EA020563B1 - Получение полиовируса с высокими титрами для получения вакцины - Google Patents

Получение полиовируса с высокими титрами для получения вакцины Download PDF

Info

Publication number
EA020563B1
EA020563B1 EA201270173A EA201270173A EA020563B1 EA 020563 B1 EA020563 B1 EA 020563B1 EA 201270173 A EA201270173 A EA 201270173A EA 201270173 A EA201270173 A EA 201270173A EA 020563 B1 EA020563 B1 EA 020563B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
poliovirus
cells
infection
cell
type
Prior art date
Application number
EA201270173A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270173A1 (ru
Inventor
Джон Альфред Льюис
Original Assignee
Круселл Холланд Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Круселл Холланд Б.В. filed Critical Круселл Холланд Б.В.
Publication of EA201270173A1 publication Critical patent/EA201270173A1/ru
Publication of EA020563B1 publication Critical patent/EA020563B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A61K39/13—Poliovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32651—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение предлагает способ получения полиовируса, включающий в себя следующие стадии: а) предоставление бессывороточной суспензионной культуры клеток, представляющих собой клетки PER.C6; b) заражение упомянутых клеток полиовирусом при плотности клеток в диапазоне между 2×10и 150×10клеток/мл и увеличение количества полиовируса до высоких титров, равных по меньшей мере 10CCID/мл; и с) сбор урожая полиовируса в период 12-48 ч после заражения.

Description

Настоящее изобретение относится к области клеточного культивирования и получения полиовируса. В частности, оно касается улучшенных способов культивирования клеток и получения из них полиовируса для получения вакцин против полиомиелита.
Уровень техники настоящего изобретения
Полиовирусы являются членами рода Еп!егоуци8 семейства Рюогпаутйае. Полиовирусы представляют собой маленькие вирусы без оболочки с капсидами, окружающими одноцепочечный положительно-полярный РНК геном. Существует три типа полиовирусов: типы 1, 2 и 3. Заражения восприимчивых индивидуумов полиовирусом может приводить к паралитическому полиомиелиту. Полиомиелит высоко контагиозен. Были разработаны две различные вакцины против полиомиелита, инактивированная вакцина против полиовируса (ИПВ) Солка и живая ослабленная оральная вакцина против полиовируса (ОПВ) БаЫп. Обе вакцины безопасны и эффективны. Каждая обладает своими индивидуальными достоинствами и недостатками, и обе сыграли важную роль в контроле над полиомиелитом. Для обзора о полиовирусах и вакцинах против полиомиелита см., например, Кете е! а1., 2005.
Оральная вакцина против полиомиелита (ОПВ) является дешевой и удобной и масштабно применялась. Тем не менее, некоторые реципиенты страдают вакцино-ассоциированным паралитическим полиомиелитом (ВАПП) из-за ревертантов в вакцине. Кроме того, в популяциях, которые не были полностью иммунизированы, наблюдали, что ослабленные полиомиелитные штаммы БаЫп претерпевали значительные мутационные изменения, чем вызывались вспышки паралитического заболевания, которое клинически и эпидемиологически неотличимо от заболевания природным полиомиелитом дикого типа; упомянутые мутанты называют циркулирующими полиовирусами вакцинного происхождения или цПВВП (см., например, Кете е! а1., 2005; \Спд1ц апй Моййп, 2008; Уакоуепко е! а1., 2009).
Все более устанавливается консенсус, что инактивированная вакцина против полиовируса (ИПВ) может внести вклад в более быстрое искоренение полиомиелита дикого типа и контроль за возникающим цПВВП, когда она применяется в сочетании с существующими стратегиями применения ОПВ (ХСпдк! апй Μοάΐίη, 2008; 1окп. 2009).
Тем не менее, производство ИПВ является более дорогим (см., например, 1окп. 2009) и может даже оказаться чрезмерно дорогим для малоразвитых и наименее развитых стран, в которых до сих пор существует серьезная необходимость в вакцинах против полиомиелита. Культуральные системы для получения большого объема полиовирусного материала, который может применяться в вакцине, в частности неослабленного полиовируса, вносят значительный вклад в относительно высокие цены.
Таким образом, остается необходимость в уровне техники для эффективных культуральных систем для получения полиовируса для применения в вакцинах.
Размножение полиовируса в клетках НЕК-293 было описано в качестве системы для исследования фенотипов полиовируса с нейрон-специфической репликацией и было описано, что ослабленные формы полиовируса, как, например, полиовирус, содержащий точечные мутации в элементе 1КЕБ, как это имеет место в штаммах БаЫп, демонстрируют уменьшенное размножение в клетках НЕК-293 (СатрЪе11 е! а1., 2005).
Е1-иммортализованные человеческие эмбриональные клетки ретины (НЕК), в частности клетки РЕК.С6, были описаны в качестве подходящих для размножения различных вирусов, причем особое внимание уделялось вирусу гриппа (Раи е! а1., 2001; \СО 01/38362). Хотя \СО 01/38362 описывает рабочие примеры размножения различных штаммов вируса гриппа и вируса Негрек Б1тр1ех (НБУ) типов 1 и 2, вируса кори и ротавируса в клетках РЕК.С6, размножение полиовируса не было подтверждено примером в \СО 01/38362. Кроме того, условия для репликации полиовируса в таких клетках не были описаны и не могут легко быть предсказаны на основании репликации неродственных вирусов в данных клетках. Следовательно, до настоящего времени не было известно, окажется ли возможным экономически получать полиовирус в промышленном масштабе с целью получения вакцины в данных клетках.
Для крупномасштабного производства инактивированных вакцин против полиомиелита полиовирус, как правило, выращивают в клетках Уего, происходящих от обезьян. Клетки Уего широко применяются для получения вакцины, включая инактивированную, а также живую ослабленную вакцину против полиомиелита, и до сих пор являются наиболее широко признанными регуляторными органами непрерывными клеточными линиями для производства вирусных вакцин, и применение данных клеток для получения вакцины будет возрастать, как ожидается экспертами в данной области (Ваггей е! а1., 2009).
Крупномасштабная культура на микроносителях клеток Уего для инактивированной вакцины против полиовируса была описана Моп!адпоп е! а1., 1982 и 1984. Способ для крупномасштабного получения вакцины против полиомиелита с использованием клеток Уего и полученная вакцина также описаны в патенте США 4525349.
Получение высоких титров полиовируса (БаЫп тип 1) (почти 2х109 ТСГО50/мл) было описано (Мейеп е! а1., 1997) для условий, когда клетки Уего на микроносителях культивировали в содержащей сыворотку среде до фазы получения вируса в бессывороточной среде, но, принимая во внимание недостатки применения сыворотки, авторы указывают, что желателен полностью бессывороточный способ, и в таком оптимизированном полностью бессывороточном способе данные авторы смогли получить титр
- 1 020563 равный 6,3 х 108 ТСГО50/мл.
КгеейепЬегд с( а1. (2006), участвовавшие в получении полиовируса для получения вакцины в промышленном масштабе, также отмечают урожаи различных штаммов полиовируса дикого типа и §аЬш в клетках Уего, выращенных на микроносителях, каковые урожаи сходны для различных штаммов, причем логарифмические титры лежат в диапазоне между 8,1 и 8,6. Данные авторы также описывают, что количество вируса, необходимого для получения целевой вакцины, значительно выше для ИПВ, чем для ОПВ, что приводит к значительно более высокой стоимости получения на дозу для ИПВ, чем для ОПВ.
Бессывороточное получение полиовируса с применением клеток Уего, культивированных на микроносителях, также было описано в (Сагй е( а1., 2005) и, хотя уровень урожайности был ниже, чем в статических культурах, было описано, что культуры на микроносителях легче масштабировать.
Несмотря на эффективность и промышленную применимость данных клеточных культур Уего с применением микроносителей, получение больших количеств полиовируса остается дорогостоящим, и, следовательно, остается необходимость в альтернативных системах получения полиовирусов, которые меньше страдали бы от данного недостатка.
Было описано получение полиовируса с применением суспензионных клеток Уего с более низкими титрами вируса (101од ССГО50/мл между 6,5 и 7,9), чем наблюдаемые в обычных клетках Уего на микроносителях (уап ЕПюпНопй е( а1., 2009).
Целью настоящего изобретения являются подходящие способы, которые можно было бы применять для крупномасштабного и экономически выгодного получения полиовирусов для применения в вакцинах. Это может помочь в обеспечении доступа к недорогой вакцине против полиомиелита в развивающихся странах на постоянной основе.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на демонстрации очень эффективного размножения полиовируса в клетках РЕК.С6, причем были получены беспрецедентно высокие титры полиовируса в соответствии со способами, описанными в настоящем описании. Получение таких высоких титров, которое обеспечивает значительное экономическое преимущество над получением полиовируса в клетках Уего, не могло быть предсказано на основании репликации других вирусов в таких клетках, и не могли быть предсказаны условия для осуществимого в промышленном масштабе способа, поскольку данные условия и достигаемые преимущества могут широко варьироваться для различных несходных типов вирусов, которые обладают сильно различающимися свойствами.
Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ получения полиовируса, включающий в себя следующие стадии: а) предоставление бессывороточной суспензионной культуры клеток, представляющих собой клетки РЕК.С6, депонированные в ЕСАСС под № 96022940; Ь) заражение упомянутых клеток полиовирусом при плотности клеток между 2х106 и 150х106 клеток/мл и с) сбор урожая полиовируса в период между 12 и 48 ч после заражения.
