CN105408469A - 禽类胚胎细胞的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由禽胚制备细胞的组合物和方法。本发明还涉及这些细胞的培养物及其用途，尤其是用于生产病毒例如MDV的用途。本发明还涉及使用这些细胞或病毒制备疫苗的方法。

Description

禽类胚胎细胞的制备
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年3月5日提交的美国申请编号13/785513的权益。
本发明涉及由禽胚制备细胞的组合物和方法。本发明还涉及这些细胞的培养物及其用途，尤其是用于生产病毒如MDV的用途。本发明还涉及使用这些细胞或病毒制备疫苗的方法。
背景技术
受精的禽蛋，如鸡蛋，是生产人类和兽用疫苗的主要基质之一。使用它们的原因是它们能够支持包括复制缺陷型病毒的多种多样的人和动物病毒的复制。在禽类胚胎细胞中生产的疫苗的实例包括例如MDV疫苗、禽呼肠孤病毒疫苗和传染性法氏囊病病毒疫苗。
在禽类胚胎细胞中生产疫苗需要由无特定病原体的(SPF)禽群持续可靠地提供受精卵。SPF禽群被饲养于特殊环境下并且定期被证明为无禽类病原体(D.H.Thornton，“马立克氏病：科学依据和控制方法：疫苗的质量控制和标准化(Marek′sDiseases：ScientificBasisandMethodsofControl：qualitycontrolandstandardizationofvaccines.)”(L.N.Payne，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，波士顿，MA，第267-292页(1985))。从蛋中获得胚胎，将其断头，然后进行处理(通常通过机械和/或酶处理)从而生产初生胚胎细胞，通常是胚胎成纤维细胞。通常，将胚胎与头分离并收集在烧杯中。然后将仅有身体的胚胎转移至胰蛋白酶培养瓶，其中在冷胰蛋白酶(比室温冷)中所述胚胎被胰蛋白酶化(trypsinized)3次，每次10分钟。将包含分离的细胞的消化缓冲液倾倒通过筛网(1mm目径)至含血清的酸瓶中。通过离心浓缩收集的CEF，并且将其冷冻直至使用。
然后可以培养这些细胞并将其用于生产病毒。
例如，目前的马立克氏病疫苗是感染的鸡胚细胞(CEF)的悬液，或由感染有马立克氏病病毒疫苗株的超声粉碎的CEF制得的无细胞病毒悬液(A.E.Churchill，“马立克氏病：科学依据和控制方法：疫苗的生产(Marek′sDiseases：ScientificBasisandMethodsofControl：Productionofvaccines)”(L.N.Payne，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，波士顿，MA，第251-266页(1985))。
与所有初生动物细胞一样，禽胚成纤维细胞会经历衰老，倍增时间逐代增加直至细胞最终死亡。初生禽胚细胞如鸡胚细胞(CEF)的有限寿命为大约两到三周。因此，为了维持疫苗生产，必须每隔一或两周制备这些细胞，这增加了生产疫苗的成本。
为了克服对初生细胞的需要及对受精卵的使用，已经尝试开发永生化的禽类细胞系(参见例如K.Nazerian，AvianPathol.16：527-544(1987))。然而，这些细胞系来自病毒转化的细胞，或在接种到鸡中时产生肿瘤，或产生不足以商业生产的病毒滴度。因此，在疫苗生产中这些细胞系不能替代初生禽胚成纤维细胞。
本发明提供了一种改进适合于疫苗生产的禽类胚胎细胞生产的可选方法。本发明公开了一种用于从完整胚胎生产适合疫苗接种的初生禽类细胞的改进方法。该方法提高了产生的细胞的数量且因此降低了疫苗生产的成本。
发明内容
本发明涉及生产初生禽胚细胞的改进方法。本发明还涉及这些细胞及其生产疫苗或其它生物产品的用途。
本发明尤其源于从完整胚胎生产细胞的新方法的开发。呈现的结果显示这种方法提供了提高的每个胚胎的细胞数量，并且显示这些细胞展示了适于商业疫苗生产的特征(密度、融合度、病毒生产滴度)。更具体地呈现的结果显示该方法产生的CEF/胚胎产量是现有技术实现的产量的大约两倍，并且允许以更高的密度接种细胞，和在感染后大约50小时进行收获，从而实现高于最低释放量的滴度。因此与使用建立的细胞系或常规仅有身体的胚胎细胞的现有技术的方法相比，这种方法具有很大优势。
