 eGFP 단백질 발현 수준으로 이어진다.
관심의 대상이 되는 유전자의 TetR-조절 발현을 나타내는 안정한 세포 클론을 확립하기 위하여, hCMV 프로모터의 제어 하에 TetR을 발현하는 PER.C6-hCMV.TetR 세포를 AoHV.2xtetO의 제어 하에 관심의 대상이 되는 유전자를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 항생제 선발 배지를 사용하여 85개의 클론을 선발하였다. 이 실험에서 관심의 대상이 되는 유전자(GOI)의 유도성 발현의 테스트를 위하여 2개의 클론을 선발하였다. 도 4c는 GOI의 유도성 발현에 대한 상기 2개의 선발 클론의 테스트를 나타낸다. 웨스턴 블롯으로부터 알 수 있는 바와 같이, 테스트한 클론 둘 다는 Dox의 부재 하에서 낮은 배경 신호를 나타내며, 반면에 Dox의 존재 하에서는 GOI가 강력하게 발현된다. 양성 대조군으로서, AoHV-1 short 프로모터의 제어 하에 GOI를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 세포를 사용하였다. 상기 양성 대조군은 상기 세포 클론보다 더 높은 GOI 발현 수준을 나타내는데, 이는 안정한 세포주를 생성하는 경우 일반적으로 관찰된다.
큐메이트 오퍼레이터 서열(CuO)이 AoHV-1 short 프로모터의 (추정) 개시 요소의 바로 하류에 위치된 대안적인 박테리아 리프레서-조절 프로모터를 또한 설계하고 테스트하였으며, 이것도 기능성인 것으로 입증되었다(데이터는 예시되어 있지 않음). 이 프로모터 설계에서, CymR 리프레서 단백질은 CuO 서열에 결합하고 이에 의해 발현을 저해할 수 있다.
게다가, 설명된 TetR- 및 CymR-조절 AoHV1-프로모터-기반 시스템과 유사하게, Lac 오퍼레이터(LacO)-함유 AoHV-1 short 프로모터를 생성하였으며, 이는 Lac 리프레서(LacR)에 의해 강하게 억제가능한 것으로 입증되었다(데이터는 예시되어 있지 않음).
결론적으로, 이 실시예는 이종 유전자 발현을 위한 다른 일반적으로 사용되는 프로모터와 비교하여 높은 AoHV-1 short 프로모터 능력을 확인해 준다. 더욱이, 포유류 세포에서 GOI의 조절된 발현을 허용하는 TetR-, CymR-, 및 LacR-조절 버전의 AoHV-1 프로모터를 생성하였다. 이것은 예를 들어 세포에 유독한 단백질의 발현에 또는 세포 또는 벡터의 불안정성을 초래하는 단백질의 발현에 사용될 수 있다.
실시예 4: 2개의 발현 카세트를 갖는 바이러스 벡터에서의 AoHV-1 프로모터의 적용
AoHV-1 short 프로모터(AoHV-1 short)를 바이러스 벡터에서 적용하여 백신 항원 또는 관심의 대상이 되는 다른 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 이것은 본원에서 아데노바이러스 벡터 Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL의 맥락에서 AoHV-1 short의 적용에 의해 예시된다. 이들은 두 Ad26-기반 재조합 아데노바이러스 벡터로서, 이들 둘 다는 2개의 발현 카세트, 즉, (결실) E1 영역 대신 삽입된 가우시아 루시퍼라아제(GLuc)를 코딩하는 제1 카세트, 및 E4 영역과 우측 역 말단 반복체(RITR) 사이에 위치하는 레드 반딧불이 루시퍼라아제(RFL)를 코딩하는 제2 카세트를 지닌다. 상기 두 바이러스의 Gluc 발현 카세트는 각각 hCMV 프로모터(서열 번호 4) 및 CMVtetO(서열 번호 15)에 의해 구동된다. CMVtetO는, 2개의 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO) 서열 모티프를 함유하는 서열의 삽입을 지녀서, 이 프로모터가 테트라사이클린 리프레서(TetR) 단백질에 의해 억제가능하다는 점에서 hCMV 프로모터와는 다르다. 상기 둘 다의 바이러스에서, RFL 발현 카세트는 AoHV-1 short(서열 번호 30)의 제어 하에 있다. 상기 두 벡터의 게놈의 개략도에 대해서는 도 5a를 참조한다.
상기 두 벡터는 본원에서 방법 섹션에서 설명한 전체-게놈 플라스미드 pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL에 의한 PER.C6 세포의 형질감염에 의해 생성하였다. 이러한 형질감염은 그 전날 플라스크당 3x106개의 PER.C6 세포를 접종한 T25 조직 배양 플라스크에서 형질감염당 4 ug의 SwaI-절단 플라스미드 DNA 및 리포펙타민 2000 형질감염용 시약(Invitrogen)을 사용하여 표준 절차에 따라 수행하였다. (SwaI 절단은 플라스미드 백본으로부터 아데노바이러스 벡터 게놈을 방출시키는 역할을 한다). 바이러스 레스큐(rescue) 형질감염의 수확 후, 대규모 바이러스 생성 감염을 형질감염 후 바이러스 계대수(VPN) 5로 수행할 때까지 PER.C6 세포에서 몇 회의 연속 감염 라운드에 의해 바이러스를 추가로 증폭시켰다. 이전에 설명된 바와 같이 2단계 염화세슘(CsCl) 밀도 구배 초원심분리 절차(Havenga et al., 2006)를 이용하여 조 바이러스 수확물로부터 바이러스를 정제하였다. 바이러스를 분광광도법-기반 절차에 의해 정량화하여 바이러스 입자(VP) 역가를 결정하고, TCID50 분석법에 의해 감염유발 단위(IU) 역가를 결정하였으며, 이는 이들 둘 다의 경우에 이전에 설명된 바와 같았다(Maizel, White, & Scharff, 1968).
Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL의 정제된 배치에 대한 VP 및 IU 정량화 결과가 표 1에 예시되어 있다. 상기 두 배치에 대하여 얻어진 바이러스 수율과 VP:IU의 비는 표준, 단일 트랜스진 발현 카세트-함유 Ad26-기반 벡터에 대하여 일상적으로 얻어진 것과 동일한 범위에 있다. 예를 들어, Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL의 배치들에 대하여 얻어진 VP:IU의 비, 즉, 23 및 14 둘 다는 상이한 (단일) 트랜스진 발현 카세트를 포함하는 Ad26-기반 벡터의 패널에 대하여 이전에 보고된 18, 11, 24, 10, 12, 및 26의 VP:IU의 비의 범위 내에 있다(Zahn et al., 2012).
아데노바이러스의 E1 영역으로부터의 두 트랜스진의 발현을 위한 두 동일 프로모터의 사용은, 아마도 상동 재조합에 의해 유전자 불안정성을 야기할 수 있음이 이전에 보고되었다(예를 들어, (Belousova et al., 2006) 및 국제 공개 제2016166088A1호의 실시예 2 참조). 이것이 hCMV 프로모터와 동일한 시스템에서 각각 E1 및 E4_rITR 위치에서 본 발명의 AoHV-1 프로모터의 조합의 사용에 의해 해결될 수 있는지를 체크하기 위하여, 이 조합에 있어서의 트랜스진 카세트의 완전성을 테스트하였다. 트랜스진(TG) 카세트 완전성은 PCR-기반 증폭, 이어서 트랜스진 카세트 삽입 영역의 서열결정에 의해 Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL의 두 정제 배치에 대하여 확인하였다(도 5b). 구체적으로, PCR을 수행하여, E1 내에 삽입된 TG 카세트를 증폭시키고("E1 PCR") E4와 RITR 사이의 TG 카세트를 표적화하여 두 PCR을 수행하였다("E4 PCR1" 및 "E4 PCR2"). 이러한 PCR에서 사용한 모든 프라이머는 Ad26-특이적 서열에 대하여 상보성이다(즉, 프라이머는 각각의 TG 카세트 그 자체 내에 위치하는 서열에는 어닐링되지 않는다). 모든 PCR은 예상된 크기의 생성물을 제공한 반면, 결실을 나타내는 더 작은 크기의 생성물은 인지되지 않았다. PCR 생성물의 서열결정도 돌연변이를 전혀 보여주지 않았다. 따라서, 단일 벡터에서의 본 발명의 AoHV-1 프로모터와 hCMV 프로모터의 조합은 유전적으로 안정한 벡터를 생성하였다.
마지막으로, Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL 및 Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL 정제 배치를, 이들이 코딩하는 두 루시퍼라아제를 발현하는 능력에 대하여 테스트하였다. 이를 위하여, 인간 세포주 A549를 두 바이러스에 의한 상이한 감염 다중도로 감염시키고, GLuc 및 RFL 활성을 2일 후에 수확한 샘플에서 탐지하였다. 결과는, 상기 둘 다의 벡터가 GLuc 및 RFL 둘 다를 발현할 수 있었음을 보여준다(도 5c 및 도 5d). 이는 관심있는 트랜스진 발현 카세트 배열들이, 이들이 테스트된 아데노바이러스 게놈의 맥락 내에서 전적으로 기능성임을 나타낸다.
결론적으로, AoHV-1 short는 바이러스 벡터 내에 삽입된 트랜스진 발현 카세트로부터의 관심의 대상이 되는 단백질의 발현을 유도하기 위한 프로모터로서 적용될 수 있다. 이것은 상기에 예시되어 있으며, 여기서, 두 아데노바이러스 벡터(각각은 아데노바이러스 벡터 게놈 내의 상이한 위치들에 삽입된 2개의 별개의 트랜스진 발현 카세트들을 포함함)의 맥락에서 RFL을 발현하기 위하여 AoHV-1 short를 이용하였다. 이러한 아데노바이러스 벡터는 쉽게 생성되었으며, 이는 양호한 VP:IU의 비를 나타내고 유전적으로 그리고 기능적으로 온전한 트랜스진 발현 카세트를 갖는 고역가 정제 벡터 배치를 생성할 수 있는 것으로 입증되었다.
