KR20120070015A

KR20120070015A - 알파-피넨을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물

Info

Publication number: KR20120070015A
Application number: KR1020100131400A
Authority: KR
Inventors: 강성종; 정철연; 이영돈
Original assignee: (주)창조바이오텍
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2012-06-29

Abstract

본 발명은 스쿠티카충 구제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 알파-피넨(alpha-pinene)을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 사료 첨가제 조성물에 의하면, 스쿠티카충 살충 효과가 뛰어난 캄펜(camphene)을 어류 양식용 사료 첨가제의 유효성분으로 포함함으로써, 어류의 대량 폐사를 유발하는 스쿠티카충을 효과적으로 구제할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 유독성 구제제인 포르말린을 대체할 수 있어 해양 환경오염을 미연에 방지할 수 있는 효과가 있다.

Description

알파-피넨을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물{Scuticociliates Insecticide Composition Comprising Alpha-pinene as an Active Ingredient}

본 발명은 스쿠티카충 구제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 알파-피넨(alpha-pinene)을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물에 관한 것이다.

제주도에서 생산되는 어류는 34만톤 정도이며 그 중에서 양식 넙치 생산량은 1만톤을 상회하여 제주도 수산물 생산에 상당한 비중을 차지하고 있다.

양식 넙치에 발생하는 스쿠티카충은 어류의 대량 폐사를 유발함으로써 양식어업에 심각한 타격을 입히고 있다. 넙치의 양식 과정에 발생하는 주요 감염성 질병으로는 바이러스성, 세균성 및 기생충성 질병 등이 있으며, 이러한 질병 중 섬모충성 기생충질병인 스쿠티카충은 특히 우리나라 양식어 중 가장 많은 생산량을 차지하는 넙치의 치어에서부터 성어에 이르기까지 광범위하게 기생하여 대량폐사를 유발하기 때문에 스쿠티카충은 양식어업의 생산성 증진에 커다란 위협 요인으로 대두되어 왔다.

스쿠티카충은 어류의 체표, 아가미는 물론 뇌에까지 침투하기 때문에 일단 기생당한 어류는 거의 100% 폐사에 이르게 된다. 근래들어 스쿠티카충에 감염된 넙치들이 일년 내내 발생하면서 그 피해량도 해마다 증가하는 추세에 있지만, 현재까지는 전혀 유효한 제어대책이 없는 실정이다. 국내의 넙치 양식장에서 스쿠티카충의 발생동향을 보면 주로 저수온기에 집중하여 발생하였지만, 근래 들어서는 여름철에도 스쿠티카충이 발생하여 많은 피해를 주고 있다.

지금까지의 스쿠티카충에 대한 대처방법은 사육원수의 소독 및 감염개체의 화공약품을 이용한 약욕 혹은 담수욕 등이 거의 대부분이다. 화공약품은 다소의 구제효과를 기대하여 가장 많이 사용되어지지만 이 물질은 유해 환경오염원으로 되어 있어 그 사용에 제한을 받을 뿐만 아니라 근래에는 매우 높은 농도의 화공약품 사용에도 불구하고 전혀 치유가 되지 않고 있는 실정이다.

향후 스쿠티카충에 대한 살충 물질로 사용되는 화공약품 등의 화학요법제가 환경오염 문제로 사용이 금지될 경우, 현재로서는 마땅한 스쿠티카충 살충제가 없는 실정이다.

따라서, 환경오염의 문제를 야기하지 않으면서 스쿠티카충에 대한 구제 효과가 뛰어난 구제제에 대한 개발이 절실히 필요하다.

본 발명은 상기와 같은 필요에 의해 도출된 것으로, 환경오염 문제를 야기시키는 화공약품을 이용하지 않으면서, 스쿠티카충에 대한 구제 효과 또한 우수한 사료 첨가제 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 스쿠티카충 구제용 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알파-피넨은 테르펜(terpene) 계열의 화합물로 (1R, 5R)-(+)-alpha-pinene과 (1S, 5S)-(-)-alpha-pinene의 두 가지 이성질체 구조를 하고 있다. 알파-피넨은 향을 내는 에센셜 오일 성분으로 티-트리 오일(tee-tree oil)의 주요 성분으로 알려져 있다. 알파피넨이 존재하는 대표적 식물로는 소나무(Pinus densiflora), 약쑥(Artemisia vulgaris), 쑥갓(Chrysanthemum coronarium L.) 또는 후추(Piper nigrum) 등이 있다.

