CN102093983A - 人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是利用人二倍体细胞(KMB17)生产用于预防人类狂犬病的疫苗毒种及其制备方法。本发明是将狂犬病固定毒CTN-1V₅株连续在人二倍体细胞(KMB17)中传代，并以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，从而获得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出可在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)。用该毒种生产人二倍体细胞(KMB17)狂犬病疫苗可以有效避免当前国内使用的疫苗中异种DNA残留引起的风险，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性和实用性，具有重大的社会效益和经济效益。

Description

人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是利用人二倍体细胞(KMB17)生产用于预防人类狂犬病的疫苗毒种及其制备方法。 

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种疾病，一旦发病，100％死亡。我国近年来狂犬病疫情持续上升，发病率现居世界第二位，仅次于印度，狂犬病病死人数居37种法定报告传染病之首。狂犬病至今无法治愈但可有效预防，因此我国狂犬病的预防工作就显得尤为重要。 

目前世界用于生产狂犬病疫苗的培养基质细胞主要有地鼠肾细胞、鸡胚细胞和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)等动物源性细胞。动物源性原代细胞不能排除细菌、病毒、寄生虫等外源致病因子的污染，且有生产规模不易扩大、环保难解决等缺点；而Vero细胞由于是传代细胞系，有一定的致瘤性，疫苗中细胞残余DNA必须达到标准，而且其最大的缺点是该细胞株没有我国自主知识产权。人二倍体细胞为人源性正常核型细胞，无致癌性，无异种DNA，其安全性无疑要高于动物源性细胞。目前我国使用的狂犬病疫苗种类虽多，但质量良莠不齐，至今尚无被WHO、FDA等组织肯定和推荐的人二倍体细胞培养疫苗，而基本是用地鼠肾细胞、Vero细胞和鸡胚细胞等动物源性细胞培养的疫苗。国外生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗，如美国Wyeth厂、法国Merieux研究所和德国Behring厂生产的二倍体疫苗，已证实其具有良好的免疫原性和安全性，但用人二倍体细胞培养狂犬病毒，有病毒滴度相对较低、疫苗成本高及价格昂贵等缺点，难以广泛使用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有我国自主知识产权，适应于人二倍体细胞(KMB17)，具有良好免疫原性和传代稳定性，并且易于大量扩增的狂犬病疫苗 毒种及其制备方法。用该毒种生产人二倍体细胞(KMB17)狂犬病疫苗，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性和实用性，以便能更安全、有效地预防人类狂犬病。 

1984年WHO第7次狂犬病专家委员会将CTN-1V₅株认可为狂犬病毒固定株，列为可用于生产疫苗的病毒株。本发明是将狂犬病固定毒CTN-1V₅株连续在人二倍体细胞(KMB17)中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，该狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，分类命名为狂犬病毒Rabies virus，已于2010年07月16日保藏于中国微生物生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.3989。 

CTN-1V₅株经过在人二倍体细胞(KMB17)中传代适应，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。 

本发明的人二倍体细胞(KMB17)的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由Eagle液、乳蛋白及一定量的新生牛血清组成。 

具体制备方法步骤如下： 

1、用由Eagle液、乳蛋白及2％～15％的新生牛血清组成的细胞营养液，于35℃～37℃培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。 

2、将狂犬病固定毒CTN-1V₅株在人二倍体细胞(KMB17)中传代，收获所得病毒命名为CTN-DK株。传代方法为当细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将CTN-1V₅株按0.005～1.0MOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于32℃～37℃，PH7.2～8.0培养，培养2～20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DK1，并以相同方法继续传代。 

3、当传代至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为CTN-DK29，再以CTN-DK29经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经终末稀释法筛选并传至47代。 

4、CTN-1V₅株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。 

5、病毒的接种方式是悬浮细胞接种法，病毒接种剂量为0.005～1.0MOI，培养温度为32℃～37℃，PH7.2～8.0，病毒收获时间为接种病毒后2～20天。该毒种参照《中华人民共和国药典》三部(2005年版)“人用狂犬病疫苗” 毒种的无菌检查、支原体检查、鉴别试验、外源因子检查和免疫原性检查方法检测，检测结果均达到药典要求的标准。经测定，毒种中和指数为3981，保护指数为≥776，均大大超过药典所要求中和指数不低于500和保护指数不低于100的标准。研究同时表明，此毒种的G蛋白基因在人二倍体细胞(KMB17)传代时具有遗传稳定性。 

