CN116438192A - 基于aav5的sars-cov-2疫苗 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物技术、免疫学、病毒学、遗传学和分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及分离的重组SARS‑CoV‑2(严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2)S糖蛋白受体结合结构域(RBD‑S)，涉及编码SARS‑CoV‑2的RBD‑S的核酸，涉及表达盒及基于其的载体，以及涉及用于诱导对SARS‑CoV‑2的特异性免疫和/或预防SARS‑CoV‑2相关冠状病毒感染的重组的基于AAV5(腺相关病毒血清型5)的病毒，涉及用于诱导对SARS‑CoV‑2的特异性免疫和/或预防SARS‑CoV‑2相关冠状病毒感染的基于AAV5的疫苗，和涉及它们用于诱导对SARS‑CoV‑2的特异性免疫和/或预防SARS‑CoV‑2相关冠状病毒感染的用途。

Description

基于AAV5的SARS-COV-2疫苗
发明领域
本申请涉及生物技术、免疫学、病毒学、遗传学和分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及分离的重组SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2)S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)，涉及编码SARS-CoV-2的RBD-S的核酸，涉及表达盒及基于其的载体，以及涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫和/或预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的重组的基于AAV5(腺相关病毒血清型5)的病毒，涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫和/或预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的基于AAV5的疫苗，和涉及它们用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫和/或预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的用途。
发明背景
SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)为乙型冠状病毒属(Betacoronavirus genus)沙贝病毒亚属(Sarbecovirus subgenus)的成员。
SARS-CoV-2于2019年12月作为对取自肺炎患者的样品的分析结果而被鉴定。2019年12月31日，世界卫生组织获悉由先前未知的病原体引起的几例病毒性肺炎。该病毒的完整基因组在中国首次解码。
包括SARS-CoV-2在内的冠状病毒一般引起急性呼吸道疾病。该家族还包括SARS-CoV和MERS-CoV，它们分别引起严重急性呼吸综合征和中东呼吸综合征。
SARS-CoV-2负责持续的COVID-19大流行。2020年1月，世界卫生组织宣布SARS-CoV-2爆发为国际关注的公共卫生紧急事件，并于2020年3月11日其将该疾病的全球传播定性为大流行。
GenBank数据库，Wu F.,Severe acute respiratory syndrome coronavirus2isolate Wuhan-Hu-1,complete genome,2020,GenBank:MN908947.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947)和Fan Wu等人，A new coronavirusassociated with human respiratory disease in China,2020,Nature,volume 579,pages 265-269(https://www.nature.com/articles/s41586-020-2008-3)的文章提供了关于SARS-CoV-2基因组的信息。
专利文件CN110951756(B)公开了编码SARS-CoV-2抗原肽的核苷酸序列，并规定这些核苷酸序列可被用于诱导适当的免疫应答；预计它们将被用于针对SARS-CoV-2的疫苗。
专利文件CN110974950B公开了用于预防SARS-CoV-2感染的疫苗，其中该疫苗包含含有编码SARS-CoV-2抗原肽的核酸序列的Ad5腺病毒载体。
专利文件RU2720614 C1(以俄罗斯联邦卫生部荣誉院士N.F.Gamaleya命名的国家流行病学和微生物学研究中心)公开了基于包含SARS-CoV-2的S蛋白基因的重组腺病毒血清型5和/或26颗粒的疫苗。
截至本申请递交之日，SARS-CoV-2病例已达到超过23,000,000例，且SARS-CoV-2死亡已达到超过800,000例。此外，COVID-19大流行在申请递交之日仍在继续。因此，全球迫切需要有效手段来预防和治疗由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起的疾病。
发明描述
本发明的作者已经开发了分离的重组SARS-CoV-2糖蛋白S受体结合结构域(RBD-S)，该结构域被用作用于哺乳动物有效免疫的抗原，诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫，该事实助于预防SARS-CoV-2相关疾病。本发明的作者还开发了用于将所述抗原递送至哺乳动物生物体的手段，特别是包括编码所述抗原的核酸的表达载体、包含编码所述抗原的核酸的重组的基于AAV5(腺相关病毒血清型5)的病毒、包含所述对象的疫苗以及使用它们用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫和/或预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的方法。
发明简述
在一个方面，本发明涉及分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。
在一个方面，本发明涉及分离的重组SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2)S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。
在一个方面，本发明涉及编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的分离的核酸。
在一些实施方案中，分离的核酸为DNA。
在一些实施方案中，分离的核酸为SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的核酸为密码子优化的核苷酸序列。
在一个方面，本发明涉及包括编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中任何一种的表达盒。
在一些实施方案中，表达盒在5’-端到3’-端方向上包括以下元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复序列)；
CMV(巨细胞病毒)增强子；
CMV(巨细胞病毒)启动子；
hBG1基因(血红蛋白亚基γ1基因)的内含子；
编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种。
hGH1多腺苷酸化信号(人类生长激素基因多腺苷酸化信号)
右手(第二)ITR。
在一些实施方案中，表达盒包括具有SEQ ID NO:3的核酸。
在一个方面，本发明涉及表达载体，其包括编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种，或所述表达盒中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫和/或预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的分离的重组的基于AAV5(腺相关病毒血清型5)的病毒，其包含衣壳和所述表达盒中的任何一种。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1的衣壳。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1的衣壳，所述VP1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1的衣壳，所述VP1具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1的衣壳，所述VP1具有SEQ ID NO:5(S2A和T711S)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1的衣壳，所述VP1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且表达盒在5’-端到3’-端方向上包括以下元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复序列)；
CMV(巨细胞病毒)增强子；
CMV(巨细胞病毒)启动子；
hBG1基因(血红蛋白亚基γ1基因)的内含子；
编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种。
hGH1多腺苷酸化信号(人类生长激素基因多腺苷酸化信号)
右手(第二)ITR。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1的衣壳，所述VP1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列，并且表达盒包含具有SEQ ID NO:3的核酸。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1的衣壳，所述VP1具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列，该AAV5蛋白VP1为SEQ ID NO:5(S2A和T711S)的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的药用组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的所述重组的基于AAV5的病毒中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的药用组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的所述重组的基于AAV5的病毒中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及所述重组的基于AAV5的病毒或所述药用组合物中的任何一种用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的用途。
在一个方面，本发明涉及所述重组基于AAV5的病毒或所述药用组合物中的任何一种用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的用途。
在一个方面，本发明涉及用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的疫苗，其包含有效量的所述重组基于AAV5的病毒中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的疫苗，其包含有效量的所述重组基于AAV5的病毒中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的方法，其包括给予哺乳动物生物体有效量的用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的所述重组的基于AAV5的病毒、所述组合物或所述疫苗中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的方法，其包括给予哺乳动物生物体有效量的用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的所述重组的基于AAV5的病毒、所述组合物或所述疫苗中的任何一种。
附图简述
图1为质粒pAAV-RBD-S的示意图，该质粒预期产生具有表达盒的AAV载体，该表达盒包含重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的RBD-S基因序列
前导肽为提供靶蛋白分泌的肽
RBD-S为重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域AmpR为提供对氨苄青霉素的抗性的β-内酰胺酶基因，
pUC起点为细菌中的pUC复制起点，
ITR为反向末端重复序列，
CMV-增强子为巨细胞病毒增强子，
CMV-启动子为巨细胞病毒早期基因的启动子，
Poly A为多腺苷酸化信号序列，用于提高mRNA稳定性，
HBG内含子为人类β球蛋白内含子。
图2为显示在用病毒AAV5-RBD-S产物进行细胞转导后3天CHO-K1-S细胞培养物中RBD-S蛋白浓度的图表。
图3、4为显示在用AAV5-RBD-S产物进行免疫(以1x1011 VG/小鼠肌内注射；注射体积为200μl)后研究动物血浆中RBD-S蛋白的抗体含量的图表。图3为研究中每只动物的个体得分。图4为平均值±标准偏差(n＝8)。VG为病毒基因组。
图5、6为显示用AAV5-RBD-S产物进行免疫(以4x1011 VG/小鼠肌内注射；注射体积为200μl)后研究动物血浆中RBD-S蛋白的抗体含量的图表。图5为研究中每只动物的个体得分。图6为平均值±标准偏差(n＝8)。VG为病毒基因组。
图7为显示在用AAV5产物进行免疫后研究动物血浆中RBD-S蛋白的抗体含量的图表，所述AAV5产物的基因组不含具有RBD-S基因的表达盒(具有空AAV5衣壳的产物)。以8.6x1010 CP/小鼠肌内注射；注射体积为200μl。图表显示研究中每只动物的个体得分。CP为病毒衣壳。
图8、9为显示在用纯化的重组RBD-S蛋白产物进行免疫(以20μg/小鼠肌内注射)后研究动物血浆中RBD-S蛋白的抗体含量的图表。图8为研究中每只动物的个体得分。图9为平均值±标准偏差(n＝7)。
图10为显示在用对照无AAV产物进行免疫后研究动物血浆中RBD-S蛋白的抗体含量的图表。图表显示研究中每只动物的个体得分。
定义和通用方法
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
进一步地，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数术语。一般地，本文描述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学以及蛋白和核酸的杂交和化学的当前分类和方法为本领域技术人员众所周知和广泛使用的。酶反应和纯化方法根据制造商的指南进行，如本领域常见的或如本文所述。
“分离的”意指从自然状态改变或取出的。例如，自然存在于动物体内的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全分离自其自然状态的共存物质的同一核酸或肽为“分离的”。分离的核酸或蛋白可以基本上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境比如遗传修饰细胞中。
术语“自然存在”、“天然”或“野生型”被用于描述可在自然界中发现的与人工产生不同的对象。例如，存在于生物体(包括病毒)中，可从自然界的来源中分离，并且没有经实验室人员故意修饰的蛋白或核苷酸序列为自然存在的。
术语“基因组”是指生物体的完整遗传物质。
如本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另外规定，否则词语“包括(include)”和“包含(comprise)”或其变体比如“具有(having)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意指包含所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
蛋白质(肽)