실시예 5: 세포에서의 관심의 대상이 되는 유전자의 안정한 발현을 위한 플라스미드에서의 AoHV-1 프로모터의 적용
안정한 세포주에서 이종 유전자의 발현이 유도되도록 AoHV-1 프로모터를 적용할 수 있다. 본원에서 이것은 TetR 유전자 발현이 AoHV-1 프로모터에 의해 유도되는 플라스미드인 pC_AoHV_TetR을 사용한 TetR-발현 세포주의 생성에 의해 예시된다.
pC_AoHV_TetR은 도 6a에 도시되어 있으며, 본원에서 방법 섹션에 설명되어 있다. 이것은 AoHV-1 프로모터의 제어 하의 TetR-코딩 발현 카세트, 및 SV40-유래된 프로모터의 제어 하의 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II 유전자 발현 카세트를 포함한다. 후자의 카세트는 제네티신-보충된 세포 성장 배지의 사용에 의한 안정하게 형질감염된 세포의 선발을 허용한다.
본원에서 "PER.C6-AoHV.TetR 세포주의 생성 절차" 하에 방법 섹션에 추가로 상술된 바와 같이, pC_AoHV_TetR을 인간 세포주 PER.C6의 안정한 형질감염에 이용하였다. 이것은, 단일 세포 클로닝 후, 다수의 TetR-발현 "PER.C6-AoHV.TetR" 세포 클론의 효율적인 생성으로 이어졌다. TetR을 검출하기 위한 유세포 분석법용 세포내 염색 프로토콜을 기반으로 하면 제1 스크리닝 단계에서 100개의 테스트한 제네티신-내성 클론 중 94개의 클론이 TetR 발현에 대하여 양성임이 밝혀졌다(데이터는 예시되어 있지 않음). 이러한 TetR-양성 클론 중 47개의 클론에서의 제2 스크리닝 단계 후(데이터는 예시되어 있지 않음), 선발된 24개의 클론을 소규모 연구용 세포 은행에서 저온보관하였다.
12개의 저온보관 PER.C6-AoHV.TetR 클론은 진탕 플라스크에서 그의 해동 후 성장 성능 및 (기능성) TetR을 발현하는 그의 능력(장시간 계대배양시에(60회까지의 집단 배가))을 추가로 평가하였으며, 이들 둘 다는 제네티신 선발의 존재 하에 그리고 제네티신 선발의 부재 하에 하였다. 모든 클론은 적어도 모 현탁 PER.C6 대조 세포주만큼 효율적으로, 그리고 유사한 생존성으로 성장함이 밝혀졌다(데이터는 예시되어 있지 않음). 유세포 분석법용 세포내 염색에 의한 TetR 발현의 분석은 TetR-양성 세포 분율이 장시간 계대배양 실험 전체에 걸쳐 높게(즉, 97% 이상) 남아있음을 추가로 입증하였다. 이것은 3가지 대표적인 클론(PER.C6-AoHV.TetR 클론 1~3)에 대하여 도 6b에 예시되어 있다. 마지막으로, TetR 기능성 분석법에 의하면, 12개의 클론 전부가 그의 장시간 계대배양 후 유의한 TetR-매개 억제 활성을 나타냄이 입증되었으며, 이는 PER.C6-AoHV.TetR 클론 1~3에 대하여 도 6c에 나타낸 바와 같았다. 구체적으로, 제60세대에서, 모든 12개의 PER.C6-AoHV.TetR 클론은 TetR-조절 프로모터에 의해 유도되는 아데노바이러스 벡터-코딩 리포터 유전자의 발현을 억제하는 능력을 유지하였다. 상기 12개의 상이한 클론에 대하여 관찰된 억제의 수준은 인간 CMV 프로모터에 의해 제어되는 TetR 발현 카세트를 포함하는 이전에 기술된 TetR-발현 플라스미드 pCDNA6/TR을 이용하여 생성한 양성 대조 세포주(PER.C6-hCMV.TetR)에 대하여 관찰된 것과 유사하였다(또는 이보다 더 높았다).
결론적으로, TetR 발현이 AoHV1 프로모터에 의해 유도되는 안정한 sPER.C6-AoHV.TetR 세포주가 성공적으로 생성되었다. 이것은 본 발명에 따른 AoHV-1 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스진이 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 후 관심의 대상이 되는 단백질의 안정한 발현의 비제한적인 하나의 예이다.
실시예 6: 상이한 버전의 AoHV-1 프로모터의 설계
이종 유전자의 발현을 위한 AoHV-1 주요 극초기 조절 영역의 필수적인 부분을 지도화하기 위하여, 상이한 버전의 AoHV-1 프로모터의 패널을 만들었다. 상이한 설계들이 도 7a에 제시되어 있다. 이러한 짧은 프로모터 서열의 필수적인 부분을 지도화하기 위하여 이미 매우 짧은 AoHV-1 short 서열이 절두되도록 두 설계를 만들었다. 다른 설계는 AoHV-1 short의 능력이 증가될 수 있는지를 테스트하기 위하여 추가적인 추정 도메인 및 세포 인자 결합 부위와 예상 인트론 서열을 포함한다.