본 발명의 스쿠티카충 구제용 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알파-피넨은 자연원(natural source)인 소나무(Pinusdensiflora), 약쑥(Artemisia vulgaris), 쑥갓(Chrysanthemum coronarium L.)으로부터 일반적인 에센셜 오일 추출 방법인 수증기증류법, 압착법 또는 용제추출법을 이용해 추출해 낼 수 있다. 상세하게는, 상기의 알파-피넨은 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 보다 바람직하게는, 메탄올 및 에탄올 수용액을 이용하여 추출하고, 가장 바람직하게는, 에탄올 수용액을 이용하여 추출한다.

한편, 본 발명의 알파-피넨은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명의 알파-피넨은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 알파-피넨의 함량은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.00001 내지 1.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 1.0 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 0.1 중량%이다. 이는 알파-피넨의 함량이 0.00001 중량% 미만일 때는 스쿠티카충에 대한 살충 효능이 미약하고, 1.0 중량%를 초과하는 경우에는 물질 자체의 독성이 문제될 수 있기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 사료 첨가제 조성물이다. 본 발명의 사료 첨가제 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 알파-피넨 이외에 사료 첨가제 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 성장발육 촉진 물질, 면역 증강용 물질 등 각종 공지의 기능성 사료 첨가제용 물질들을 함께 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 오일 또는 분말 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는 알파-피넨을 함유한 어류용 사료에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 어류용 사료는 알파-피넨이 단독으로 혼합될 수도 있고, 알파-피넨과 다른 기능성 성분과 혼합된 사료 첨가제 조성물 형태로 사료에 혼합될 수도 있다. 상기 어류용 사료는 예를 들면, 고등어, 까나리, 전어, 꽁치, 정어리, 새우 등의 생선 (냉동어)을 그대로 이용하는 생어 (生魚) 사료, 생선 (냉동어)을 어분이나 식물유지 그 밖에 건조사료와 중량비로 혼합한 모이스트 펠렛 (moist pellet), 그리고 건조사료에 비타민류, 미네랄류를 첨가하여 분말 또는 펠렛 형태로 형성 가공한 배합 사료를 들 수 있다. 어류용 사료의 일반적인 구성 성분은 단백질원, 탄수화물원, 비타민 혼합물 및 미네랄 혼합물 등이 있으며, 상기 단백질원으로는 어분, 육분, 대두박, 면실박 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있고, 상기 탄수화물원으로는 소맥분, 덱스트린, 감자 전분, 수크로즈 또는 이들의 혼합물 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 비타민 혼합물로는 아스코르브산 (ascorbic acid), 티아민, 리보플라빈, 피리독신, 나이아신 (niacin), 엽산 (folic acid), 비타민 A, 비타민 K3 또는 비타민 D3 등이 사용될 수 있고, 상기 미네랄 혼합물로는 NaCl, MgSO4ㅇ7H2O, NaH2PO4ㅇ2H2O, KH2PO4, CaH4(PO4)2ㅇH2O, ZnSO4ㅇ7H2O, CuCl2, AlCl3ㅇ6H2O, KIO3, MnSO4ㅇH2O, 페릭 사이트레이트 (ferric citrate) 또는 칼슘 락테이트 (calcium lactate) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물에 의하면, 스쿠티카충 살충 효과가 뛰어난 알파-피넨(alpha-pinene)을 어류 양식용 사료 첨가제의 유효성분으로 포함함으로써, 어류의 대량 폐사를 유발하는 스쿠티카충을 효과적으로 구제할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 유독성 구제제인 포르말린을 대체할 수 있어 해양 환경오염을 미연에 방지할 수 있는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 스쿠티카충의 배양

본 발명의 실시예에 사용될 스쿠티카충의 배양은 스쿠티카섬모충에 감염된 넙치 병어에서 직접 분리하여 배양하였다. 넙치 병어로부터 감염부위의 조직을 일부 절제하여 슬라이드 글라스에 올려놓고 현미경 관찰을 한 결과, 스쿠티카충에 감염되어 있음을 확인하였다. 확인된 스쿠티카 충체를 멸균 해수에 P1Y1(1% proteose peptone, 1% yeast extract) 배지에 충체를 접종하여 15℃에서 초대 배양을 수행하였다. 초대 배양된 스쿠티카 배양액에는 많은 박테리아가 존재하고 있어 박테리아의 오염과 증식수의 한계로 어류 주화세포주를 이용한 순수배양을 수행하였다. 스쿠티카 순수배양을 위하여 어류주화세포 CHSE-214 (Chinook salmon embryo)를 7.5% sodium bicarbonate로 pH 7.3로 적정된 MEM(Modified Eagle's Medium)배지에 10% FBS와 penicillin-streptomycin을 첨가시켜 20℃에서 배양하였다. Monolayer로 자란 세포주에 초대 배양된 스쿠티카 충체를 접종하고 스쿠티카충이 완전히 세포주를 다 먹을때까지 20℃에서 배양을 지속시켰다. 스쿠티카 충이 세포주를 완전히 섭취함을 현미경하에서 관찰한 후, 증식된 스쿠티카 충체수를 hematocytometer (혈구계산판)을 이용하여 1 mm × 1 mm안의 스쿠티카 충체수를 계수하여 증식된 세포수를 확인하였다.