В определенных вариантах осуществления упомянутое заражение осуществляют при плотности клеток между приблизительно 5х106 и 20х106 клеток/мл, например между приблизительно 8х106 и 15х 106 клеток/мл, например приблизительно 10х 106 клеток/мл.
В определенных вариантах осуществления упомянутый сбор урожая полиовируса осуществляют в период между приблизительно 18 и 30 ч после заражения, например через приблизительно 24 ч после заражения.
Данные условия позволяют получать очень высокие титры (около 1010/мл, что значительно больше чем в 10 раз превосходит титры, обычно получаемые с применением клеток Уего на микроносителях для штаммов полиомиелита дикого типа) полиовируса в относительно коротком способе, который, следовательно, обладает значительными экономическими преимуществами перед способами, применяемыми в настоящее время для получения полиовируса для получения вакцины. Это было продемонстрировано для всех трех типов полиовируса: типа 1 (штамм ВгипепйегЦ, типа 2 (штамм МЕР) и типа 3 (штамм §аикей).
В определенных вариантах осуществления, следовательно, упомянутый полиовирус представляет собой дикого типа вирулентный полиовирус, например полиовирус типа 1, полиовирус типа 2 или полиовирус типа 3. В определенных вариантах осуществления упомянутый полиовирус представляет собой полиовирус типа 1 штамма Майоиеу или Вгииеийегк, полиовирус типа 2 штамма МЕР (или МЕР-1) или полиовирус типа 3 штамма 8аикей. В других вариантах осуществления упомянутый полиовирус представляет собой ослабленный полиовирус (являющийся менее нейровирулентным), например штамм §аЬш (который может также быть типа 1, 2 или 3).
Настоящее изобретение, кроме того, предлагает способ получения вакцины против полиомиелита, включающий в себя способ получения полиовируса в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно включающий в себя очистку, необязательное инактивирование и составление рецептуры собранного полиовируса, для того чтобы получить вакцину против полиомиелита. Для ИПВ осуществляют инактивацию посредством формалина или других средств. Для ОПВ стадии инактивирования не требуется.
- 2 020563
В настоящем описании также раскрыто предоставление крупной партии полиовируса, пригодной для получения вакцины против полиомиелита, причем упомянутая крупная партия полиовируса может быть получена посредством способа получения полиовируса в соответствии с настоящим изобретением и содержит культуральную среду и титр полиовируса, равный по меньшей мере 109,4 СС1О50/мл, например между приблизительно 109,5 и 1011 СС1Э50/мл. например между приблизительно 109,8 и 1010,8 СС1Э50/мл. В определенных вариантах осуществления упомянутая крупная партия имеет объем между 1 и 1000 л. В других вариантах осуществления упомянутая крупная партия содержит клетки и/или клеточный дебрис из клеток, используемых в соответствии со способами настоящего изобретения. В определенных вариантах осуществления упомянутая крупная партия присутствует в биореакторе. В других вариантах осуществления крупная партия удалена из биореактора и присутствует в подходящей емкости.
Также раскрыты полиовирус и вакцина против полиомиелита, получаемые в соответствии со способами настоящего изобретения. Упомянутый полиовирус и/или упомянутая вакцина не содержат белков обезьяны, предпочтительно не содержат нечеловеческих белков. Они также не будут содержать других остатков нечеловеческих клеток-хозяев. Напротив, полиовирус, который был получен в соответствии с обычными способами, будет содержать остаточный нечеловеческий белок и/или другие нечеловеческие остатки от используемых клеток-хозяев и/или от сыворотки, использованной во время культивирования клеток. Таким образом, полиовирус, полученный в соответствии с рассматриваемым в данный момент изобретением, страдает от меньшего загрязнения нечеловеческими примесями, являющимися результатом способа получения, чем полиовирус, полученный при применении обычных способов.
Настоящее изобретение также предлагает способ получения полиовирусного препарата в клеточной культуре с титром, равным по меньшей мере приблизительно 109,4, предпочтительно по меньшей мере 109’8, более предпочтительно по меньшей мере 1010, например между 1010,5 и 1011 ССГО50/мл, включающий в себя следующие стадии: а) предоставление бессывороточной суспензионной культуры клеток, представляющих собой клетки РЕК.Сб; Ь) заражение упомянутых клеток полиовирусом при плотности клеток в диапазоне между 2х 10б и 150х 10б клеток/мл и с) сбор урожая полиовируса в период между 12 и 48 ч после заражения, для того чтобы получить полиовирусный препарат, имеющий упомянутую концентрацию. Предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как описанные выше для способа получения полиовируса в соответствии с настоящим изобретением.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Получение полиовируса в адгезивных РЕК.Сб и Уего клетках.
Фиг. 2. Получение полиовируса типа 1 в суспензионных клетках РЕК.Сб в различных бессывороточных средах, при различных ΜΟΙ и при различной плотности клеток при заражении.
Фиг. 3. Влияние температуры и времени сбора урожая на получение полиовируса типов 1, 2 и 3 в суспензионных клетках РЕК.Сб в бессывороточной среде.
Фиг. 4. Влияние плотности клеток при заражении, температуры и времени сбора урожая на получение полиовируса типа 1 в суспензионных клетках РЕК.Сб в бессывороточной среде.
Фиг. 5. Эффективное получение полиовируса типов 1, 2 и 3 в бессывороточных суспензионных клетках РЕК.Сб при высокой плотности клеток.
Подробное описание изобретения
Клетки, применяемые в способах настоящего изобретения, представляют собой клетки РЕК.Сб, которые являются иммортализованными клетками, также известными в данной области техники как непрерывные клеточные линии, и как таковые обладают потенциалом для бесконечной продолжительности жизни (см., например, Ваггей е1 а1., 2009). Клетки РЕК.Сб для цели настоящего изобретения обозначают клетки, депонированные в ЕСАСС под № 9б022940 29 февраля 199б г. Специалисту в данной области техники ясно, что данное определение включает клетки из последующего или предыдущего пассажа или потомка последующего или предыдущего пассажа данных депонированных клеток. Клетки РЕК.Сб описаны в патенте США 5994128 и в РаНаих е1 а1., 1998. Данные клетки хорошо подходят для получения вируса гриппа, для того чтобы получать клеточные вакцины против гриппа, поскольку они могут быть заражены, и выращивать вирус с высокой эффективностью, как, например, описано в Раи е1 а1., 2001 и \УО 01/383б2. Клетки РЕК.Сб способны расти в суспензии в отсутствие сыворотки, как, например, описано в УаИор е1 а1., 2005. В настоящем описании продемонстрировано, что данные клетки также хорошо подходят для получения полиовируса с высокими титрами в бессывороточных суспензионных культурах.
Более того, используемые условия являются экономически и регуляторно выгодными.
Применение микроносителей не обязательно для рассматриваемого в данный момент изобретения в отличие от широко используемых способов с клетками Уего. Микроносители вносят вклад в высокую стоимость полиовируса, полученного с применением обычных способов, основанных на клетках Уего.
Бессывороточная в соответствии с настоящим изобретением означает, что среда, используемая для роста клеток и заражения, не имеет цельной сыворотки в качестве ингредиента. Она может не быть полностью свободной от происходящих от сыворотки продуктов, таких как, например, бычий сывороточный альбумин (БСА), однако в предпочтительных вариантах осуществления такие компоненты также отсутствуют, или их рекомбинантно получают в отсутствие каких-либо компонентов животного происхожде- 3 020563 ния. В предпочтительных вариантах осуществления весь способ осуществляют в отсутствие каких-либо компонентов, имеющих непосредственное происхождение от животных, таких как сыворотка или компоненты сыворотки и т.д. В предпочтительном варианте осуществления способ получения вакцины осуществляют в условиях отсутствия животных компонентов. Это означает, что среда, используемая для роста и заражения клеток, лишена каких-либо компонентов животного происхождения. Более того, все вспомогательные вещества, добавленные к среде в способе получения вакцины, также свободны от каких-либо компонентов животного происхождения. Отсутствие животных компонентов в способе изготовления упомянутой вакцины против полиомиелита предлагает способ, который является более управляемым и безопасным. По этой причине клетки РЕК.С6, которые являются полностью охарактеризованными человеческими клетками и которые разрабатывались в соответствии с ОЬР/ОМР, очень хорошо подходят для применения в производстве вакцины. Можно применять различные культуральные среды, и выбор оптимальной культуральной среды для клеток и используемых условий представляет собой часть рутинных задач для специалиста в данной области техники. Подходящие культуральные среды для цели настоящего изобретения поэтому хорошо известны специалисту в данной области техники и могут обычно быть получены из коммерческих источников в больших количествах или специально изготовлены в соответствии со стандартными протоколами. Культивирование можно осуществлять, например, в планшетах, роллерных флаконах или в биореакторах, используя системы периодического действия, периодического действия с подпиткой, непрерывные и т.п. Для того чтобы достичь крупномасштабного (непрерывного) получения вируса посредством клеточной культуры, в данной области техники предпочтительным является иметь клетки, способные расти в суспензии, и предпочтительным является иметь клетки, пригодные для культивирования в отсутствие сыворотки животного или человеческого происхождения или компонентов сыворотки животного или человеческого происхождения. Подходящие условия для культивирование клетки известны (см., например, ТЬкие СиИите, Асайетю Ргекк, Кгике аиб Ра1еткоп, еййотк (1973) и Κ.Ι. РтекЬпеу, СиИите οί ашша1 сеПк: А тапиа1 οί Ъаыс (есНпище. 4-е изд. ОУПет-ЬИк 1пс., 2000, ΙδΒΝ 0-471-34889-9). Бессывороточные культуральные среды, которые могут использоваться в соответствии со способами настоящего изобретения, включают, без ограничения, стандартные среды, которые могут быть заказаны по каталогам продавцов сред, включая СЭМ4 РЕКМАЪ™ (Тйетто БОепййс НуС1опе, каталожные номера 8Н30871, 8Н30872). Кроме того, подходящими являются специально заказываемые среды, такие как РеттехсН (Ьоп/а). Примерами других бессывороточных сред, которые могут быть подходящими для применения в способах настоящего изобретения, являются АЕМ (1пуИтодеп, каталожный номер 12582-011), среда ЕХСЕЬЬ™ УРКО (1РН Вюкаепсек, каталожный номер 14561) и СЭМ4 Кейпо™ (НуС1опе, каталожные номера 8Н30520, 8Н30519).