因此本发明的一个目的在于制备禽类胚胎细胞的方法，其包含：
a)由禽蛋获得禽胚，和
b)由完整胚胎制备细胞。
在一个优选的实施方案中，该方法还包含步骤c)：以20微米以上，更优选以50微米以上对细胞制备物进行过滤。
本发明的另一个目的在于由胚胎制备禽类胚胎细胞的改进的方法，改进在于由完整胚胎制备细胞及随后以20微米以上过滤细胞制备物。
在本发明方法的特定实施方案中，在过滤步骤c)之前或之后可以培养或扩增禽类胚胎细胞；和/或在过滤步骤c)之前或之后禽类胚胎细胞可以被病毒感染。
禽蛋优选为无特定病原体的禽蛋。并且，禽类胚胎细胞优选为成纤维细胞。本发明可用于任何禽类，优选鸡或鸭。在生产后，可以将细胞维持在培养物中，优选维持在无血清培养基中。
本发明的另一个目的涉及通过以上公开的方法可获得或获得的禽类胚胎细胞或所述细胞的祖细胞的培养物或组合物。
本发明还涉及禽类胚胎细胞的培养物或组合物，其中所述细胞或其祖先由完整胚胎制备得到且已经以20微米以上进行过过滤。
优选地，细胞为鸡胚成纤维细胞，任选地被病毒如马立克氏病病毒(MDV)感染。
本发明的另一个目的涉及生产或扩增病毒的方法，包括用病毒感染上述细胞以及任选地收集所产生的病毒。随后可将生产或扩增的病毒灭活。病毒可以为任何动物或人类病毒，例如但不限于MDV、火鸡疱疹病毒、MDV(SB-1)或MDV(Rispens)、禽呼肠孤病毒和传染性法氏囊病病毒。
本发明还涉及生产病毒疫苗的方法，包含(i)在允许病毒生产或扩增的条件下用病毒感染上述细胞；(ii)任选地，收集生产或扩增的病毒；(iii)任选地，将在(i)或(ii)中所生产或扩增的病毒灭活；以及(iv)将生产或扩增的病毒配制为疫苗组合物。
在该方法的一个特定的实施方案中，将生产或扩增的病毒收集、分离、以20微米以上过滤、任选地灭活、并配制为疫苗组合物。
根据另一个特定的实施方案，在步骤(i)之前将细胞以20微米以上进行过滤，并且将细胞上清液或细胞碎片用于生产疫苗。
本发明还涉及疫苗组合物，其包含上述的或通过上述方法获得的病毒或细胞，以及合适的赋形剂或载体。
本发明尤其适合生产CEF和使用这些细胞生产MDV疫苗。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一副彩图。具有彩图的本专利或专利申请出版物的副本经要求并支付必要费用后会由专利局提供。
图1：由完整胚胎制备的CEF的存活研究。
图2：由完整胚胎制备的CEF的融合度研究
图3：由完整胚胎制备的CEF细胞上马立克氏病毒的生长。
具体实施方案
本发明涉及由禽胚制备细胞的方法和组合物。本发明还涉及这些细胞的培养物及其用途，尤其是用于生产病毒如MDV的用途。本发明还涉及使用这些细胞或病毒制备疫苗的方法。
定义
在本发明的上下文中，术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅和鸟类。优选的禽类是鸡。
术语“完整的”或“整个的”胚胎指没有进行处理以去除其任何部分的胚胎。具体地，完整胚胎包含头(与仅有身体的胚胎相反)和眼睛。
MDV指三种MDV血清型中的任意一种，即血清型1、血清型2或血清型3。血清型3也指火鸡疱疹病毒(HVT)。MDV可以是包含外源基因或缺失突变的重组病毒，其用作疫苗或用于其它用途。MDV还可以是包含复制起始点和外源DNA序列的缺陷型病毒。
制备禽类胚胎细胞
本发明的第一个方面涉及基于完整胚胎的使用生产禽类胚胎细胞的改进的方法。
在现有技术中，生产胚胎细胞的方法总是使用仅有身体的胚胎。确实，头部被认为包含无关的细胞群并且会使细胞受到色素，尤其是来自眼睛的色素上皮细胞的污染。
我们的结果令人惊讶地显示，通过使用完整胚胎，可以使每个胚胎的细胞产量增加50％以上。这样的增加提供了在胚胎细胞中生产的疫苗的总成本的大大削减。此外，完整胚胎CEF制备方法还削减了劳动力需求，从而有助于减少操作和污染风险。得到的结果还出乎意料地显示，用完整胚胎制备的胚胎细胞是疫苗生产的合适基质。特别地，我们将完整胚胎与胚体在细胞和病毒生长的几个方面进行了比较，并且显示本发明的方法可产生这样的细胞，其在不同的种植密度下都具有显著的存活率，以及合适的敏感性和病毒增殖时程。