如本说明书中使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且它们是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可组成蛋白或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白。如本说明书中使用的，该术语既指短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物，也指长链，其在本领域中通常被称为蛋白，其有许多类型。“多肽”尤其包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
核酸分子
在本描述书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”意指核苷酸的精确序列，无论修饰与否，确定核酸的片段还是区域，是否含有非天然核苷酸，并且为双链DNA或RNA、单链DNA或RNA或所述DNA的转录产物。
本领域的技术人员具有核酸为可水解为单体“核苷酸”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可水解成核苷。如本说明书中使用的，作为非限制性实例，多核苷酸包括通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，作为非限制性实例，所述手段包括重组手段，即使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，以及通过合成手段。
此处还应注意，本发明不涉及在其自然染色体环境中，即在自然状态下的核苷酸序列。本发明的序列已被分离和/或纯化，即它们被直接或间接取样，例如通过拷贝，它们的环境已至少被部分地修饰。因此，此处还应提及通过重组遗传学凭借例如宿主细胞获得的，或通过化学合成获得的分离的核酸。
除非另外指明，否则术语核苷酸序列包括其补体。因此，具有特定序列的核酸应被理解为包括具有其互补序列的其互补链的核酸。
术语“转化”、“转染”和“转导”是指通过其来将核酸引入到细胞或宿主生物体中的任何方法或手段，并且可互换使用以传达相同的含义。此类方法包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、感染、PEG融合等。
腺相关病毒(AAV)
细小病毒科(Parvoviridae family)的病毒为小型含DNA的动物病毒。细小病毒科可被分成两个亚科：细小病毒亚科(Parvovirinae)，其成员感染脊椎动物，和浓核病毒亚科(Densovirinae)，其成员感染昆虫。截至2006年，已有11种血清型的腺相关病毒被描述(Mori,S.等人，2004,《Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey:pseudotyping characterization of capsid protein》,Virology,Т.330(2):375-83)。所有已知的血清型均可感染来自多种组织类型的细胞。组织特异性由衣壳蛋白血清型决定；因此，通过分配期望的血清型来构建基于腺相关病毒的载体。有关细小病毒(parvovirus)和细小病毒科其他成员的进一步信息在文献(Kenneth I.Berns,《Parvoviridae:The Viruses and Their Replication》,Chapter 69in Fields Virology(3d Ed.1996))中描述。
所有已知AAV血清型的基因组组织都非常相似。AAV的基因组为长度小于约5000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。反向末端重复序列(ITR)位于非结构蛋白(Rep)和结构蛋白(Cap)复制的独特编码核苷酸序列的侧翼。Cap基因编码形成衣壳的VP蛋白(VP1、VP2和VP3)。末端145个核苷酸为自身互补的，并且被组织成使得可形成能量稳定的形成T形发夹的分子内双链体。这种发夹结构作为病毒DNA复制的起点发挥作用，充当细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中感染野生型AAV(wtAAV)后，Rep基因(例如Rep78和Rep52)分别使用P5启动子和P19启动子进行表达，并且这两种Rep蛋白在病毒基因组的复制中都具有某些功能。Rep开放阅读框(Rep-ORF)中的剪接事件导致实际上4种Rep蛋白(例如Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已经表明，编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA足以在哺乳动物细胞中产生AAV载体。
载体
如本文使用的，术语“载体”意指能够运送其所连接的另一核酸的核酸分子。
如关于病毒滴度使用的术语“感染单位(iu)”、“感染性颗粒”或“复制单位”是指如通过感染中心测定(也被称为复制中心测定)测量的感染性重组AAV载体颗粒的数量，如例如在McLaughlin等人，J.Virol.(1988)62:1963-1973中所述。
当涉及核酸序列比如编码序列和调控序列时，术语“异源性的”表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源性”区域为自然界中未发现与另一分子相关的在另一个核酸分子内或与之连接的核酸片段。例如，核酸构建体的异源性区域可包括侧接自然界中未发现与编码序列相关的序列的编码序列。异源性编码序列的另一个实例为其中编码序列本身在自然界中不存在的构建体(例如具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。
如本说明书中使用的，术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
用途
术语“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”等意指减缓或预防疾病、障碍或感染的症状发作。
如本发明使用的，术语“免疫应答的诱导”是指对免疫应答活性的特定控制或影响，并且包括免疫应答的激活、免疫应答的刺激、免疫应答增强。
如本发明使用的，术语“特异性免疫”是指在诱导免疫应答之后对疾病免疫的状况。
术语“障碍”意指将从根据本发明的治疗中受益的任何病症。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的障碍的那些病理状况。
“疾病”为其中动物无法保持体内稳态并且其中如果疾病得不到改善则动物的健康会继续恶化的动物健康状态。
术语“受试者”、“患者”、“个体”等在本说明书中可互换使用，并且它们是指适用于本说明书中描述的方法的任何动物。在某些非限制性实施方案中，受试者、患者或个体为人。所述受试者可为任何年龄的男性或女性。
“治疗有效量”或“有效量”是指将在一定程度上减轻所预防疾病的一种或多种症状的所给予治疗剂的量。
发明详述
肽抗原
在一个方面，本发明涉及分离的重组SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2)S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)，其通过以下氨基酸序列表示：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPSSFGGVS(SEQ ID NO:1)。
所述SARS-CoV-2的RBD-S得自SARS-CoV-2的全长S糖蛋白，其已在GenBank数据库中描述，Wu F.,Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2isolate Wuhan-Hu-1,complete genome,2020,GenBank:MN908947.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947)和Fan Wu等人，Anew coronavirus associated with humanrespiratory disease in China,2020,Nature,volume 579,pages 265–269(https://www.nature.com/articles/s41586-020-2008-3)，并且具有以下氨基酸序列：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:6)。
基于对该糖蛋白的结构分析，SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)选自所述SARS-CoV-2S糖蛋白序列(参见实施例1)，SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域具有以下氨基酸序列：RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVS(SEQ ID NO:7)。
接下来，将点氨基酸取代C272S引入到具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列中，以提供SARS-CoV-2RBD-S蛋白的另外稳定性，从而产生具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)。
核酸
在一个方面，本发明涉及编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的分离的核酸。
“分离的”核酸分子为这样的核酸分子，其鉴定和分离自至少一种核酸分子-杂质，前者一般在核酸酶核酸的天然来源中与后者结合。分离的核酸分子不同于在自然条件下发现其所呈的形式或集合。因此，分离的核酸分子不同于在自然条件下存在于细胞中的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括位于其中核酸酶正常表达的细胞中的核酸分子，例如如果核酸分子具有不同于其在自然条件下于细胞中的定位的染色体定位。
在一些实施方案中，分离的核酸为DNA。
在一些实施方案中，分离的核酸为以下核苷酸序列：AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATCTTCTTTTGGTGGTGTCAGT(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，分离的核酸为密码子优化的核苷酸序列。
表达盒.表达载体
在一个方面，本发明涉及包括编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中任何一种的表达盒。
如本文使用的，术语“表达盒”特别是指在适当环境下能够触发编码包括在所述表达盒中的感兴趣多肽的多核苷酸表达的DNA片段。当引入到宿主细胞中时，表达盒尤其是能够参与细胞机制，以将编码感兴趣多肽的多核苷酸转录成RNA，所述RNA然后一般进行进一步处理并最终被翻译成感兴趣的多肽。表达盒可被包含在表达载体中。
本发明的表达盒包含作为元件的启动子。如本文使用的，术语“启动子”特别是指促进启动子可操作地连接的多核苷酸转录的DNA元件。启动子可进一步形成启动子/增强子元件的一部分。尽管“启动子”和“增强子”元件之间的物理界限并不总是明确的，但术语“启动子”一般是指核酸分子上RNA聚合酶和/或任何相关因子结合至此并且转录在此起始的位点。增强子在时间以及空间上增强启动子活性。本领域已知许多启动子在广泛范围的细胞类型中具有转录活性。启动子可被分成两类，组成性地发挥功能的那些和通过诱导或去抑制进行调控的那些。这两类均适合于蛋白表达。用于在真核细胞，并且特别是在哺乳动物细胞中高水平产生多肽的启动子应为强的，并且优选地在广泛范围的细胞类型中为活性的。能够在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子为本领域众所周知的，并且因此没有必要在本文中详细描述它们。根据本发明的思想，优选的是使用巨细胞病毒(CMV)启动子。源于人类巨细胞病毒(hCMV)的立刻早期(IE)区域的启动子或启动子/增强子特别适合作为本发明表达盒中的启动子。人类巨细胞病毒(hCMV)的立刻早期(IE)区域以及由此获得的诱导功能性表达的片段和/或增强功能性表达的片段例如描述于EP0173177和EP0323997中，并且也为本领域众所周知的。因此，hCMV立刻早期(IE)区域的几个片段可被用作启动子和/或启动子/增强子。根据本发明的一个实施方案，人类CMV启动子被用于本发明的表达盒中。
在一些实施方案中，表达盒在5’-端到3’-端方向上包括以下元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复序列)；
CMV(巨细胞病毒)增强子；
CMV(巨细胞病毒)启动子；
hBG1基因(血红蛋白亚基γ1基因)的内含子；
编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种。
hGH1多腺苷酸化信号(人类生长激素基因多腺苷酸化信号)
右手(第二)ITR。
在一些实施方案中，左手(第一)ITR(反向末端重复序列)具有以下核酸序列：
Cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcg cccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，CMV(巨细胞病毒)增强子具有以下核酸序列：
cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgCcaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatg(SEQ ID NO:9)。
在一些实施方案中，CMV(巨细胞病毒)启动子具有以下核酸序列：
gtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgGcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagct(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，hBG1(血红蛋白亚基γ1基因)基因的内含子具有以下核酸序列：
cgaatcccggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattgggat(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，hGH1(人类生长激素1基因)多腺苷酸化信号具有以下核酸序列：
Acgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatcttggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttgggattccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacggggtttcaccatattggccaggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccaccttggcctcccaaattgctgggattacaggcgtgaaccactgctcccttccctgtcctt(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，右手(第二)ITR具有以下核酸序列：
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg(SEQID NO:13)。
在一些实施方案中，表达盒包括具有以下核苷酸序列的核酸：
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgCcaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgGcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggattcgaatcccggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattgggattcgaacatcgCGATaattaGCCGCCACCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGGTCGACCGGGAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAAT
TATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAA
TTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACC
TGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGA
GATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAA
TGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGG
TTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAG
TAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTG
GACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAA
TTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGT
CTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATT
GCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGAT
TCTTGACATTACACCATCTTCTTTTGGTGGTGTCAGTtaaGgatcctcta
gagtcgacctgcagaagcttgcctcgagcagcgctgctcgagagatctacgggtggcatccctgtgacc
cctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaa
gttgcatcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggg
gcaagttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcac
aatcttggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttggg
attccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacggggtttcaccatattggcca
ggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccaccttggcctcccaaattgctgggattacaggcgt
gaaccactgctcccttccctgtccttctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcaggaac
ccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggt
cgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg(SEQID NO:3)。
在一个方面，本发明涉及一种表达载体，其包括编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种，或所述表达盒中的任何一种。
在一些实施方案，载体为质粒，即其中可连接另外DNA区段的环状双链DNA片段。
在一些实施方案，载体为病毒载体，其中另外的DNA区段可连接到病毒基因组中。
在一些实施方案中，载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起始位点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在进一步的实施方案中，载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在被引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒(比如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。DNA分子可连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控DNA转录和翻译的预期功能。可选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。DNA分子可通过标准方法(例如互补限制性位点的连接，或者如果不存在限制性位点则为平末端连接)被引入到表达载体中。
重组表达载体还可编码促进从宿主细胞分泌感兴趣蛋白的前导肽(或信号肽)。可将感兴趣蛋白的基因克隆到载体中，使得信号肽框内连接至感兴趣蛋白的氨基末端。前导肽(或信号肽)可为免疫球蛋白前导肽或异源性前导肽(即非免疫球蛋白前导肽)。
除根据本发明的SARS-CoV-2的RBD-S基因之外，根据本发明载体的重组表达可携带控制SARS-CoV-2的RBS-S基因在宿主细胞中表达的调控序列。本领域的技术人员将会理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、所期望蛋白的表达水平等因素。用于哺乳动物中表达宿主细胞的优选控制序列包括确保哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，比如源于逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(比如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(比如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如主要晚期启动子腺病毒(AdMLP))、多瘤病毒的启动子/增强子，以及强哺乳动物启动子，比如天然免疫球蛋白启动子或肌动蛋白启动子。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
如本说明书中使用的，术语“启动子”或“转录调控序列”或“调控序列”是指这样的的核酸片段，其控制一个或多个编码序列的转录，并且关于读取方向(相对于从编码序列的转录起始位点的转录方向)位于上游，并且通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、抑制和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接地用所述启动子调控转录水平的任何其他核苷酸序列)的存在而在结构上被鉴定。“组成型”启动子为在典型的生理和发育条件下于大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子为生理或发育上调控的启动子，例如在化学诱导剂的影响下。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。
如本文使用的，术语“增强子(enhancers)”或“增强子(enhancer)”可指位于邻近编码重组产物的DNA序列的DNA序列。增强子元件一般位于启动子元件的5’方向上，或者可位于编码DNA序列(例如被转录或翻译成一种或多种重组产物的DNA序列)的下游或内部。因此，增强子元件可位于编码重组产物的DNA序列上游或所述序列下游100个碱基对、200个碱基对或者300或更多个碱基对处。增强子元件可增加从DNA序列表达的重组产物的量，使其高于与单个启动子元件相关的表达水平。多种增强子元件为本领域普通技术人员易于获得的。
除以上基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体可携带另外的序列，比如调控宿主细胞中载体复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因促进选择其中已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4399216、4634665和5179017)。例如，选择标记基因一般向其中已引入载体的宿主细胞赋予对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。例如，选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在甲氨蝶呤选择/扩增期间在dhfr宿主细胞中使用)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。
如本说明书中使用的，术语“表达控制序列”是指影响它们所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，比如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及当期望时增强蛋白分泌的序列。此类控制序列的性质取决于宿主生物体而异；在原核生物中，此类控制序列通常包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列；在真核生物中，一般此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期至少包括其存在对表达和加工至关重要的所有组分，并且还可包括其存在为有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
如本文使用的，术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)元件呈功能性关系的连接。当一个核酸与另一个核酸序列在功能性关系的条件下存在时，该核酸“可操作地连接”。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则该转录调控序列可操作地连接于所述编码序列。术语“可操作地连接”意指所连接的DNA序列一般为连续的，并在需要连接两个蛋白编码区的情况下也为连续的，且存在于阅读框中。
在本发明的一个实施方案中，“表达载体”涉及包含侧翼为细小病毒序列或反向末端重复(ITR)序列的一个或多个感兴趣的多核苷酸序列、感兴趣的基因或“转基因”的载体。
本发明的盒和载体两者均不包含编码腺相关病毒的非结构蛋白(Rep)和结构蛋白(Cap)的基因的核苷酸序列。
基于AAV5(腺相关病毒血清型5)的重组病毒
在一个方面，本发明涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫和/或预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的分离的重组的基于AAV5(腺相关病毒血清型5)的病毒，其包含衣壳和所述表达盒中的任何一种。
如本说明书中使用的，术语“基于AAV的重组病毒”(或“基于AAV的病毒样颗粒”，或“AAV重组病毒株”，或“AAV重组载体”，或“rAAV载体”)是指包围在AAV衣壳内的以上表达盒(或以上表达载体)。
Cap基因，除其他备选产物以外，编码3种衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)。VP1、VP2和VP3以1:1:10的比率存在，以形成二十面体衣壳(Xie Q.等人，The atomic structure ofadeno-associated virus(AAV-2),a vector for human gene therapy.Proc Natl AcadSci USA,2002；99:10405-10410)。这些基因的转录开始自一个启动子，p40。相应蛋白(VP1、VP2和VP3)的分子量分别为87、72和62kDa。所有这3种蛋白均为从单一mRNA翻译而来。转录后，前体mRNA可以两种不同方式剪接，其中较长或较短的内含子被切除以形成不同核苷酸长度的mRNA。
在基于AAV(rAAV)的重组病毒产生期间，侧翼为ITR的表达盒被包装到AAV衣壳中。如上所述，AAV复制所需的基因并未包括在盒中。
表达盒DNA以约3000个核苷酸长的单链DNA分子(ssDNA)的形式被包装到病毒衣壳中。一旦细胞感染了病毒，单链DNA就会转化为双链DNA(dsDNA)形式。dsDNA只能由细胞的蛋白使用，所述蛋白将当前的一个或多个基因转录成RNA。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1的衣壳。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有以下氨基酸序列的AAV5蛋白VP1：
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFG
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GGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVE
MEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括AAV5蛋白VP2。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有以下氨基酸序列的AAV5蛋白VP2：TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:14)。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP3的衣壳。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有以下氨基酸序列的AAV5蛋白VP3：
MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKST
RTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRF
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在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有包括AAV5蛋白VP1、VP2和VP3的衣壳。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VP1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VP2和具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的VP3。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有包括在野生型AAV5 VP1(SEQ ID NO:4)的位置S2A和T711S处的氨基酸取代的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1，并具有以下氨基酸序列：
MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQAR
GLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGD
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MGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTV
EMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:14的氨基酸序列的AAV5蛋白VP2。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有包括在野生型AAV5 VP2(SEQ ID NO:14)的位置T575S处的氨基酸取代的氨基酸序列的AAV5蛋白VP2，并具有以下氨基酸序列：TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:16)。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:15的氨基酸序列的AAV5蛋白VP3。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有包括在野生型AAV5 VP3(SEQ ID NO:15)的位置T519S处的氨基酸取代的氨基酸序列的AAV5蛋白VP3，并具有以下氨基酸序列：MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VP1、具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VP2和具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VP3。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VP1、具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的VP2和具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VP3。
短语“多个点突变(more point mutations)”是指两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个点取代。
特别优选的实施方案包括自然界中保守的取代(突变)，即发生在在侧链中相连接的氨基酸家族内的取代。具体地讲，氨基酸一般被分成4个家族：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，以及(4)不带电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳族氨基酸。例如，可以合理地预测，分别地用亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸、用天冬氨酸取代谷氨酸、用苏氨酸取代丝氨酸或类似保守地用氨基酸取代结构相关的氨基酸，对生物活性不会具有重大影响。例如，感兴趣的多肽可包括至多约5-10个保守或非保守的氨基酸取代，只要分子的期望功能保持完整即可。
具有在AAV5蛋白VP1、VP2或VP3的序列中使用氨基酸取代的点突变的实施方案为用另一个氨基酸残基取代AAV5蛋白VP1、VP1或VP3中的至少一个氨基酸残基。
保守取代在表A中于“优选取代”下显示。
Figure BDA0004100908660000271
Figure BDA0004100908660000281
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列或含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1，并且表达盒在5’-端到3’-端方向上包括以下元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复序列)；
CMV(巨细胞病毒)增强子；
CMV(巨细胞病毒)启动子；
hBG1基因(血红蛋白亚基γ1基因)的内含子；
编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种。
hGH1多腺苷酸化信号(人类生长激素基因多腺苷酸化信号)；
右手(第二)ITR。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VP1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VP2和具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的VP3；并且表达盒在5’-端到3’-端方向上包括以下元件：
CMV增强子；
CMV启动子；
hBG1基因的内含子(血红蛋白亚基γ1基因)；
编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种。
hGH1多腺苷酸化信号；
右手ITR。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VP1、具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VP2和具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VP3；并且表达盒在5’-端到3’-端方向上包括以下元件：
CMV增强子；
CMV启动子；
hBG1基因的内含子；
编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种。
hGH1多腺苷酸化信号；
右手ITR。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VP1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VP2和具有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VP3；并且表达盒在5’-端到3’-端方向上包括以下元件：
CMV增强子；
CMV启动子；
hBG1基因的内含子；
编码所述分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的所述核酸中的任何一种。
hGH1多腺苷酸化信号；
右手ITR。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列或含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1，并且表达盒包含具有SEQ ID NO:3的核酸。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1，AAV5蛋白VP1为SEQ ID NO:5(S2A和T711S)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VP1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VP2和具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的VP3；并且表达盒包含具有SEQ ID NO:3的核酸。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VP1、具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VP2和具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VP3；并且表达盒包含具有SEQ ID NO:3的核酸。
在一些实施方案中，基于AAV5的重组病毒具有衣壳，所述衣壳包括以下蛋白：具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VP1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VP2和具有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VP3；并且表达盒包含具有SEQ ID NO:3的核酸。
药用组合物/疫苗
在一个方面，本发明涉及用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的药用组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的所述重组的基于AAV5的病毒中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的药用组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的所述重组的基于AAV5的病毒中的任何一种。
在特定实施方案中，本发明涉及包含在药学上可接受的载剂中或在其他药剂、佐剂、稀释剂等中的本发明基于AAV5的重组病毒的药用组合物。对于注射，载剂一般为液体载体。对于其他给予方法，载剂可为固体或液体，比如无菌无热原水或无菌无热原磷酸盐缓冲盐水溶液。对于吸入给予，载剂为可吸入的，并且优选呈固体或液体颗粒形式。作为注射介质，优选的是使用含有对注射溶液剂常见的添加剂的水，比如稳定剂、盐或盐水和/或缓冲剂。
“药用组合物”意指包含以上本发明基于AAV5的重组病毒和至少一种选自药学上可接受和药理学上相容的赋形剂的组分的组合物，所述赋形剂比如填充剂、溶剂、稀释剂、载剂、助剂、分散剂、递送剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂、延长递送控制剂，其选择和比例取决于给予的类型和途径以及剂量。本发明的药用组合物及其制备方法对本领域技术人员无疑将会是显而易见的。药用组合物应优选按照GMP(良好制造规范)要求来制造。组合物可包含缓冲组合物、张度剂、稳定剂和增溶剂。
“药学上可接受的”意指不具有生物或其他负面副作用的材料，例如，该材料可在不引起任何不合期望的生物效应的情况下给予受试者。因此，此类药用组合物可被用于例如离体转染细胞或直接体内给予受试者本发明基于AAV5的重组病毒。
本文使用术语“赋形剂”来描述除以上本发明成分以外的任何成分。这些为具有无机或有机性质的用于药用制造以赋予药品必要的物理化学特性的物质。
“稳定剂”是指提供活性剂的物理和/或化学稳定性的一种赋形剂或者两种或更多种赋形剂的混合物。
术语“缓冲液”、“缓冲组合物”、“缓冲剂”是指一种溶液，其能够通过其酸碱共轭组分的作用抵抗pH变化，这允许rAAV5载体产物抵抗pH变化。通常，药用组合物优选具有4.0-8.0范围内的pH。可使用的缓冲液的实例包括但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。
如果活性剂在例如2-8℃的储存温度下于规定保质期期间保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或者生物活性，则药用组合物为“稳定的”。优选地，活性剂保持物理和化学稳定性，以及生物活性。基于加速或自然老化条件下的稳定性测试的结果来调整储存期。
本发明的药用组合物可以现成制剂的形式以一个单个单位剂量或多个单个单位剂量的形式制造、包装或广泛销售。如本文使用的，术语“单个单位剂量”是指含有预定量活性成分的离散量的药用组合物。活性成分的量一般等于待给予受试者的活性成分的剂量，或此种剂量的方便部分，例如此种剂量的一半或三分之一。
在一个方面，本发明涉及用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的疫苗，其包含有效量的所述重组的基于AAV5的病毒中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的疫苗，其包含有效量的所述重组的基于AAV5的病毒中的任何一种。
术语“疫苗”是指包含源于病原体用于诱导针对病原体的免疫应答的抗原的免疫原性组合物，所述免疫应答赋予保护性免疫(例如保护受试者免受由病原体引起的感染和/或降低由病原体造成的感染引起的疾病或病症的严重程度的免疫)。保护性免疫可包括抗体的产生和/或细胞介导的应答。
根据上下文，术语“疫苗”还可指给予脊椎动物以形成保护性免疫的抗原混悬剂或溶液剂。
疫苗包括优选以生物有效量存在于其中的基于AAV5的重组病毒。重组病毒的“生物有效”量为足以在细胞中引起感染(或转导)和异源核酸序列表达的量。如果将病毒体内给予细胞(例如将病毒给予受试者，如下所述)，则病毒载体的“生物有效”量为足以在靶细胞中引起转导和异源核酸序列表达的量。
与药用组合物有关的所有定义和解释也应当适用于疫苗。
用途
在一个方面，本发明涉及所述重组的基于AAV5的病毒或所述药用组合物中的任何一种用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的用途。
在一个方面，本发明涉及所述重组的基于AAV5的病毒或所述药用组合物中的任何一种用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的用途。
在一个方面，本发明涉及用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的方法，其包括给予哺乳动物生物体有效量的用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的所述重组的基于AAV5的病毒、所述组合物或所述疫苗中的任何一种。
在一个方面，本发明涉及用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的方法，其包括给予哺乳动物生物体有效量的用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的所述重组的基于AAV5的病毒、所述组合物或所述疫苗中的任何一种。
本领域认识到的用于给予基于AAV5的重组病毒的任何方法均可适合地用于以上本发明基于AAV5的重组病毒。
示例性的给予模式包括局部应用、鼻内、吸入、经粘膜、经皮、肠内(例如口服、直肠)、肠外(例如静脉内、皮下、皮内、肌内)给予以及直接组织或器官注射。
注射剂可以常规形式制备，作为液体溶液剂或混悬剂，适合于在注射之前制备呈液体的溶液剂或混悬剂的固体形式，或者作为乳剂。或者，可以局部而非全身方式，例如以贮库或缓释制剂给予所述本发明基于AAV5的重组病毒。
将基于AAV5的重组病毒以有效量引入到生物体中。基于AAV5的重组病毒优选以生物有效量引入到生物体中。重组病毒的“生物有效”量为足以在细胞中引起感染(或转导)和异源核酸序列表达的量。如果将病毒体内给予细胞(例如将病毒给予受试者，如下所述)，则病毒载体的“生物有效”量为足以在靶细胞中引起转导和异源核酸序列表达的量。
所述本发明基于AAV5的重组病毒的剂量将取决于给予模式、特定的病毒载体，并且它们可以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量为至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016转导单位或更高，优选约108-1013转导单位，仍然更优选1012转导单位的病毒滴度。
用于给予所述本发明基于AAV5的重组病毒的细胞可为任何类型的细胞，包括但不限于上皮细胞(例如皮肤、呼吸和肠道上皮细胞)、肝细胞、肌细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、脾细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。
并不使用以上基于AAV5的重组病毒来修饰人类生殖系细胞的遗传完整性。
实施例
提供以下实施例以更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明的目的，而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过参考结合至本文中。尽管为清楚理解的目的，已通过说明和实施例相当详细地描述了上述发明，但是鉴于本发明的讲授，对本领域普通技术人员将会易于显而易见的是，可对其进行某些变化和修改而不背离所附实施方案的精神或范围。
材料和通用方法
重组DNA技术
DNA操纵通过标准技术进行，所述技术如Sambrook J.等人，Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989所述。根据制造商说明使用分子生物学试剂。简言之，产生质粒DNA用于在选择性抗生素压力下生长的大肠杆菌细胞中进一步操纵，使得质粒不会在细胞群中丢失。我们使用商业试剂盒从细胞中分离质粒DNA，测量浓度，并通过限制性核酸内切酶处理或PCR扩增将其用于克隆。使用连接酶将DNA片段彼此连接并转化至细菌细胞内进行选择克隆和进一步生产。通过限制性模式和完整Sanger测序确认了所有产生的遗传构建体。
基因合成
期望的基因区段由通过化学合成制成的寡核苷酸制备。侧翼为独特的限制性位点的300-1000bp长的基因区段通过在彼此的顶端复性寡核苷酸，然后从边界引物进行PCR扩增来收集。作为结果，产生了片段的混合物，包括期望的片段。将片段在限制性位点处克隆到中间载体中，然后通过DNA测序确认了亚克隆片段的DNA序列。
DNA序列测定
DNA序列通过Sanger测序测定。分析DNA和蛋白序列，并在SnapGene Viewer 4.2或更高版本中处理序列数据，以进行序列创建、映射、分析、注释和说明。
培养细胞培养物
