KR20120033334A - 백신 제조를 위한 고역가 폴리오바이러스의 제조 - Google Patents

Abstract

본 발명은 a) 세포의 무혈청 현탁 배양물을 제공하는 단계, 여기서 상기 세포는 PER.C6 세포이고, b) 상기 세포를 폴리오바이러스로, 2x10⁶ cells/ml 내지 150x10⁶ cells/ml의 세포밀도로 감염시키는 단계, 그리고 c) 감염 후 12 내지 48시간 후에 폴리오바이러스를 수확하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

Description

백신 제조를 위한 고역가 폴리오바이러스의 제조{Production of polio virus at high titers for vaccine production}

본 발명은 세포 배양 및 폴리오 바이러스의 분야에 관한 것이다. 더욱 특별히는, 본 발명은 세포 배양을 위한 개선된 방법 및 폴리오 백신의 제조를 위한 그로부터의 폴리오 바이러스의 제조에 관한 것이다.

폴리오바이러스는 피코르나바이러스 과 엔테로바이러스 속의 멤버이다. 폴리오바이러스는 단일 가닥의, 양성 센스 RNA 게놈을 포함하는 캡시드를 갖는, 작고 외피가 없는(non-enveloped) 바이러스이다. 폴리오바이러스에는 3가지 유형이 있다: 유형 1, 2, 및 3. 폴리오바이러스에 민감한 개인의 감염은 마비성 회백질척수염(paralytic poliomyelitis)을 가져올 수 있다. 회백질척수염은 전염성이 높다. 두 개의 다른 폴리오백신이 개발되어 왔는데, 솔크(Salk)의 불활성화 폴리오바이러스 백신(IPV)과 사빈(Sabin)의 감독된 경구 폴리오바이러스 백신(OPV)이다. 두 백신 모두 안전하고 효과적이다. 각각은 독특한 장점과 단점을 갖고, 둘 다 회백질척수염의 제거에 중요한 역할을 하고 있다. 폴리오바이러스와 폴리오백신에 관한 리뷰는 예를 들면, Kew et al, 2005을 참조하라.

경구 폴리오 백신(OPV)은 저렴하고 편리하여 대량 사용되어 왔다. 그러나, 가끔 수용자들이 백신에서의 복귀돌연변이(revertants)로 인해 백신-관련 마비성 회백질척수염(VAPP)을 앓는다. 더욱이, 완전히 면역화되지 않은 인구에게서, 감독된 사빈 폴리오 균주가 자연발생하는 야생형 폴리오 질병과 임상적으로 및 전염병학적으로 구별할 수 없는 마비성 질병을 야기하는 충분한 돌연변이성 변화를 일으킨다는 것을 발견하였다; 이들 돌연변이는 순환 백신-유래 폴리오바이러스 또는 cVDPVs라 불린다(예를 들면, Kew et al, 2005; Wright and Modlin, 2008; Yakovenko et al, 2009 참조).

불활성화된 폴리오바이러스 백신(IPV)이 야생형 폴리오의 더 신속한 박멸 및 기존의 OPV 전략과 결합하여 사용했을 때 긴급한 cVDPV의 조절에 기여할 것이라는 합의가 이루어지고 있다(Wright and Modlin, 2008; John, 2009).

그러나, IPV의 생산은 더 고가이고(예를 들면, John, 2009 참조) 그리고 폴리오백신을 여전히 강하게 요구하는 저개발 국가 또는 개발도상 국가들에게 더욱 엄청난 비용일 수 있다. 백신에 사용될 수 있는 대량 폴리오바이러스 재료, 특히 비-감독된 폴리오바이러스를 생산하기 위한 배양 시스템은 비교적 높은 비용의 큰 원인이 된다.

그러므로, 백신에 사용하기 위한 폴리오바이러스를 생산하기에 효율적인 배양 시스템에 대한 요구가 여전히 존재한다.

HEK293 세포에서 폴리오바이러스의 증식이 폴리오바이러스의 뉴런-특이 복제 표현형에 대한 연구를 위한 시스템으로서 기재되어 왔고, 사빈 균주에 존재하는 바와 같이 IRES 요소에 점(point) 돌연변이를 함유하는 폴리오바이러스와 같은 폴리오바이러스의 감독된 형태가 HEK293 세포에서의 감소된 증식을 입증한다고 기재되어 있다(Campbell et al, 2005).

E1-불멸화 인간 배아 망막(HER) 세포, 특히 PER.C6 세포가 인플루엔자 바이러스에 중점을 둔 다양한 바이러스의 증식에 적합한 것으로 기재되어 왔다 (Pau et al, 2001; WO 01/38362). 비록 WO 01/38362은 인플루엔자 바이러스의 다양한 균주, 그리고 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 타입 1 및 2, 홍역 바이러스 및 로타바이러스의 PER.C6 세포에서의 증식의 작업예를 기재하였지만, 폴리오바이러스의 예는 WO 01/38362에 예시되어 있지 않다. 더욱이, 세포와 같은 폴리오바이러스의 복제를 위한 조건은 기재하고 있지 않고, 이들 세포들에서 관련없는 바이러스의 복재를 근거로 쉽게 예측할 수 없다. 따라서, 지금까지는 이들 세포에서 백신 생산 목적을 위한 산업규모로 경제적으로 폴리오바이러스를 생산하는 것이 실현 가능한지 여부는 알려지지 않았다.

불활성화된 폴리오 백신의 대량 생산의 경우, 폴리오바이러스는 일반적으로 원숭이-유래의 베로 세포에서 증식된다. 베로 세포는 불활성화뿐 아니라 생(live) 감독된 폴리오 백신을 포함하여 백신 생산에 널리 사용되고 그러므로 지금까지 바이러스 백신의 제조를 위해 규제 당국에 의해 가장 광범위하게 허용되는 연속(continuous) 세포주이고, 백신 생산을 위한 이들 세포의 사용은 본 분야의 전문가들에 의해 증가할 것으로 예상된다 (Barrett et al, 2009).

불활성화된 폴리오바이러스 백신을 위한 베로 세포의 대규모 마이크로캐리어(microcarrier culture) 배양은 1982년과 1984년에 Montagnon et al에 의해 기재되어왔다. 베로 세포를 사용한 폴리오 벡신의 대규모 제조방법, 및 제조된 백신이 미국 특허 4,525,349에 기재되어 있다.

고역가 폴리오바이러스 (사빈 유형 1) 제조 (대략 2x10⁹ TCID₅₀/ml)는 마이크로캐리어 상의 베로 세포가 무혈청 매질에서 바이러스 생산기(phase)에 앞서 혈청-함유 매질에서 배양될 때의 조건에 대해 Merten et al, 1997에 의해 기재되었지만, 혈청을 사용한다는 단점의 관점에서, 이들 저자들은 이미 완전한 무혈청 공정을 요구하였고, 이들 저자들은 이와 같은 최적화된 완전 무혈청 방법으로 6.3x10⁸ TCID₅₀/ml의 역가를 얻을 수 있다는 것을 나타내었다.

산업적 규모로의 백신 제조를 위한 폴리오바이러스의 생산에 참여하였던 Kreeftenberg et al (2006)은 또한 마이크로캐리어 상에서 성장한 베로 세포에서 폴리오바이러스의 다양한 야생형과 사빈 균주의 수득률을 언급하였고, 그 수득률은 다른 균주들과 유사하였고, 로그 역가가 8.1 내지 8.6이었다. 이들 저자들은 또한 최종 백신을 생산하는데 필요한 바이러스의 양이 OPV에서보다 IPV에서 상당히 높다는 것을 언급하며, 이것은 POV보다 IPV의 경우 제형 당 생산가가 상당히 높아지도록 한다.