因此本发明的一个目的涉及制备禽类胚胎细胞的方法，其包含：
a)由禽蛋获得禽胚，
b)由完整胚胎制备细胞，以及
c)任选地，以20微米以上过滤细胞制备物。
本发明还涉及由胚胎制备禽类胚胎细胞的改进的方法，改进在于由完整胚胎制备细胞及随后以20微米以上过滤细胞制备物。
禽蛋可从本领域已知的任何商业来源获得。实际上，这些蛋已经被普遍用于生产胚胎细胞。优选地，本发明使用无特定病原体的(SPF)蛋。SPF禽群被饲养于特殊环境下并且定期被证明无禽类病原体(D.H.Thornton，“马立克氏病：科学依据和控制方法：疫苗的质量控制和标准化”(L.N.Payne，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，波士顿，MA.，第267-292页(1985))。使用SPF蛋保证了胚胎细胞以及从这些细胞生产的任何生物产品不被污染。
由蛋获得胚胎并收集于合适的容器如烧杯、烧瓶、瓶等等中。正如说明的，本发明利用完整胚胎，即未进行处理以去除头、眼睛或任何其它部分的胚胎。通常，收集50到800个完整胚胎并置于同一个容器中以进行随后的细胞制备。
可以按照本领域本身已知的技术由完整胚胎制备细胞。更具体地，可以通过完整胚胎的机械和/或酶消化制备细胞，从而使组织分离为分离的细胞。在一个特定的实施方案中，将完整胚胎用胰蛋白酶消化1-3次，每次5到20分钟。接着将包含分离的细胞的消化缓冲液倾倒通过筛网(1mm目径)至含血清(终体积的5-20％)的酸瓶中。
在此制备过程中，胰蛋白酶消化通常在冷的、即比室温冷的胰蛋白酶中进行。令人惊讶地，本发明人现在表明如果使用温胰蛋白酶进行制备则可得到提高的产量。因此在一个特定的实施方案中，通过在室温(20-25摄氏度)或高于室温进行胰蛋白酶消化由完整胚胎制备细胞。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及由禽胚制备禽类胚胎细胞的方法，该方法包含如下步骤：在20-40℃之间、优选20-25℃之间如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃的温度下对胚胎进行酶消化。或者，可在30-40℃之间如34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃的更高温度下进行消化。优选利用胰蛋白酶进行消化，通常持续5到20分钟，并且可以重复几次。
此外，本发明人还发现，通过控制每次制备所使用的胚胎数量，可以提高此方法的绩效。更具体地，得到的结果显示，通过在一个单个制备批次中使用不多于约150个胚胎，可以优化每个胚胎得到的细胞数。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括收集禽胚，将所述胚胎置于一个或几个合适的容器中，其中所述至少一个容器中的每个含大约50到150个胚胎，以及通过酶和/或机械处理所述胚胎制备禽类胚胎细胞。在一个优选的实施方案中，该方法包含：
-获得完整的禽胚，
-将所述完整禽胚置于一个或几个合适的容器中，其中所述一个或几个容器中的每个含大约50到150个完整禽胚，
-在大约20-40℃的温度下，对所述容器中的完整禽胚进行酶消化，以及
-收集禽类胚胎细胞。
降低组织对体积的比率，以及通过提高温度增加胰蛋白酶活性，能够更有效地将完整胚胎分离为单个细胞并且减少堵在筛网而不能进入滚瓶的残留材料。同样，控制每个容器的胚胎数量可以进一步提高细胞/胚胎比。
使用此方法，我们能够在600个蛋的批次中实现比每个胚胎6E+08个细胞高的产量。使用现有技术的胚胎的马立克氏制备通常每个胚胎产生2.0-2.5E+08个细胞。因此我们的结果证明本发明能使每个胚胎的产量显著提高200％到300％。