该实验使用HEK293(人胚胎肾克隆293)和CHO-K1-S(中国仓鼠卵巢细胞)细胞系。在不含FBS和抗生素的完全培养基上于37℃和5％CO2的标准条件下培养用于产生AAV的悬浮HEK293细胞。在补充有5％ FBS、抗生素/抗真菌剂的完全DMEM/F12培养基上于37℃和5％CO2的标准条件下培养用于测试AAV产物效力的贴壁CHO-K1-S细胞。CHO-K1-S细胞在达到80-90％汇合后进行传代培养。使用台盼蓝染色和血细胞计数器或PI染色和流式细胞术来评估细胞活力。
RBD-S蛋白水平和对RBD-S蛋白的特异性抗体的测定
通过使用辣根过氧化物酶作为指示酶的酶联免疫吸附测定(ELISA)，评估了细胞转导后RBD-S蛋白和免疫后动物血浆中对RBD-S蛋白的抗体的含量。简言之，用对RBD-S蛋白的一抗使96孔板的孔敏化，然后将测试样品分层。当采用ELISA来检测对RBD-S蛋白的抗体时，用RBD-S蛋白敏化平板，然后将动物的血浆加入孔中。接下来，用以生物素和HRP缀合的链霉亲和素标记的对RBD-S的二抗(分析蛋白本身)或对研究动物免疫的球蛋白的二抗(分析对RBD-S的抗体的存在)来补充样品。接下来，加入TMB溶液以可视化酶促反应，并加入停止溶液以停止反应的发展。
为确定测试样品中RBD-S/对RBD-S的抗体的浓度，我们绘制了校准曲线，其显示溶液的光密度与标准样品中RBD-S/对RBD-S的抗体的浓度的相依性，并且我们使用光密度来确定测试样品的浓度。
重组AAV载体病毒颗粒的组装和纯化
为组装含有RBD-S基因的AAV颗粒，我们使用了HEK293生产细胞，向其中如下转染了3种质粒：
包含具有RBD-S转基因表达盒的AAV基因组的pAAV-RBD-S质粒(图1)；
用于表达AAV5血清型Cap基因和AAV2血清型Rep基因的质粒。每个基因使用不同的阅读框，编码几种蛋白产物；
用于表达AAV衣壳组装和包装所需的Ad5(腺病毒血清型5)基因的质粒。
在72小时后，裂解细胞，并使用过滤、色谱和超速离心方法纯化和浓缩病毒颗粒。通过用对重组病毒基因组区域具有特异性的引物和样品的定量PCR测定病毒颗粒的滴度，并将其表示为病毒基因组拷贝数/1ml。
细胞培养物的转导
将细胞系以10,000个细胞/cm2的接种密度预接种到6孔板的孔中，然后以100,000vg/细胞的MOI和500,000vg/细胞MOI添加病毒颗粒产物，在第3天通过ELISA测定RBD-S蛋白含量，如上所述。通过测量GFP+细胞的百分比来评估转导效率。
转导后，使用TrypLE将CHO-K1-S细胞从培养板中取出并在PBS中洗涤；如上所述分析蛋白表达。
所有测量以3个独立实验进行。使用完整细胞作为阴性对照。
在实验动物上的体内研究
实验在BALB/c小鼠(6-8周龄的雄性和雌性)上进行。免疫通过将产物单次肌内注射到后肢来进行。阴性对照组动物注射缓冲溶液，阳性对照组注射RBD-S蛋白、弗氏完全佐剂和盐水的混合物。
在给予产物之前于注射当天，然后在免疫后第14、21、27、42和56天采集血浆。
实施例1.SARS-CoV-2的RBD-S序列的选择
SARS-CoV-2RBD-S抗原的开发包括对ET AL.,Cryo-electron microscopystructures of the SARS-CoV spike glycoprotein reveal aprerequisiteconformational state for receptor binding,2017,Cell Res.27,p.119-129中提供的SARS-CoV刺突糖蛋白5WRG结构的分析。我们对SARS-CoV刺突糖蛋白结构的分析表明，可使用保守的RBD-S及其扩展部分两者进行免疫。我们的分析揭示了，所讨论的RBD-S长度的增加应该助于RBD-S蛋白结构的稳定，这是因为二级结构的保存增加了保持稳定蛋白构象而无需解链的可能性。进一步地，RBD-S长度的略微增加不应影响免疫结果。以上对SARS-CoV刺突糖蛋白结构的分析被外推至SARS-CoV-2刺突糖蛋白的结构。此外，向SARS-CoV-2的RBD-S蛋白的结构中引入了将最接近结构域的未配对半胱氨酸取代为丝氨酸(C272S位的氨基酸取代)，以提供SARS-CoV-2的RBS-S蛋白的另外稳定性。
因此，选择以下具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列作为SARS-CoV-2RBD-S抗原。
该抗原将被用于有效地免疫哺乳动物(参见实施例5)。
实施例2.包含具有重组RBD-S基因的AAV表达盒的遗传构建体的组装.
预期产生具有包含RBD-S基因(SEQ ID NO:1)的表达盒的AAV5病毒载体的靶质粒pAAV-RBD-S(图1)通过以下来产生：在ClaI/BamHI位点使用克隆的限制性酶连接酶方法，将来自CellBiolab(USA)的初始构建体pAAV-GFP对照质粒(VPK-402)中修饰的绿色荧光蛋白序列取代为具有信号肽的RBD-S序列，该RBD-S序列由通过化学合成产生的寡核苷酸从头合成，在5’-端添加ClaI限制性位点和在3’-端添加BamHI限制性位点。
最终载体含有作为重组AAV基因组一部分的基因的表达和组装所必须的所有元件：
1)被包封到病毒衣壳中的序列末端处的ITR；
2)用于靶基因表达的元件(启动子、增强子、内含子、Kozak序列、转基因、多腺苷酸化位点)；
3)在细菌细胞中产生质粒DNA的细菌复制起点及抗生素抗性基因。
实施例3.表达RBD-S的病毒产物的创建
将靶质粒pAAV-RBD-S(图1)与产生重组AAV病毒颗粒所需的其余质粒(见上文)一起用于产生AAV5-RBD-S产物。生物加工产生包含具有RBD-S基因的表达盒的重组AAV5-RBD-S病毒颗粒。用于体外和体内研究的纯化AAV5-RBD-S产物使用安全且不改变AAV特性的标准缓冲剂和赋形剂制备。纯化的AAV5-RBD-S产物的浓度为4.6x1011和1.8x1012 VG/mL。
实施例4.AAV5-RBD-S产物的体外测试
在动物研究之前，对纯化的AAV5-RBD-S产物进行体外测试。这些实验使用CHO-K1-S贴壁细胞系进行(图2.)。将CHO-K1-S细胞铺板到6孔板的孔中。在以下生长培养基中进行接种：补充有谷氨酰胺的DMEM/F12，葡萄糖含量为4.5g/l，5％胎牛血清(FBS)。
细胞接种密度为10,000个细胞/cm2。在转导运行期间，将预先制备的细胞以100,000vg/细胞的MOI和500,000vg/细胞的MOI进行转导。所有样品一式三份运行。将完整细胞用作阴性对照。成功转导后，将CHO-K1-S细胞从基质中取出，在磷酸盐缓冲液中洗涤，并如上所述通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析RBD-S蛋白的表达。已经表明，我们开发的产物使得可有效地将RBD-S转基因传递到细胞中，并确保靶蛋白的产生，这一点已由ELISA数据证实(图2)。
实施例5.AAV5-RBD-S产物的体内测试
AAV5-RBD-S产物的体内研究使用BALB/c实验小鼠。研究使用了如下的两种不同的AAV5-RBD-S产物剂量：低剂量(1x1011 VG/小鼠)和高剂量(4x1011 VG/小鼠)。使用不含AAV的对照溶液和不含具有RBD-S基因的表达盒的AAV5产物(空AAV5衣壳)作为阴性对照。将纯化的重组RBD-S蛋白用作阳性对照。动物通过向后肢中单次肌内注射进行免疫。在免疫后的第0、14、21、27、42和56天，如上所述通过ELISA来测定血浆中对RBD-S蛋白的抗体的滴度。体内研究已经表明，用AAV5-RBD-S产物免疫导致产生对RBD-S的特异性抗体(图3、4、5和6)。进一步地，对RBD-S的抗体水平与用重组RBD-S蛋白免疫的动物组相当(图8和9)。同时，在注射不含AAV的对照溶液和不含具有RBD-S基因的表达盒的AAV5产物(空AAV5衣壳)的动物组未观察到对RBD-S的抗体的产生(图7、10)。
因此，根据本发明的重组的基于AAV5的病毒和基于其的疫苗具有诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的高潜力，并且可被用于预防SARS-CoV-2相关的冠状病毒感染。此外，由于AAV载体能够提供长期抗原表达，因此它们优于基于重组蛋白抗原的传统系统。
序列表
<110> JSC BIOCAD
<120> 用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫和/或预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的基于AAV5的疫苗
<150> RU2020128658
<151> 28-08-2020
<160> 17
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在272位具有氨基酸取代的分离的重组SARS-CoV-2病毒糖蛋白S受体结合结构域(RBD-S)
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn
210 215 220
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys
225 230 235 240
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp
245 250 255
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Ser
260 265 270
Ser Phe Gly Gly Val Ser
275
<210> 2
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码重组SARS-CoV-2病毒糖蛋白S受体结合结构域(RBD-S)的核酸
<400> 2
agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60
ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120
agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180
tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240
tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300
gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360
aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420
tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480
ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540
cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600
catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660
gtcaatttca acttcaatgg tttaacaggc acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag 720
tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat 780
ccacagacac ttgagattct tgacattaca ccatcttctt ttggtggtgt cagt 834
<210> 3
<211> 2940
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有重组SARS-CoV-2病毒糖蛋白S受体结合结构域(RBD-S)的表达盒
<400> 3
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 180
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 240
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 300
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 360
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 420
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 480
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 540
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 600
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 660
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag 720
tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc 780
gggaccgatc cagcctccgc ggattcgaat cccggccggg aacggtgcat tggaacgcgg 840
attccccgtg ccaagagtga cgtaagtacc gcctatagag tctataggcc cacaaaaaat 900
gctttcttct tttaatatac ttttttgttt atcttatttc taatactttc cctaatctct 960
ttctttcagg gcaataatga tacaatgtat catgcctctt tgcaccattc taaagaataa 1020
cagtgataat ttctgggtta aggcaatagc aatatttctg catataaata tttctgcata 1080
taaattgtaa ctgatgtaag aggtttcata ttgctaatag cagctacaat ccagctacca 1140
ttctgctttt attttatggt tgggataagg ctggattatt ctgagtccaa gctaggccct 1200
tttgctaatc atgttcatac ctcttatctt cctcccacag ctcctgggca acgtgctggt 1260
ctgtgtgctg gcccatcact ttggcaaaga attgggattc gaacatcgcg ataattagcc 1320
gccaccatgg agaccgacac cctgctgctg tgggtgctgc tgctgtgggt gcccgggtcg 1380
accgggagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac aaacttgtgc 1440
ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg gaacaggaag 1500
agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc attttccact 1560
tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac taatgtctat 1620
gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg gcaaactgga 1680
aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt tatagcttgg 1740
aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta tagattgttt 1800
aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta tcaggccggt 1860
agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca atcatatggt 1920
ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact ttcttttgaa 1980
cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt ggttaaaaac 2040
