CN102482647B - 以高效价制备用于疫苗制备的脊髓灰质炎病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制备脊髓灰质炎病毒的方法，包括以下步骤：a)提供细胞的无血清悬浮培养物，所述细胞为PER.C6细胞，b)在2x106细胞/ml至150x106细胞/ml的细胞密度下，用脊髓灰质炎病毒感染所述细胞，和c)在感染后12至48小时收获脊髓灰质炎病毒。

Description

以高效价制备用于疫苗制备的脊髓灰质炎病毒
技术领域
本发明涉及细胞培养和脊髓灰质炎病毒制备的领域。更具体地，本发明涉及用于培养细胞和由此细胞制备用于制备脊髓灰质炎疫苗的脊髓灰质炎病毒的改进方法。
背景技术
脊髓灰质炎病毒为小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员。脊髓灰质炎病毒为小型非包膜病毒，具有封装单链正义RNA基因组的衣壳。脊髓灰质炎病毒有三种类型：1型、2型和3型。脊髓灰质炎病毒引起的易感个体的感染可导致麻痹型脊髓灰质炎。脊髓灰质炎具有高度传染性。现已开发出两种不同的脊髓灰质炎疫苗，即Salk的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)和Sabin的活的减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。两种疫苗均是安全且有效的。每一种疫苗具有其特定的优点和缺点，且两种疫苗均在脊髓灰质炎的控制中起到重要作用。对于脊髓灰质炎病毒和脊髓灰质炎疫苗的综述参见如Kewetal，2005。
口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)便宜且方便，并已被大量使用。然而，临时接受者会因疫苗中的回复体(revertant)而患上疫苗相关麻痹型脊髓灰质炎(VAPP)。而且，已在未完全免疫的人群中观察到减毒的Sabin脊髓灰质炎病毒株已经历足以引起麻痹病发作的突变，这种麻痹病在临床上和流行病学上难以与天然发生的野生型脊髓灰质炎疾病相区别；这些突变体被称为循环的疫苗衍生脊髓灰质炎病毒或cVDPV(参见如Kewetal，2005；WrightandModlin，2008；Yakovenkoetal，2009)。
越来越多的观点认为，将灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)在与现有OPV策略结合使用会有助于更快速消灭野生型脊髓灰质炎病毒并控制突发的cVDPV(WrightandModlin，2008；John，2009)。
然而，IPV的制备更昂贵(参见如John，2009)，且在对脊髓灰质炎疫苗仍有很强需求的欠发达和最不发达国家中更是高的惊人的昂贵。用于制备可用在疫苗中的大量脊髓灰质炎病毒材料，特别是非减毒脊髓灰质炎病毒的培养体系很大程度上导致了相对高的成本。
因此，本领域仍需要高效的培养体系来制备疫苗中用的脊髓灰质炎病毒。
脊髓灰质炎病毒在HEK293细胞中的增殖已被描述为用于研究脊髓灰质炎病毒的神经元特异性复制表型的体系，且描述了减毒型脊髓灰质炎病毒，如在Sabin株的IRES元件中含点突变的脊髓灰质炎病毒，在HEK293细胞中表现出减少的增殖(Campbelletal，2005)。
E1永生化人胚胎视网膜(HER)细胞，特别是PER.C6细胞已被描述为适用于各种病毒，尤其是流感病毒的增殖(Pauetal，2001；WO01/38362)。虽然WO01/38362描述了各种流感病毒株以及1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒和轮状病毒在PER.C6细胞中增殖的实例，但是WO01/38362中未例举脊髓灰质炎病毒的增殖。而且，脊髓灰质炎病毒在此类细胞中复制的条件也未描述，此条件在不相关病毒在这些细胞中复制的基础上是不容易预期的。因此，至今尚不知道是否能够在产业规模上经济地制备脊髓灰质炎病毒以用于在这些细胞中制备疫苗的目的。
为了大规模制备灭活脊髓灰质炎疫苗，脊髓灰质炎病毒通常在源自猴的Vero细胞中增殖。Vero细胞被广泛用于疫苗制备，包括灭活以及活体减毒脊髓灰质炎疫苗，因此至今是被监管机构最广泛接受的用于病毒疫苗制备的连续细胞系，且预期本领域技术人员会更多将这些细胞用于疫苗制备。
Montagnon等在1982和1984年已描述了用于灭活脊髓灰质炎病毒疫苗的Vero细胞的大规模微载体培养。使用Vero细胞大规模制备脊髓灰质炎疫苗的方法和所得疫苗也描述在美国专利4,525,349中。
Merten等在1997年描述了在病毒生产期在无血清培养基中培养前，当将微载体上的Vero细胞在含血清的培养基中培养时，高效价脊髓灰质炎病毒(Sabin1型)制备(几乎2x109TCID50/ml)的条件，但是鉴于使用血清的缺点，这些作者已经表明需要完全无血清的方法，且在此优化的完全无血清的方法中，这些作者能够获得6.3x108TCID50/ml的效价。