마이크로캐리어 상에서 배양된 베로 세포를 사용한 폴리오바이러스의 무혈청 생산은 Card et al, 2005에 의해서도 기재되어 있고, 비록 생산성 수준이 정치 배양(static cultures)보다는 낮지만, 마이크로캐리어 배양이 규모 확대에 더 용이한 것으로 기재되었다.

이들 마이크로캐리어-기재 베로 세포 배양의 효율성 및 산업적 적용가능성에도 불구하고, 폴리오바이러스의 다량 생산은 여전히 돈이 많이 들고 그러므로 이러한 단점이 덜한 폴리오바이러스 대체 생산 시스템에 대한 요구가 여전히 있다.

일상적인 마이크로캐리어 베로 세포(van Eikenhorst et al, 2009)에서 관찰되는 것보다 낮은 바이러스 역가(¹⁰log CCID₅₀/ml 6.5 내지 7.9)를 가져오는 현탁물 베로 세포를 사용한 폴리오바이러스의 생산이 기재되었다.

본 발명의 목적은 백신에 사용하기 위한 폴리오바이러스의 대규모 및 경제적 생산에 사용될 수 있는 적합한 방법을 제공하는 것이다. 이것은 지속가능한 근거로 개발도상국이 가용 폴리오백신에 대해 접근하도록 도울 것이다.

본 발명은 PER.C6 세포에서 폴리오바이러스의 매우 효과적인 증식의 증명을 근거로 하고, 여기서 폴리오바이러스의 전례없는 높은 역가는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 얻어진다. 베로 세포에서 바이러스의 생산의 상당한 경제적 이점을 제공하는 이와 같은 고역가의 수득은, 조건과 얻을 수 있는 이점이 매우 다른 특성들을 갖는 여러 가지 다른 유형의 바이러스에 대해 크게 다를 수 있기 때문에, 이와 같은 세포에서의 다른 바이러스의 복제를 근거로 예상될 수 없었을 뿐 아니라, 산업적으로 이용가능한 방법의 조건을 예견할 수도 없었다.

그러므로, 본 발명은: a) 세포의 무혈청 현탁 배양물을 제공하는 단계, 여기서 상기 세포는 ECACC no. 96022940로 기탁된 PER.C6 세포이고, b) 상기 세포를 2x10⁶ cells/ml 내지 150x10⁶ cells/ml의 세포 밀도로 폴리오바이러스로 감염시키는 단계, 및 c) 감염 후 12 내지 48시간에 폴리오바이러스를 수확하는 단계를 포함하는 폴리오바이러스의 제조 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 상기 감염은 약 5x10⁶ cells/ml 내지 20x10⁶ cells/ml의 세포밀도, 일례로 약 8x10⁶ cells/ml 내지 15x10⁶ cells/ml, 예를 들면, 약 10x10⁶ cells/ml에서 수행된다.

특정 구현예에서, 폴리오바이러스의 상기 수확은 감염 후 약 18 내지 30시간, 예를 들면 감염 후 약 24시간에 수행된다.

이들 조건들은 비교적 짧은 공정에서 폴리오바이러스의 매우 높은 역가 (대략 10¹⁰/ml으로, 이것은 야생형 폴리오 균주의 경우 마이크로캐리어 기재 베로 세포를 사용하여 통상적으로 얻은 역가의 10배 보다도 상당히 많은 것이다)를 얻는 것을 가능하게 하고, 그러므로, 백신 제조를 위한 폴리오바이러스 생산에 현재 사용되고 있는 방법보다 경제적으로 상당히 유리하다. 이것은 폴리오바이러스의 3가지 유형 모두에 대해 증명되었다: 유형 1 (Brunenders 균주), 유형 2 (MEF 균주) 및 유형 3 (Saukett 균주).

그러므로, 특정 구현예에서, 상기 폴리오바이러스는 야생형 독성 폴리오바이러스, 예를 들면, 폴리오바이러스 유형 1, 폴리오바이러스 유형 2 또는 폴리오바이러스 유형 3이다. 특정 구현예에서, 상기 폴리오바이러스는 폴리오바이러스 유형 1 균주 Mahoney 또는 Brunenders, 폴리오바이러스 유형 2 균주 MEF (또는 MEF-1), 또는 폴리오바이러스 유형 3 균주 Saukett이다. 또 다른 구현예에서, 상기 폴리오바이러스는 (신경독성이 덜한) 감독된 폴리오바이러스, 예를 들면 Sabin 균주 (이것은 또한 유형 1, 2 또는 3일 수 있다)이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 폴리오바이러스를 생산하기 위한 방법을 포함하고, 폴리오 백신을 생산하기 위해 추가로 정제, 임의로 불활성화, 그리고 수확된 폴리오바이러스를 제형화는 것을 포함하는 폴리오 백신의 제조방법을 제공한다. IPV의 경우, 포르말린 또는 다른 수단에 의한 불활성화가 수행된다. OPV의 경우, 불활성화 단계는 요구되지 않는다.

본 명세서는 또한 폴리오바이러스의 제제에 유용한 폴리오바이러스 벌크를 제공하는 것을 기재하고, 상기 폴리오바이러스 벌크는 본 발명에 따른 폴리오바이러스의 제조방법에 의해 얻을 수 있고 그리고 배양 매질 및 적어도 10^9.4 CCID₅₀/ml, 예를 들면, 약 10^9.5 내지 10¹¹ CCID₅₀/ml, 예를 들면, 약 10^9.8 내지 10^10.8 CCID₅₀/ml의 폴리오바이러스 역가를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 벌크는 1 내지 1000 리터의 부피를 갖는다. 추가의 구현예에서, 상기 벌크는 세포 및/또는 본 발명에 따라 사용된 세포 부스러기를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 벌크는 생물반응기(bioreactor)에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 벌크는 생물반응기로부터 제거되고 적절한 용기에 존재한다.

또한 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 폴리오바이러스 및 폴리오 백신이 기재된다. 상기 폴리오바이러스 및/또는 상기 백신은 원숭이 단백질이 없고, 바람직하기는 비-인간 단백질이 없다. 이것은 또한 다른 비-인간 숙주 세포 잔류물이 없다. 반대로, 통상의 방법으로 생산된 폴리오바이러스는, 세포 배양 중 사용된 숙주 및/또는 사용된 혈청으로부터의 잔류된 비-인간 단백질 및/또는 다른 비-인간 잔류물을 함유할 것이다. 그러므로, 본 발명에 따라 생산된 폴리오바이러스는 통상의 방법을 사용하여 제조된 폴리오바이러스보다 생산 과정에서 생긴 비-인간 불순물에 덜 오염된다.

본 발명은 또한 적어도 약 10^9.4, 바람직하기는 적어도 10^9.8, 더욱 바람직하기는 적어도 10¹⁰, 예를 들면, 10^10.5 내지 10¹¹ CCID₅₀/ml의 역가에서 세포 배양물 중 폴리오바이러스 제제를 얻는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 세포의 무혈청 현탁 배지를 제공하고, 이것은 PER.C6 세포이고, b) 상기 세포를 2x10⁶ cells/ml 내지 150x10⁶ cells/ml의 세포 밀도로 폴리오바이러스로 감염시키고, 그리고 c) 감염 후 12 내지 48시간 후에 폴리오바이러스를 수확하여 상기 농도를 갖는 폴리오바이러스 제제를 수득하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예는 본 발명에 따른 폴리오바이러스의 제조방법에 관한 상기 기재와 동일하다.