В некоторых необязательных и неограничивающих вариантах осуществления возможным является дополнение бессывороточных сред в способах настоящего изобретения липидами, и/или гидролизатами, и/или другими добавками, для того чтобы еще более увеличить урожайность.
Термин приблизительно или около для численных значений, как он используется в настоящем описании, означает величину ±10%.
Заражение клеток полиовирусом и/или размножение вируса в способах в соответствии с настоящим изобретением соответственно осуществляют, например, при температуре в диапазоне между приблизительно 33 и 38°С. В предпочтительных вариантах осуществления упомянутое заражение и/или размножение вируса осуществляют при температуре в диапазоне между приблизительно 34 и 36°С, в определенных вариантах осуществления между приблизительно 34,5 и 35,5°С, например приблизительно при 35°С.
Заражение клеток полиовирусом в способах в соответствии с настоящим изобретением может, например, быть соответственно выполнено при множественности заражения (МО1) в диапазоне между 0,001 и 10. В определенных вариантах осуществления упомянутое заражение осуществляют при МО1 в диапазоне между приблизительно 1 и 3, например при МО1 равной приблизительно 2. Заражение при такой, относительно высокой, МО1 (>0,1, предпочтительно приблизительно 1 или выше) может дополнительно увеличивать высокую эффективность, высокую урожайность способа.
В соответствии с настоящим изобретением клетки заражают полиовирусом, предпочтительно при высокой плотности клеток. В определенных аспектах заражение полиовирусом имеет место, когда плотность клеток составляет между 1 х 106 и 150х106 клеток/мл, предпочтительно между 2х106 и 150х106 клеток/мл. В определенных предпочтительных вариантах осуществления упомянутое заражение осуществляют при плотности клеток в диапазоне между приблизительно 5х106 и 20х106 клеток/мл, например между приблизительно 8х106 и 15х106 клеток/мл, например приблизительно при 10х106 клеток/мл. Насколько известно, способы настоящего изобретения предлагают наивысшие концентрации клеток, при которых производят вакцины против неаденовирусного вируса. Преимущества данных способов в соответствии с настоящим изобретением заключаются в том, что могут быть получены очень высокие титры полиовируса, т.е. по меньшей мере на порядок величины выше, чем с помощью обычных способов с применением Уего из известного уровня техники.
- 4 020563
В способах в соответствии с настоящим изобретением полиовирус собирают в период между 12 и 48 ч после заражения. В определенных вариантах осуществления упомянутый сбор полиовируса осуществляют в период между приблизительно 18 и 30 ч после заражения, например между приблизительно 20 и 28 ч, между приблизительно 22 и 26 ч после заражения, например через приблизительно 24 ч после заражения. Таким образом, способы в соответствии с настоящим изобретением можно применять, для того чтобы получать высокие титры полиовируса чрезвычайно быстро, что также способствует тому, что способы настоящего изобретения становятся экономически чрезвычайно перспективными по сравнению с более продолжительными способами, которые приняты в уровне техники.
С большей частью крупномасштабных суспензионных культур работают с помощью периодического или периодического с подпиткой способов, поскольку они наиболее просты для работы и масштабирования, и такие способы в принципе подходят для способов рассматриваемого в настоящий момент изобретения. Тем не менее, непрерывные способы, основанные на перфузионных принципах, становятся более распространенными. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения клеткипродуценты культивируют в перфузионной системе.
С клетками РЕК.С6 применяли периодический, периодический с подпиткой, перфузионный и перфузионный способы получения, например, для получения рекомбинантных антител. В периодических культурах обычно достигается концентрация жизнеспособных клеток больше чем 12х106 клеток/мл. Концентрация жизнеспособных клеток вплоть до 40х106 клеток/мл была много раз продемонстрирована при применении периодического действия с подпиткой. В перфузионных способах обычно достигаются пиковые концентрации клеток свыше 150х 106 клеток/мл (Κταί с1 а1., 2009).
Перфузионное культивирование клеток обладает своим общепринятым значением в данной области техники, т.е. оно означает, что во время культивирования клетки удерживаются сепарационным устройством, в котором имеет место выходной поток жидкости с более низкой плотностью клеток, чем до сепарации, и в котором имеет место входной поток клеточной культуральной среды. Префузируемую культуру применяют в ответ на заражение растущих клеток при высокой плотности (например, 10-50х106 жизнеспособных клеток/мл). Для того чтобы увеличить плотности, среду постоянно или периодически заменяют свежим притоком, для того чтобы восполнить нехватку питательных веществ и чтобы удалить токсичные продукты. Перфузия также предоставляет возможность для лучшего управления условиями культивирования (рН, άθ2, уровни питательных веществ и т.д.). Перфузия свежей среды через культуру может быть достигнута посредством удерживания клеток с помощью множества сепарационных устройств (например, центробежного фильтра с мелкими отверстиями, мембранных фильтров на полых волокнах или с плоской решеткой, седиментационных трубок). В определенных вариантах осуществления сепарационное устройство представляет собой модуль фильтра, содержащий полые волокна, т.е. трубчатые мембраны. Внутренний диаметр трубки обычно лежит в диапазоне между 0,3 и 6,0 мм, например между 0,5 и 2,0 мм. В определенных вариантах осуществления размер отверстий (размер пор) в мембране выбирают таким, что размер пор в сетке близок к диаметру клеток, обеспечивая высокое удерживание клеток, в то время как клеточный дебрис может проходить через фильтр. В других вариантах осуществления размер отверстий значительно меньше, чем диаметр клеток. Предпочтительно размер отверстий лежит в диапазоне между 0,1-30 мкм, например между 0,1 и 3 мкм, например приблизительно 0,2 мкм. Модули фильтра, содержащие полые волокна, коммерчески доступны от, например, Сеиета1 Е1сс1г1с (в прошлом Атеткйат).
Перфузию применяют, для того чтобы поддерживать требуемые уровни определенных метаболитов и чтобы удалить и посредством этого уменьшить примеси в культуральной среде. Как это обычно имеет место, перфузию не осуществляют все время во время культивирования, а обычно осуществляют только время от времени во время культивирования, по необходимости. Например, перфузию обычно начинают только после того, как определенные компоненты среды, такие как глюкоза, начинают истощаться и требуют замены.
Несколько перфузионных систем известны в области техники и в принципе подходят для применения в способах настоящего изобретения. Термин перфузионная система означает комбинацию биореактора, соединенного с сепарационным устройством. Сепарационное устройство может быть или встроено в биореактор (например, центробежный фильтр с мелкими отверстиями), или оставаться снаружи биореактора (например, полое волокно). В обоих случаях, как разъяснено выше, сепарационное устройство препятствует вымыванию клеточной массы из реактора и делает возможным восстановление среды. В определенных вариантах осуществления биореакторы работают (соединены) с перфузионной системой изменяемого тангенциального потока (АТЕ) (например, АТЕ §у81ет, Кейпе ТесЬпо1оду, Со., Еак! Напоует, N1). Тангенциальный поток может быть получен в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники, и, как описано, например, в патенте США 6544424. Работа перфузионной системы АТЕ была описана и является масштабируемой (Еигеу, 2002). Системы АТЕ предоставляют клеткам возможность подвергаться культивированию в течение более долгого периода времени и достигать высокой плотности клеток в отсутствие модульного фильтра. В самом деле, чрезвычайно высокие плотности клеток свыше 100х106 жизнеспособных клеток/мл можно получить с применением пер- 5 020563 фузионной системы АТР, например с клетками РЕК.С6 (см., например, Уа11ор с! а1., 2005 и \УО 2005/095578). Тем не менее, в упомянутых более ранних сообщениях клетки РЕКС6 в перфузионных системах применяли для рекомбинантного получения антител, т.е. с совершенно другой целью, и не заражали полиовирусом.
В определенных вариантах осуществления перфузия с применением, например, системы ЛТР является эффективной во время прекультуры (т.е. до заражения полиовирусом), поскольку она делает возможным получение очень высокой плотности клеток, и клетки находятся в хорошем состоянии для последующего заражения полиовирусом. Для того чтобы достичь упомянутой высокой плотности клеток, культуральную среду в определенных вариантах осуществления, по меньшей мере частично, префузируют во время отрезка времени во время роста клеток. В определенных вариантах осуществления перфузию начинают, как только достигается плотность клеток между приблизительно 2х106 и 8х106 жизнеспособных клеток/мл.