Kreeftenbergetal(2006)涉及在产业规模上制备用于疫苗制备的脊髓灰质炎病毒，也提及了脊髓灰质炎病毒的各种野生型和Sabin株在微载体上生长的Vero细胞中的产率，对于不同株此产率类似，效价的对数值在8.1至8.6之间。这些作者也描述了对于制备最终疫苗所需的病毒量而言，IPV显著高于OPV，这导致IPV的单位剂量生产成本显著高于OPV。
Card等在2005年也已描述了使用在微载体上培养的Vero细胞来无血清制备脊髓灰质炎病毒，且虽然产率水平低于静态培养物，但是微载体培养物被描述为更易于按比例扩大。
尽管这些基于微载体的Vero细胞培养物的功效和工业实用性，大量脊髓灰质炎病毒的制备仍成本很高，因此仍需要此缺点更小的用于脊髓灰质炎病毒的替代制备体系。
已经描述了使用悬浮Vero细胞制备脊髓灰质炎病毒，这导致比在常规微载体Vero细胞中观察到的那些病毒效价更低的病毒效价(10logCCID50/ml在6.5至7.9之间)(vanEikenhorstetal，2009)。
本发明的目的是提供一种可用于大规模和经济制备在疫苗中使用的脊髓灰质炎病毒的适合方法。这可有助于在能维持的基础上在发展中国家提供能够花费得起的脊髓灰质炎疫苗。
发明内容
本发明基于脊髓灰质炎病毒在PER.C6细胞中的高效增殖的论证，其中根据本文所述的方法获得了脊髓灰质炎病毒的意想不到的高效价。此高效价的获得比在Vero细胞中制备脊髓灰质炎病毒具有显著的经济优点，其无法基于其他病毒在此类细胞中的复制而预期，而且也无法预测适用于产业上可行方法的条件，这是因为所述条件和可获得的优点对于具有很大不同性质的各种不同类型病毒而言变化很大。
因此，本发明提供了用于制备脊髓灰质炎病毒的方法，包括以下步骤：a)提供细胞的无血清悬浮培养物，所述细胞为以ECACC号96022940保藏的PER.C6细胞，b)在2x106细胞/ml至150x106细胞/ml的细胞密度下用脊髓灰质炎病毒感染所述细胞，和c)在感染后12至48小时收获脊髓灰质炎病毒。
在某些实施方式中，所述感染在约5x106细胞/ml至20x106细胞/ml的细胞密度下进行，例如约8x106细胞/ml至15x106细胞/ml，如约10x106细胞/ml。
在某些实施方式中，所述收获脊髓灰质炎病毒在感染后约18至30小时进行，如在感染后约24小时。
这些条件能够在相对短的方法中获得很高的脊髓灰质炎病毒效价(约1010/ml，其显著地为通常使用用于野生型脊髓灰质炎株的基于微载体的Vero细胞所获得的效价的10倍)，因此比目前用于疫苗制备的脊髓灰质炎病毒的制备方法具有显著的经济优点。这在全部三种类型的脊髓灰质炎病毒(1型(Brunenders株)、2型(MEF株)和3型(Saukett株))中均有证实。
因此，在某些实施方式中，所述脊髓灰质炎病毒为野生型强毒脊髓灰质炎病毒，如1型脊髓灰质炎病毒、2型脊髓灰质炎病毒或3型脊髓灰质炎病毒。在某些实施方式中，所述脊髓灰质炎病毒为1型脊髓灰质炎病毒株Mahoney或Brunenders、2型脊髓灰质炎病毒株MEF(或MEF-1)或3型脊髓灰质炎病毒株Saukett。在其它实施方式中，所述脊髓灰质炎病毒为减毒脊髓灰质炎病毒(更低的神经毒力)，如Sabin株(其也可为1型、2型或3型)。
本发明进一步提供了制备脊髓灰质炎疫苗的方法，包括根据本发明制备脊髓灰质炎病毒的方法，进一步包括纯化、任选地灭活、和配制收获的脊髓灰质炎病毒以获得脊髓灰质炎疫苗。对于IPV，灭活通过福尔马林或其它方法进行。对于OPV，不需要灭活的步骤。
在本文中也公开以提供用于制备脊髓灰质炎疫苗的脊髓灰质炎病毒批量制备物(bulk)，所述脊髓灰质炎病毒批量制备物可通过根据本发明的制备脊髓灰质炎病毒的方法获得且包括培养基和至少109.4CCID50/ml的脊髓灰质炎病毒效价，如约109.5至1011CCID50/ml，如约109.8至1010.8CCID50/ml。在某些实施方式中，所述批量制备物具有1至1000升的体积。在其它实施方式中，所述批量制备物包含根据本发明方法所用的细胞和/或细胞碎片。在某些实施方式中，所述批量制备物存在于生物反应器中。在其它实施方式中，所述批量制备物已从所述生物反应器中移出并存在于适合的容器中。
还公开了可根据本发明的方法获得的脊髓灰质炎病毒和脊髓灰质炎疫苗。所述脊髓灰质炎病毒和/或疫苗不含猴的蛋白，优选不含非人的蛋白。其将也不含其它非人的宿主细胞残留物。相反，已根据常规方法制备的脊髓灰质炎病毒将包含来自细胞培养期间所用的宿主细胞和/或来自细胞培养期间所用的血清的残留的非人的蛋白和/或其它非人的残留物。因此，与使用常规方法制备的脊髓灰质炎病毒相比，根据本发明制备的脊髓灰质炎病毒受到因制备方法导致的非人的杂质的污染更小。
本发明还提供了用于在细胞培养物中获得效价为至少约109.4、优选至少109.8、更优选至少1010，如1010.5至1011CCID50/ml的脊髓灰质炎病毒制备物的方法，包括以下步骤：a)提供细胞的无血清悬浮培养物，所述细胞为PER.C6细胞，b)在2x106细胞/ml至150x106细胞/ml的细胞密度下，用脊髓灰质炎病毒感染所述细胞，和c)在感染后12至48小时收获脊髓灰质炎病毒，以获得具有所述浓度的脊髓灰质炎病毒制备物。根据本发明，优选实施方式与上述用于制备脊髓灰质炎病毒的方法相同。