도 1은 부착(adherent) PER.C6 및 베로 세포에서의 폴리오바이러스의 제조를 나타낸 도면이다.
도 2는 감염시 다른 MOI 및 다른 세포 밀도에서 다른 무혈청 매질 중의 현탁 PER.C6 세포에서의 폴리오바이러스 유형 1의 제조를 나타내는 도면이다.
도 3은 무혈청 매질에서 현탁 PER.C6 세포 중 폴리오바이러스 유형 1, 2, 및 3의 제조에서 온도 및 수확 시간의 효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 무혈청 매질에서 현탁 PER.C6 세포 중 폴리오바이러스 유형 1의 제조에서 감염시의 세포밀도, 온도 및 수확시간의 효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 높은 세포 밀도에서 무혈청 현탁 PER.C6 세포에서 폴리오바이러스 유형 1, 2, 및 3의 효율적인 제조를 나타내는 도면이다.

본 발명의 과정에 사용된 세포는 PER.C6 세포이고, 이것은 불멸화된 것으로 또한, 본 분야에서 연속 세포주로 알려져 있고 무한 수명의 잠재력을 갖는 것으로 알려져 있다(예를 들면, Barrett et al, 2009 참조). 본 출원의 목적을 위한 PER.C6 세포는 1996년 2월 29일에 ECACC no. 96022940로 기탁된 세포를 의미한다. 이 정의는 이들 기탁된 세포의 상류 또는 하류 계대 또는 상류 또는 하류 계대의 자손로부터의 세포를 포함할 것이다. PER.C6 세포는 US 특허 5,994,128 및 Fallaux et al, 1998에 기재되어 있다. 이들 세포는 세포-기반 인플루엔자 백신을 제조하기 위한 인플루엔자 바이러스 생산에 매우 적합하다. 이들은 예를 들면, Pau et al, 2001 및 WO 01/38362에 기재된 바와 같이, 바이러스를 매우 높은 효율로 감염시키고 증식시킬 수 있다. PER.C6 세포는 예를 들면, Yallop et al, 2005에 기재된 바와 같이, 혈청의 부재 중에 현탁액 중에서 성장할 수 있다. 이들 세포는 또한 무혈청 현탁 배지에서 높은 수준으로 폴리오바이러스를 생산하는데 매우 적합하다는 것이 증명된다.

더욱이, 적용된 조건은 경제적이고 규제적으로 유리하다.

마이크로캐리어의 사용은, 베로 세포를 사용한 공정에서 널리 사용되는 것과는 달리 본 발명에서는 요구되지 않는다. 마이크로캐리어는 통상의 베로 세포 기재 공정을 사용하여 제조된 폴리오바이러스의 고비용에 기여한다.

본 발명에 따른 무혈청은 세포 성장 및 감염을 위해 사용된 매질이 구성성분으로서 전(whole) 혈청이 부족하다는 것을 의미한다. 이것은 송아지 혈청 알부민(BSA)와 같이 혈청-유래 산물이 완전히 없다는 것은 아니며, 그러나 바람직한 구현예에서 이와 같은 성분은 또한 존재하지 않거나 또는 어느 동물 유래 성분의 부재 중에 재조합적으로 생산되었다. 바람직한 구현예에서, 완전 방법은 혈청 또는 혈청-성분 등과 같은 동물로부터 직접적으로 유래된 어느 성분들의 부재하에 수행된다. 바람직한 구현예에서, 백신의 제조방법은 동물성분이 없는 조건에서 수행된다. 이것은 세포 성장 및 감염을 위해 사용되는 매질이 어느 동물 유래 성분을 피한다는 것을 의미한다. 더욱이, 백신 제조 공정 중 매질에 공급된 어느 첨가물은 또한 동물-유래 성분이 없다. 상기 폴리오 백신의 제조방법에서 동물 성분의 부재는 좀더 제어되고 안전한 공정을 제공한다. 이 이유로, 완전히 특성화된 인간 세포이고 GLP/GMP와 컴플라이언스로 전개된 PER.C6 세포는 백신 제작에 사용하기에 매우 적합하다. 다양한 배지가 사용될 수 있고, 세포 및 사용된 환경에 대한 최적 배지의 선택은 본 분야의 당업자에게는 일상적인 업무의 일부이다. 그러므로, 본 발명의 목적을 위한 적절한 배지는 당업자에게 잘 알려져 있고 대량으로 시판물로부터 또는 표준 프로토콜을 따른 기성품으로부터 일반적으로 얻어질 수 있다. 배양은 배치, 공급-배치, 연속 시스템 등을 사용하여 예를 들면, 디쉬, 롤러병 또는 생물반응기에서 행해질 수 있다. 세포 배양을 통해 바이러스의 대랑 (연속) 생산을 얻기 위해, 현탁물 중에서 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하고, 동물- 또는 인간 유래 혈청 또는 동물- 또는 인간 유래 혈청 성분의 부재 하에 배양할 수 있는 것이 바람직하다. 세포를 배양하기에 적합한 조건은 알려져 있다(예를 들면, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), 및 R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9) 참조). 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 무혈청 배지는, CDM4PERMAb^TM (Thermo Scientific HyClone, cat. nos. SH30871, SH30872)를 포함하여, 매질 판매사의 카탈로그에서 주문할 수 있는 표준 매질을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 추가로, Permexcis (Lonza)와 같은 주문 매질이 적합하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 무혈청 매질의 예는 AEM (Invitrogen, cat. no. 12582-011), EX-CELL^TM VPRO 매질 (JRH Biosciences, catalog number 14561) 및 CDM4Retino^TM (HyClone, cat. nos. SH30520, SH30519)이다.

특정 선택 및 비-제한적 구현예에서, 반응성을 더욱 개선하기 위해 본 발명의 방법에서의 무혈청 배지에 지질 및/또는 가수분해산물 (hydrolysates) 및/또는 다른 공급물을 공급하는 것이 가능하다.

본 명세서에 사용되는 수치에 대한 용어 '약' 또는 '대략'은 값±10%을 의미한다.

본 발명에 따른 방법에서 세포를 폴리오바이러스 및/또는 바이러스 증식물로 감염시키는 것은 예를 들면, 약 33℃ 내지 38℃의 온도에서 수행되는 것이 적합하다. 바람직한 구현예에서, 상기 감염 및/또는 바이러스 증식은 약 34℃ 내지 36℃의 온도, 특정 구현예에서는 약 34.5℃ 내지 35.5℃의 온도, 예를 들면 약 35℃에서 수행된다.

세포를 본 발명에 따른 방법에서 폴리오바이러스로 감염시키는 것은 예를 들면, 감염다중도 (MOI) 0.001 내지 10에서 적절히 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 감염은 약 1 내지 3의 MIO, 예를 들면 약 2의 MIO에서 적절히 수행될 수 있다. 이와 같이 비교적 높은 MIO (>0.1, 바람직하기는 약 1 이상)는 높은 효율, 높은 수득 공정을 더욱 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따르면, 세포는 폴리오바이러스로, 바람직하기는 높은 세포 밀도로 감염된다. 특정 면에서, 폴리오바이러스에 의한 감염은 세포가 1x10⁶ cells/ml 내지 150x10⁶ cells/ml, 바람직하기는 2x10⁶ cells/ml 내지 150x10⁶ cells/ml의 밀도를 가질 때 일어난다. 특정 바람직한 구현예에서, 상기 감염은 5x10⁶ cells/ml 내지 20x10⁶ cells/ml, 예를 들면, 약 8x10⁶ cells/ml 내지 15x10⁶ cells/ml, 예를 들면, 약 10x10⁶ cells/ml의 세포밀도에서 수행된다. 본 발명자들이 알고 있는 바에 따르면, 본 발명의 방법은 비-아데노바이러스성 바이러스 백신이 제조되는 가장 높은 세포 농도를 제공한다. 본 발명에 따른 방법의 장점은 매우 높은, 즉 선행기술의 통상의 베로 공정보다 적어도 한자리수 (10배; an order of magnitude) 더 높은 역가를 얻을 수 있다는 것이다.