В способах настоящего изобретения клетки заражают полиовирусом. Как правило, вирус подвергают воздействию соответствующей клетки-продуцента в оптимальных условиях, позволяющих поглощение вируса. Специалисту в данной области техники известно, как найти оптимальные дополнительные условия, т.е. для перемешивания, рН, растворенного кислорода (ЙО2 или ΌΟ). Обычно перемешивание оптимально между приблизительно 50 и 300 об/мин, как правило приблизительно 100-200, например приблизительно 150, обычный ΌΟ составляет 5-60%, оптимальный рН составляет между 6,7 и 7,7. Как правило, полиовирус заражает клетки настоящего изобретения спонтанно, и осуществление контакта клеток с полиовирусными частицами является существенным для заражения клеток. Как правило, полиовирусный посевной материал добавляют к культуре, для того чтобы инициировать заражение, и затем полиовирус размножается в клетках.
Оказалось, что существует выгодная возможность заражать клеточную культуру в соответствии с настоящим изобретением полиовирусом при высокой плотности клеток, т.е. приблизительно 10х106 клеток/мл, и были получены очень высокие титры (выше чем 1010 ССГО50/мл) полиовируса.
В определенных вариантах осуществления жизнеспособность клеточной культуры до заражения остается выше чем 75%, что означает, что по меньшей мере 75% от полного количества клеток в культуре жизнеспособно на момент заражения. В определенных вариантах осуществления жизнеспособность клеточной культуры при заражении составляет по меньшей мере 80%, в дополнительных вариантах осуществления по меньшей мере 85%. Жизнеспособность можно измерять с помощью обычных способов, доступных специалисту в данной области техники, например исключения трипанового синего, подсчета клеток с помощью Саву и т.п.
В определенном варианте осуществления плотность клеток при заражении лежит в диапазоне между приблизительно 10х106 и 50х106 жизнеспособных клеток/мл, например между приблизительно 10х106 и 20х106 жизнеспособных клеток/мл, например между приблизительно 10х106 и 15х106 жизнеспособных клеток/мл. Данные плотности клеток создают возможность для высокой урожайности вируса с ограниченным накоплением клеточного дебриса и ДНК клеток-хозяев, что предоставляет преимущество данных вариантов осуществления в дальнейшей переработке урожая полиовируса. Таким образом, настоящее изобретение предлагает оптимизированный способ получения полиовируса, дающий высокие титры полиовируса, в то же время предоставляя собранный материал, который еще удобен для цели дальнейшей переработки.
В других вариантах осуществления плотность клеток при заражении лежит в диапазоне между приблизительно 15х106 и 150х106 клеток/мл, например между приблизительно 15х106 и 80х106 клеток/мл, например между приблизительно 20х106 и 50х106 клеток/мл. При заражениях при данных плотностях клеток можно получать даже более высокие концентрации вируса.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения крупной партии полиовируса при титре, равном по меньшей мере 1010 ССГО50/мл.
Титр выражается в ССГО50, что представляет собой 50% заразительной дозы клеточной культуры. Иногда его также называют ТСГО50 (50% заразительной дозы тканевой культуры), но, поскольку он определяется клеточной культурой, в настоящем описании применяется термин ССГО50.
Вирус приводят в контакт с клетками, для того чтобы дать возможность вирусу заразить упомянутые клетки и размножиться. Например, вирусную посевную партию добавляют к клеточной культуре и позволяют ей абсорбироваться на клетках, например, в течение приблизительно 30 мин при легком перемешивании (например, приблизительно 30 об/мин), после которого можно добавить дополнительную культуральную среду, и корректируют рН при необходимости, можно скорректировать скорость перемешивания, и культивирование продолжают. После стадии заражения имеет место увеличение количества вирусных частиц. Конечно, данную стадию также предпочтительно осуществляют в клетках РЕК..С6, которые культивируют в суспензии в отсутствие сыворотки, и более предпочтительно в условиях полного отсутствия компонентов, непосредственно происходящих от животных. Данная стадия может соответственно осуществляться в биореакторах, например, с размером в диапазоне между 1 и 20000 л, например между 10 и 2000 л, например между 50 и 1000 л, каковой размер можно легко скорректировать исходя из
- 6 020563 потребности в вакцине. В определенных вариантах осуществления биореактор представляет собой одноразовый биореактор (8ИВ).
После размножения полиовируса в клетках вирус или его компоненты собирают на клеточной культуре. Это может быть осуществлено обычными способами, которые как таковые известны специалисту в данной области техники. Вирус, полученный и выделенный в клеточную культуральную среду, можно отделить от клеточной биомассы посредством обычных способов, таких как центрифугирование или ультрафильтрация, и собрать в супернатант. В таком случае центрифугирование или фильтрация являются стадиями сбора. Можно применять обычные способы для сбора вируса, например, описанные в патенте США 4525349. Кратко говоря, жидкую суспензию среды, содержащей вирус, как правило, отбирают, фильтруют и концентрируют посредством, например, ультрафильтрации. Например, в конце культивирования проводят сбор урожая посредством сбора культуральной среды, содержащей вирусную суспензию. Урожай можно отфильтровать, например используя 0,22 мкм фильтр, и необязательно сохранить при 4°С.
Отфильтрованный урожай можно необязательно подвергнуть ультрафильтрации, для того чтобы сконцентрировать вирусную суспензию, и затем полиовирус можно очистить, например используя гельфильтрацию и/или ионообменную хроматографию, например следуя методике, описанной в патенте США 4525349 или в Уап \Ус/с1 с1 а1., 1978. Полученную в результате вирусную суспензию можно необязательно разбавить, и для получения ИПВ полиовирус в ней инактивируют, для чего можно применять обычные способы.
Способы для сбора и очистки полиовируса или вирусных компонентов и получения из них вакцин применяются в области техники уже в течение десятилетий и, следовательно, хорошо известны и подробно описаны, например, в Уап \Ус/с1 с1 а1., 1978; Мойадпоп с1 а1., 1984; νθ 2007/007344; патенте США 4525349, все включены в настоящее описание посредством ссылки.
Вакцины против полиомиелита основаны на живом вирусе или инактивированном вирусе. Они содержат полиовирусный Ό-антиген, который является важным протективным антигеном. Урожаи вируса можно измерять посредством стандартных методик титрования вируса, в то время как определение концентрации Ό-антигена также осуществляют посредством обычных методик, хорошо известных специалисту в данной области техники, например иммуноферментного анализа Ό-антигена. Иммуногенность можно, например, определить посредством ш νίνο испытаний на животных. Эффективность можно определить, используя иммуноферментный анализ Ό-антигена и посредством анализа нейтрализации полиовируса в культуре клеток на сыворотках от предварительно иммунизированных крыс.
Как правило, каждый из полиовирусных штаммов культивируют в отдельном способе, и если, например, получают тривалентную вакцину, содержащую три типа полиовируса, (инактивированные в случае ИПВ) вирусы смешивают и составляют для получения индивидуальных доз. В определенных вариантах осуществления, например, конечная доза вакцины (например, 0,5 мл) может, например, содержать 40 единиц Ό-антигена (ΌΌ) полиовируса типа 1, 8 ΌΌ полиовируса типа 2 и 32 ΌΌ полиовируса типа 3, что определяется сравнением с эталонными препаратами.
Инактивацию полиовируса можно осуществлять в соответствии со способами, известными в уровне техники, например с помощью формалина или с помощью β-пропиолактона (ВРЬ) (см., например, Лапд с1 а1., 1986). В определенных вариантах осуществления инактивацию осуществляют с помощью формалина, например, посредством следующего способа: очищенную вирусную суспензию фильтруют через 0,22 мкм мембрану, нагревая до 37°С при равномерном перемешивании с помощью магнитной мешалки в течение 24 ч, после чего добавляют раствор формалина до концентрации, равной 1 на 4000. Поддерживая температуру вирусной суспензии, равную 37°С, продолжают перемешивание с помощью магнитной мешалки в течение первых четырех дней. На шестой день вирусную суспензию фильтруют через 0,22микронную мембрану и продолжают инактивацию суспензии при 37°С вплоть до двенадцатого дня. Инактивированную вирусную суспензию гомогенизируют и могут сохранять, например, при 4°С. После данной стадии могут быть получены концентрированные и/или окончательные партии для применения, например, посредством смешивания требуемых препаратов.
В определенных вариантах осуществления очищенный полиовирус или вирусный компонент составляют в фармацевтическую композицию. Это может быть осуществлено в соответствии с множеством способов и с применением множества буферов в полном соответствии с обычными способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Как правило, сюда входит введение полиовирусных частиц в фармацевтически приемлемую композицию, содержащую полиовирус и по меньшей мере фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Такая композиция может быть получена в условиях, известных специалисту в данной области техники, и в определенных вариантах осуществления подходит для введения людям. В определенных вариантах осуществления композиция может содержать буферизованную культуральную среду, которая может необязательно представлять собой среду М-199, которую применяют в качестве буфера для композиции для определенных зарегистрированных стандартных инактивированных вакцин против полиовируса. Кроме того, можно использовать фосфатный буферный солевой раствор, и конечные дозированные композиции могут содержать, например, 0,5% 2-феноксиэтанола и не более 0,02% формальдегида на дозу в качестве противомикробных консервантов.