aaatgtgtca atttcaactt caatggttta acaggcacag gtgttcttac tgagtctaac 2100
aaaaagtttc tgcctttcca acaatttggc agagacattg ctgacactac tgatgctgtc 2160
cgtgatccac agacacttga gattcttgac attacaccat cttcttttgg tggtgtcagt 2220
taaggatcct ctagagtcga cctgcagaag cttgcctcga gcagcgctgc tcgagagatc 2280
tacgggtggc atccctgtga cccctcccca gtgcctctcc tggccctgga agttgccact 2340
ccagtgccca ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg 2400
tccttctata atattatggg gtggaggggg gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag 2460
acaacctgta gggcctgcgg ggtctattgg gaaccaagct ggagtgcagt ggcacaatct 2520
tggctcactg caatctccgc ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag 2580
ttgttgggat tccaggcatg catgaccagg ctcagctaat ttttgttttt ttggtagaga 2640
cggggtttca ccatattggc caggctggtc tccaactcct aatctcaggt gatctaccca 2700
ccttggcctc ccaaattgct gggattacag gcgtgaacca ctgctccctt ccctgtcctt 2760
ctgattttgt aggtaaccac gtgcggaccg agcggccgca ggaaccccta gtgatggagt 2820
tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 2880
gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 2940
<210> 4
<211> 724
<212> PRT
<213> 天然序列
<220>
<223> 野生型衣壳AAV5蛋白VP1的天然序列
<400> 4
Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu
1 5 10 15
Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35 40 45
Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val
50 55 60
Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85 90 95
Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100 105 110
Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe
115 120 125
Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile
130 135 140
Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser
145 150 155 160
Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln
165 170 175
Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr
180 185 190
Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala
195 200 205
Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
210 215 220
Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro
225 230 235 240
Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp
245 250 255
Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260 265 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275 280 285
Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val
290 295 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr
305 310 315 320
Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp
325 330 335
Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys
340 345 350
Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
355 360 365
Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser
370 375 380
Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn
385 390 395 400
Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser
405 410 415
Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp
420 425 430
Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln
435 440 445
Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp
450 455 460
Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly
465 470 475 480
Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu
485 490 495
Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr
500 505 510
Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile
515 520 525
Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu
530 535 540
Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg
545 550 555 560
Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser
565 570 575
Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro
580 585 590
Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp
595 600 605
Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met
610 615 620
Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn
625 630 635 640
Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser
645 650 655
Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu
660 665 670
Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln
675 680 685
Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp
690 695 700
Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu
705 710 715 720
Thr Arg Pro Leu
<210> 5
<211> 724
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的修饰的AAV5衣壳VP1蛋白，其包括S2A和T711S取代
<400> 5
Met Ala Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu
1 5 10 15
Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35 40 45
Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val
50 55 60
Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85 90 95
Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100 105 110
Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe
115 120 125
Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile
130 135 140
Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser
145 150 155 160
Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln
165 170 175
Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr
180 185 190
Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala
195 200 205
Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
210 215 220
Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro
225 230 235 240
Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp
245 250 255
Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260 265 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275 280 285
Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val
290 295 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr
305 310 315 320
Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp
325 330 335
Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys
340 345 350
Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
355 360 365
Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser
370 375 380
Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn
385 390 395 400
Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser
405 410 415
Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp
420 425 430
Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln
435 440 445
Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp
450 455 460
Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly
465 470 475 480
Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu
485 490 495
Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr
500 505 510
Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile
515 520 525
Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu
530 535 540
Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg
545 550 555 560
Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser
565 570 575
Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro
580 585 590
Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp
595 600 605
Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met
610 615 620
Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn
625 630 635 640
Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser
645 650 655
Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu
660 665 670
Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln
675 680 685
Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp
690 695 700
Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Ser Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu
705 710 715 720
Thr Arg Pro Leu
<210> 6
<211> 1273
<212> PRT
<213> 天然序列
<220>
<223> SARS-CoV-2病毒全长糖蛋白S的天然序列
<400> 6
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 7