본 발명에 따른 공정에서, 폴리오바이러스는 감염 후 12 내지 48시간 후에 수확된다. 특정 구현예에서, 폴리오바이러스의 상기 수확은 감염 후 약 18 내지 30시간, 예를 들면 감염 후 약 20 내지 28시간, 약 22 내지 26시간, 예를 들면, 감염 후 약 24시간 후에 수행된다. 그러므로, 본 발명에 따른 방법은 극히 신속하게 폴리오바이러스의 고역가를 얻는데 사용될 수 있고, 이것은 또한 본 분야의 통상적인훨씬 긴 공정과 비교하여 본 발명의 방법을 경제적으로 매우 매력적으로 만들도록 돕는다.

가장 대규모의 현탁 배양은 배치 또는 공급-배치 공정으로 작동하는데, 이들이 작업하고 규모를 확대하기에 가장 단순하고, 이와 같은 공정은 즉각적인 발명의 공정에 기본적으로 적합하기 때문이다. 그러나, 관류 원칙에 따른 연속 공정이 더욱 일반적이 되고 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 생산자 세포는 관류 시스템에서 배양된다.

배치, 공급-배치, 관류 및 관류 생산 공정이, 예를 들면, 재조합 항체 생산을 위해 PRE.C6 세포와 함께 사용되었다. 배치 배양에서, 12x10⁶ cells/ml 보다 높은 생존세포농도는 일상적으로 달성된다. 최대 40x10⁶ cells/ml의 생존 세포 농도가 공급-배치를 사용하여 여러 번 증명되었다. 관류 공정에서, 150x10⁶ cells/ml을 초과하는 피크 세포 농도는 일상적으로 얻어진다(Kral et al, 2009).

세포의 관류 배양은 본 분야에서 통상의 의미를 갖고, 즉, 이것은 배양 중 세포가 분리 전보다 낮은 세포밀도를 갖는 액체의 유출을 갖고 세포 배지가 유입되는 별개의 장비에 유지되는 것을 의미한다. 관류된 배지의 사용은 높은 밀도(예를 들면, 10-50 x 10⁶ viable cells/mL)에서 세포 생장의 챌린지에 대한 응답이다. 밀도를 증가시키기 위해, 매질은 끊임없이 또는 간헐적으로 새로운 공급물로 대체하어 영양 결핍을 보전하고 독성 산물을 제거하였다. 관류는 또한 배양 환경(pH, dO₂, 영양 수준 등)의 더 나은 조절을 허용한다. 배양을 통한 새로운 매질의 관류는 다양한 분리 장비들(예를 들면, 미세 메쉬 회전 필터, 중공섬유 또는 평판막 필터, 침전 튜브)에 세포를 보유함에 의해 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 분리 장비는 중공섬유를 포함하는 필터 모듈, 즉 관형막이다. 튜브의 내부 직경은 0.3 내지 0.6 mm, 예를 들면, 0.5 내지 2.0 mm이다. 특정 구현예에서, 막의 메쉬 크기 (구멍 크기)는, 세포 부스러기가 필터를 통과하는 동안 세포는 확실히 유지되도록 메쉬의 구멍 크기는 세포의 직경에 근접하도록 선택된다. 다른 구현예에서, 메쉬 크기는 세포의 직경보다 상당히 작다. 바람직하기는 0.1 내지 30㎛이고, 예를 들면, 0.1 내지 3㎛이고, 예를 들면, 약 0.2㎛이다. 중공 섬유를 포함하는 필터 모듈은 예를 들면, 제너럴 일렉트릭사 (이전, Amersham)의 제품을 사용할 수 있다.

관류는 특정 대사의 원하는 수준을 유지하고 불순물을 제거하여 매질에서 감소시키기 위해 사용된다. 통상적으로 관류는 배양 중 모든 시간에 수행되지 않고 필요에 따라 배양 중 오직 가끔씩 수행되는 것이 일반적이다. 예를 들면, 관류는 통상적으로 글루코스와 같은 특정 매질 성분이 소모되기 시작한 후 대체되어야 할 필요가 있을 때까지 개시되지 않는다.

여러 관류 시스템이 본 분야에 얄려져 있고 원칙적으로 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. "관류 시스템"이란 용어는 분리 장비에 연결된 생물반응기의 조합을 의미한다. 분리 장비는 생물반응기에 병합되거나 (예를 들면, 미세 메쉬 회전필터) 또는 생물반응기 외부에 남아 있을 수 있다 (예를 들면, 중공 섬유). 두 경우 모두, 위에서 설명한 바와 같이, 분리 장비는 반응기로부터 세포 매스가 씻겨져 나가는 것을 막고 매질을 원기회복시킨다. 특정 구현예에서, 생물반응기는 교류 접선 흐름(ATF) 관류 시스템(예를 들면, ATF 시스템, Refine Technology, Co., East Hanover, NJ) (에 연결되어)과 작동한다. 접선 흐름은 본 분야의 당업자에게 알려진 방법에 따라 그리고 예를 들면, US 6,544,424에 기재된 방법에 따라 달성될 수 있다. ATP 관류 시스템의 작동이 기재되었고 측정가능하다 (Furey, 2002). ATF 시스템은 세포를 장기간 배양할 수 있게 하고 필터가 막힘없이 높은 세포 밀도에 도달하도록 한다. 참으로, 100 x 10⁶ viable cells/mL를 넘는 극히 높은 세포 밀도가 ATF 관류 시스템, 예를 들면, PER.C6 세포을 사용하여 얻을 수 있다 (예를 들면, Yallop et al, 2005 및 WO 2005/095578 참조). 그러나, 관류 시스템에서 PER.C6 세포의 초기 보고서들은 항체의 재조합 생산, 즉, 완전히 다른 목적에 사용되었고, 폴리오바이러스에 감염되지 않았다.

특정 구현예에서, 예를 들면 ATF 시스템과의 관류는, 이것이 매우 높은 세포 밀도를 얻을 수 있도록 하고 세포는 이어서 폴리오바이러스에 의한 감염에 양호한 상태이기 때문에, 예비배양기(preculture phase) 동안 (즉, 폴리오바이러스로 감염되기 전) 유리하다. 상기의 높은 세포 밀도에 도달하기 위해, 배양물은 특정 구현예에서, 세포 성장 중의 기간 동안 적어도 부분적으로 관류된다. 특정 구현예에서, 관류는 세포 밀도가 약 2x10⁶ viable cells/mL 내지 8x10⁶ viable cells/mL에 도달하면 일단 개시된다.

본 발명의 방법에서, 세포는 폴리오바이러스에 감염된다. 통상적으로, 바이러스는 최적의 조건하에서 적합한 생산자 세포에 노출되어 바이러스를 수득한다. 본 분야의 당업자는 최적의 추가 조건들, 즉, 교반, 용존 산소(dO₂ 또는 DO)를 찾는 방법을 안다. 보통, 최적 교반은 약 50 내지 300 rpm, 통상적으로 약 100~200, 예를 들면, 약 150이고, 전형적인 DO는 5~60%, 최적 pH는 6.7 내지 7.7이다.