附图说明
图1：在粘附PER.C6和Vero细胞中制备脊髓灰质炎病毒。
图2：在感染时，在不同MOI和不同细胞密度下，在不同无血清培养基的悬浮PER.C6细胞中制备1型脊髓灰质炎病毒。
图3：温度和收获时间对在无血清培养基的悬浮PER.C6细胞中制备1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒的影响。
图4：感染时细胞密度、温度和收获时间对在无血清培养基的悬浮PER.C6细胞中制备1型脊髓灰质炎病毒的影响。
图5：在高细胞密度的无血清悬浮PER.C6细胞中高效制备1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒。
具体实施方式
本发明方法所用的细胞为PER.C6细胞，此细胞为永生化细胞，在本领域也称为连续细胞系，因此具有无限寿命的潜能(参见如Barrettetal，2009)。用于本申请目的的PER.C6细胞是指在1996年2月29日以ECACC号96022940保藏的细胞。本领域技术人员明白此定义将包括来自这些保藏细胞的上游或下游传代，或上游或下游传代的子代的细胞。PER.C6细胞描述在美国专利5,994,128和Fallauxetal，1998中。这些细胞非常适用于流感病毒制备以制备基于细胞的流感疫苗，这是因为它们可被感染并以高效率增殖病毒，如Pauetal，2001和WO01/38362所述。PER.C6细胞能够在无血清下悬浮生长，如Yallopetal，2005所述。本文表明这些细胞也非常适合在无血清悬浮培养中以高水平制备脊髓灰质炎病毒。
而且，所用的条件在经济上和监管上是有利的。
与广泛使用的通过Vero细胞的方法相反，本发明无需使用微载体。微载体导致使用基于常规Vero细胞的方法制备的脊髓灰质炎病毒成本很高。
根据本发明的“无血清”是指用于细胞生长和感染的培养基缺少全血清作为组分。培养基可并非完全不含血清衍生的制品如牛血清白蛋白(BSA)，然而在优选实施方式中，此类组分也不存在，或已在无任何动物源组分下重组制备。在优选实施方式中，完整的方法在无直接源自动物的任何组分(如血清或血清成分等)下进行。在优选实施方式中，制备疫苗的方法在无动物组分的条件下进行。这是指用于细胞生长和感染的培养基全无任何动物源成分。而且，在疫苗制备过程期间补加到培养基中的任何添加剂也不含动物源组分。在制备所述脊髓灰质炎疫苗的方法中无动物组分提供了可控性更强且更安全的方法。因此，作为完全表征的人细胞且遵循GLP/GMP开发出的PER.C6细胞非常适用于疫苗制备。可使用不同的培养基，且选择用于细胞的最佳培养基和所用条件是本领域技术人员日常工作的一部分。因此，用于本发明目的的适合培养基是本领域技术人员公知的，且可通常从商业渠道大量获得，或根据标准方法由常规制备获得。培养可使用分批、补料分批、连续体系等在培养皿、转瓶或生物反应器中完成。为了通过细胞培养实现病毒的大规模(连续的)制备，本领域优选能够在悬浮液中生长的细胞，且优选能够在无动物或人源血清，或动物或人源血清组分下培养的细胞。适合培养细胞的条件是已知的(参见如TissueCulture，AcademicPress，KruseandPaterson，editors(1973)，和R.I.Freshney，Cultureofanimalcells：Amanualofbasictechnique，fourthedition(Wiley-LissInc.，2000，ISBN0-471-34889-9)。可根据本发明方法使用的无血清培养基包括但不限于可订购自培养基提供商目录的标准培养基，包括CDM4PERMAbTM(ThermoScientificHyClone，目录号SH30871，SH30872)。而且，定制的培养基如Permexcis(Lonza)是适合的。其它可适用于本发明方法的无血清培养基的实例为AEM(Invitrogen，目录号12582-011)、EX-CELLTMVPRO培养基(JRHBiosciences，目录号14561)和CDM4RetinoTM(HyClone，目录号SH30520，SH30519)。
在某些可选和非限定性实施方式中，在本发明的方法中可向无血清培养基中补加脂质和/或水解物和/或其他补加物，以进一步改进产率。
本公开中数值所用的术语“约”(“about”或“around”)是指此值±10％。
在根据本发明的方法中使用脊髓灰质炎病毒感染细胞和/或病毒增殖适合如在约33℃至38℃的温度下进行。在优选实施方式中，所述感染和/或病毒增殖在约34℃至36℃的温度下进行，在某些实施方式中，在约34.5℃至35.5℃下，如在约35℃下进行。
在根据本发明的方法中，用脊髓灰质炎病毒感染细胞可以如0.001至10的感染复数(MOI)适当地进行。在某些实施方式中，所述感染以约1至3的MOI进行，如以约2的MOI进行。在此相对高MOI(＞0.1，优选约1或更高)下感染可进一步增强此高效率、高产率的方法。