테스트한 프로모터 버전은 버전 v00~v09로 명명되며 하기에 열거되어 있다:
v00: 서열 번호 30(천연 AvrII 부위를 가짐)
v01: 서열 번호 22
v02: 서열 번호 23
v03: 서열 번호 24
v04: 서열 번호 25
v05: 서열 번호 26
v06: 서열 번호 1(뉴클레오티드 위치 360에서의 시토신(c)의 단일 뉴클레오티드 삽입에 의해 AvrII 부위가 제거됨)
v07: 서열 번호 27
v08: 서열 번호 28
v09: 서열 번호 29
PER.C6 세포를 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키는 것을 이용하여 프로모터 활성을 테스트하였다. 상이한 프로모터 버전들이 본원에서의 방법 섹션에 설명된 pDualLuc 플라스미드에서의 가우시아 루시퍼라아제의 발현을 유도한다. 도 7b는 AoHV-1 short(버전 00)의 활성에 대한 프로모터 능력 테스트의 결과를 나타낸다. 이 실험을 2회 수행하였다. 각각의 개별 값을 동일 실험에서의 v00의 평균에 대하여 계산하였다. 두 실험으로부터의 값을 모아서 평균 및 표준 편차를 계산하였으며, 이를 AoHV-1 short v00에 대하여 나타낸다. v00 및 v06(각각 AvrII 부위를 포함하는, 그리고 AvrII 부위를 포함하지 않는 AoHV-1 short)은 동일 범위 내에 있는 것으로 여겨진다.
흥미롭게도, 절두형 버전 04는 AoHV-1 short(버전 00 및 06)에 비견되는 프로모터 활성을 나타낸다. 이 버전 04는 단지 371개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 이와는 대조적으로, 길이가 241개 뉴클레오티드인 추가의 절두형 버전 05는 AoHV-1 short와 비교하여 감소된 활성을 나타내는데, 이는 몇 개의 예상 세포 인자 결합 부위의 부재에 의해 설명될 수 있다. 이 프로모터 버전 05도 여전히 강력 프로모터로 여겨질 수 있다. 상기 프로모터의 활성은 절두를 더 함에 의해 점진적으로 감소될 것으로 예상된다.
대부분의 다른 프로모터 버전(이들 전부는 AoHV-1 short 프로모터와 비교하여 연장부를 함유함)의 능력은 AoHV-1 short 프로모터의 범위 내에 있다. 이들 연장형 AoHV-1 프로모터 변이체 중 v03(데이터는 예시되어 있지 않음)만이 AoHV-1 short와 비교하여 프로모터 활성의 두드러진 감소를 나타내지만, 이것은 v03에 있어서의 불완전한 인트론 서열의 존재에 의해 설명될 수 있으며, 즉, v03은 그의 연장부 내에 예상 스플라이스 도너 부위를 지니는 한편 v03에는 더 하류에 위치하는 임의의 예상 스플라이스 억셉터 부위가 결여되어 있다. 이와는 대조적으로, 연장형 AoHV-1 프로모터 변이체 v07, v08 및 v09(이들 각각은 (임의의) 그의 예상 스플라이스 도너 부위의 하류에 적어도 하나의 예상 스플라이스 억셉터 부위를 지님) 각각은 AoHV-1 short 프로모터의 범위 내의 발현을 나타냈다. 서열 v09는 v07과 비교하여 v07의 결실 돌연변이체이며, v09는 온전한 특정 예상 스플라이스 도너 및 억셉터 서열을 남기는 내부 결실을 지닌다. 데이터는 v09가 예상 인트론을 갖는 짧지만 강력한 AoHV-1 프로모터 변이체의 일례임을 보여준다. 유사하게 짧지만 강력한, 인트론-함유 프로모터는 유사한 결실을 (v07에 적용된 상기 내부 결실로서) AoHV-1 프로모터 변이체 v08에 적용함으로써 생성될 수 있을 것으로 생각될 수 있다.
2가지 추가적인 AoHV-1 프로모터 서열들, 서열 번호 33의 서열 및 서열 번호 34의 서열을 또한 설계하고, 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 유도하는 능력에 대하여 테스트하였다. AoHV-1 short(즉, 서열 번호 30)와 비교하여, 이러한 두 서열 각각은 84 bp 길이의 3' 절두부를 지니며, 더욱이, 각각 2개 및 7개의 단일 뉴클레오티드 치환을 지닌다(그의 AoHV-1 프로모터 코어 영역 내에). 상기 3' 절두로 인하여, 서열 번호 33의 서열 및 서열 번호 34의 서열 둘 다는 AoHV-I 프로모터의 추정 개시 서열의 하류에 1개의 AoHV-1 뉴클레오티드만을 포함한다.
서열 번호 33의 서열을 플라스미드 pC_AoHV_TetR(본원에서 방법 섹션에 설명됨) 내로의 합성 유전자 단편의 일부로서의 삽입에 의해 TetR-코딩 서열에 작동가능하게 연결하여서 이 플라스미드의 AoHV-1 short 프로모터를 대체하였다. 후속적으로, PER.C6 세포의 일시적 형질감염, 이어서 항-TetR 단클론 항체(TetR03, MoBiTec)를 사용한 세포 용해물의 면역블로팅에 의해 서열 번호 33의 프로모터의 활성이 AoHV-1 short의 프로모터 활성과 유사함이 입증되었다(데이터는 예시되어 있지 않음).