통상적으로, 폴리오바이러스는 본 발명의 세포를 자동적으로 감염시키고, 세포를 폴리오바이러스 입자와 접촉하도록 하는 것이 세포의 감염을 위해 충분하다. 일반적으로, 폴리오바이러스 원종(seed stock)이 감염을 개시하도록 배양물에 첨가되고, 그리고 이어서 폴리오바이러스가 세포에서 증식한다.

본 발명에 따른 세포 배양물을 높은 세포밀도, 즉 약 10x10⁶ cells/mL에서 폴리오바이러스로 감염시키고 그리고 매우 높은(10¹⁰ CCID₅₀/ml 초과) 폴리오바이러스 역가를 얻었다.

특정 구현예에서, 감염 전의 세포 배양물의 생존능은 75%보다 높게 유지하였고, 이것은 세포 배양물에서 세포의 총량의 적어도 75%는 감염 순간에 생존한다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 감염시 세포 배양물의 생존능은 적어도 80%, 추가의 구현예에서 적어도 85%이다. 생존능은 예를 들면, 트립신 블루 배제, Casy 세포 계수 등과 같은, 당업자에게 적용가능한 통상의 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

특정 구현예에서, 감염시 세포 밀도는 약 10x10⁶ 내지 50x10⁶ viable cells/mL이고, 예를 들면, 약 10x10⁶ 내지 20x10⁶ viable cells/mL, 예를 들면, 약 10x10⁶ 내지 15x10⁶ viable cells/mL이다. 이들 세포 밀도는 세포 부스러기 및 숙주 세포 DNA의 축적이 제한된 높은 바이러스 생존력을 허용하고, 이것은 폴리오바이러스 수확의 하류 공정에서 이들 구현예의 이점을 제공한다. 그러므로, 본 발명은 폴리오바이러스 생산을 위한 최적의 방법을 제공하고, 폴리오바이러스의 높은 역가를 산출하고, 동시에 하류 공정 목적을 관리할 수 있는 수확 물질을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 감염시 세포 밀도는 약 15x10⁶ 내지 150x10⁶ cells/mL, 예를 들면, 약 15x10⁶ 내지 80x10⁶ cells/mL, 예를 들면, 약 20x10⁶ 내지 50x10⁶ cells/mL이다. 이들 세포 밀도에서의 감염은 바이러스의 더 높은 농도를 산출할 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, 적어도 10¹⁰ CCID₅₀/ml의 역가에서 폴리오바이러스 벌크를 생산하기 위한 방법이 제공된다.

역가는 CCID₅₀로 표현되고, 이것은 세포 배양물 감염성 투여량의 50% 이다. 이것은 때때로 TCID₅₀ (조직 배양물 감염성 투여량의 50%)로도 언급되지만, 이것은 세포 배양물에 의해 측정되므로, 본 발명에서는 용어 CCID₅₀가 사용된다.

바이러스는 세포와 접촉되도록 놓여 바이러스가 상기 세포를 감염시키고 증식되도록 한다. 예를 들면, 바이러스 시드 롯트를 세포 배양물에 첨가하고, 예를 들면, 부드럽게 교반하면서 (약 30 rpm) 약 30분 동안, 세포에서 흡수되도록 하고, 그리고 나서 추가의 배양물을 첨가하고 필요에 따라 pH를 조절하고 교반 속도를 조절하고 배양을 유지한다. 감염 단계 후, 다수의 바이러스 입자의 증폭이 일어난다. 물론, 이 단계도 바람직하기는 혈청의 부재하여 현탁물에서 배양되는 PER.C6 세포에서, 더욱 바람직하기는 직접 동물로부터 유래된 성분이 전혀 없는 조건에서 수행된다. 이 단계는 예를 들면 1 내지 20,000 리터의 크기, 예를 들면, 10 내지 2000 리터, 예를 들면 50 내지 1000 리터 크기의 생물 반응기에서 적절히 수행되고, 이 크기는 백신에 대한 요구에 맞춰 쉽게 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 생물반응기는 일회용 생물반응기(SUB)이다.

폴리오바이러스가 세포에서 증식된 후, 바이러스 또는 그들의 성분들이 세포 배양물로부터 수확된다. 이것은 일상적인 방법으로 수행될 수 있고, 이것은 당업자에게 알려져 있다. 생산되고 세포 배양물에 방출된 바이러스는 원심분리 또는 한외여과와 같은 통상의 방법으로 세포의 바이오매스로부터 분리되고, 그리고 상등액 중에 수확될 수 있다. 이와 같은 경우, 원심분리 또는 여과는 수확단계이다. 바이러스를 수확하기 위한 기존의 방법들, 예를 들면, US 4,525,349에 기재된 방법들이 사용될 수 있다. 즉, 바이러스를 함유하는 액체 매질 현탁액이 통상적으로 빼내지고, 여과되고 예를 들면 한외여과에 의해 농축된다. 예를 들면, 배양의 마지막에, 수확은 바이러스 현탁액을 함유하는 배양물을 수집함으로써 수행된다. 수확물은 예를 들면, 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과되고, 그리고 임의로 4℃에서 보관된다.

여과된 수확물은 임의로 한외여과하여 바이러스 현탁물을 농축시키고, 그리고 이어서 폴리오바이러스는, 예를 들면 겔 여과 및/또는 이온교환 크로마토그래피를 사용하여, 예를 들면, US 4,525,349, 또는 Van Wezel et al, 1978 에 기재된 방법에 따라 정제될 수 있다. 생성된 농축된 바이러스 현탁물은 임의로 희석될 수 있고, IPV를 제조하는 경우, 그 안의 폴리오바이러스는 불활성화될 것이고, 이것을 위해 종래의 방법이 사용될 수 있다.

폴리오바이러스 또는 바이러스 성분을 수확하고 정제하는 방법, 및 그로부터 백신의 생산은 이미 수 십년 동안 본 분야에서 사용되었고, 그러므로 잘 알려져 있고 예를 들면, (Van Wezel et al, 1978; Montagnon et al, 1984; WO 2007/007344; US 4,525,349)에 상세히 기술되어 있고, 이것은 모두 본 명세서에 참조로서 병합된다.

폴리오 백신은 생 바이러스 또는 불활성화된 바이러스를 기재로 한다. 이들은 폴리오바이러스 D-항원을 함유하고, 이것은 중요한 보호 항원이다. 바이러스 수득량은 표준 바이러스 역가 기술에 의해 측정될 수 있고, 반면 D-항원 농도의 측정은 또한 당업자에게 잘 알려진 종래의 기술, 예를 들면, D-항원 ELISA 분석으로 수행될 수 있다. 면역원성은 예를 들면, 동물에서 인 비보 시험에 의해 측정될 수 있다. 효능은 D-항원 ELISA를 사용하여 그리고 이미 면역화된 래트의 혈청에서 폴리오바이러스 중화 세포 배양물 분석에 의해 측정될 수 있다.

일반적으로, 각각의 폴리오바이러스 균주들은 별개의 공정에서 배양되고, 예를 들면, 3가지 유형의 폴리오바이러스를 함유하는 3가의 백신이 제조되는 경우, (불활성화된, IPV 경우) 바이러스들이 혼합되고 개개의 제형의 제조를 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 예를 들면, 투여량 당 최종 백신 (예를 들면 0.5 ml)은 참조 제제와 비교하여 측정하여, 예를 들면, 유형 1 폴리오바이러스의 40 D-항원 단위를 포함하고, 유형 2 폴리오바이러스의 8 DU 및 유형 3 폴리오바이러스 32 DU를 포함한다.

