SU764391A1

SU764391A1 - Способ культивировани вирусов

Info

Publication number: SU764391A1
Application number: SU792723822A
Authority: SU
Inventors: Л.Л. Миронова; Н.Е. Гольдрин; В.П. Грачев; Т.М. Орлова
Original assignee: Институт Полиомелита И Вирусных Энцефалитовамн Ссср
Priority date: 1979-01-31
Filing date: 1979-01-31
Publication date: 1981-07-23

Description

1

Изобретение относитс к области медицины, а именно вирусологии, и может найти применение дл культивировани вакцинных штаммов вируса.

Известен способ культивировани вирусов путём-размножени на линии диплоидных клеток 1.

Однако этот способ вл етс малодоступным , кроме того, линии-клеток высоко чувствительны к определенным питательным средам и сывороткам.

Цель изобретени - упрощение способа .

Это достигаетс тем, что вирусы размножают на линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-7.

Полученна Лини диплоидных клеток кожи и мьашц эмбриона человека М-7 имеет следующие биологические, генетические и морфологические характе-рисгики .

Культура состоит из фибробластоподобных клеток. Морфологи клеток остаетс стабильной в течение фазы активного роста.

.Клетки легко снимаютс со стекла раствором трипсина, при субкультировании быстро прикрепл ютс к стеклу и на 3-4 сутки образуют монослой. Клетки хорошо растут на среде Игла

и среде MEM с 10% сыворотки крупного рогатого скота, коэффициент развивки составл ет 1:2, 1:3.

Клетки имеют ограниченное врем жиэни вне организма, до 66 пассажа, на прот жении фазы активного роста не тер ют своих генетических свойств. При. кариологическом анализе установ- лено, что модапыный класс на уровне

10 дес того, двадцатого, тридцатого и сорокового пасссокей составл ли клетки с двойным набором хромосом (2п-46). Число диплоидных клеток на прот жении фазы активного роста колебалось от

15 97% на ранних пассажах до 85,6% на поздних, гипоплоидных - 1,6-2,0, гиперплоидных - 1,0-12,8. Обследовано 1200 метафаз. Установлено, что кариотип диплоидных клеток не отли20 чаетс от кариотипа, хара терного дп мужского пола. При сравнении хромосомных наборов на разных уровн х пассажей различий не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии

25 контаминации линии другими клеткают. Различий также не вы влено в рисунке дифференцированности хромосом по длине при окраске по Гимза, что также указывает на генетическую стабильность

30 культуры.

Клетки линии М-7 не контаминированы бактери ми, грибами и микоплазмами. Посторонние вирусы не вы влены ни в культурной жидкости, ни в клетках. .ы на рнкогенность также были отрицательными .

По мере размножени клетки замораивсши на различных уровн х пассажей дл хранени в жидком азоте, таким обазом создан их банк. При восстановлеии клетки сохран ли жизнеспособность. а70-80 %.

Клетки линии чувствительны к разичным вирусам группы ECHO, Кокс&ки, полиомиелита и клещевого энцефалита. В частности, характер цитопатических зменений под действием вируса полиомиелита штаммов Сэбина по морфологии и срокам развити не отличаетс от наблюдаёмого в первичной культуре клеток почек обезь н, используемых л йз готовлени вакцины против полиомиелита и клещевого энцефалита, В частности, характер цитопатических изменений под действием вируса полиомиелита штаммов Сэбина по морфологии и срокам развити не отличаетс от аблюдаемого в первичной культуре клеток почек обезь н, используеких дл изготовлени вакцины против полиомиелита .

Вирусклещевого энцефалита в клетках линии М-7 размножаетс со стабильно высокими показател ми титров,чего не -наблюдаетс при заражении первич- ных культур клеток куриного эмбриона, используемых дл изготовлени вакцины против клещевого энцефалита.

Привод тс примеры культивировани вирусов на линии диплоидных клегок кожи и мышц эмбриона человека М-7.

Пример 1. Способ культивировани вируса полиомиелита,штамм Сэбина 1 Типа.

В матрасную колбу с диплоидными /клетками кожи и мышц эмбриона человека М-7 на уровне I пассажа ввод т 0,25 %-ный раствор трипсина, подог-ретый до 37°С. Через 10 с раствор УДалТдют, а сосуд .тками помещают в термостат при температуре З7с йй 2 мин. .После этого в него внос т неёольшое количество дит.ательной среды и энергичным встр хиванием заканчивают процесс отделёнй йлётоК от с Шгла . Затем в клеточную взвесь добавл ют среду роста - среду НЕМ с 10% сыйоротки крупного рогатого скота, и разливают на две матрасные колба, Эти культуры 19 пассажа инкубируют при 37°с в течение 4 суток до момента формировани плотного сло .

При заражении вирусом среду из хультуральных Сосудов слИвают, клетки трижды про Ф1вают раствором Эрла и ввод т вируссодержащую жидкость из расчета 3 БОЕ на клетку. Затем добавл ют поддерживающую среду, в качестве КйтороЯ используют среду MEM,

Инфицированные культуры инкубируют при 34С. Сбор вируса. производ т на

4день после зарал ени и определ ют его титр по методу образовани бл шек . Титр равен 7,7.д БОЕ/мл.