서열 번호 34의 서열은 AvrII 및 AscI 제한효소 부위를 사용한 pDualLuc 내로의 합성 유전자 단편의 클로닝(본원에서 방법 섹션에 설명됨)에 의해 RFL-코딩 서열에 작동가능하게 연결시켰다. 후속적으로, PER.C6 세포의 일시적 형질감염 실험, 이어서 세포 용해물에서의 RFL 활성 측정에 의해 서열 번호 34의 서열이 기능성 프로모터 서열임이 입증되었다(데이터는 예시되어 있지 않음).
이러한 프로모터 변이체들의 활성은, 프로모터 활성에 있어서, 추정 Inr의 3'의 첫 번째 뉴클레오티드의 하류에 AoHV-1 서열을 포함하는 것이 요구되지 않음을 보여준다(즉, 서열 번호 30에서의 뉴클레오티드 399는 서열 번호 25에서의 뉴클레오티드 287에 상응한다).
결론
상기에 설명된 바와 같이, 짧고 강력한 프로모터가 아오틴 헤르페스바이러스-1로부터 확인되었다. AoHV-1 프로모터는 짧은 서열을 가지며, hCMV 프로모터에 비견되는 능력을 갖는다. 이러한 특징들은 hCMV 프로모터가 사용되는 임의의 상황에서 AoHV-1 프로모터가 대용물로 사용하기에 이상적인 프로모터가 되게 한다. 더욱이, AoHV-1 프로모터는 hCMV 프로모터와의 서열 동일성이 비교적 낮은데, 이는 2가지 상이한 트랜스진을 동일 바이러스 벡터로부터 발현시키는 경우 또는 유사 서열들을 또한 포함할 수 있는 생산자 세포주를 이용하여 바이러스를 생성하는 경우 AoHV-1 프로모터가 hCMV 프로모터와 조합하여 사용하기에 적합해지게 만든다. 또한 AoHV-1 프로모터는 AoHV-1 프로모터로부터의 전사를 조정하는 데 사용될 수 있는 조절 서열과 함께 사용하기에 적합하다.
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참고 문헌
미국 특허 문서:
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Figure pct00004
유럽 특허 문서:
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국제 특허출원 공보:
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Figure pct00008
기타 참고 문헌:
책
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저널
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SEQUENCE LISTING <110> Janssen Vaccines and Prevention B.V. <120> Potent and short promoter for expression of heterologous genes <130> 0284 WO 00 ORD <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 484 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AoHV-1 short (AvrII site eliminated with single nucleotide insertion of cytosine (c) at nucleotide position 360) <400> 1 aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60 gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120 aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180 cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240 cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300 tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctac 360 gggtatataa gcagagcccg gttagcagac cgccattcgc cttcaagaca gcgtgaggga 420 cccacgttct ccggaccagc caccgggacc gagcggccta gcctagccgg ggacccttca 480 ctgg 484 <210> 2 <211> 1333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AoHV-1 long <400> 2 cctaggtcaa tatactggat gtcagccagc taaaaaaata aacaataaaa tcgtcacctg 60 gcattcagcc aatggatcaa tgtattggct gaatgccata ctattgatat atagataatc 120 tattgccaat taattggcca tatagccaat acaatggcac ggggccaatg tattggctat 180 atatcaatat gatggcgggg ttccagtata ttaatatatt gccaatgtat tggctatata 240 tcaatatggt ggcaaggttc cagtatatta atctattggc aatctattgg ccatatatca 300 atatggtggc aaggttccag tatattaatc tattggcaat ctattggcca tatatcaata 360 tggtggcaag gttccagtat attaatctat tggcaatcta ttggccatat atcaatatgg 420 tggcaaggtt ccagtatatt aatctattgg caatctattg gccatatatc aatatggtgg 480 cagtgaccca agttattaat ctattgccaa tataggccaa tagattggag atgagccagt 540 ctatcaatcc ataatcaata tatatctatc agtattggga catatattga ttagtatggg 600 gtcaaatagg gtatttccgt gttcccatca atacttggca caaacaacac tatgactcaa 660 tgggctatgg gccaagaaca taggtcaaat agggtatttc cgtgttccca tctgtacttg 720 gcacaaacaa cactatgact caataggcta tttgccaaga acataaggtc aatcagggta 780 cttccgcgtt cccaccgccc catttggcaa caaaataggg gttatttggg 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accgagcggc ctagcctagc cggggaccct tcactggg 538 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E1 PCR - forward <400> 8 tggcgcgaaa actgaatgag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E1 PCR - reverse <400> 9 gcaggcgggt tgtcaaataa g 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 PCR1 - forward <400> 10 gacgggagca atccctccag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 PCR1 - reverse <400> 11 ccccacaaag taaacaaaag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 PCR2 - forward <400> 12 cgttctcact tcctcgtatc 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 PCR2 - reverse <400> 13 caacgctgat tggacgag 18 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tetO regulatory sequence <400> 14 ccctatcagt gatagag 17 <210> 15 <211> 883 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMVtetO in Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL <400> 15 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660 cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tctccctatc agtgatagag atctccctat cagtgataga gatcgtcgac gagctcgttt 780 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 840 ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga 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ggaactcgtc gctcgacagc accgccgcag ccgcggcagc 780 cgcagccgcc atgacagcga cgagactggc ctcgagctac atgcccagca gcggtagtag 840 cccctctgtg cccagttcca tcatcgccga ggagaaactg ctggccctgc tggccgagct 900 ggaagccctg tgtacatact ttaatgctcc aaagctagca cccaaaaact