本发明的液体毒种保存于-60℃以下，有效期可达3年半以上，毒种真空冷冻干燥后可于-60℃以下长期保存。 

用毒种(CTN-DK株)制备了3批试验性疫苗，经免疫原性、豚鼠异常毒性试验、残余活病毒检查(包括细胞盲传三代后小鼠脑内接种)和效价测定等均证明安全有效，其中一批经国家(浙江)新药安全性评价研究重点实验室的安全性评价(小鼠im急性毒性试验、豚鼠全身主动过敏试验、大鼠被动皮肤过敏试验)，结论为安全。 

本发明具有以下技术效果： 

本发明制备的毒种可用细胞工厂大量增殖。以细胞工厂制备毒种的培养方式与传统的克氏瓶相同，但与前者相比，有培养面积大，制备批量大，占用空间小，操作简便，污染机会小等的优点。毒种(CTN-DK株)用细胞工厂大量增殖的滴度与用克氏瓶制备毒种的滴度相当。 

本发明的毒种(CTN-DK株)是一种已经适应于人二倍体细胞(KMB17)，具有良好免疫原性和传代稳定性，符合《中华人民共和国药典》三部(2005年版)“人用狂犬病疫苗”毒种要求，并且易于大量扩增的狂犬病毒毒种。用该毒种生产的人二倍体细胞(KMB17)狂犬病疫苗具有安全性和有效性，可以避免当前国内使用的疫苗中异种DNA残留引起的风险，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性，具有重大的社会效益和经济效益。 

具体实施方式

实施例1： 

用由Eagle液、乳蛋白及2％～15％的新生牛血清组成的细胞营养液，于35℃～37℃培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。当细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将CTN-1V₅株按0.005～1.0MOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于32℃～37℃，PH7.2～8.0培养，培养2～20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DK1，并以相同方法继续传代。当传代 

至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为 CTN-DK29，再以CTN-DK29经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经终末稀释法筛选并传至47代。CTN-1V₅株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。 

实施例2： 

采用悬浮细胞接种方法，取已长成单层的细胞，用胰酶常规消化，收集细胞，再以生长液(含10％～15％新生牛血清的Eagle乳白蛋白培养液)按合适的比例悬浮细胞。在悬浮细胞中接种病毒，置37℃培养至细胞长成单层，去除原培养液，换上维持液(含2％～5％新生牛血清的Eagle乳白蛋白培养液)，分别置32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃培养，5～7天收获病毒液。收获的病毒液以狂犬病病毒滴度滴定试验(LD50)检测，结果见表1。 

表1毒种在人二倍体细胞(KMB17)中不同培养温度的病毒滴度(lgLD50/ml) 

以上数据经T检验，0.2＜P＜0.5，无显著差异。狂犬病毒固定毒CTN-DK 株在人二倍体细胞(KMB17)中培养温度在32℃～37℃之间均为适宜的。 

实施例3： 

为确定毒种最佳接种量，进行了狂犬病毒固定毒CTN-DK毒株感染人二倍体细胞(KMB17)不同感染复数(MOI)的试验。方法是将在对数期生长的KMB-17细胞制成细胞悬液，进行计数。将已滴定过的病毒按1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005MOI接种悬浮细胞，经适宜的温度培养，培养一定的时间后收获病毒液。收获的病毒液以狂犬病病毒滴度滴定试验(LD50)检测，结果见表2。 

表2毒种不同MOI感染人二倍体细胞(KMB17)的病毒滴度(lgLD50/ml) 

结果显示，不同病毒数感染细胞后的产量无明显差异。因此，狂犬病毒固定毒CTN-DK株感染人二倍体细胞(KMB17)，采用0.005～1.0MOI较为合适。 

实施例4： 

狂犬病毒G蛋白是狂犬病毒唯一能诱生宿主产生中和抗体的蛋白，对疫苗的免疫原性至关重要。我们对毒种在人二倍体细胞(KMB17)培养传代第2、5、10、15、20、23、29、30、37、39、40、41、42及47代的G基因稳定性进行了研究，研究方法如下： 

1.提取RNA：用RNA提取试剂盒从接种了病毒的KMB17细胞中提取总RNA。 

2.逆转录合成模板CDNA，PCR扩增病毒G基因。 

3.将纯化的PCR扩增产物测序分析。 

结果如下： 

1.以上代次病毒G基因的开放阅读框架(ORF)均由1575个核苷酸组成，编码524个氨基酸(前19个氨基酸构成疏水性信号肽，在转录过程中被切除， 成熟的G为505个氨基酸的多肽)。 