폴리오바이러스의 불활성화는 예를 들면, 포르말린 또는 프로피올락톤 (BPL)을 사용하여 본 분야의 공지의 방법에 따라 수행된다 (예를 들면, Jiang et al, 1986 참조). 특정 구현예에서, 불활성화는 포르말린을 사용하여 다음의 방법에 따라 수행된다: 정제된 바이러스 현탁액을 0.22㎛ 막으로 여과하고, 고정 마그네틱으로 24시간 교반하면서 37℃에서 가열하고, 그 후 포르몰(formol) 용액을 첨가하여 1/4000의 농도를 얻는다. 바이러스 현탁액을 37℃로 유지하면서, 처음 4일간 마그네틱 교반을 계속한다. 제6일에, 바이러스 현탁액을 0.22 미크론 막으로 여과하고, 제12일까지 37℃에서 현탁하에 불활성화를 계속한다. 불활성화된 바이러스 현탁액을 균질화하고, 예를 들면, 4℃에서 보관한다. 이 단계 후, 농축된 및/또는 투여용 최종 배치는 예를 들면, 원하는 제제를 혼합하여 제조할 수 있다.

특정 구현예에서, 정제된 폴리오바이러스 또는 바이러스 성분은 약제학적 조성물로 제형화된다. 이것은 다양한 방법에 따라 그리고 본 분야의 당업자들에게 통상적으로 알려진 다양한 완충액을 사용하여 수행된다. 일반적으로, 이것은 폴리오바이러스와 적어도 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물에 폴리오 바이러스 입자를 제공하는 것을 수반한다. 이와 같은 조성물은 당업자에게 알려진 조건하에서 제조될 수 있고, 특정 구현예에서는 인간에게 투여하기에 적합하다. 특정 구현예에서, 조성물은 완충된 배지를 포함할 수 있고, 이것은 임의로 Medium M-199일 수 있고, 이것은 특정 등록된 통상의 불활성화 폴리오바이러스 백신을 위한 제형화 매질로서 사용된다. 더욱이, 포스페이트 완충된 살린이 사용될 수 있고, 최종 투여량 제형은 예를 들면, 0.5% 2-페녹시에탄올과 항생제 보존제로서 투여량 당 최대 0.02%의 포름알데히드를 포함할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 희석제가 본 분야에 알려져 있고 다양한 치료 산물에 광범위하게 사용된다. 바람직하기는, 담체는 백신에 주효하게 적용된다. 특정 구현예에서, 백신은 추가로 부형제, 예를 들면 명반을 포함한다. 부형제는 적용된 항원결정기에 대한 면역 반응을 더욱 증가시키는 것으로 본 분야에 알려져 있다.

인간에게 투여하기 위해, 본 발명은 폴리오바이러스와 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 사용할 수 있다. 현 컨텍스트에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 사용된 투여량 및 농도에서 담체 또는 부형제가 그들이 투여될 개체에서 원하지 않거나 또는 해로운 효과를 일으키지 않는다는 것을 의미한다. 이와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 부형제는 본 분야에 잘 알려져 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000] 참조). 정제된 불활성화된 폴리오바이러스 또는 그것의 면역원성 부분은 바람직하기는 멸균 용액으로 제형화되고 투여된다. 멸균 용액은 멸균 여과법 또는 본 분야에 알려진 다른 방법에 의해 제조된다. 용액은 그리고 나서 동결건조되거나 또는 약제학적 제형 용기에 채워진다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5의 범위, 예를 들면 pH 5.0 내지 7.5이다. 폴리오바이러스 또는 그것의 면역원성 부분은 전형적으로 적절한 약제학적으로 허용가능한 완충액을 갖는 용액이고, 폴리오바이러스의 용액은 또한 염을 함유할 수 있다. 임의로 알부민과 같이, 살균제가 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 세척제가 첨가된다. 특정 구현예에서, 백신은 주사제로 제형화될 수 있다. 이들 제형들은 유효량의 폴리오바이러스 또는 그것의 면역원성 부분을 함유하고, 멸균 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조 형태(version)이고, 임의로 안정화제 또는 부형제를 함유한다.

폴리오 백신은 한가지 유형의 폴리오바이러스(유형 1, 2, 또는 3)를 함유하는 1가, 또는 두 가지 유형의 폴리오바이러스(유형 1과 2, 유형 1과 3, 또는 유형 2와 3)을 함유하는 2가, 또는 (3가지 유형의 폴리오바이러스 즉, 유형 1,2, 및 3을 함유하는) 3가일 수 있다.

야생형 폴리오바이러스로부터 IPV를 생산하는 것이 가능하다. 선택적으로, IPV는 비-맹독성 생 폴리오바이러스로, 예를 들면, 사빈 균주부터 생산될 수 있고, 이것은 추가로 IPV 제조로부터 야생형 폴리오바이러스를 재도입하는 위험을 감소시킬 수 있다 (예를 들면, WO 2007/007344, 및 Doi et al, 2001 참조). 본 발명은 야생형 폴리오바이러스 (유형 1, 2 및 3, 예를 들면, 유형 1 균주 Mahoney, 유형 2 균주 MEF, 또는 유형 3 균주 Saukett) 뿐 아니라 폴리오바이러스의 비-맹독성 유형(예를 들면, 사빈 균주)를 생산하기에 적합하다. 본 발명은, 그러므로 IPV용 뿐 아니라 OPV용 폴리오바이러스를 생산하는데 사용할 수 있다. IPV를 생산하는데 적용되는 본 발명에 따른 공정은 IPV를 개발도상국 및 저개발국에서 이용할 수 있는 정도로 비용이 낮도록 만들 수 있다. 비록 통상의 방법에 따라 제조할 때 일반적으로 OPV가 IPV보다 저렴하지만, 본 발명의 매우 효과적인 방법은 OPV용의 벌크 재료의 비용을 여전히 낮출 수 있고, 따라서 그것의 제조비용도 감소시킨다.

폴리오 백신의 투여는 본 분야에 알려진 방법에 따라, 예를 들면, 근육내, 피부내, 또는 경구적으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따라 얻을 수 있는 폴리오바이러스 백신은 독립형(stand-alone) 백신으로 사용될 수 있지만, 다른 구현예에서는 보통과 같이, 예를 들면, 디프테리아, 백일해, 파상풍 및 소아마비에 대하여 조합된 백신일 수 있고, 임의로 B형 간염 및/또는 헤모폴리우스(heamophilus) 인플루엔자 등에 대한 백신 성분을 포함할 수 있다. 그러므로, 폴리오바이러스는 면역화 (EPI)에 대한 확장 프로그램에 사용하기에 적합하고, 그리고 그 프로그램의 백신들과 조합될 수 있다. 통상의 폴리오바이러스 백신과 유사하게, 본 발명에 따른 백신은 단일 투여량으로, 또는 바람직하기는 1차 접종(prime-boost regimen)으로 제공될 수 있고, 여기서 백신의 다중 투여량은 적절한 시간 간격으로, 예를 들면, 1~2개월 간격으로 2회 접종, 이어서 6~12개월 후 추가접종(a booster dose); 또는 예를 들면 초기 경구 투여, 이어서 약 8주 후 두 번째 투여 및 2회 투여 후 8~12개월에 세 번째 투여; 또는 예를 들면, 영아의 경우 6 내지 12주에 첫 번째 경구투여, 이어서 첫 번째 투여 후 약 8주에 두 번째 투여 및 약 6-19개월에 세 번째 투여, 또는 예를 들면, 높은 위험도에서, 기존 접종한 인간에게 오직 단일 투여 등으로 투여될 수 있다

최적 투여량 용법은 표준 의술에 따라 결정될 수 있고 일반적으로 이용가능한 폴리오바이러스 백신에 대한 것과 동일한 스킴을 따른다.