然后，可将收集的禽类胚胎细胞浓缩(如通过离心)、培养、扩增和/或冻存直至使用。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含如下步骤：以20微米以上，通常20微米～1000微米，特别是20微米～300微米、20微米～200微米，更特别是20微米～70微米的筛孔直径过滤细胞。使用完整胚胎导致含有来自视网膜的色素上皮细胞的细胞制备物。这些细胞可能在制备物中引入黑斑。优选地，通过通常以20微米以上进行过滤将这些细胞从制备物中清除。本发明表明，在这样的过滤条件下，这些细胞被完全分开因此它们宏观不可见。可以使用本身在本领域中已知的各种技术或过滤器如流速为如1Lpm的50微米孔径的Sartorius聚丙烯PP筒式过滤器或反冲系统进行过滤。通过使用50-70微米系统，可以去除所有可见的黑斑而不会损失任何大量的胚胎成纤维细胞。
可以在随后的任何处理如浓缩、扩增、培养、感染等之前或之后对胚胎细胞制备物进行过滤。
在一个特定的实施方案中，在添加至组织培养基之前对浓缩的胚胎细胞进行过滤。
在另一个特定的实施方案中，在过滤步骤c)之前或之后培养或扩增禽类胚胎细胞。
在另一个特定的实施方案中，在过滤步骤c)之前或之后用病毒感染禽类胚胎细胞。
如指出的，在一个优选的实施方案中，禽类胚胎细胞为成纤维细胞。这可以通过目测观察，或通过对一些成纤维细胞特异性特征或标记进行检测来证实。成纤维细胞是来自禽类的生长最快的初生细胞。当来自完整禽胚的细胞悬液开始进行培养时，成纤维细胞是最主要的细胞类型。在一个优选的实施方案中，本发明的禽类胚胎细胞制备物包含至少80％的成纤维细胞，更优选至少90％的成纤维细胞，甚至更优选95％～100％。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及制备禽胚成纤维细胞的方法，其包括
a)由禽蛋获得禽胚，
b)由完整胚胎制备细胞，
c)任选地，以20微米以上过滤细胞制备物，以及
d)从所述制备物中分离成纤维细胞。
可以在任何合适的培养基中，优选在无血清培养基中维持或培养或扩增细胞。合适的培养基是可商购的，包括但不限于EMEM、DMEM、M199、F12和DME/F12。
通常在无菌条件下，将细胞维持在任何合适的装置如培养瓶、瓶、试管、安瓿等中。
就这一点而言，本发明的一个特定目的在于通过上述方法可获得或获得的禽类胚胎细胞或所述细胞的祖细胞的培养物或组合物。
本发明的另一个目的是来自完整禽胚的禽类胚胎细胞的培养物，所述培养物优选包含至少90％的成纤维细胞。
本发明的另一个目的涉及禽类胚胎细胞的培养物或组合物，其中所述细胞或其祖先由完整胚胎制备得到并已经以20微米以上进行过过滤。
如上所述，本发明尤其适合于制备来自鸡的胚胎细胞。同样，在一个特定的实施方案中，以上培养物或制备物中的细胞被病毒如MDV、禽呼肠孤病毒、传染性法氏囊病病毒、火鸡疱疹病毒、MDV-SB1或MDVRispens感染。
将用完整胚胎生产的CEF与仅由胚胎身体生产的CEF进行比较，以便我们能够明确评价整个过程。除完整胚胎CEF的融合度、存活和生长外，我们还囊括了病毒生长曲线研究、收获时间优化及种植密度影响。
我们对滚瓶中CEF的生长/存活进行了研究并且发现，就在3天生长期内我们可从瓶中回收的细胞数量而言，由完整胚胎制备的CEF与仅由身体制备的CEF没用差异。
对种植密度和融合度进行了评估，表明关于融合度两种类型的CEF一般没有差异，除了由完整胚胎CEF以更低的种植密度产生更高的融合度。
我们还利用马立克氏病病毒HVT-NDV研究了病毒生长的完整生长曲线。我们的结果显示，由完整胚胎生产的CEF能够支持病毒的强劲生长并且产生高于最低释放量的滴度以及高于5安瓿/滚瓶的产量。
因此这些结果明确表明，在适合商业用途的条件下，本发明的细胞可用于生产或扩增病毒。
在另一个方面，本发明提供了生产或扩增病毒的方法，其包含用病毒感染上述细胞以及任选地收集产生的病毒。
可在本领域本身已知的任何合适条件下进行感染。例如，可以在培养基中用病毒制备物以0.001至10的感染复数(MOI)感染细胞。在生产或扩增之后，可优选灭活病毒。可以使用本领域本身已知的任何技术如使用甲醛、BEI、BPL等的化学处理进行灭活。
在另一个方面，本发明还涉及生产病毒疫苗的方法，其包含(i)在允许病毒生产或扩增的条件下用病毒感染上述细胞，(ii)任选地，收集生产或扩增的病毒，(iii)任选地，将在(i)或(ii)中生产或扩增的病毒灭活，以及(iv)将生产或扩增的病毒配制为疫苗组合物。