gcatgctgga 960 ataagctctc tttgtgtcac cggtgatgcc ttccaatagg tgagtgataa agcgaggtag 1020 tttttcttta atcatttgag taatagaaaa gtcctctaaa taagtcacta ggaccccagg 1080 aaccacaatg tggtagctga cagcgtgtcg ctcaagcatg gttagtagag atgagagtct 1140 gaaaaacaga aagcatgcac taaaccagag ttgccagtct cactgaagga aaaatcactc 1200 tctccagcag caaagtgccc actgggtggc cctctcggac atacaaaaat cgatccgtgt 1260 ggttaaagag cagcacagtt agctcctgtc ttctcccagc aaagatcaca tcggactggg 1320 ttagtatgcc cctggaatgg tagtcattca aggccataaa tctgccttgg tagccattag 1380 gaatcagcac gctcactctc aagtgaacca aaaccacccc atgcggagga atgtggaaag 1440 attctgggca aaaaaaggta tatctattgc tagtcccttc ctggacggga gcaatccctc 1500 cagggctatc tatgaaagca tacagagatt cagccatagc tcagcccgct taccagtaga 1560 cagagagcac agcagtacaa gcgccaacag cagcgactga ctacccactg acccagctcc 1620 ctatttaaag gcaccttaca ctgacgtaat gaccaaaggt ctaaaaaccc cgccaaaaaa 1680 acacacacgc cctgggtgtt tttcgcgaaa acacttccgc gttctcactt cctcgtatcg 1740 atttcgtgac tcaacttccg ggttcccacg ttacgtcact tctgccctta catgttaatt 1800 aactcagccg tagggcgcca tcttgcccac gtccaaaatg gcttccatgt ccggccacgc 1860 ctccgcggcg accgttagcc gtgcgtcgtg acgtcatttg catcaccgtt tctcgtccaa 1920 tcagcgttgg ctccgcccca aaaccgttaa aattcaaaag ctcatttgca tattaacttt 1980 tgtttacttt gtggggtata ttattgatga tgatttaaat attaat 2026 <210> 17 <211> 1813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV_GLuc_SV <400> 17 accggtgacc cgcgtccgtg tcaaagtccg gtgtttatgt cacagatcag ctgagcgatc 60 tcgagtcaat attggccatt agccatatta ttcattggtt atatagcata aatcaatatt 120 ggctattggc cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca 180 tgtccaacat taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 240 acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 300 ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 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480 tggaacgcgg atacagcgtg ccaaattaag gtatggagcg cggatggtat agcttgcatg 540 ctgattggtg gctggtggcg gtatctatag tatataatgt atagcctatt catggtatag 600 gcctccatat tgggggctgt gccgccattt taatgcatgg atgacgtgtg ggcttaatgt 660 atagatattg attattgatt aatcatggca gccatagctt ttatctgcat gttaatgata 720 cagctgccat tactatgtgc ccttatgccc tatatgttac taatttcctt gttggcacag 780 tgcctaacag tgctaatgta tgctttgcta taatgggcgg tgggccaggc ctggcatcgg 840 gccaactttt tgctaattgc tgggggcgct tctccatgtt gttgtggttt attattttgg 900 cacccggcca ttatgcggag cccctgtcag tcgaaacccg ggttttggca ccgtgccaaa 960 ttcacgtcat ccatacatag agctataatg tgatttggtg atggttaaca tatggtgatg 1020 cgtcagtaca ttcatgacaa cacgccacac acactttagg ctgcatgccc tctccacaca 1080 ctcttttctg gacgcttgcc agttttggcc cagtgccaat ttaccgctac agacacagta 1140 aactgagtta gattgtt 1157 <210> 25 <211> 371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> v04 <400> 25 tattagtcaa tgtccttggc caatagccag tgacgtcaat gggaacgggg ccagttcccc 60 tttcccacca ttaccggcaa tggtgggtgg ggaaattcca tattagtcaa tgttcttggc 120 accaaaaccg cggggacttt ccattgacgt cagtggaaag gggcgtaacg gggagtgacc 180 atgggcgttc ccgggcggag ttatgggcgt tactgggcgg ttcgtgggcg gaccatgggc 240 tgtcctaggg tatataagca gagcccggtt agcagaccgc cattcgcctt caagacagcg 300 tgagggaccc acgttctccg gaccagccac cgggaccgag cggcctagcc tagccgggga 360 cccttcactg g 371 <210> 26 <211> 241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> v05 <400> 26 cggggacttt ccattgacgt cagtggaaag gggcgtaacg gggagtgacc atgggcgttc 60 ccgggcggag ttatgggcgt tactgggcgg ttcgtgggcg gaccatgggc tgtcctaggg 120 tatataagca gagcccggtt agcagaccgc cattcgcctt caagacagcg tgagggaccc 180 acgttctccg gaccagccac cgggaccgag cggcctagcc tagccgggga cccttcactg 240 g 241 <210> 27 <211> 1728 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> v07 <400> 27 aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60 gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120 aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180 cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240 cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300 tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360 ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc gccattcgcc ttcaagacag cgtgagggac 420 ccacgttctc cggaccagcc accgggaccg agcggcctag cctagccggg gacccttcac 480 tggaacgcgg atacagcgtg ccaaattaag gtatggagcg cggatggtat agcttgcatg 540 ctgattggtg gctggtggcg gtatctatag tatataatgt atagcctatt catggtatag 600 gcctccatat tgggggctgt gccgccattt taatgcatgg atgacgtgtg ggcttaatgt 660 atagatattg attattgatt aatcatggca gccatagctt ttatctgcat gttaatgata 720 cagctgccat tactatgtgc ccttatgccc tatatgttac taatttcctt gttggcacag 780 tgcctaacag tgctaatgta tgctttgcta taatgggcgg tgggccaggc ctggcatcgg 840 gccaactttt tgctaattgc tgggggcgct tctccatgtt gttgtggttt attattttgg 900 cacccggcca ttatgcggag cccctgtcag tcgaaacccg ggttttggca ccgtgccaaa 960 ttcacgtcat ccatacatag agctataatg tgatttggtg