본 발명은 다음의 실시예에서 더욱 설명된다. 실시예들은 본 발명을 어떠한 방법으로도 제한하지 않는다. 이들은 단지 본 발명을 명백히 하는 것이다.

실시예

실시예 1:

부착 PER . C6 세포에서의 폴리오바이러스의 효율적 생산

부착 PER.C6 세포에서의 폴리오바이러스의 증식을 시험하고 그리고 바이러스 스톡을 발생시키기 위해, 폴리오바이러스 유형 1 (Brunenders), 유형 2 (MEF-1) 및 유형 3 (Sauckett)을 SBL (Sweden)로부터 얻었다. 이들 각각은 베로 세포에서 생산되었고 이들 스톡의 역가는 약 10⁶ CCID₅₀/ml이었다. PER.C6 세포 (Fallaux et al, 1998)를 배지에서 성장시켰다(10% FBS 및 10mM MgCl₂를 갖는 DMEM). 3개의 T175 플라스크를 각 유형의 폴리오바이러스에 대해 25 ml 배지에서 30x10⁶ PER.C6 세포/플라스크로 시드하고 그리고 다음날 습식 인큐베이터에서 37℃ 및 10% CO₂에서 감염다중도 0.1 (0.1 CCID₅₀/cell)로 접종하였다. 3일 후, 세포와 매질을 수확하고 조(crude) 용출물을 2회 냉동/해동 순환으로 제조하였다. 세포 부스러기를 제거하기 위해 원심분리후, 현탁물을 부분표본(aliquots)으로 나누고 80℃에서 보관하였다. 동시에, 하나의 T175 플라스크를 폴리오바이러스의 각각의 균주에 대해 베로 세포 배지(4 mM L-글루타민이 보충된 Optipro SFM 매질) 25ml 중의 6.25x10⁶ 베로 세포로 시드하고 동일한 MOI로 감염시켰다. 베로 배지를 또한 3일 후 수확하였고, 2회 냉동/해동하였고 보관을 위해 부분표본하였다.

폴리오바이러스 생산물을 베로 세포를 사용한 CCID₅₀ 분석으로 정량화하였다. 여기에, 1.25x10⁴ 베로 세포를 100㎕ 매질에서 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 시드하고 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다. 다음날, 폴리오바이러스 샘플의 일련의 5배 희석물 15개를 베로 세포 배지 중에서 제조하고 희석물 번호 5 내지 15 100㎕를 8배 희석된 96-웰 플레이트의 칼럼 1 내지 11에 첨가하였다. 칼럼 12은 감염되지 않은 대조군으로 제공되었다. 7일 후 웰을 세포병원성 효과의 발생(CPE)에 대해 분석하였고 역가를 Spearman-Karber법을 사용하여 계산하였다:

종점 역가(Endpoint titer) (log₁₀)= X_o- d/2+d/n*∑X_i

여기서, X_o는 모든 접종물이 여전히 양성일 때 가장 높은 희석물의 log₁₀ 값이고, d는 사용된 희석물 인자의 log₁₀ 값이고, n은 각각의 희석물에서 복제물의 수이고, ∑X_i 는 희석물 X_o를 포함하여 양성인 모든 웰의 합이다.

적정 실험의 결과를 도 1에 나타내었고 부착 PER.C6 세포에서의 역가는 유형 1 폴리오바이러스의 경우 베로 세포에서보다 >5배 높았고, 유형 2 및 3의 경우 >10배 높았다. 세포당 바이러스 입자의 생산에서의 차이는, 더 많은 PER.C6 세포가 시드되었기 때문에 더 작을 것으로 예상된다. PER.C6 및 베로 둘 다에 대해, 세포 단일층의 융합(confluence)은 ~80%일 것으로 평가되었다.

이러한 실험결과로부터, 본 발명가들은 PER.C6 세포의 부착 단일층에서의 폴리오바이러스의 생산은 최소한 베로 세포에서만큼 양호하다고 결론지었다.

실시예 2: 현탁물 중의 PER . C6 세포에서의 폴리오바이러스의 효율적인 생산

현탁물 중의 PER.C6 세포에서의 폴리오바이러스의 증식을 조사하기 위해, 다른 배양 매질, 감염다중도 (MOI) 및 수확시간 (TOH)를 시험하기 위한 소규모 실험을 수행하였다. 여기에 PER.C6 세포를 3가지 다른 매질에서 배양하였다: AEM (Invitrogen), BMIVg (Permexcis^TM, Lonza사 제품) 및 CDM4PERMAb (Hyclone). 감염일에, 한가지 유형의 매질에서 배양된 세포들을 계수하고 동일한 매질에서 다른 세포 밀도로 재-시드하고(1.5, 2.5, 3.5 또는 5 million cells/ml), 진동 플랫폼 위의 습식 배양기에서 37℃에서 다른 MOI로 감염시켰다(0.01, 0.05 또는 0.1 CCID₅₀/cell). 플랫폼(IKA KS 260)은 오비탈 직경이 10mm였고 15~20 ml의 매질이 채워진 125 또는 250 ml 플라스크의 경우 100 rpm으로 사용하였다. AEM 매질의 경우, AEM는 높은 세포 밀도를 지지하지 않으므로 1.5 또는 2.5 million cells/ml를 접종하였다. 이 방식으로, 감염 후 제 2, 3 또는 4일에 수확된 다중 배양물을 제조하였다. 모든 샘플을 2회 냉동/해동시키고 추가 분석 때까지 -20℃ 이하에서 보관하였다.

도 2는 제2일 및 제4일 샘플에 대한 이들 샘플의 적정 결과를 나타낸다(제3일은 도시하지 않음). 3개의 매질 모두에서 성장하고 감염된 PER.C6 세포는, 비록 BMIVg 매질이 PERMAb 및 AEM 매질과 비교하여 다소 낮은 역가를 제공하였지만, 폴리오바이러스 유형 1의 높은 역가를 생산할 수 있었다. 더욱이, 인큐베이션이 길수록 더 높은 역가를 나타내지 않았다. 반대로, 제2일 수확은 대부분의 경우 제3 및 제4일 수확물과 비교하여 높은 역가를 가져왔다. MOI의 변이의 일관 효과는 이 실험에서는 볼 수 없었다. 중요하기는, 감염시 더 높은 세포 밀도의 사용은 높은 용적 역가를 나타내고, 이것은 높은 세포 밀도를 사용한 현탁물 배양 공정이 감염성 폴리오바이러스의 산출에 유리하다는 것을 나타낸다.

다음 실험에서, 감염 중 수확 시간과 온도를 세 가지 폴리오바이러스 균주 모두에 대해 비교하였다. 여기에, PER.C6 세포를 진동 플라스크에서 15 ml 부피 중 2.5x10⁶ cells/ml에서 AEM 매질 중에 시드하고, 각각의 폴리오바이러스 균주의 37℃ 및 35℃에서 MOI 0.1로 감염시켰다. 세포와 매질을 감염 후 제, 3, 및 4일에 수확하고 상기와 같이 처리하였다. 다른 조건들하에서 바이러스 산물의 분석을 상기와 같이 CCID₅₀ v값을 측정하여 수행하였고, 3가지 유형의 폴리오바이러스 모두에 대해 37℃와 비교하여 35℃에서 수득률의 증가를 나타내었다 (도 3). 이에 더하여, 이것은 폴리오바이러스 유형 2와 3에서 확인되고 확장되었고 대부분의 경우 가장 높은 역가는 제2일에 취한 수확물에서 측정되었다.