根据本发明，优选在高细胞密度下，用脊髓灰质炎病毒感染细胞。在某些方面，当细胞具有约1x106细胞/ml至150x106细胞/ml，优选2x106细胞/ml至150x106细胞/ml的密度时，脊髓灰质炎病毒的感染发生。在某些优选实施方式中，所述感染在约5x106细胞/ml至20x106细胞/ml，例如约8x106细胞/ml至15x106细胞/ml，如约10x106细胞/ml的细胞密度下进行。据我们所知，本发明的方法提供了非腺病毒疫苗制备的最高的细胞浓度。根据本发明的这些方法的优点为可获得极高效价，即至少比现有技术的常规Vero方法高一个数量级的脊髓灰质炎病毒。
在根据本发明的方法中，脊髓灰质炎病毒在感染后12至48小时收获。在某些实施方式中，所述收获脊髓灰质炎病毒在感染后约18至30小时进行，如在感染后约20至28小时，约22至26小时，如在感染后约24小时。因此，可使用根据本发明的方法来极快地获得高效价的脊髓灰质炎病毒，这也有助于使得本发明的方法比常规现有技术的更长时间方法在经济上更具有吸引力。
大多数大规模悬浮培养以分批或补料分批方法运行，这是因为这些方法是最直接地运行和按比例扩大，且此类方法原理上适用于本发明的方法。然而，基于灌注原理的连续方法正在变得更为普遍。在本发明的某些实施方式中，生产者细胞(producercell)在灌注体系中培养。
分批、补料分批、灌注和灌注制备方法已与PER.C6细胞一起使用，如用于重组抗体制备。在分批培养中，通常实现存活细胞的浓度大于12x106细胞/ml。已使用补料分批多次证实存活细胞浓度至高为40x106细胞/ml。在灌注方法中，常规地实现大于150x106细胞/ml的峰值细胞浓度(Kraletal，2009)。
细胞的灌注培养在本领域具有其常规含义，即其是指在培养期间，细胞通过分离装置被保留，在分离装置中，存在具有比分离前更低细胞密度的液体流出，和细胞培养基流入。使用灌注培养以应对在高密度(如10-50x106存活细胞/mL)下生长细胞的挑战。为了增加密度，将培养基不断地或间歇地用新鲜补充物替换，以弥补营养缺陷并去除毒性产物。灌注也使得能更好控制培养环境(pH、dO2、营养水平等)。使新鲜培养基灌注通过培养物可通过使用各种分离装置(如细网格旋转过滤器、中空纤维或平板膜过滤器、沉降管)保留细胞来实现。在某些实施方式中，分离装置是包括中空纤维即管状膜的过滤器模块。管的内径通常为0.3至6.0mm，如0.5至2.0mm。在某些实施方式中，选择膜中的网格大小(孔大小)，使得网格中的孔大小接近细胞的直径，在确保细胞高保留的同时使细胞碎片可通过过滤器。在其它实施方式中，网格大小显著小于细胞的直径。优选地，网格大小为约0.1-30μm，如0.1至3μm，如约0.2μm。包括中空纤维的过滤器模块可从如GeneralElectric(formerlyAmersham)商购。
使用灌注以将某些代谢物保持在所希望的水平并去除及由此降低培养基中的杂质。通常的情况是，灌注并非在培养期间的全部时间进行，而通常是根据需要仅在培养期间分段进行。例如，灌注通常在某些培养基成分如葡萄糖开始耗尽且需要替换之后才开始。
一些灌注体系是本领域已知的且原理上适用于本发明的方法。术语“灌注体系”是指与分离装置连接的生物反应器的组合。分离装置或者可装入生物反应器中(如细网格旋转过滤器)，或者保留在生物反应器之外(如中空纤维)。在两种情况中，如上所述，分离装置防止细胞团块被从反应器中洗出且使得培养基更新。在某些实施方式中，生物反应器通过交替切向流(ATF)灌注体系(如ATFSystem，RefineTechnology，Co.，EastHanover，NJ)来运行(连接至交替切向流(ATF)灌注体系)。切向流可根据本领域技术人员已知的方法实现，且其描述在如US6,544,424中。ATF灌注体系的运行已有描述且是可升级的(Furey，2002)。ATF体系允许细胞被培养更长的时间，并实现高细胞密度而不阻塞过滤器。确实，大于100x106存活细胞/mL的极高细胞密度可通过使用ATF灌注体系，如使用PER.C6细胞获得(参见如Yallopetal，2005andWO2005/095578)。然而，在那些更早期的报道中，PER.C6细胞在灌注体系中被用于抗体的重组制备，即完全不同的目的，且不用脊髓灰质炎病毒感染。
在某些实施方式中，使用如ATF体系的灌注在预培养阶段(即在用脊髓灰质炎病毒感染前)是有利的，这是因为其允许获得极高细胞密度，且细胞处于良好状态以适于随后脊髓灰质炎病毒的感染。为了达到所得高细胞密度，在一些实施方式中，在细胞生长的部分时间内，至少部分灌注培养基。在一些实施方式中，当细胞密度达到约2x106存活细胞/mL至8x106存活细胞/mL时，开始灌注。