2.以上代次病毒G基因ORF序列在206、734及1055位核苷酸有差异，由此推导出各代次病毒G蛋白氨基酸序列在第50、226及333位有差异。 

3.各代次病毒均在37、247和319位有3个糖基化位点。 

已研究的各代次病毒的G基因ORF上有3个位点的核苷酸有差异，导致了G蛋白有3个氨基酸位点有差异。狂犬病毒固定毒CTN-1V₅，在人二倍体细胞(KMB17)传代至29代时，333位氨基酸已经由R变为了Q。狂犬病病毒G蛋白333位氨基酸与病毒的毒力密切相关，如此位点的精氨酸(R)被谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(I)或甘氨酸(G)取代，病毒的毒力下降。传代病毒另两个有差异的氨基酸均不位于膜外区的已知关键位点上。研究结果表明毒种在人二倍体细胞(KMB17)中培养传代时，病毒毒力减低的同时其G基因是稳定的。 

实施例5： 

该毒种参照《中华人民共和国药典》三部(2005年版)“人用狂犬病疫苗”毒种的无菌检查、支原体检查、鉴别试验、外源因子检查和免疫原性检查方法检测，无菌检查、支原体检查及外源因子检查的结果均为阴性，毒种鉴别试验结果为中和指数3981，免疫原性检查结果为保护指数≥776，均达到药典所要求中和指数不低于500和保护指数不低于100的标准。 

实施例6： 

取3个不同代次毒种以相同的MOI，用悬浮细胞接种法分别接种于10层细胞工厂和150cm²塑料克氏瓶、，于32℃～37℃培养7天后取样检测病毒滴度。细胞工厂培养毒种的滴度与用克氏瓶制备毒种的滴度相当，结果见表3。 

表3毒种用细胞工厂与克氏瓶培养的LD50结果比较 

实施例7： 

将毒种于-60℃保存，分别在冻存1年、2年和3年半后取出毒种检测病毒滴度，结果证明毒种在-60℃冻存至3年半时，病毒滴度仍未降低，结果见表4。 

表4 毒种-60℃保存病毒滴度测定 

Claims (6)

1.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗毒种，其特征在于将狂犬病固定毒CTN-1V₅株连续在人二倍体细胞(KMB17)中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，再经连续传代，获得适应于人二倍体细胞(KMB17)并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出在人二倍体细胞(KMB17)高效增殖的狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，该狂犬病疫苗毒种(CTN-DK株)，其保藏号为CGMCC No.3989。

2.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于毒种病毒滴度≥7.0lgLD50/ml。

3.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于毒种在人二倍体细胞(KMB17)传代，其G蛋白基因具有稳定性。

4.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种，其特征在于液体毒种-60℃以下可保存3年半以上，毒种真空冷冻干燥后于-60℃以下长期保存。

5.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种的制备方法，其特征在于具体制备方法步骤为

1)用由Eagle液、乳蛋白及2％～15％的新生牛血清组成的细胞营养液，于35℃～37℃培养扩增人二倍体细胞(KMB17)。

2)将狂犬病固定毒CTN-1V₅株在人二倍体细胞(KMB17)中传代，收获所得病毒命名为CTN-DK株。传代方法为细胞长成致密单层后，用胰酶-EDTA消化，收集细胞，将CTN-1V₅株按0.005～1.0MOI剂量，以悬浮细胞接种法接种于人二倍体细胞(KMB17)，于32℃～37℃，PH7.2～8.0培养，培养2～20天后收获病毒即狂犬病毒固定毒CTN-DK1，并以相同方法继续传代。

3)当传代至CTN-DK20时以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒继续传代9代，命名为CTN-DK29，再以CTN-DK29经终末稀释法筛选并传4代，命名为CTN-DK33，再以CTN-DK33经终末稀释法筛选并传至47代。

4)CTN-1V₅株经过在人二倍体细胞(KMB17)中连续传代，逐渐适应于人二倍体细胞(KMB17)，其病毒滴度由第1代的4.5lgLD50/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9lgLD50/ml，经进一步筛选后，传代至47代，病毒滴度基本稳定在7.0lgLD50/ml以上。

5)病毒的接种方式是悬浮细胞接种法，病毒接种剂量为0.005～1.0MOI，培养温度为32℃～37℃，PH7.2～8.0，病毒收获时间为接种病毒后2～20天。

6.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗毒种的制备方法，其特征在于人二倍体细胞(KMB17)的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由Eagle液、乳蛋白及一定量的新生牛血清组成。