- 7 020563
Фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества и разбавители хорошо известны в данной области техники и широко применяются в широком диапазоне терапевтических продуктов. Предпочтительно применяют носители, которые хорошо работают в вакцинах. В определенных вариантах осуществления вакцины дополнительно содержат адъювант, например квасцы. В данной области техники известно, что адъюванты дополнительно увеличивают иммунный ответ на применяемую антигенную детерминанту.
Для введения людям настоящее изобретение может применять фармацевтические композиции, содержащие полиовирус и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. В настоящем контексте термин фармацевтически приемлемый означает, что носитель или вспомогательное вещество в применяемых дозах и концентрациях не окажет какого-либо нежелательного или вредного воздействия на субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества хорошо известны в данной области техники [см. Кеш1п§1оп'8 РЬаттасеийса1 8сюпсс5. 18'1' еФОоп. Л.К. Оеппато, Ей., Маск РиЫЫипд Сотрапу (1990); РЬаттасеийса1 Рогти1айоп Эеуе1ортеп1 о! Рерййек апй Рго1ет8, 8. Ргок)аег апй Ь. Ноудаатй, Ей§., Тау1ог & Ртапшз (2000) и НапйЪоок о! РЬаттасеийса1 Ехс1р1еп18, 3гй еййоп, А. КтЪЪе, Ей., РЬаттасеийса1 Рте88 (20 00)]. Очищенный инактивированный полиовирус или его иммуногенные части предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора. Стерильные растворы получают посредством стерильной фильтрации или посредством других способов, известных рег 8е в данной области техники. Затем растворы лиофилизируют или разливают в контейнеры для фармацевтических препаратов. рН раствора, как правило, составляет от 3,0 до 9,5, например от 5,0 до 7,5. Полиовирус или его иммуногенные части, как правило, помещены в раствор с подходящим фармацевтически приемлемым буфером, и раствор полиовируса может также содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления вакцина может быть составлена в инъекционный препарат. Данные композиции содержат эффективные количества полиовируса или его иммуногенные части, представляют собой или стерильные жидкие растворы, жидкие суспензии или лиофилизированные варианты и необязательно содержат стабилизаторы или вспомогательные вещества.
Вакцина против полиомиелита может быть моновалентной, содержащей один тип полиовируса (тип 1, 2 или 3), или бивалентной (содержащей два типа полиовируса, например типы 1 и 2, 1 и 3 или 2 и 3), или тривалентной (содержащей три типа полиовируса, т.е. типы 1, 2 и 3).
Существует возможность получать ИПВ из полиовирусов дикого типа. Иначе ИПВ можно получать из невирулентного живого полиовируса, например из штаммов 8аЫи, что дополнительно снизило бы риск повторного занесения полиовируса дикого типа с производства ИПВ (см., например, \УО 2007/007344 и Эо1 е1 а1., 2001). Настоящее изобретение подходит для получения полиовируса дикого типа (типов 1, 2 и 3, например штамма Макопеу типа 1, штамма МЕР типа 2 или штамма 8аикей типа 3), а также невирулентных типов полиовируса (например, штаммов 8аЫп). Настоящее изобретение можно, таким образом, применять, для того чтобы получать полиовирус для ИПВ, а также для ОПВ. Способы в соответствии с настоящим изобретением, применяемые для того чтобы получать ИПВ, могут послужить снижению цены до такой степени, что ИПВ может стать доступна для малоразвитых и наименее развитых стран. Хотя, как правило, ОПВ дешевле, чем ИПВ, когда ее получают в соответствии с обычными способами, высокоэффективные способы настоящего изобретения могут еще уменьшить цену нерасфасованного материала для ОПВ и, следовательно, уменьшить также ее цену.
Введение вакцины против полиомиелита может осуществляться, например, внутримышечно, внутрикожно или орально в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Вакцину против полиовируса, получаемую в соответствии с настоящим изобретением, можно применять в качестве отдельной вакцины, но в других вариантах осуществления можно обычным способом объединять с другими вакцинами, например в форме комбинированной вакцины против дифтерии, коклюша, столбняка и полиомиелита, и можно необязательно включать дополнительные вакцинные компоненты, например против гепатита В и/или гемофильной инфекции, и т.д. Таким образом, полиовирус подходит для применения в расширенной программе вакцинации (ЕР1) и может сочетаться с вакцинами в данной программе. Аналогично обычным вакцинам против полиовируса, вакцину в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в виде отдельной дозы или предпочтительно в схеме прайм-буст, в которой несколько доз вакцины вводят с соответствующими временными интервалами, например две инъекции с временным интервалом 1-2 месяца, за чем следует повторная доза через 6-12 месяцев; или, например, начальная оральная доза, за которой следует вторая доза приблизительно через 8 недель и третья доза через 8-12 месяцев после второй дозы; или, например, для маленьких детей первая оральная доза в возрасте 6-12 недель, за чем следует вторая доза приблизительно через 8 недель после первой дозы и третья доза в возрасте приблизительно 6-18 месяцев; или, например, только одна доза для предварительно вакцинированных людей при повышенном риске; и т.д. Оптимальная схема применения может быть определена в соответствии со стандартной медицинской практикой и, как правило, будет следовать тем же схемам, что и для доступных вакцин против полиовируса.
- 8 020563
Настоящее изобретение далее разъясняется в последующих примерах. Примеры не ограничивают настоящее изобретение каким бы то ни было образом. Они всего лишь служат для большей ясности настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Эффективное получение полиовируса на адгезивных клетках РЕК.Сб.
Для того чтобы исследовать размножение полиовируса на адгезивных клетках РЕК.Сб и создать запасы вирусного материала, получили полиовирус типа 1 (Вгипепбегк), типа 2 (МЕР-1) и типа 3 (Заискей) от ЗВЬ (Швеция). Титры данных материалов, каждый из которых получен на клетках Уего, составили приблизительно 10б ССГО50/мл. Клетки РЕК.Сб (Ра11аих е1 а1., 1998) вырастили в культуральной среде (ИМЕМ с 10% РВЗ и 10 мМ МдС12). В три флакона Т175 посеяли по 30х10б клеток РЕК. Сб/флакон в 25 мл культуральной среды для каждого типа полиовируса и заразили на следующий день с множественностью заражения (МО1), равной 0,1 (0,1 ССГО50/клетку), при 37°С и 10% СО2 во влажной камере. Через три дня клетки и среду собрали и получили неочищенные лизаты с помощью двух циклов замораживания/размораживания. После центрифугирования для удаления клеточного дебриса супернатанты разделили на аликвоты и сохранили при -80°С. Параллельно в один флакон Т175 посеяли б,25х10б клеток Уего в 25 мл культуральной среды для клеток Уего (среда Орйрго ЗРМ, дополненная 4 мМ Ь-глутамина) для каждого штамма полиовируса и заразили с той же самой МО1. Культуры Уего также собрали через 3 дня, заморозили/разморозили дважды и разделили на аликвоты для хранения.
Получение полиовируса затем определили количественно посредством анализа ССГО50 с применением клеток Уего. Для этого 1,25х104 клеток Уего посеяли в каждую лунку 9б-луночного планшета в 100 мкл среды и инкубировали при 37°С и 5% СО2. На следующий день серию из 15 пятикратных разбавлений образцов полиовируса приготовили в культуральной среде для клеток Уего и 100 мкл разбавлений с номерами с 5 по 15 добавили в ряды с 1 по 11 в 9б-луночный планшет восьмикратно. Ряд 12 служил в качестве неинфицированного контрольного ряда. Через семь дней лунки проанализировали на наличие цитопатогенного эффекта (СРЕ) и вычислили титры, используя метод Спирмена-Кербера:
Конечный титр (1од10) = Х0 - ά/2 +й/п х ΣΧ1, где Х0 представляет собой значение 1од10 наивысшего разбавления, при котором все посевы еще остаются положительными;
ά представляет собой значение 1од10 использованного коэффициента разбавления; п представляет собой количество повторов при каждом разбавлении и
ΣΧ1 представляет собой сумму всех лунок, которые остались положительными, включая разбавление Х0.
Результаты эксперимента по титрованию изображены на фиг. 1 и показывают, что на адгезивных клетках РЕК.Сб титры были >5 раз выше, чем на клетках Уего для полиовируса типа 1 и >10 раз выше в случае типов 2 и 3. Ожидается, что различия в получении вирусных частиц на клетку будут меньше, поскольку было посеяно больше клеток РЕК.Сб. Как для РЕК.Сб, так и для Уего слияние клеточного монослоя было определено равным ~80%.
Из данных экспериментов авторы заключили, что получение полиовируса на адгезивных монослоях клеток РЕК.Сб оказалось, по меньшей мере, не хуже, чем на клетках Уего.
Пример 2. Эффективное получение полиовируса в клетках РЕК.Сб в суспензии.