atggttaaca tatggtgatg 1020 cgtcagtaca ttcatgacaa cacgccacac 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gagatgagcc agtctatcaa tccataatca atatatatct atcagtattg 780 ggacatatat tgattagtat ggggtcaaat agggtatttc cgtgttccca tcaatacttg 840 gcacaaacaa cactatgact caatgggcta tgggccaaga acataggtca aatagggtat 900 ttccgtgttc ccatctgtac ttggcacaaa caacactatg actcaatagg ctatttgcca 960 agaacataag gtcaatcagg gtacttccgc gttcccaccg ccccatttgg caacaaaata 1020 ggggttattt gggggtcttc cccttgaaat caatgacttg gcaagcatat acatccgtcc 1080 tggcaccaga ataggggtta aatggggact ttccataagc ccaccgcctc atttggcacc 1140 aaaaaggggg atttctatta ttagtcaatg tccttggcca atagccagtg acgtcaatgg 1200 gaacggggcc agttcccctt tcccaccatt accggcaatg gtgggtgggg aaattccata 1260 ttagtcaatg ttcttggcac caaaaccgcg gggactttcc attgacgtca gtggaaaggg 1320 gcgtaacggg gagtgaccat gggcgttccc gggcggagtt atgggcgtta ctgggcggtt 1380 cgtgggcgga ccatgggctg tcctagggta tataagcaga gcccggttag cagaccgcca 1440 ttcgccttca agacagcgtg agggacccac gttctccgga ccagccaccg ggaccgagcg 1500 gcctagccta gccggggacc cttcactgga acgcggatac agcgtgccaa attaaggtat 1560 ggagcgcgga tggtatagct tgcatgctga ttggtggctg gtggcggtat ctatagtata 1620 taatgtatag cctattcatg gtataggcct ccatattggg ggctgtgccg ccattttaat 1680 gcatggatga cgtgtgggct taatgtatag atattgatta ttgattaatc atggcagcca 1740 tagcttttat ctgcatgtta atgatacagc tgccattact atgtgccctt atgccctata 1800 tgttactaat ttccttgttg gcacagtgcc taacagtgct aatgtatgct ttgctataat 1860 gggcggtggg ccaggcctgg catcgggcca actttttgct aattgctggg ggcgcttctc 1920 catgttgttg tggtttatta ttttggcacc cggccattat gcggagcccc tgtcagtcga 1980 aacccgggtt ttggcaccgt gccaaattca cgtcatccat acatagagct ataatgtgat 2040 ttggtgatgg ttaacatatg gtgatgcgtc agtacattca tgacaacacg ccacacacac 2100 tttaggctgc atgccctctc cacacactct tttctggacg cttgccagtt ttggcccagt 2160 gccaatttac cgctacagac acagtaaact gagttagatt gttttattca cagggaactg 2220 ttattgacag ggctggtaca cagtcctctt tgcccatctc aggcacatca atgatggtgt 2280 cctgggggac ccggttcaag gcctctgctt cctccatgat ctcttgcaca gcttcctcca 2340 gattcttgtc agtagagcag aaactgcaca tcatgactgt gattataagt ccgaacatac 2400 acagtatagc gcctatggag ctcacggggc gcatccaggc attatgtgca aaagatagta 2460 catgcgaacg gtcagagctt ctcccggtgg tagtaggttg acttgaggta agaatggtgg 2520 tgctcacagt agtagatgag tgatctagaa atggacatta gtcttaatat ctatttttag 2580 atcacatgag ggggggtagg cttcatgaat gttgtctctg tccacttact ggtggtttga 2640 gtgacacttg tggtgacatt atcagcagtg gtggcgttga gcatccaggc gatggcgcat 2700 ccacagatga taagtcccag ggggtccagg tccctgaagg taacaggtgt ttgtgtttac 2760 tcacagctgt aaag 2774 <210> 33 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first variant AoHV-1 short with 3' trunctation <400> 33 aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60 gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120 aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180 cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240 cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300 tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360 ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc gccactctc 399 <210> 34 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second variant AoHV-1 short promoter with 3' truncation <400> 34 aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60 gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120 aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180 cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240 cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300 tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360 ggtatataag cagagctctg ttcgcacacc tccactctc 399 <210> 35 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter (Fig 2A) <400> 35 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 60 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 120 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 180 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 240 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 300 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 360 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 420 cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc attgga 456 <210> 36 <211> 398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chCMV short promoter (Fig 2A) <400> 36 cgccaattgc atcatcctat tgtttttcta tgggaatttc cctattggca gtacatcaac 60 gtattactaa tggggatttc caatgactaa tacaacgggc agtacgccca gtacgtatga 120 ctaatgggac tttccataat cccgccccat tgacgtcaat gggcatccgt tctggcacca 180 aaatgaatgg gaatttccaa tatgagtcat aaaccccgcc ccattgacgc acattacacg 240 tcaatgggcg gtaggcgtgc cctatgggcg gtctatataa gcagagcccg tttagtgaac 300 cgtcacttcg cttggagcca ccgtccacgc tgtttggagc tccatagaag gaaccgggac 360 ccagccagcc tccgtagccg ggaacggtgc