在该方法的一个特定的实施方案中，将生产或扩增的病毒收集、分离、以20微米以上过滤、任选地灭活、以及配制为疫苗组合物。
在该方法的另一个可选实施方案中，在步骤(i)之前以50微米以上过滤细胞，并且将细胞上清液或细胞碎片用于生产疫苗。
病毒可以是非人类或人类医学中用于疫苗制剂的任何病毒，例如优选MDV、禽呼肠孤病毒、传染性法氏囊病病毒、火鸡疱疹病毒、MDV-SB1或MDVRispens。
本发明还涉及疫苗组合物，其包含上述的或通过以上公开的方法获得或可获得的细胞或病毒，以及合适的赋形剂或载体。
本发明的其它方面和优势将在以下实验部分中公开，其应被视为是说明性的。
实施例
材料和方法：
细胞计数
总是使用血细胞计数板对台盼蓝染色的细胞进行人工细胞计数。使用NC200自动细胞计数仪进行自动细胞计数。通常将用于计数的样品稀释10-100倍范围以达到仪器的最佳计数范围。
种植瓶/接种
接种前24小时，用含小牛血清的马立克氏生长培养基以不同种植密度种植滚瓶。在37℃下温育滚瓶。所有研究中使用的马立克氏病毒均为HVT-NDVx+4或x+5。
收获
我们以两种不同方法收获滚瓶。使用预温(37℃)的0.25％胰蛋白酶-EDTA收获未感染的滚瓶。每个滚瓶接收50mL并在37℃下温育10分钟，随后对细胞进行倾析并以500×g离心13分钟。如在马立克氏生产中，使用1∶1混合物形式的胰蛋白酶-EDTA-Puck缓冲液收获感染的滚瓶。每个滚瓶接收100mL(温育温度、时间以及离心与未感染瓶的情况相同)。
分批/填充
在对感染滚瓶的研究中，总是将收获的材料分批和填充到安瓿中。用25％冷冻保护剂II和75％的冷冻保护剂I对产品进行分批。对安瓿人工地进行填充，使用Cozzoli安瓿填充机/封口机进行密封，而后在Mr.Frosty容器中进行冷冻。然后在第二天将安瓿转移至液氮。
滴定
在100mm组织培养皿中进行安瓿的滴定。通常，滴定前24小时种植培养皿，产生CEF的融合单层。将安瓿1比400稀释于马立克氏稀释剂中，然后视情况进一步稀释。接种培养皿，然后在CO2孵箱中温育5天。使用革兰氏结晶紫在室温下将培养皿染色60分钟，而后使用温自来水洗涤且自然风干。使用显微镜在25倍放大率下对色斑进行计数。
统计
图中的误差线代表平均值的95％置信区间。简言之，这意味着如果重复该测定，我们将有95％的机会得到落在该误差线范围之内的结果。在没有误差线的图表的情况中，我们没有重复足够的次数以产生95％置信区间。回归线(曲线)与它们可应用的数据拟合，并表示在图例中。
结果：
1.由完整胚胎生产鸡胚细胞
通过添加150个胚胎/烧瓶以及1800mL室温的1∶1比的胰蛋白酶/Puck，由完整胚胎制备CEF。以这种方式将胚胎用胰蛋白酶消化三次，每次10分钟。在每次胰蛋白酶消化之间，对细胞进行倾析。胰蛋白酶消化之后，将细胞以450×g离心10分钟并弃掉上清液。然后，合并细胞沉淀并通过纱布倒出。下面给出几次实验的结果：
温度和胚胎数的影响
进行了比较实验，以进一步改进工艺条件和产量。更特别地，对温度以及每烧瓶的胚胎数进行了检测。将结果示于下表中。室温指20-25℃。
胚胎/烧瓶 胰蛋白酶温度 体积(mL) 平均细胞计数/活力 细胞/胚胎
100 室温 1270 5.60E+07/67％ 7.11E+08
150 室温 1269 7.89E+07/82％ 6.67E+08
150 37℃ 1335 7.61E+07/84％ 6.77E+08
200 室温 1340 8.20E+07/80％ 5.97E+08
2.存活研究
作为切入点，我们比较了由完整胚胎生产的CEF与仅由身体生产的CEF的存活率。我们用两种细胞类型以每个滚瓶相同的细胞密度种植滚瓶，并在3天内观察它们的细胞生长和存活。在每个时间点对来自五个滚瓶的贴壁和未贴壁细胞进行细胞计数。图1总结了这些结果。我们观察到得自完整胚胎的CEF细胞的适宜的生长和存活，两者之间没有显著差异。
3.融合度研究