Для того чтобы исследовать размножение полиовируса на клетках РЕК.Сб в суспензии, осуществили эксперименты малого масштаба, для того чтобы испытать различные культуральные среды, множественность заражений (МО1) и время сбора урожая (ТОН). Для этого клетки РЕК.Сб культивировали в трех различных средах: АЕМ (1пуйгодеп), ВМ1У§ (коммерчески доступна как РегтехсЧ™ от йоп/а) и СИМ4РЕКМАЬ (Нус1опе). В день заражения клетки, культивированные в одном типе среды, подсчитывали и пересевали в том же самом типе среды при различных плотностях клеток (1,5, 2,5, 3,5 или 5 млн клеток/мл) и заражали с различными МО1 (0,01, 0,05 или 0,1 ССГО50/клетку) при 37°С во влажной камере на качающейся платформе. Платформа (ΙΚΑ КЗ 2б0) имела орбитальный диаметр 10 мм и применялась при 100 об/мин для 125 или 250 мл встряхиваемых флаконов, содержавших 15-20 мл среды. Для среды АЕМ клетки посеяли при 1,5 или 2,5 млн клеток/мл, поскольку АЕМ не поддерживает более высокие плотности клеток. Таким способом было получено несколько культур, которые были собраны через 2, 3 или 4 дня после заражения. Все образцы заморозили/разморозили дважды и оставили при -20°С или ниже до дополнительного анализа.
Фиг. 2 изображает результаты титрования данных образцов для образцов дня 2 и дня 4 (данные дня 3 не показаны). Клетки РЕК.Сб, выращенные и зараженные во всех трех средах, оказались способны к получению высоких титров полиовируса типа 1, хотя титры на среде ВМ1У§ были несколько ниже по сравнению со средами РЕКМАЬ и АЕМ. Кроме того, более долгая инкубация не привела к более высоким титрам. Напротив, титры урожая дня 2 оказались в большинстве случаев более высокими по сравнению с урожаями дней 3 и 4. Стойкого эффекта от изменения МО1 в данном эксперименте увидеть было нельзя. Что важно, применение более высоких плотностей клеток при заражении действительно привело к более высоким волюметрическим титрам, что показывает, что способ с суспензионной культурой с
- 9 020563 применением высоких плотностей клеток выгоден для урожая инфекционного полиовируса.
В следующем эксперименте время сбора и температуру во время заражения сравнили для всех трех полиовирусных штаммов. Для этого клетки РЕК.С6 посеяли в среде АЕМ при 2,5х106 клеток/мл с объемами 15 мл во встряхиваемых флаконах и заразили с ΜΟΙ равной 0,1 при 37 и при 35°С каждым полиовирусным штаммом. Клетки и среду собрали через 2, 3 и 4 дня после заражения и обработали, как описано выше. Анализ получения вируса в различных условиях был проведен посредством определения значений ССГО50, как описано выше, и показал увеличение урожая при 35°С по сравнению с 37°С для всех трех типов полиовируса (фиг. 3). Кроме того, было подтверждено и распространено на полиовирус типа 2 и 3, что в большинстве случаев наиболее высокие титры были измерены, когда урожай собирали в день
2.
Пример 3. Повышение урожая полиовируса на суспензионных клетках РЕК.С6 при более высокой плотности клеток.
Для того чтобы исследовать, влечет ли дальнейшее увеличение плотности клеток увеличение титра вируса, получение при 2,5х106 клеток/мл сравнили с 10х106 клеток/мл. Для этого клетки РЕК.С6 в среде РЕКМАЪ посеяли в объеме 15 мл во встряхиваемых флаконах с указанными плотностями клеток и заразили 2 ССГО50/клетку полиовируса типа 1 в трех повторностях. Через 24 и 48 ч клетки и среду собрали и получили очищенные лизаты посредством замораживания/размораживания и центрифугирования, как описано выше. В дополнение к ранее проверенным температурам 35 и 37°С эксперимент также провели при 33°С.
Анализ титров с помощью анализа ССГО50 (фиг. 4) подтвердил, что урожай возрастал, когда клетки заражали при плотности, равной 10х106 клеток/мл, по сравнению с 2,5х106 клеток/мл. Наилучшие титры были получены при 35°С независимо от плотности клеток или дня сбора урожая. Кроме того, и это указывает на эффективное размножение полиовируса на клетках РЕК.С6, было показано, что урожаи можно также собирать через 24 ч, поскольку урожаи в 24- и 48-часовых образцах были вполне сопоставимы.
В следующем эксперименте данные условия исследовали также для других типов полиовируса. Клетки РЕКС посеяли в среду РЕКМАЪ при 10х106 клеток/мл и заразили 2 ССГО50/клетку при 35°С во встряхиваемых флаконах в трех повторностях различными полиовирусными материалами. Урожаи собрали через 24 и 48 ч и клетки и среду переработали до очищенных лизатов, как описано выше. Анализ титрования ССГО50 показал, что применение высоких плотностей клеток также приводило к высоким урожаям вируса для типов 2 и 3 (фиг. 5).
Это ясно показывает, что высокая плотность культур клеток РЕК.С6 в суспензии предоставляет отличную платформу для получения полиовируса дикого типа. Поскольку клеточная плотность клеток РЕК.С6 и размер/объемы культуры можно увеличить посредством применения биореакторных систем, волновых мешков или других типов масштабируемых систем для культивирования, получение полиовируса может быть значительно улучшено по сравнению с применяемой в настоящее время системой на микроносителях с клеточными культурами Уего.
Полученный полиовирус собирают и очищают в соответствии со способами, известными в данной области техники и применяемыми для полиовируса, размножающегося на клетках Уето, инактивируют формалином в соответствии с известными способами, и затем проверяют иммуногенность с применением стандартного анализа иммуногенности на крысах в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники (например, ВеуПассща е1 а1., 1996). Ожидается, что полиовирус, полученный таким способом, обладает иммуногенностью, сопоставимой с полиовирусом, полученным с помощью обычных способов с применением клеток Уего.
Пример 4. Получение полиовируса в клетках РЕК.С6 в биореакторе.
Клетки из рабочего банка клеток РЕК.С6 размораживают и размножают в бессывороточной культуральной среде во влажной камере при 37°С и 10% СО2. Пассирование осуществляют каждые 3-4 дня до тех пор, пока не достигается достаточная плотность клеток, для того чтобы засеять двухлитровый биореактор с плотностью клеток, равной 0,2-0,4х106 клеток/мл. Клетки размножаются в двухлитровом биореакторе при 37°С, ΌΟ 40% и рН 7,3. Когда достигается плотность клеток, равная приблизительно 2х106 клеток/мл (4 день после заражения), начинает работать система АТЕ, для того чтобы позволить культивирование клеток в течение более долгого периода времени и для того чтобы достичь высоких плотностей клеток. Приблизительно через 11-12 дней достигается плотность клеток в двухлитровом биореакторе более чем 50х106 клеток/мл. В этот момент клеточную суспензию переносят в десятилитровый биореактор. Клеточную суспензию из двухлитрового биореактора разбавляют 1:5 бессывороточной культуральной средой. Плотность клеток в десятилитровом биореакторе лежит в диапазоне между 10 и 15х106 клеток/мл. Затем десятилитровый биореактор заражают полиовирусным посевным материалом с ΜΟΙ 2 ССГО50/клетку. Получение полиовируса осуществляют при 35°С, рН 7,3 и ΌΟ 40%. Из десятилитрового биореактора в определенные моменты времени берутся образцы для подсчета клеток и получения полиовируса, и сбор урожая полиовируса осуществляют соответственно между 12 и 48 ч после заражения.
- 10 020563
Список литературы
ВаггеМ ΡΝ, Мипй1 XV, К1»1пст О, Ηον/агй МК. 2009. Уего се11 р1а1(6гтп ϊη уассте ргойисбоп: тоущ§ Соодгйз сеН сиЬиге-Ьазей \тга1 уассшез, Ехреп Р.ее. Уассшез 8: 607-618.
ВеуПасциа ЛИ, Υουη§ ί, СЫи 87/, Зрагксз ГО, КгссйспЬег^ ГО. 1996. Ка1 1ттиподетсйу аззау оГ|пас!1Уа1ей ροϊίονίηΐϋ, Πον. ΒίοΙ. 51апй. 86: 121-127,
СатрЬеП ЗА, Пп 1, ОоЬпкоуа ΕΥ, Оготе1ег М. 2005. Сепейс Йсюгттатз оГсеН (уре-8рес|'йс ροΙίονίηΐ3 ргора^айоп ίη НЕК 293 сс!1з. 1. νίτοΙ. 79: 6281-6290.
Сагй О, ЗтйЬ Т, Нипзакег В, Вашем В. 2005. Зегит-Ггее ргойисПоп оГ ροϊΐονίηΐδ: А сотрагамуе з1ийу изт§ ппсгосагпегз, га11ег Ъом1ез апй зтйопагу сеП си11игс. 1п: Р. Осй1а апй М. Риззепе^ег (Ейз.), Ап1та1 Сс11 ТесЬпо1ооу тсс1з Оепотасз, 761-765.
ϋοί Υ, АЬе 3, УататоЮ Н, Нопе Н, е1 а!. 2001, Ргодгезз ννΐΐΗ тасйуаий ροϊίονΐηΐί уассшез йепуей Ггот 1Ье ЗаЪт зп-атз. 1п; Вго\уп Р (ей): Рго^гезз ίη ΡοΙίο Егайюайоп: Уассте 8(га1е^ез ГопЬе Епй Сате. Оеу. ΒίοΙ. 105:163-169.