在本发明的方法中，用脊髓灰质炎病毒感染细胞。通常，在允许吸收病毒的最佳条件下，将病毒暴露于合适的生产者细胞。本领域技术人员知道如何获得其它最佳条件，即对于搅拌、pH、溶解氧(dO2或DO)的最佳条件。通常，最佳搅拌为约50至300rpm，通常约100-200，如约150；通常的DO为5-60％；最佳pH为6.7至7.7。通常，脊髓灰质炎病毒自发地感染本发明的细胞，且使细胞开始接触脊髓灰质炎病毒颗粒足以导致细胞感染。通常，将脊髓灰质炎病毒种子储备液(seedstock)加入至培养物中以启动感染，随后脊髓灰质炎病毒在细胞中增殖。
根据本发明，在高细胞密度，即约10x106细胞/mL下用脊髓灰质炎病毒感染细胞培养物是有利的，并获得很高的脊髓灰质炎病毒效价(大于1010CCID50/ml)。
在某些实施方式中，感染前细胞培养物的存活力保持大于75％，这表示培养物中细胞总量的至少75％在感染时是存活的。在某些实施方式中，感染时细胞培养物的存活力至少为80％，在其它实施方式中为至少85％。存活力可使用本领域技术人员可利用的常规方法，如台盼蓝拒染、Casy细胞计数等来测定。
在某些实施方式中，感染时细胞密度为约10x106至50x106存活细胞/mL，如约10x106至20x106存活细胞/mL，如约10x106至15x106存活细胞/mL。这些细胞密度允许高病毒产率以及细胞屑和宿主细胞DNA的有限积累，这使得脊髓灰质炎病毒收获的下游加工受益于这些实施方式的优点。因此，本发明提供了用于制备脊髓灰质炎病毒、产生高效价的脊髓灰质炎病毒、同时提供仍可处理以用于下游加工目的收获材料的最佳方法。
在其它实施方式中，感染时细胞密度为约15x106至150x106细胞/mL，如约15x106至80x106细胞/mL，如约20x106至50x106细胞/mL。在这些细胞密度下感染甚至可产生更高的病毒浓度。
在本发明的某些实施方式中，提供用于制备至少1010CCID50/ml效价的脊髓灰质炎病毒批量制备物的方法。
效价以CCID50，即50％的细胞培养物感染剂量来表示。其有时也称为TCID50(50％的组织培养物感染剂量)，但因为其通过细胞培养物确定，所述本文使用术语CCID50。
将病毒接触细胞放置，以使得此病毒感染所述细胞并增殖。例如，将一批病毒种子加入至细胞培养物中并使其吸附在细胞上，持续如约30分钟并轻微搅拌(如约30rpm)，随后可加入另外的培养基，并根据需要调节pH，可调节搅拌速度并保持培养。在感染步骤后，发生大量病毒颗粒的扩增。当然，此步骤也优选在无血清下悬浮培养的PER.C6细胞中进行，且更优选在完全不含直接源自动物的组分的条件下进行。此步骤可适合于在如1至20,000升、如10至2000升、如50至1000升规模的生物反应器中进行，此规模可很容易根据对疫苗的需要来调节。在某些实施方式中，生物反应器为一次性生物反应器(SUB)。
在脊髓灰质炎病毒在细胞中增殖后，从细胞培养物中收获病毒或其组分。这可通过本领域技术人员同样已知的常规方法来完成。在细胞培养基中产生和释放的病毒可通过常规方法如离心或超滤从细胞的生物量中分离，并在上清液中收获。在此情况中，离心或过滤为收获步骤。可使用常规方法来收获病毒，如US4,525,349中所述的那些方法。简而言之，通常将含病毒的液体培养基悬液移出、过滤并通过如超滤来浓缩。例如，在培养结束时，通过收集含病毒悬液的培养基来进行收获。收获物可使用如0.22μm过滤器来过滤并任选地储存在4℃。
任选地可将过滤的收获物超滤以浓缩病毒悬液，随后脊髓灰质炎病毒可使用如凝胶过滤和/或离子交换层析，如按照US4,525,349或VanWezeletal，1978中所述的方法来纯化。任选地地可将所得的浓缩病毒悬液稀释，且为了制备IPV，可使用常规方法将本文的脊髓灰质炎病毒灭活。
用于收获和纯化脊髓灰质炎病毒或病毒组分的方法以及由此的疫苗制备在本领域中已使用数十年，因此是公知的且已详细描述在如VanWezeletal，1978；Montagnonetal，1984；WO2007/007344；US4,525,349中，它们全部通过引用并入本文。
脊髓灰质炎疫苗基于活病毒或灭活病毒。它们包含作为重要保护性抗原的脊髓灰质炎病毒D抗原。病毒产率可通过标准病毒滴定技术来测定，而D抗原浓度的测定也通过本领域技术人员熟知的常规技术如D抗原ELISA分析进行。免疫原性可通过如动物体内测试测定。效价(Potency)可使用D抗原ELISA和在来自预先免疫大鼠血清上的脊髓灰质炎病毒中和细胞培养物分析测定。
通常，将每种脊髓灰质炎病毒株用单独的方法培养，且如果例如制备含三种类型脊髓灰质炎病毒的三价疫苗，则将(IPV用的灭活的)病毒混合并配制单独剂量的制剂。在某些实施方式中，例如，每剂量(如0.5ml)的最终疫苗可包含如40D抗原单位(DU)的1型脊髓灰质炎病毒、8DU的2型脊髓灰质炎病毒和32DU的3型脊髓灰质炎病毒，这通过与参比制剂的比较来确定。
脊髓灰质炎病毒的灭活可根据本领域已知的方法，如通过福尔马林或β-丙内酯(BPL)完成(参见如Jiangetal，1986)。在某些实施方式中，灭活通过福尔马林，如通过以下方法进行：将纯化的病毒悬液通过0.22μm膜过滤，稳定的磁搅拌下加热至37℃，持续24小时，随后加入福尔马林溶液以达到1/4,000的浓度。在将病毒悬液保持在37℃的同时，在最初4天继续磁搅拌。在第6天，将病毒悬液通过0.22μm膜过滤，在37℃悬浮下继续灭活，直至第12天。将灭活的病毒悬液均质化且可储存在如4℃下。在此步骤后，浓缩的和/或用于施用的最终批料可通过如混合所需制剂来制备。