本研究的目的是评价完整胚胎CEF的增殖动力学的可能性改变。在本实验中，我们用CEF细胞以3.0E+08到1.0E+09的种植密度种植滚瓶，24小时后检查贴壁细胞的细胞计数，以确定产生各类型CEF(完整胚胎或仅身体)的融合单层的最低种植密度。在每个密度下接种5个滚瓶。由三个不同的技术人员读取融合度并取平均值。结果示于图2中并显示，就从滚瓶中回收的细胞而言，两种CEF类型之间没有显著差异。结果还显示来自完整胚胎的CEF在更低的种植密度下产生了稍高的融合度。
4.生长曲线研究
在这些研究中，我们的目的是明确在不同的CEF中HVT感染时程中的可能性改变，或者换句话讲，评价病毒增殖的时间分布。瓶被以相同的密度种植，并被以相似的MOI感染。在所示的感染后的多个时间点收获滚瓶。如前所述，对安瓿进行分批、填充和滴定。
图3示出来自生长曲线研究的结果，并表明仅身体和完整胚胎两者产生的滴度大致相同。仅有身体的胚胎的曲线看起来上升更快，但两者均在3000pfu/ds附近达到峰值。
5.过滤试验
为了保护最终产品的表面外观和实现处理完整胚胎赋予的增益，进行过滤以去除来自胚胎眼睛的“黑点”。为此，我们对由完整胚胎制备的浓缩CEF进行了两项过滤试验。在这种情况下，浓缩的是指在加工后以可以预期的密度过滤CEF。这远高于种植密度。通常，来自仅有身体的胚胎的密度将为约2-3E+07细胞/mL。对于这些研究，我们以7E+07细胞/mL的密度过滤细胞以将来自完整胚胎的增加的细胞数量考虑在内。我们检测的过滤器为来自Sartorius的50微米聚丙烯深度过滤器。进行了两项试验，小规模的(使用50微米PP过滤器的盘式过滤器型号过滤0.5LCEF)，以及中等规模的(使用50微米PP过滤器的9码型号过滤11.5LCEF)。在过滤过程中，我们记录了滤液中的细胞计数以及细胞活力。
来自小规模试验的结果表明活力保持在～80％，细胞计数有些波动但始终维持稳定。在过滤结束时，我们计算了滤液的总体积，发现总损失为12％。
在中等规模试验中，活力始终保持在～80％，然而细胞计数稳步下降。在试验结束时，我们计算了滤液，发现总损失为20％。
为了避免细胞损失，我们设计了反冲所述过滤器的系统。计数CEF，然后将其经50微米聚丙烯过滤器(Sartorius)过滤。装配反冲系统并且反向冲洗过滤器。如下表中所示，使用此反冲系统，在过滤中无细胞损失。
阶段 体积(ml) 总细胞计数
过滤前 5000 2.14E+11
过滤后 5000 2.05E+11
反冲后 9000 2.41E+11
7.初步研究
考虑到来自所有前述研究的结果，生产了初始量批次的马立克氏病毒和呼肠孤病毒。
呼肠孤病毒的生产
制备小规模批次的禽呼肠孤病毒株S1133，以说明怎样用完整胚胎生产病毒。如前所述将300个完整胚胎制成CEF细胞。以每瓶1.4E+09CEF的密度接种滚瓶，并用呼肠孤病毒共感染。在4天后，收获瓶并合并上清液。在灭活前取样进行活病毒滴定。
结果如下表所示。
马立克氏病毒的生产
使用完整胚胎制备小规模试验的包含HVT-ILT病毒的马立克氏病病毒疫苗。如前所述由完整胚胎制备CEF细胞，并将其以每瓶8.0E+08细胞的密度接种到滚瓶中。种植后24小时，使用病毒以0.006的MOI感染瓶。在48小时后，通过胰蛋白酶消化和倾析对瓶进行收获。将收获的细胞离心、分批并填充到安瓿中。
来自初始批次的结果如下表所示。

Claims (23)

1.一种制备禽类胚胎细胞的方法，其包含：
a)由禽蛋获得禽胚，
b)由完整胚胎制备细胞，以及
c)任选地，以20微米以上过滤细胞制备物。
2.一种由胚胎制备禽类胚胎细胞的改进的方法，改进在于由完整胚胎制备细胞以及随后以20微米以上过滤细胞制备物。
3.权利要求1的方法，其中在过滤步骤c)之前或之后培养或扩增所述禽类胚胎细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述禽类胚胎细胞在过滤步骤c)之前或之后被病毒感染。
5.权利要求1的方法，其中所述禽蛋为无特定病原体的禽蛋。
6.权利要求1的方法，其中将几个完整禽胚置于一个或几个合适容器中，所述一个或几个容器中的每个容纳大约50到150个胚胎。
7.权利要求1的方法，其中通过在20℃到40℃之间的温度下对所述完整胚胎进行酶处理来制备所述胚胎细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述禽类胚胎细胞为成纤维细胞。
9.权利要求1的方法，其中所述禽类为鸡。