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的SARS-CoV-2病毒糖蛋白S受体结合结构域(RBD-S)
<400> 7
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn
210 215 220
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys
225 230 235 240
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp
245 250 255
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys
260 265 270
Ser Phe Gly Gly Val Ser
275
<210> 8
<211> 130
<212> DNA
<213> 天然序列
<220>
<223> 左手(第一) ITR (反向末端重复序列)
<400> 8
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 9
<211> 304
<212> DNA
<213> 天然序列
<220>
<223> CMV (巨细胞病毒)增强子
<400> 9
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catg 304
<210> 10
<211> 204
<212> DNA
<213> 天然序列
<220>
<223> CMV (巨细胞病毒)启动子
<400> 10
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 11
<211> 493
<212> DNA
<213> 天然序列
<220>
<223> hBG1基因内含子(血红蛋白γ-1亚基基因)
<400> 11
cgaatcccgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc ccgtgccaag agtgacgtaa 60
gtaccgccta tagagtctat aggcccacaa aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt 120
tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa 180
tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg ggttaaggca 240
atagcaatat ttctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt 300
tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt atggttggga 360
taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt catacctctt 420
atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 480
aaagaattgg gat 493
<210> 12
<211> 479
<212> DNA
<213> 天然序列
<220>
<223> hGH1多腺苷酸化信号(人类生长激素基因多腺苷酸化信号)
<400> 12
acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60
cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120
ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180
caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240
ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300
tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360
ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420
cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctt 479
<210> 13
<211> 141
<212> DNA
<213> 天然序列
<220>
<223> 右手(第二) ITR
<400> 13
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 14
<211> 588
<212> PRT
<213> 天然序列
<220>
<223> 野生型AAV5衣壳VP2蛋白的天然序列
<400> 14
Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala
20 25 30
Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro
35 40 45
Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro
50 55 60
Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly
65 70 75 80
Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys
85 90 95
Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg
100 105 110
Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe
115 120 125
Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser
130 135 140
His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly
145 150 155 160
Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys
165 170 175
Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr
180 185 190
Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val
195 200 205
Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val
210 215 220
Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr
225 230 235 240
Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
245 250 255
Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe
260 265 270
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe
275 280 285
Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser
290 295 300
Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg
305 310 315 320
Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr
325 330 335
Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala
340 345 350
Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val
355 360 365
Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr
370 375 380
Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro
385 390 395 400
Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu
405 410 415
Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln
420 425 430
Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr
435 440 445
Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp
450 455 460
Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala
465 470 475 480
His Phe His Pro Ser Pro Ala Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro
485 490 495
Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr
500 505 510
Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr
515 520 525
Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser
530 535 540
Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro
545 550 555 560
Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr
565 570 575
Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
580 585
<210> 15
<211> 532
<212> PRT
<213> 天然序列
<220>
<223> 野生型AAV5衣壳VP3蛋白的天然序列
<400> 15
Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala
1 5 10 15
Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
20 25 30
Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro
35 40 45
Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp
50 55 60
Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
65 70 75 80
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln
85 90 95
Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val
100 105 110
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr
115 120 125
Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp
130 135 140
Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
165 170 175
Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser
180 185 190
Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn
195 200 205
Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser
210 215 220
Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp
225 230 235 240
Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln
245 250 255
Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp
260 265 270
Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly
275 280 285
Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu
290 295 300
Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr
305 310 315 320
Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile
325 330 335
Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu
340 345 350
Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg
355 360 365
Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser
370 375 380
Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro
385 390 395 400
Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp
405 410 415
Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met
420 425 430
Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn
435 440 445
Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser
450 455 460
Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu
465 470 475 480
Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln
485 490 495
Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp
500 505 510
Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu
515 520 525
Thr Arg Pro Leu
530
<210> 16
<211> 588
<212> PRT
<213> 天然序列
<220>
<223> 包括替换T575S的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP2
<400> 16
Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala
20 25 30
Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro
35 40 45
Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro
50 55 60
Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly
65 70 75 80
Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys
85 90 95
Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg
100 105 110
Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe
115 120 125
Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser
130 135 140
His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly
145 150 155 160
Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys
165 170 175
Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr
180 185 190
Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val
195 200 205
Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val
210 215 220
Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr
225 230 235 240
Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
245 250 255
Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe
260 265 270
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe
275 280 285
Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser
290 295 300
Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg
305 310 315 320
Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr
325 330 335
Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala
340 345 350
Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val
355 360 365
Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr
370 375 380
Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro
385 390 395 400
Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu
405 410 415
Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln
420 425 430
Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr
435 440 445
Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp
450 455 460
Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala
465 470 475 480
His Phe His Pro Ser Pro Ala Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro
485 490 495
Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr
500 505 510
Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr
515 520 525
Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser
530 535 540
Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro
545 550 555 560
Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Ser Thr
565 570 575
Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
580 585
<210> 17
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括替换T519S的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP3
<400> 17
Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala
1 5 10 15
Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
20 25 30
Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro
35 40 45
Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp
50 55 60
Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
65 70 75 80
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln
85 90 95
Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val
100 105 110
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr
115 120 125
Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp
130 135 140
Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
165 170 175
Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser
180 185 190
Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn
195 200 205
Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser
210 215 220
Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp
225 230 235 240
Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln
245 250 255
Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp
260 265 270
Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly
275 280 285
Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu
290 295 300
Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr
305 310 315 320
Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile
325 330 335
Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu
340 345 350
Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg
355 360 365
Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser
370 375 380
Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro
385 390 395 400
Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp
405 410 415
Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met
420 425 430
Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn
435 440 445
Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser
450 455 460
Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu
465 470 475 480
Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln
485 490 495
Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp
500 505 510
Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Ser Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu
515 520 525
Thr Arg Pro Leu
530

Claims (26)

1.分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。
2.编码根据权利要求1的分离的重组SARS-CoV-2S糖蛋白受体结合结构域(RBD-S)的分离的核酸。
3.权利要求2的分离的核酸，其中所述核酸为DNA。
4.权利要求2的分离的核酸，所述分离的核酸为SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
5.权利要求2的分离的核酸，所述分离的核酸为密码子优化的核苷酸序列。
6.包含根据权利要求2-5中任何一项的核酸的表达盒。
7.权利要求6的表达盒，其在5’-端到3’-端方向上包含以下元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复序列)；
CMV(巨细胞病毒)增强子；
CMV(巨细胞病毒)启动子；
hBG1基因(血红蛋白亚基γ1基因)的内含子；
根据权利要求2-5中任何一项的核酸；
hGH1多腺苷酸化信号(人类生长激素基因多腺苷酸化信号)
右手(第二)ITR。
8.权利要求7的表达盒，其包含具有SEQ ID NO:3的核酸。
9.表达载体，其包含根据权利要求2-5中任何一项的核酸或根据权利要求6-8中任何一项的盒。
10.用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫和/或预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的分离的重组的基于AAV5(腺相关病毒血清型5)的病毒，其包含衣壳和根据权利要求6-8中任何一项的表达盒。
11.根据权利要求10的基于AAV5的重组病毒，其中所述衣壳包含AAV5蛋白VP1。
12.根据权利要求11的基于AAV5的重组病毒，其中所述衣壳包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1。
13.根据权利要求10的基于AAV5的重组病毒，其中所述衣壳包含具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1。
14.根据权利要求13的基于AAV5的重组病毒，其中所述衣壳包含具有SEQ ID NO:5(S2A和T711S)的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1。
15.根据权利要求10-13中任何一项的基于AAV5的重组病毒，其中所述衣壳包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1，并且所述表达盒在5’-端到3’-端方向上包括以下元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复序列)；
CMV(巨细胞病毒)增强子；
CMV(巨细胞病毒)启动子；
hBG1基因(血红蛋白亚基γ1基因)的内含子；
根据权利要求2-5中任何一项的核酸；
hGH1多腺苷酸化信号(人类生长激素基因多腺苷酸化信号)
右手(第二)ITR。
16.根据权利要求15的基于AAV5的重组病毒，其中所述衣壳包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的AAV5蛋白VP1，并且所述表达盒包含具有SEQ ID NO:3的核酸。
17.根据权利要求15-16中任何一项的基于AAV5的重组病毒，其中具有含有一个或多个点突变的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的所述AAV5蛋白VP1为SEQ ID NO:5(S2A和T711S)的氨基酸序列。
18.药用组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的根据权利要求10-17中任何一项的重组的基于AAV5的病毒。
19.根据权利要求18的药用组合物，其用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染。
20.根据权利要求18的药用组合物，其用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫。
21.根据权利要求10-17中任何一项的重组的基于AAV5的病毒或根据权利要求18的组合物用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的用途。
22.根据权利要求10-17中任何一项的重组的基于AAV5的病毒或根据权利要求18的组合物用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的用途。
23.用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的疫苗，其包含有效量的根据权利要求10-17中任何一项的重组的基于AAV5的病毒。
24.用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的疫苗，其包含有效量的根据权利要求10-17中任何一项的重组的基于AAV5的病毒。
25.用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的方法，其包括给予哺乳动物生物体有效量的用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的根据权利要求10-17中任何一项的重组的基于AAV5的病毒、根据权利要求18的组合物或根据权利要求24的疫苗。
26.用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的方法，其包括给予哺乳动物生物体有效量的用于预防SARS-CoV-2相关冠状病毒感染的根据权利要求10-17中任何一项的重组的基于AAV5的病毒、根据权利要求18的组合物或根据权利要求23的疫苗。
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