在一些实施方式中，将纯化的脊髓灰质炎病毒或病毒组分配制为药物组合物。这可根据各种方法和根据本领域技术人员熟知的全部常规方法使用各种缓冲剂完成。通常，这需要将脊髓灰质炎病毒颗粒置于包括脊髓灰质炎病毒和至少一种药学上可接受的赋形剂的药学上可接受的组合物中。此类组合物可在本领域技术人员熟知的条件下制备，且在一些实施方式中，此类组合物适用于向人类施用。在某些实施方式中，组合物可包括缓冲的培养基，所述缓冲的培养基任选地为用作某些注册的常规灭活脊髓灰质炎病毒疫苗的配制缓冲剂的MediumM-199。此外，可使用磷酸盐缓冲盐水，且最终制剂可包括如每剂量为0.5％的2-苯氧基乙醇和最高0.02％的甲醛作为抗微生物防腐剂。
药学上可接受的载体或赋形剂和稀释剂是本领域熟知的且广泛地用在大量治疗产品中。优选地，应用在疫苗中适用的载体。在某些实施方式中，疫苗进一步包括佐剂，如明矾。本领域已知佐剂可进一步增加对所用抗原决定簇的免疫应答。
为了向人类施用，本发明可应用包括脊髓灰质炎病毒和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在本文中，术语“药学上可接受的”是指载体或赋形剂的所用剂量和浓度将不会在所施用的对象中引起任何不希望的或有害的后果。此类药学上可接受的载体和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington′sPharmaceuticalSciences，18thedition，A.R.Gennaro，Ed.，MackPublishingCompany[1990]；PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins，S.FrokjaerandL.Hovgaard，Eds.，Taylor&Francis[2000]；和HandbookofPharmaceuticalExcipients，3rdedition，A.Kibbe，Ed.，PharmaceuticalPress[2000])。优选将纯化的灭活脊髓灰质炎病毒或其免疫原性部分作为无菌溶液配制和施用。无菌溶液通过无菌过滤或本领域已知的其它方法来制备。溶液随后被冻干或填充入药物剂量容器。溶液的pH通常为pH3.0至9.5，如pH5.0至7.5。脊髓灰质炎病毒或其免疫原性部分通常在具有适合药学上可接受的缓冲剂的溶液中，且脊髓灰质炎病毒的溶液也可包括盐。任选地，可存在稳定剂，如白蛋白。在某些实施方式中，加入去污剂。在某些实施方式中，可将疫苗配制为可注射的制剂。这些制剂包含有效量的脊髓灰质炎病毒或其免疫原性部分，为无菌液体溶液、液体悬液或冻干形式，且任选地包括稳定剂或赋形剂。
脊髓灰质炎疫苗可为单价(包含一种类型的脊髓灰质炎病毒，如1型、2型或3型)，或二价(包含两种类型的脊髓灰质炎病毒，如1型和2型、1型和3型、或2型和3型)，或三价(包含三种类型的脊髓灰质炎病毒，即1型、2型和3型)。
可从野生型脊髓灰质炎病毒制备IPV。或者，IPV可从无毒力活脊髓灰质炎病毒如从Sabin株制备，这将进一步降低由IPV制备而再次引入野生型脊髓灰质炎病毒的风险(参见如WO2007/007344和Doietal，2001)。本发明适用于制备野生型脊髓灰质炎病毒(1型、2型和3型，如1型株Mahoney、2型株MEF或3型株Saukett)以及无毒力型脊髓灰质炎病毒(如Sabin株)。因此，本发明可用于制备IPV以及OPV用的脊髓灰质炎病毒。用于制备IPV的本发明的方法可将成本降低至欠发达和最不发达国家能使用IPV的程度。虽然当根据常规方法制备时OPV通常比IPV便宜，但是本发明的高效方法仍可降低OPV所用大量材料的成本，因此也降低OPV的成本。
脊髓灰质炎疫苗的施用可根据本领域公知的方法，通过如经肌肉、经皮下或经口服来进行。
根据本发明可获得的脊髓灰质炎病毒疫苗可用作独立的疫苗，但是在其它实施方式中，其可以诸如针对白喉、百日咳、破伤风和脊髓灰质炎的组合疫苗的形式与其它疫苗组合，且其任选地进一步包括诸如抗乙型肝炎和/或流感嗜血杆菌等的疫苗组分。因此，脊髓灰质炎病毒适用于扩大免疫计划(EPI)，且可与此计划中的疫苗组合。与常规脊髓灰质炎病毒疫苗类似，根据本发明的疫苗可按单次剂量施用，或优选地以初免-加强方案施用，在此初免-加强方案中多个疫苗剂量以适合的时间间隔施用，例如以1-2个月时间间隔注射2次，在6-12个月后加强剂量；或例如，初始口服剂量，在约8周后第二剂量，且在第二剂量后8-12个月第三剂量；或例如，对于婴儿，在6-12周龄时第一口服剂量，在第一剂量后约8周时第二剂量，且在约6-18月龄时第三剂量；或例如，对于之前免疫过的人，在增加风险时仅单次剂量；等。最佳剂量方案可根据标准医学实践来确定，且通常将遵循与可用的脊髓灰质炎病毒疫苗所用相同的那些策略。