Уап ЕйсепЬогз! С, Ваккет \УАМ, ТЬотаззеп ΥΕ, уап йег Ро1 ЬА. 2009. РЫГогт 1ссЬпо1о§у Гог у!га1 уасстс ргойисйоп: сотрапзоп Ьс(\уссп аМасЬсй апй зизрепзюп Уего се11з. Роз(ег апй АЬзГгай Р70,1п: 21я Мее1ш§ оГ 1Ье Еигореап Зос1е1у Гог ΑηίπιβΙ СеП ТесЬпо1о§у, Рго^гатте апй Воок оГ АЬзкасГз.
РаНаих Р1, Вой! А, уап йег Уе1йе 1, уап йеп У.'о11епЬег§ ϋ_Ι, НеЫг КМ, Кее§ап 1, е1 а1, Νειν Ье!рег се11з апй таиНей еаг!у гефоп 1 -йе1е(ей айепоу)гиз уесЮгз ргеусп! ^епегапоп оГгерПсаНоп-сотрегепГ айепоустзез. Нит Оепе ТЬег 1998 Зср 1 ;9(13):1909-17.
- 11 020563
Ригсу ). 5са1с-ир оГ а сеН сикиге регГиаюп ргосекк - А Ιοιν-зЬеаг ΓιΙίηΚίοη ауйет (Ьа( 1пЬ(ЫК Якег-тетЪгапе ГоиПпд. ОепеПс £п§1пееппд Νοννκ. Уок 22, Νο. 7, Αριΐΐ 2002.
.Лапд 5, Руе ϋ, Сох .(С. 1986.1пасПуа(юп οΓροϋονίτυκ \νί(Η р-рторю1ас(опе 3. ΒίοΙ. 5(ап(1.14: 103-109.
ЗоЬп 3. 2009. Кок оГиуейаЫс апё ога1 ροϊίο уасстсз ίη ροϊίο сгасксайоп, Ехреп Кеу. Уасстеа 8: 5-8.
Ке\у ОМ, ЗиНег К\У, ке СоитНе ЕМ, ОстчПе \УК, РаПапзсЬ МА. 2005. Уассте-кепуек ροϋονΐηΐ5β$ ап5 (Ье епкдате 8(га(еду Гог §1оЬа1 ροϊίο егасЬсакоп. Аппи. Κον. МкгоЪкЯ. 59: 587-635,
Кга1 КМ, СоИеп К, 2у1а(га О, 5νΑΐνιπ& Д, №еЬоег М, СЬоп 1Н, 2009. Акуапсез ίη Ы §Ь у1е1сПп§ рЗаЙ'огт ргокисиоп ргосеззез изт§ (Не РЕК.С6® Ьитап се11 Ппе. АЪя(гас( Р142.1п: 21й МееРпд оГ (Ье Еигореап 5ос1е(у Гог Атта! СеН ТесЬпо1оду, Ргодгатте ап<3 Воок оГАЬягаск.
МеПеп Ο.-\ν„ \Уи К, Соиуё Е, Сгатк К. 1997. Еуа1иа(1оп оГ (Ье зегит-Ггее тсФит Μϋ552 Гог (Ье ргокисиоп оГροϋονίηικ оп Усго сеНз ίη Ъюгсас(огз. СуклееЬпокду 25; 35-44.
Моп(адпоп В, УтсеШ-РаЩие! ЗС, Рапде! В. 1982. ТЬоизапк 1кге зса1е гтсгосатег сикиге оГ Уего сеПз Гог кШек ροϊΐονϊηικ уассше. Ргопизтд гезиКз. ββνβίορ, Βίο!. 5(апкагс1. 55: 37-42.
Моп(адпоп В], Рапде( В, Утсеп(-Ра1дие( ЗС, 1984.1пЗи51па1-$са1е ргойисбоп οί тас(1Уа(ск ροϊίσνίηικ уасстс ргсрагсй Ьу си1тгс оГ Усго сс!1$ оп ткгосагпег. Κεν. 1пГес(. ОЕ. 6 (зирр!. 2): 5341-5344.
Раи МС, ОрНогз! С, КоШук МН, 5сЬои(еп О, МеЬ(аП М, иу(кеЬаад Р. ТЬе Ьитап сеН Ппе РЕК.С6 ргоуИез а пе\у тапиГасгиппд зузгет Гог (Ье ргокиепоп оГ тГЗиепга уасапез. Уассше 2001 Маг2];19(17-19).2716-21.
Уап \Уеге1 АЬ, уап 5(еетз С, Натик СА, СоЬеп Н. 1978. Νε\ν арргоаск (о (Ьс рго5ис(юп оГсопссп(га(с<3 апк рипПск тасПуа(ск ροϊίο ап<1 гаЫез какие си!(иге уасстез. ϋενείορ. ΒίοΙ. 5(апкагс). 43: 159-168.
У/гфЫ РР, МосПт ЗР. 2008. ТЬе Пепизе апк геЫпЬ οίΡοΙΐο - А токст РЬоешх? 3.1пГес(. βίβ, 197: 335-336,
Уакоуепко МЬ, Кого(коуа ЕА, 1уапоуа ОЕ, Егетееуа ТР е1 а). 2009. Ενοίυΐίοη οί (Ье 5аЪт уассше ίηΐο ра(Ьодетс кепуакуез \укЬои( арргешаЫе сЬапдев ίη апНдсшс ргорсгНса: песк Гог 1тргоустеп( оГсиггеп( ροΙίονίηΐϊ зигуеШапсе. 3. Уйок 83: 3402-3406.
УаНор С, СТоу/Зсу 3, Со(е 3, Недтапз-Вгоии/ег К, ЬадепсегГР, Оадпе К, Магкп ЗС, Ооз1сгЬшз Ν, ОржеКеп ϋ3, Вои( А. Рег.Сб сеПз Гог (Ье тапиГас(иге оГ ЫорЬагтасеипса! рго(етк. Мокет ВюрЬагтасеиисаВ - Ос:4@п, βονείορτηεηί апс! Орпгшгаиоп. Уо1. 3, 2005.

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения полиовируса, включающий следующие стадии:
    a) получение бессывороточной суспензионной культуры клеток, представляющих собой клетки РЕК.С6, депонированные в ЕСАСС под № 96022940;
    b) заражение указанных клеток полиовирусом при плотности клеток между 2х106 и 150х106 клеток/мл и увеличение количества полиовируса до высоких титров, равных по меньшей мере 109·4 ССГО50/мл; и
    c) сбор урожая полиовируса в период между 12 и 48 ч после заражения.
  2. 2. Способ по п.1, в котором указанное заражение и/или размножение вируса осуществляют при температуре между 34 и 36°С.
  3. 3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанное заражение осуществляют при плотности клеток между 5х 106 и 20 х 106 клеток/мл.
  4. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанное заражение осуществляют при плотности клеток приблизительно 10х 106 клеток/мл.
  5. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанное заражение осуществляют при множественности заражения (ΜΟΙ) между 1 и 3 ССШ50/клетку, например приблизительно 2.
  6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный сбор урожая полиовируса осуществляют в период между 18 и 30 ч после заражения, например через приблизительно 24 ч после заражения.
  7. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный полиовирус представляет собой полиовирус типа 1, полиовирус типа 2 или полиовирус типа 3.
  8. 8. Способ по п.7, в котором указанный полиовирус представляет собой полиовирус типа 1 штамма МаНопсу, полиовирус типа 2 штамма МЕР или полиовирус типа 3 штамма ЗаиксП.
  9. 9. Способ по п.7, в котором указанный полиовирус представляет собой ослабленный полиовирус, такой как штамм §аЬш.
  10. 10. Способ получения вакцины против полиомиелита, включающий в себя способ по любому из предшествующих пунктов с последующей очисткой и инактивированием собранного полиовируса, для того чтобы получить вакцину против полиомиелита.