2. 실험에 사용된 시료

본 발명의 실시예에 사용된 스쿠티카충 구제용 test 물질은 알파-피넨(alpha-pinen) 이며, 비교예로서는 caffeine(비교예 1), Quiacrine dihydrochloride(비교예 2), Quinine sulfate(비교예 3), Trimethoprim(비교예 4), Oxytetracycline(비교예 5)을 사용하였으며, 기존에 사용되고 있는 스쿠티카충 구제용 물질인 포르말린(formaline)은 양성 대조구(positive control)에 사용하였다. 그리고, 음성 대조구(negative control)로서는 아무런 물질도 투여하지 않고 용매 dimethylsulfoxide(DMSO)만 투여하였다(<표 1> 참조).

실험에 사용된 시료

실시예	alpha-pinen
비교예 1	caffeine
비교예 2	Quiacrine dihydrochloride
비교예 3	Quinine sulfate
비교예 4	Trimethoprim
비교예 5	Oxytetracycline
positive control	formaline
negative control	dimethylsulfoxide(DMSO)

3. 스쿠티카충에 대한 구제 효과 실험

① 스쿠티카충의 운동성(Motility) 저하 및 형태적 변화(Morphology) 실험

상기 2.의 실험용 시료들을 건조시킨 후, 건조된 시료를 멸균해수로 적당한 배율로 희석한 후 1ppm 또는 5ppm으로 농도를 달리하여 상기 1.에서 준비된 스쿠티카충 배양액에 접종한 후 20 ℃에서 2시간 동안 방치하면서 현미경으로 직접 살충 효율을 측정하였다. 스쿠티카충의 경우 살충 물질과 접촉할 경우 나타나는 현상은 운동성 저하, 공 모양으로 부풀어 오르는 형태적인 변화, 형태적인 변화를 거쳐 터지는 단계를 거친다. 실험 결과 판정은 하기 <표 2>와 같이 Novotony et al.(1996)의 방법을 응용하여 운동성과 형태를 0, 1, 2, 3, 4 단계로 나타내었고, 살충율은 스쿠티카충이 터지는 것을 기준으로 하였다.

실험 결과 판정 기준 (Novotony, 1996)

점수	운동성(Motility)
4	운동성 저하가 없는 경우
3	전체 스쿠티카충의 50% 이상의 운동성이 저하된 경우
2	전체 스쿠티카충의 50% 가까이 운동을 멈춘 경우
1	전체 스쿠티카충의 50% 이상이 운동을 멈춘 경우
0	스쿠티카충 모두가 운동을 멈춘 경우
점수	형태적 변화(Morphology)
4	스쿠티카충의 형태적 변화가 전혀 없는 경우
3	전체 스쿠티카충 충의 50% 미만의 형태가 공모양 또는 불규칙적 형태로 부풀어 오른 경우
2	전체 스쿠티카충 중 대략 50% 정도가 공모양 또는 불규칙적 형태로 부풀어 오른 경우
1	전체 스쿠티카충 중 50% 이상이 공모양 또는 불규칙적 형태로 부풀어 오른 경우
0	대부분의 스쿠티카충이 용해(lysis)된 경우

실험결과는 하기 <표 3>에 나타난 바와 같다. 하기 <표 3>에 의하면 알파-피넨(alpha-pinen)을 접종한 경우(실시예) 다른 시료를 접종한 비교예 1 내지 비교예 5에 비해서 시간이 지날수록 수쿠티카충의 운동성이 현저히 저하되어, 접종 후 2시간이 경과한 시점에서는 수쿠티카충이 모두 운동을 멈춘 상태가 됨을 알 수 있다. 또한, 형태적 변화를 살펴보면 본 발명의 알파-피넨을 접종한 실시예가 다른 시료를 접종한 비교예 1 내지 비교예 5에 비해서 공모양으로 부풀어 오르는 정도가 크며, 1시간 30분(90분)이 경과한 시점에서 대부분의 스쿠티카충이 용해됨을 확인할 수 있다.