本发明在以下实施例中进一步说明。实施例不以任何方式限制本发明。实施例仅用于阐明本发明。
实施例
实施例1：在粘附PER.C6细胞上高效制备脊髓灰质炎病毒
为了测试脊髓灰质炎病毒在粘附PER.C6细胞上的增殖和产生病毒储备液，从SBL(Sweden)获得1型(Brunenders)、2型(MEF-1)和3型(Sauckett)脊髓灰质炎病毒。每种均在Vero细胞上产生的这些储备液的效价为约106CCID50/ml。PER.C6细胞(Fallauxetal，1998)生长在培养基中(含10％FBS和10mMMgCl2的DMEM)。向三个T175烧瓶中接种在25ml培养基中为30x106PER.C6细胞/烧瓶的每种类型脊髓灰质炎病毒，并在第二天在37℃和10％CO2的增湿培养箱中以0.1(0.1CCID50/细胞)的感染复数(MOI)接种。三天后，收获细胞和培养基，并通过两轮冻/融循环制备粗裂解物。在离心去除细胞碎片后，将上清液分为等分试样并储存在-80℃下。平行地，对于每种脊髓灰质炎病毒株，向一个T175烧瓶中在25mlVero细胞培养基(添加有4mML-谷氨酰胺的OptiproSFM培养基)中接种6.25x106Vero细胞并以相同的MOI感染。Vero培养物也在3天后收获，冻/融两次并等分以用于储存。
脊髓灰质炎病毒的产量通过使用Vero细胞的CCID50测定来定量。为此，将1.25x104Vero细胞接种在具有100μl培养基的96孔板的每个孔中并在37℃和5％CO2下孵育。第二天，在Vero细胞培养基中制备脊髓灰质炎病毒样品的15个5倍稀释液系列，且将100μl的5至15号稀释液按8个复孔加入至96孔板的1至11列中。12列用作未感染的对照列。7天后，分析孔中出现的致细胞病变(CPE)，并使用方法计算效价：
终点效价(log10)＝Xo-d/2+d/n*∑Xi
其中Xo为最大稀释(在该稀释下全部接种物仍为正值)的log10值，d为所用稀释因子的log10值，n为每个稀释下的重复数，且∑Xi为全部孔的总和，全部孔的总和为正值，包括稀释Xo。
滴定实验的结果描述在图1中，且显示对于1型脊髓灰质炎病毒，粘附PER.C6细胞上效价是Vero细胞的＞5倍，对于2型和3型脊髓灰质炎病毒，粘附PER.C6细胞上效价是Vero细胞的＞10倍。因为接种了更多的PER.C6细胞，所以预期每个细胞的病毒颗粒的产量差异更小。对于PER.C6和Vero，估计细胞单层的汇合率均为～80％。
我们从这些实验推断在PER.C6细胞的粘附单层上制备脊髓灰质炎病毒至少和在Vero细胞上一样好。
实施例2：在悬浮PER.C6细胞中高效制备脊髓灰质炎病毒
为了研究脊髓灰质炎病毒在悬浮PER.C6细胞中的增殖，进行小规模实验以测试不同的培养基、感染复数(MOI)和收获时间(TOH)。为此，PER.C6细胞在三种不同的培养基中培养：AEM(Invitrogen)、BMIVg(从Lonza以PermexcisTM商购)和CDM4PERMAb(Hyclone)。在感染时，将在一种类型培养基中培养的细胞计数，并在以不同的细胞密度(1.5、2.5、3.5或5×106细胞/ml)再接种在相同类型的培养基中，并在37℃下在摇床上的增湿培养箱中以不同MOI(0.01、0.05或0.1CCID50/细胞)感染。摇床(IKAKS260)具有10mm轨道直径，且以100rpm用于装有15-20ml培养基的125或250ml摇瓶。对于AEM培养基，因为AEM不支持更高的细胞密度，所以细胞以1.5或2.5×106细胞/ml接种。以此方式制备多种培养物，所述培养物在感染后2、3或4天收获。全部样品冻/融两次并保持在-20℃下或更低，直到进一步分析。
图2描述了2天和4天样品的滴定结果(3天的数据未示出)。虽然BMIVg培养基比PERMAb和AEM培养基提供略低的效价，但是在全部三种培养基中生长和感染的PER.C6细胞能够产生高效价的1型脊髓灰质炎病毒。而且，更长时间的孵育不导致更高的效价。相反，在多数情况下，2天收获比3天和4天收获提供更高的效价。在此实验中无法看出MOI变化的一致效果。重要地，在感染时使用更高的细胞密度导致更高的体积效价，这显示出使用高细胞密度的悬浮培养方法有利于产生感染性脊髓灰质炎病毒。
在接下来的实验中，比较全部三种脊髓灰质炎病毒株在感染期间的收获时间和温度。为此，将PER.C6细胞在15ml体积摇瓶中以2.5x106细胞/ml接种在AEM培养基中，并在37℃和35℃下用各种脊髓灰质炎病毒株以0.1MOI感染。如上所述，细胞和培养基在感染后2、3和4天收获并处理。在不同条件下病毒产生的分析通过上述的CCID50值测定来完成，且对于全部三种类型的脊髓灰质炎病毒显示出在35℃下比在37℃下产率增加(图3)。此外，在多数情况下，当在2天取得收获物时，测量出最高效价，这已得到确认并也适用于脊髓灰质炎病毒2型和3型。
实施例3：脊髓灰质炎病毒在悬浮PER.C6细胞上的产率在更高细胞密度下增加