attggaac 398 <210> 37 <211> 785 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter (Fig 2B) <400> 37 aaatcaatat tggctattgg ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt 60 atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat 120 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 180 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 240 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 300 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 360 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 420 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 480 ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 540 tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 600 aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 660 tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 720 gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 780 ttgga 785

Claims (25)

  1. 이종 트랜스진에 작동가능하게 연결된 아오틴 헤르페스바이러스(Aotine Herpesvirus) 1 주요 극초기 프로모터(AoHV-1 프로모터)를 포함하는 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 237~286에 대하여 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 바람직하게는 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 201~286과 적어도 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, AoHV-1 프로모터는 AoHV-1 프로모터로부터의 전사를 조정하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, AoHV-1 프로모터는 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(tetO 부위)을 포함하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 플라스미드 벡터인 벡터.
  7. 제5항에 있어서, 아데노바이러스인 바이러스.
  8. 제7항에 있어서, 게놈에서, 바람직하게는 게놈의 적어도 E1 영역에서 하나 이상의 결실을 갖는 아데노바이러스.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 바이러스를 포함하는 세포.
  10. 게놈 내에 AoHV-1 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 포함하며, 바람직하게는 상기 프로모터는 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 것인 세포.
  11. 제10항에 있어서, AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 237~286에 대하여 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 바람직하게는 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 201~286과 적어도 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산 분자.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 게놈 내의 AoHV-1 프로모터는 테트라사이클린 리프레서(TetR) 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 바람직하게는 상기 세포는 PER.C6 세포인, 세포.
  13. 다음을 포함하는 세포: (i) 제1 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 핵산 분자, 및 (ii) 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 hCMV 프로모터를 포함하는 핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서, AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 237~286에 대하여 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 바람직하게는 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 201~286과 적어도 95% 이상 동일한 서열을 포함하고, hCMV 프로모터는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 578~736에 대하여, 바람직하게는 뉴클레오티드 564~736에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세포.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 제1 트랜스진은 TetR을 코딩하며, 바람직하게는 세포는 PER.C6 세포인, 세포.
  16. 제15항에 있어서, 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 hCMV 프로모터를 포함하는 핵산 분자는 아데노바이러스의 일부인 세포.
  17. 다음을 포함하는 벡터: (i) 제1 트랜스진에 작동가능하게 연결된 AoHV-1 프로모터를 포함하는 핵산 분자, 및 (ii) 제2 트랜스진에 작동가능하게 연결된 hCMV 프로모터를 포함하는 핵산 분자.
  18. 제17항에 있어서, AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 237~286에 대하여 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 바람직하게는 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 201~286과 적어도 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 벡터.
  19. 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 생성하는 방법으로서, 숙주 세포에서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자로부터의 트랜스진의 발현 단계를 포함하며, 트랜스진은 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 코딩하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 발현 생성물은 단백질인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 숙주 세포로부터, 또는 숙주 세포가 배양된 배양 배지로부터, 또는 상기 숙주 세포 및 상기 배양 배지 둘 다로부터 관심의 대상이 되는 발현 생성물을 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 바이러스를 생성하는 방법으로서, 바이러스를 증식시키는 기능을 갖는 이종 유전자를 발현하는 세포에서 상기 바이러스를 증식시키는 단계(여기서, 상기 이종 유전자는 AoHV-1 프로모터의 제어 하에 있음), 및 바이러스를 상기 세포로부터, 또는 상기 세포가 배양된 배양 배지로부터, 또는 상기 세포 및 상기 배양 배지 둘 다로부터 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 237~286에 대하여 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 바람직하게는 AoHV-1 프로모터는 서열 번호 25의 뉴클레오티드 201~286과 적어도 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 방법.
  24. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 바이러스 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  25. 아데노바이러스를 제조하는 방법으로서, 제12항에 따른 세포에서 하나 이상의 tetO 부위에 작동가능하게 연결된 hCMV 프로모터의 제어 하의 트랜스진을 코딩하는 아데노바이러스를 증식시키는 단계, 및 바람직하게는 아데노바이러스를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
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