EA201270173A 2009-07-16 2010-07-08 Получение полиовируса с высокими титрами для получения вакцины EA020563B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27103809P 2009-07-16 2009-07-16
EP09165620 2009-07-16
PCT/EP2010/059796 WO2011006823A1 (en) 2009-07-16 2010-07-08 Production of polio virus at high titers for vaccine production

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270173A1 EA201270173A1 (ru) 2012-06-29
EA020563B1 true EA020563B1 (ru) 2014-12-30

Family

ID=41412431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270173A EA020563B1 (ru) 2009-07-16 2010-07-08 Получение полиовируса с высокими титрами для получения вакцины

Country Status (33)

Country Link
US (4) US8546123B2 (ru)
EP (1) EP2454364B1 (ru)
JP (1) JP5845178B2 (ru)
KR (1) KR101548790B1 (ru)
CN (1) CN102482647B (ru)
AP (1) AP3140A (ru)
AR (1) AR077314A1 (ru)
AU (1) AU2010272685B2 (ru)
BR (1) BR112012000942B8 (ru)
CA (1) CA2763091C (ru)
CO (1) CO6491042A2 (ru)
CU (1) CU20120006A7 (ru)
DK (1) DK2454364T3 (ru)
EA (1) EA020563B1 (ru)
ES (1) ES2484093T3 (ru)
HK (1) HK1164922A1 (ru)
HR (1) HRP20140597T1 (ru)
IL (1) IL217465A (ru)
MA (1) MA33429B1 (ru)
MX (1) MX2011012648A (ru)
MY (1) MY183385A (ru)
NZ (1) NZ596880A (ru)
PE (1) PE20120571A1 (ru)
PL (1) PL2454364T3 (ru)
PT (1) PT2454364E (ru)
RS (1) RS53377B (ru)
SG (1) SG177655A1 (ru)
SI (1) SI2454364T1 (ru)
SM (1) SMT201400079B (ru)
TN (1) TN2011000628A1 (ru)
TW (1) TWI477606B (ru)
WO (1) WO2011006823A1 (ru)
ZA (1) ZA201108271B (ru)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009532352A (ja) 2006-03-31 2009-09-10 ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション ワクチンのための高力価組み換えインフルエンザ・ウィルス
US9474798B2 (en) 2007-06-18 2016-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
PL2350268T3 (pl) 2008-11-03 2015-05-29 Crucell Holland Bv Sposób wytwarzania wektorów adenowirusowych
ES2484093T3 (es) 2009-07-16 2014-08-11 Crucell Holland B.V. Producción de poliovirus con títulos elevados para producción de vacunas
WO2011056591A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Warf - Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
CN108588027A (zh) 2013-02-05 2018-09-28 乔治亚大学研究基金公司 用于病毒生产的细胞系和使用方法
BR112015021523A8 (pt) 2013-03-08 2021-06-29 Crucell Holland Bv composição de uma vacina contra a tosse convulsa acelular, e, usos da composição e de antígenos da bordetella pertussis
CN105121634B (zh) 2013-03-13 2019-07-26 易木农麦克斯有限公司 具有提高的病毒生产能力的细胞系及其生产方法
KR20140112255A (ko) 2013-03-13 2014-09-23 고려대학교 산학협력단 바이러스 생산능이 증가된 세포주 및 그 제조방법
GB201305361D0 (en) 2013-03-25 2013-05-08 Univ Edinburgh Enhanced expression
US10080793B2 (en) 2013-06-17 2018-09-25 De Staat der Nederlanden, vert, door de minister van VWS, Ministerie van Volksgezonheid, Welzijn en Sport Methods for the prevention of aggregation of viral components
US9950057B2 (en) 2013-07-15 2018-04-24 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in MDCK or vero cells or eggs
US20160053281A1 (en) * 2013-08-15 2016-02-25 The University Court Of The University Of Edinburgh Enhanced Expression Of RNA Vectors
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
JP6591461B2 (ja) 2014-06-17 2019-10-16 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 低温適応性ウイルス弱毒化（ｃａｖａ）および新規の弱毒化ポリオウイルス株
CN106661558B (zh) 2014-06-18 2020-07-10 易木农麦克斯有限公司 用于通过使用已缺失bst2基因功能的细胞系来促进病毒感染和增加病毒产生的方法
WO2015196150A2 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
BR112017001177B1 (pt) * 2014-07-24 2022-05-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V Método de purificação e de potenciação da liberação de poliovírus a partir de uma colheita de cultura celular bruta contendo poliovírus e uso de um detergente catiônico
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
US9890363B2 (en) 2015-07-06 2018-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
WO2017143236A1 (en) 2016-02-19 2017-08-24 Yoshihiro Kawaoka Improved influenza b virus replication for vaccine development
WO2017205667A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US10372100B2 (en) * 2016-08-29 2019-08-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Manufacturing system for biopharmaceutical products
CN117247899A (zh) 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
CN107723279B (zh) * 2017-10-18 2020-11-10 成都远睿生物技术有限公司 一种缺陷型腺病毒AdC68-GP的培养方法
SG11202007503WA (en) * 2018-02-07 2020-09-29 Bharat Biotech Int Ltd A process for enterovirus purification and inactivation and vaccine compositions obtained thereof
EP3914295A2 (en) 2019-01-23 2021-12-01 Yoshihiro Kawaoka Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
WO2020163804A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Humanized cell line
CN114929269A (zh) 2019-05-01 2022-08-19 威斯康星校友研究基金会(Warf) 用于疫苗开发的改进的流感病毒复制
EP3969046A1 (en) 2019-05-16 2022-03-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing a safe immune response against polio virus
JP2022551805A (ja) 2019-08-27 2022-12-14 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション 卵内複製のための安定化されたｈａを持つ組換えインフルエンザウイルス

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4525349A (en) * 1981-12-29 1985-06-25 Societe Anonyme Dite: Institut Merueux Process for the large-scale production of a vaccine against poliomyelitis and the resulting vaccine
ES2333425T5 (es) 1995-06-15 2012-08-28 Crucell Holland B.V. Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano destinados a terapia génica
EP1103610A1 (en) * 1999-11-26 2001-05-30 Introgene B.V. Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
US7521220B2 (en) * 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
EP1256803A1 (en) * 2001-05-07 2002-11-13 Crucell Holland B.V. Methods for the identification of antiviral compounds
EP1553983A2 (en) * 2002-10-23 2005-07-20 Crucell Holland B.V. New settings for recombinant adenoviral-based vaccines
EP2258850B1 (en) * 2002-12-17 2013-07-17 Crucell Holland B.V. Recominant viral-based malaria vaccins
EP1623023B1 (en) * 2003-05-09 2008-11-12 Crucell Holland B.V. Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom
US8206981B2 (en) 2004-03-05 2012-06-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow
US20080193478A1 (en) 2004-08-27 2008-08-14 Rajesh Jain Inactivated Poliomyelitis Vaccine Derived From Sabin Strain Of Polio Virus
AU2005293572B2 (en) * 2004-10-14 2011-08-04 Crucell Holland B.V. Malaria prime/boost vaccines
CN100500827C (zh) * 2004-11-26 2009-06-17 中国医学科学院医学生物学研究所 用人胚肺二倍体细胞培养繁殖脊髓灰质炎病毒的方法
WO2008059041A2 (en) * 2006-11-16 2008-05-22 Crucell Holland B.V. Complementation of factor xi deficiency by factor v mutants
ES2484093T3 (es) * 2009-07-16 2014-08-11 Crucell Holland B.V. Producción de poliovirus con títulos elevados para producción de vacunas
KR20120070015A (ko) 2010-12-21 2012-06-29 (주)창조바이오텍 알파-피넨을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
US20110027317A1 (en) 2011-02-03
CA2763091A1 (en) 2011-01-20
BR112012000942B1 (pt) 2020-10-27
AP2012006075A0 (en) 2012-02-29
US9022240B2 (en) 2015-05-05
MA33429B1 (fr) 2012-07-03
TWI477606B (zh) 2015-03-21
US20130052224A1 (en) 2013-02-28
MY183385A (en) 2021-02-18
TN2011000628A1 (en) 2013-05-24
MX2011012648A (es) 2012-01-12
PT2454364E (pt) 2014-07-04
IL217465A0 (en) 2012-02-29
AU2010272685A1 (en) 2011-12-08
CU20120006A7 (es) 2012-10-15
AU2010272685B2 (en) 2015-02-26
CO6491042A2 (es) 2012-07-31
RS53377B (en) 2014-10-31
KR101548790B1 (ko) 2015-08-31
AR077314A1 (es) 2011-08-17
ES2484093T3 (es) 2014-08-11
HK1164922A1 (en) 2012-09-28
SMT201400079B (it) 2014-09-08
PE20120571A1 (es) 2012-06-06
JP2012532616A (ja) 2012-12-20
CA2763091C (en) 2019-07-23
NZ596880A (en) 2013-10-25
CN102482647B (zh) 2015-12-16
PL2454364T3 (pl) 2014-09-30
US20130273106A1 (en) 2013-10-17
WO2011006823A1 (en) 2011-01-20
EA201270173A1 (ru) 2012-06-29
BR112012000942B8 (pt) 2021-05-25
IL217465A (en) 2016-05-31
US20140242670A1 (en) 2014-08-28
AP3140A (en) 2015-02-28
BR112012000942A2 (pt) 2016-03-15
ZA201108271B (en) 2012-07-25
KR20120033334A (ko) 2012-04-06
DK2454364T3 (da) 2014-07-21
SG177655A1 (en) 2012-02-28
HRP20140597T1 (hr) 2014-09-12
TW201118173A (en) 2011-06-01
SI2454364T1 (sl) 2014-08-29
JP5845178B2 (ja) 2016-01-20
CN102482647A (zh) 2012-05-30
EP2454364B1 (en) 2014-04-23
US8546123B2 (en) 2013-10-01
EP2454364A1 (en) 2012-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020563B1 (ru) Получение полиовируса с высокими титрами для получения вакцины
ES2345606T3 (es) Multiplicacion de virus en un cultivo celular.
ES2351300T3 (es) Procedimiento para la preparacion a escala industrial de vacunas.
CN113122510A (zh) 一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥肌肉细胞上扩增的方法
CN113583968A (zh) 传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法
ES2341352T3 (es) Procedimiento para la preparacion de material virico.
ES2560452T3 (es) Vacuna de IPV-DPT
DK3010537T3 (en) PROCEDURE FOR PREVENTING AGGREGATION OF VIRUS COMPONENTS
CN110669739A (zh) 一种新型甲型肝炎病毒抗原制备方法
El-Bagoury et al. Comparative potentiality study of three different vero cell culture systems for production of PPR Vaccine
KR20100017593A (ko) 바이러스의 증식을 위한 ２-단계 온도 프로파일
CN112870343A (zh) 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法
CN102406928A (zh) 一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法
CN101792777A (zh) 食蟹猴骨髓间充质干细胞的慢病毒转染

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM KG MD TJ TM