10.权利要求1的方法，其中将所述细胞维持在无血清培养基中。
11.能够通过权利要求1的方法获得的禽类胚胎细胞、或所述细胞的祖细胞的培养物或组合物。
12.一种禽类胚胎细胞的培养物或组合物，其中所述细胞或其祖先由完整胚胎制备得到并已经以20微米以上进行过过滤。
13.权利要求11的培养物或组合物，其中所述禽类胚胎细胞为鸡胚成纤维细胞。
14.权利要求12的培养物或组合物，其中所述禽类胚胎细胞为鸡胚成纤维细胞。
15.权利要求12的培养物或组合物，其中所述细胞被病毒感染。
16.生产或扩增病毒的方法，其包含用病毒感染权利要求12的细胞，以及任选地收集所生产的病毒。
17.权利要求16的方法，其中随后将生产或扩增的病毒灭活。
18.权利要求16的方法，其中所述病毒为MDV。
19.一种生产病毒疫苗的方法，其包含(i)在允许病毒生产或扩增的条件下用病毒感染权利要求12的细胞，(ii)任选地，收集生产或扩增的病毒，(iii)任选地，将在(i)或(ii)中生产或扩增的病毒灭活，以及(iv)将生产或扩增的病毒配制为疫苗组合物。
20.权利要求19的方法，其中将所述生产或扩增的病毒收集、分离、以20微米以上过滤、任选地灭活、以及配制为疫苗组合物。
21.权利要求19的方法，其中在步骤(i)之前以20微米过滤所述细胞，且将细胞上清液或细胞碎片用于生产所述疫苗。
22.权利要求19的方法，其中所述病毒为MDV。
23.一种疫苗组合物，其包含通过权利要求16的方法获得的病毒以及合适的赋形剂或载体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113015789A (zh) * 2018-11-08 2021-06-22 整合培育株式会社 动物细胞增殖促进剂、动物细胞培养用培养基和动物细胞培养装置
CN114107171A (zh) * 2021-11-12 2022-03-01 广东省华晟生物技术有限公司 鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050149996A1 (en) * 2003-09-10 2005-07-07 Alexander Baguisi Generation of chicken cell lines from embryonic stem cells and germ cells
CN1826406A (zh) * 2003-07-22 2006-08-30 维涡里斯公司 用附着或非附着鸟细胞系生产痘病毒
CN102000328A (zh) * 2010-11-23 2011-04-06 北京市兽医生物药品厂 一种利用细胞工厂生产鸡马立克氏病疫苗的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340740A (en) * 1992-05-15 1994-08-23 North Carolina State University Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process
DE4405841C1 (de) * 1994-02-23 1995-01-05 Mayr Anton Prof Dr Med Vet Dr Multipotente Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen von Pockenviruskomponenten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
US20040023358A1 (en) * 2001-12-21 2004-02-05 Wyeth Avian embryo particulate biomass for the production of virus antigens
FR2836924B1 (fr) * 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