为了研究是否细胞密度的进一步增加导致病毒效价的增加，比较2.5x106细胞/ml和10x106细胞/ml下的产量。至此，将PERMAb培养基中的PER.C6细胞以所述细胞密度接种在15ml体积摇瓶中，并一式三份用2CCID50/细胞的1型脊髓灰质炎病毒感染。在24和48小时后，收获细胞和培养基，并通过上述冻/融和离心制备澄清的裂解物。除了之前35℃和37℃的测试温度外，实验也在33℃下进行。
通过CCID50测定的效价分析(图4)确认，与2.5x106细胞/ml相比，当细胞以10x106细胞/ml的密度感染时，产率提高。最佳效价在35℃下获得，这与细胞密度或收获天数无关。而且，对于脊髓灰质炎病毒在PER.C6细胞上有效增殖的预示，显示收获物也可在24小时后取出，这是因为在24小时或48小时样品中的产率很相近。
在接下来的实验中，对于其它类型的脊髓灰质炎病毒也测试这些条件。PER.C6细胞以10x106细胞/ml接种在PERMAb培养基中，并一式三份在35℃下在摇瓶中用脊髓灰质炎病毒的不同储备液以2CCID50/细胞感染。如上所述，在24和48小时后进行收获，且将细胞和培养基处理为澄清的裂解物。通过CCID50测定的滴定显示出使用高细胞密度也导致对于2型和3型病毒的高产率(图5)。
这清楚地显示悬浮的PER.C6细胞的高密度培养物为制备野生型脊髓灰质炎病毒提供了优异的平台。因为PER.C6细胞的细胞密度和培养物的大小/体积可使用生物反应器系统、波浪袋(wavebag)或其它类型的培养用更高规格系统来增加，所以与目前使用Vero细胞培养物的微载体系统相比，脊髓灰质炎病毒的产量可显著提高。
制备的脊髓灰质炎病毒根据本领域已知的以及用于在Vero细胞上增殖的脊髓灰质炎病毒的方法收获和纯化，并根据已知方法用福尔马林灭活，且随后根据本领域熟知的方法，使用标准大鼠免疫原性试验来测试免疫原性(如Bevilacquaetal，1996)。预期由此制备的脊髓灰质炎病毒具有可匹配通过使用Vero细胞的常规方法制备的脊髓灰质炎病毒的免疫原性。
实施例4：在生物反应器中在PER.C6细胞中制备脊髓灰质炎病毒
细胞从PER.C6工作细胞库中融化，并在37℃和10％CO2的增湿培养箱中在无血清培养基中增殖。每3至4天进行继代培养，直至达到能够以0.2-0.4x106cells/mL的细胞密度接种2L生物反应器的细胞密度。细胞在37℃、40％DO和pH7.3的2L生物反应器中增殖。当达到约2x106细胞/mL的细胞密度时(接种后4天)，启动ATF系统，以使细胞培养一段更长的时间并达到高细胞密度。在约11至12天后，2L生物反应器中的细胞密度达到大于50x106细胞/mL。此时，将细胞悬液转移至10L生物反应器。将来自2L生物反应器的细胞悬液用无血清培养基以1∶5稀释。10L生物反应器中的细胞密度为10至15x106细胞/mL。随后，将10L生物反应器用脊髓灰质炎病毒种子储备液以2CCID50/细胞的MOI感染。脊髓灰质炎病毒的制备在35℃、pH7.3和40％DO下进行。在特定时间点从10L生物反应器取样以用于细胞计数和脊髓灰质炎病毒制备，且脊髓灰质炎病毒的收获适于在感染后12至48小时进行。
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Claims (13)

1.一种制备脊髓灰质炎病毒的方法，包括以下步骤：
a)提供细胞的无血清悬浮培养物，所述细胞为以ECACC号96022940保藏的PER.C6细胞，
b)在2x106细胞/ml至50x106细胞/ml的细胞密度下，用脊髓灰质炎病毒以0.1至3CCID50/细胞的感染复数感染所述细胞，和
c)在感染后12至48小时收获脊髓灰质炎病毒。
2.权利要求1的方法，其中所述感染和/或病毒增殖在34℃至36℃的温度下进行。
3.前述任一项权利要求的方法，其中所述感染在5x106细胞/ml至20x106细胞/ml的细胞密度下进行。
4.权利要求3的方法，其中所述感染在约10x106细胞/ml的细胞密度下进行。
5.权利要求1的方法，其中所述感染以1至3CCID50/细胞的感染复数进行。
6.权利要求5的方法，其中所述感染以约2CCID50/细胞的感染复数进行。
7.权利要求1的方法，其中所述收获脊髓灰质炎病毒在感染后18至30小时进行。
8.权利要求7的方法，其中所述收获脊髓灰质炎病毒在感染后约24小时进行。
9.权利要求1的方法，其中所述脊髓灰质炎病毒为1型脊髓灰质炎病毒、2型脊髓灰质炎病毒或3型脊髓灰质炎病毒。
10.权利要求9的方法，其中所述脊髓灰质炎病毒为1型脊髓灰质炎病毒株Mahoney、2型脊髓灰质炎病毒株MEF或3型脊髓灰质炎病毒株Saukett。
11.权利要求9的方法，其中所述脊髓灰质炎病毒为减毒脊髓灰质炎病毒。
12.权利要求11的方法，其中所述脊髓灰质炎病毒为Sabin株。
13.一种制备脊髓灰质炎疫苗的方法，包括前述任一项权利要求的方法，进一步包括纯化、任选地灭活、配制所述收获的脊髓灰质炎病毒以获得脊髓灰质炎疫苗。
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