실시예 3: 현탁물 PER . C6 세포에서의 폴리오바이러스 수득률은 더 높은 세포밀도에서 증가한다.

세포 밀도의 추가의 증가가 바이러스 역가의 증가를 가져오는가를 연구하기 위해, 2.5x10⁶ cells/ml의 생산물을 10x10⁶ cells/ml과 비교하였다. 여기에, PERMAb 매질에서의 PER.C6 세포를 표시된 세포 밀도에서 진동 플라스크에 15 ml 부피로 시드하고 3중으로 유형 1 폴리오바이러스 2 CCID50/cell로 감염시켰다. 24시간 및 48시간 후에 세포와 매질을 수확하고 승인된(cleared) 용출물을 상기와 같이 냉동/해동 및 원심분리하여 제조하였다. 앞서 시험된 35℃ 및 37℃의 온도 이외에, 33℃에서도 실험을 수행하였다.

CCID₅₀ 조사에 의한 역가의 분석(도 4)은 세포가 10x10⁶ cells/ml의 밀도로 감염되었을 때 2.5x10⁶ cells/ml와 비교하여 수득률이 개선된다는 것을 확인하였다. 최고의 역가는 세포 밀도 또는 수확일에 관계없이 35℃에서 얻어졌다. 더욱이, 그리고 PER.C6 세포에서의 폴리오바이러스의 효율적인 증식에 대해 나타내는 것으로, 수확은 24시간 또는 48시간 샘플에서의 수득률이 상당히 유사하므로 24시간 후에도 취해질 수 있다는 것을 나타낸다.

다음 실험에서, 이들 조건들을 또한 폴리오바이러스의 다른 역가에 대해 시험하였다. PER.C6 세포를 PERMAb 매질에 10x10⁶ cells/ml로 시드하고 폴리오바이러스의 다른 스톡으로 3중으로 진동 플라스크 중에서 37℃에서 2 CCID₅₀/cell로 감염시켰다. 24시간과 48시간 후에 수확하고 세포와 매질을 상기와 같이 승인된 용출물로 처리하였다. CCID₅₀ 분석에 의한 적정은 높은 세포 밀도의 사용이 유형 2 및 3의 바이러스에서도 높은 수득률을 가져온다는 것은 나타낸다(도 5).

이것은 현탁물 중의 PER.C6 세포의 높은 밀도 배양물이 야생형 폴리오바이러스의 생산에 뛰어난 플랫폼을 제공한다는 것을 분명히 나타낸다. PER.C6 세포의 세포 밀도와 배양물의 크기/부피는 생물반응기 시스템, 웨이브 백 또는 배양을 위한 기타 유형의 확장 시스템을 사용함으로써 증가될 수 있기 때문에, 폴리오바이러스의 제조는 베로 세포 배양물을 사용하는 현재의 마이크로-담체 시스템과 비교하여 상당히 개선될 수 있다.

생산된 폴리오바이러스를 본 분야에 알려지고 그리고 베로 세포에서 증식된 폴리오바이러스에 대해 사용된 공지의 방법에 따라 수확하고 정제하고, 공지의 방법에 따라 포르말린으로 불활성화하고, 이어서, 면역원성을 본 분야에 잘 알려진 방법에 따라 표준 래트 면역원성 조사법을 사용하여 시험하였다(예를 들면, Bevilacqua et al, 1996). 이와 같이 생산된 폴리오바이러스는 베로 세포를 사용한 통상의 방법으로 생산된 폴리오바이러스와 비교할 만한 면역원성을 갖는다고 기대된다.

실시예 4: 생물반응기에서 PER .C 6 세포에서의 폴리오바이러스의 생산

세포를 PER.C6 작업 세포 은행으로부터 해동하였고, 37℃ 및 10% CO₂에서 습식 인큐베이터 중에서 무혈청 배지 중에서 증식시켰다. 충분한 세포밀도에 도달할 때까지 매 3~4일마다 2차 배양을 수행하여 0.2~0.4x10⁶ cells/mL의 세포 밀도로 2L 생물반응기를 접종하였다. 세포를 2L 생물반응기에서 37℃, 40% DO 및 pH 7.3에서 증식시켰다. 세포밀도가 대략 2x10⁶ cells/mL에 도달하면 (접종 후 제4일), ATF 시스템을 시작하여 세포가 더 긴 기간 동안 배양되고 높은 세포밀도에 도달하도록 하였다. 대략 11~12일에, 2L 생물반응기에서의 세포 밀도가 50x10⁶ cells/mL에 도달하였다. 이때, 세포 현탁물을 10L 생물반응기로 옮겼다. 2L 생물반응기로부터의 세포 현탁물을 무혈청 배지로 1:5로 희석하였다. 10L 생물반응기에서의 세포 밀도는 10 내지 15x10⁶ cells/mL이다. 이어서, 10L 생물반응기를 폴리오바이러스 원종으로 MOI 2 CCID₅₀/cell로 감염시켰다. 폴리오바이러스의 생산을 35℃, pH 7.3 및 40% DO에서 수행하였다. 10L 생물반응기를 세포 계수와 폴리오바이러스 생산을 위해 특정 시점에서 샘플화하고, 폴리오바이러스를 감염 후 12 내지 48시간 사이에 적절히 수확하였다.

참고문헌

European Collection of Cell Cultures 96022940 19960229

Claims (10)

1. a) 세포의 무혈청 현탁 배양물을 제공하고, 상기 세포는 ECACC no. 96022940로 기탁된 PER.C6 세포인 단계,
   b) 상기 세포를 폴리오바이러스로, 2x10⁶ cells/ml 내지 150x10⁶ cells/ml의 세포밀도로 감염시키는 단계, 그리고
   c) 감염 후 12 내지 48시간 후에 폴리오바이러스를 수확하는 단계를 포함하는 폴리오바이러스의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 감염 및/또는 바이러스 증식은 34℃ 내지 36℃의 온도에서 수행되는 것인 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 감염은 5x10⁶ cells/ml 내지 20x10⁶ cells/ml의 세포 밀도로 수행되는 것인 제조방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염은 약 10x10⁶ cells/ml의 세포밀도로 수행되는 것인 제조방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염은 1 내지 3, 예를 들면 2의 감염다중도 (MOI)로 수행되는 것인 제조방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스의 수확은 감염 후 18 내지 30 시간, 예를 들면, 감염 후 약 24시간에 수행되는 것인 제조방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리오바이러스는 폴리오바이러스 유형 1, 폴리오바이러스 유형 2 또는 폴리오바이러스 유형 3인 것인 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 폴리오바이러스는 폴리오바이러스 유형 1 균주 Mahoney, 폴리오바이러스 유형 2 균주 MEF, 또는 폴리오바이러스 유형 3 균주 Saukett인 것인 제조방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 폴리오바이러스는 사빈 균주와 같은 감독된 폴리오바이러스인 것인 제조방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제조방법을 포함하고, 추가로 수확된 폴리오바이러스를 정제, 임의로 불활성화 및 제제화하여 폴리오바이러스 백신을 얻는 것을 포함하는 폴리오 백신의 제조방법.

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