본 발명의 알파-피넨을 접종한 실시예와 기존의 구제제인 포르말린(formaline)을 접종한 양성 대조구(positive control)을 비교해 보면, 알파-피넨을 접종한 경우가 포르말린을 접종한 경우보다 빠른 시간 내에 스쿠티카충의 운동성을 저하시키고, 공 모양으로 부풀어 오르게 함을 알 수 있다. 따라서, 좀 더 신속한 스쿠티카충 구제 효과를 보기 위해서는 기존의 포르말린 보다는 본 발명의 알파-피넨을 사용하는 것이 유리함을 알 수 있다. 또한, 유독성 물질인 포르말린을 대체하여 친환경 물질인 알파-피넨을 사용함으로써 환경오염을 미연에 방지할 수 있다.

스쿠티카충의 운동성(Motility) 저하 및 형태적 변화(Morphology) 실험 결과

	대상물질	농도	10 min		30 min		60 min		90 min		120 min
	대상물질	ppm	A*	B**	A	B	A	B	A	B	A	B
실시예	alpha-pinen	1	1	2	1	2	1	1	0	1	0	0
실시예	alpha-pinen	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
비교예 1	caffeine	1	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4
비교예 1	caffeine	5	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4
비교예 2	Quiacrine dihydrochloride	1	4	4	4	4	3	3	3	3	3	2
비교예 2	Quiacrine dihydrochloride	5	4	4	2	2	1	1	1	1	1	1
비교예 3	Quinine sulfate	1	3	3	3	3	3	3	2	2	2	2
비교예 3	Quinine sulfate	5	3	3	3	3	3	3	2	2	2	2
비교예 4	Trimethoprim	1	3	3	3	3	3	3	2	2	2	2
비교예 4	Trimethoprim	5	2	3	2	3	2	3	2	2	1	2
비교예 5	Oxytetracycline	1	3	3	3	3	3	2	2	2	2	2
비교예 5	Oxytetracycline	5	2	3	2	3	2	3	2	2	2	2
positive control	formaline	1	3	3	2	3	1	2	0	1	0	0
positive control	formaline	5	3	3	0	0	0	0	0	0	0	0
negative control	DMSO	5	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4

* A : 형태적 변화(morphology)

** B : 운동성(motility)

② 스쿠티카충에 대한 현장 실험

넙치 양어장에서 스쿠티카충의 감염이 발생되어 폐사가 진행되고 있는 양어장에 본 발명의 알파-피넨을 사료에 1,000 ppm이 되도록 혼합하였다. 그 후 알파-피넨을 함유한 사료를 1일 2회 급이하였다(실험구). 반면 대조구에는 알파-피넨을 함유하지 않은 사료를 1일 2회 급이하였다.

실험구 및 대조구 각각에 대해 1일 1회 폐사되는 마리수를 확인하였으며, 폐사한 광어를 해부하여 아가미, 표피를 해부한 후 현미경으로 스쿠티카충의 존재여부를 400배에서 확인하였다. 또한, 실험구 및 대조구 각각에서 건강한 5마리의 광어를 별도로 해부하여 아가미, 표피를 해부한 후 현미경으로 스쿠티카충의 존재여부를 400배에서 확인하였으며, 그 결과는 하기 <표 4>와 같다.

하기 <표 4>에 의하면, 알파-피넨을 함유한 사료를 급이한 실험구에서는 폐사량이 줄어들고 외관상으로 건강한 광어를 해부해 보았을 때에도 아가미, 표피에서 적은 수의 스쿠티카충이 보였지만, 알파-피넨을 함유한 사료를 급이하지 않은 대조구의 경우 폐사량이 줄지 않았으며 외관상으로 건강한 광어를 해부해 보았을 때에도 아가미, 표피에서 상당수의 스쿠티카충이 확인되어 스쿠티카충이 번식 상태에 있음을 확인할 수 있었다.

그 후 일주일간 관찰한 결과 실험구에서는 더 이상의 폐사는 발생하지 않았고 넙치를 정상적으로 사육할 수 있었다.

스쿠티카충에 대한 현장 실험 결과

일자	alpha-pinene처리구 폐사량(마리)	대조구 폐사량(마리)
0일(2010.06.14.)	47	43
1일 경과	14	40
2일 경과	15	46
3일 경과	15	38
4일 경과	16	41
5일 경과	14	42
6일 경과	15	45
7일 경과	13	43
8일 경과	12	44

이상에 설명한 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명보다는 후술할 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

알파-피넨(alpha-pinene)을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 알파-피넨(alpha-pinene)의 함량은 조성물 총 중량 대비 0.00001 내지 1.0 중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 어류 사료 첨가제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 오일 및 분말로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 어류용 사료.
알파-피넨을 스쿠티카충 구제용 첨가제로 함유하는 어류용 사료.