WO2005007840A1 (en) * 2003-07-22 2005-01-27 Vivalis Production of poxviruses with adherent or non adherent avian cell lines
EP1528101A1 (en) * 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
NZ548623A (en) * 2004-01-02 2010-04-30 Advanced Cell Tech Inc Novel culture systems for ex vivo development of stem cells in telolecithal or eutelolecithal eggs
FR2884255B1 (fr) * 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
BRPI0714257A8 (pt) * 2006-08-09 2017-05-09 Valneva "métodos para a cultura de células tronco embriónarias (es) de aves, para modificar geneticamente as células tronco embrionárias, para a obtenção de um pintinho quimérico, para a obtenção de um progênie do pintinho, para a analise do polimorfismo genético, meio de cultura para células tronco embrionárias de aves e meio de cultura".
EP1939214B1 (en) * 2006-12-22 2013-07-10 Institut Pasteur Cells and methodology to generate non-segmented negative-strand RNA viruses

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1826406A (zh) * 2003-07-22 2006-08-30 维涡里斯公司 用附着或非附着鸟细胞系生产痘病毒
US20050149996A1 (en) * 2003-09-10 2005-07-07 Alexander Baguisi Generation of chicken cell lines from embryonic stem cells and germ cells
CN102000328A (zh) * 2010-11-23 2011-04-06 北京市兽医生物药品厂 一种利用细胞工厂生产鸡马立克氏病疫苗的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEO 等: ""Bone marrow cell-mediated production of transgenic chickens"", 《LABORATORY INVESTIGATION》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113015789A (zh) * 2018-11-08 2021-06-22 整合培育株式会社 动物细胞增殖促进剂、动物细胞培养用培养基和动物细胞培养装置
CN114107171A (zh) * 2021-11-12 2022-03-01 广东省华晟生物技术有限公司 鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用
CN114107171B (zh) * 2021-11-12 2022-12-27 广东省华晟生物技术有限公司 鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用

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