Параллельно аналогичным способом инфицируют первичную культуру клеток почек обезь н, и вирус в ней размнорсаетс до титра 7,5 Хд БОЕ/мл,

При мер 2, Способ культивировани вируса полиомиелита, штамм Сэбина П типа,

клетки линии М-7 на уровне 19 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1, При этом титр вируса как при размножении его в данной культуре, так и в первичной культуре клеток почек обезь н составл ет 7,5 1д БОЕ/мл.

Пример 3. Способ культивировани вируса полиомиелита, штамм Сэбина I I I типа.

Клетки линии М-7 на уровне 19 пассажа получают И заражают вирусом по способу, описанному в примере 1. При этом титр вируса как при размножении его в данной культуре, так и в первичной культуре клеток почек обезь н составл ет 7,5 1д БОЕ/мл,

П р и м е р 4. Способ культивировани вируса ECHO Л.

Клетки линии М-7 получают и готов т к зараокению по способу, описанному в примере 1. При заражении внос т вируссодержащую жидкость из расчета

1БОЕ на клетку. Дл ащсорбции вируса культуры выдерживают при в течение-1,S ч, после чего добавл ют поддерживающую среду. Культуры инкубируют при.37°С, сбор вируса провод т через 5 дней после заражени , затем определ ют его титр, который равен 7,3 Вд БОЕ/МЛ.

Параллель;но аналогичным способом заражают первичную культуру клеток почек обезь н и вирус в ней размножаетс до титра 6,5 9 БОЕ/мл.

П р и м е р 5 . Способ культивировани вируса ECHO 12.

Клетки линиим-7; получают и гото й т к заражению по описанному в примере 4 способу. При заражении внос т вируссодержащую жидкость из расчета

2БОЕ на клетку. Вирус собирают на

5день после заражени и его титр равен 7,6 Eg БОЕ/МЛ, При параллельном заражении аналогичным способом первичных культур клеток почек обезь н титр вируса достигает лишь 5,7 tg ВОЕ/мл.

П р и м е р 6. Способ культивировани вируба Коксаки в 5.

Клетки линии М-7 получают и заражают по способу,указанному в примере 5.

Claims

Титр вируса при размножении в данной культуре составл ет 7,4 9 БОЕ/мл а в параллельно инфицированной анологичным способом kyльтype клеток почек обезь н - 6,45 ig БОЕ/мл, Пример 7. Способ культивировани вируса клещевого энцефалита , штамм Софьин, Линию клеток на уровне II пассажа готов т аналогичным способом, описан ным в примере 1. Культуру трижды отмывают раствором Эрла и ввод т вирус содержащую жидкость из расчета 0,002 LD o/клетку. Адсорбцию вируса провод т при 32С в течение 1,5 ч пр посто нном покачивании. В качестве подцерживгиощей среды используют среду 199 на растворе Эрла с 5% аминопептида - 2, и по 0,1 % куриного эмбрионального экстракта, человеческого альбумина и гидролизата лактальбу мина. Культуры инкубируют при З7с в .течение 48 ч и производ т сбор вируса . Степень его размножени определ ют в опытах биологического титрова-. ни путем интрацеребрального зараже ни кмшей. При этом титр составл ет 8,02 LDSO. Параллельно аналогичным способом инфицируют первичные культуры клеток куриного эмбриона и титр вируса; в этом случае равен 7 Iq . Предлагаемый способ позвол ет использовать дл культивировани вирусов новогхэ субстрата, полученного из легкодоступного абортивного материала (кб жи и эмбриона человека) , легко культивируемого, обладающего диплоид ным набором хромосом, свободного от посторонних агентов, чувствительного к различным вирусам, лишенного онкогеннойактивности . Лини диплоидных клеток кожи и млац эмбриона М-7 человека отличаетс легкостью получени и субкультивировани при использовании ростовой среды Игла или среды MEM с добавлением 10% качественной сыворотки крупного рогатого скота, не требует особых видов питательных и дефицитной эмбриональной сыворотки тел т, обладает устойчивыми морфологическими и генетическими особенност ми. Лини чувствительна ко многим вирусам, что открывает перспективы широкого применени ее в вакцинном производстве. Ее клетки хорошо сохран ютс в жидком азоте и можно создават1г их запас. Использование линии в производстве вакцин позволит снизить импорт обезь н и готовить большие партии вакцин на заранее отконтролированном клеточном субстрате. Применение его в качестве лабораторной модели вместо первичных культур клетой и животных позволит получать более достоверные данные с меньшими экономическими затратами. Формула изобретени Способ культивировани вирусов путем размножени на линии диплоидных клеток, о т ли ч а ю щ и и с тем, что, с целью упрощени способа, вирусы размножают на линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-7. Источники информации, прин тые во внимание при экстге) 1. HayMick and Moorhead. The Serial Cultiva.tion of Diploid Cell Strains. Experimental Cellulior Research, 25, 3, p. 585-621.