CN108893451A - 人副流感i型病毒大规模培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人副流感I型病毒大规模培养的方法,首先将人副流感I型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上,然后于37℃、5%CO2培养;每天采用ELISA法检测上清中病毒效价,绘制病毒增殖曲线;至第7天,收取病毒培养上清,使用胰酶消化液消化细胞,按1:4‑5进行带毒细胞的传代扩增,然后于37℃、5%CO2培养;重复收取病毒液,重新添加病毒培养液,或重复进行带毒细胞的传代扩增至所需规模。本发明在第7天进行带毒细胞的传代扩增,此时病毒效价高,细胞活率较好,减少了细胞制备量,缩短了培养时间,提高了工作效率;同时本发明按1:4‑5进行带毒细胞的传代扩增,无需重新接毒,可根据需要扩大规模,满足了对人副流感I型病毒疫苗进行深入研究和制造的需求。
Description
技术领域
本发明涉及病毒的培养方法,尤其是涉及一种人副流感I型病毒大规模培养的方法。
背景技术
人类副流感病毒(HPIVs)是引起儿童下呼吸道感染的一种病毒,其致病性仅次于呼吸道合胞病毒 (RSV)。与RSV一样,人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染(如感冒和喉咙痛),同时它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病(如肺炎,支气管炎和细支气管炎),特别是在老年人和有免疫缺陷人群中,其发病率更高。
人类副流感I型病毒是单链的RNA病毒。病毒表面含有溶合酶和红血球凝聚素—神经氨酸苷酶的醣蛋白刺。从血清学上人类副流感病毒可分为I型、Ⅱ型、Ⅲ型、IV型,其中IV型又分a和b两个亚型。这些病毒颗粒大小不一(平均直径大小在150纳米~300纳米之间),形态各异。
目前为止,对于人类副流感I型病毒引起的呼吸道感染还没有特效药物,也没有制造出疫苗。而制造疫苗,就需要大规模培养人类副流感I型病毒。传统的培养方法是:细胞经逐级传代扩增,得到病毒接种后,经10~14天培养,然后再进行单批次收获。因人类副流感I型病毒病变不明显,产毒慢,培养周期长,成本高,严重影响了对人类副流感I型病毒疫苗的进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单,能对人副流感I型病毒进行大规模培养的方法,以满足对人副流感I型病毒疫苗的研究和制造需求。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的人副流感I型病毒大规模培养的方法包括下述步骤:
第一步,将人副流感I型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上,然后于37℃、5%CO2培养;
第二步,接种后,每天采用ELISA法检测上清中病毒效价,绘制病毒增殖曲线;
第三步,培养至第7天,收取病毒培养上清,使用胰酶消化液消化细胞,按1:4-5进行带毒细胞的传代扩增,然后于37℃、5%CO2培养;
第四步,重复第二步收取病毒液,重新添加病毒培养液,或重复第三步进行带毒细胞的传代扩增至所需规模。
本发明的优点在于在病毒培养第7天进行带毒细胞的传代扩增,此时病毒效价较高,细胞活率也较好,较传统单批次收获,减少了细胞制备量,缩短了培养时间,提高了工作效率;同时本发明按1:4-5进行带毒细胞的传代扩增,无需重新接毒,可根据需要扩大规模,满足了对人副流感I型病毒疫苗进行深入研究和制造的需求。
具体实施方式
下面通过具体实例,对本发明方法作更加详细的说明,以便于本领域技术人员对本申请的理解。
本发明所述的人副流感I型病毒大规模培养的方法包括下述步骤::
第一步,将人副流感I型病毒于37℃快速融化后,按0.01MOI计算病毒接种量,将所需体积的毒种接种于长满单层的Vero细胞上,并补加含有2%小牛血清的病毒维持液,于37℃、5%CO2培养;
第二步,接种后第1天,无菌抽取培养上清,使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价,以后每天同步操作,绘制病毒增殖曲线。于第7天进行效价检测,酶免吸光值达到3.45,收取病毒培养液上清;若病毒维持液pH降低时,需要进行换液(病毒维持液),维持细胞活率;
第三步,收取病毒培养上清后,使用0.01mol/L的PBS冲洗细胞表面,弃去PBS后,加入胰酶消化液消化细胞,37℃放置5min,观察细胞呈细沙状散开,即为消化完成;加入含有2%小牛血清的病毒维持液,终止消化,然后按1:4~5进行第一次带毒细胞的传代扩增,然后于37℃、5%CO2培养;
第四步,当第三步扩增培养至第7天后收取病毒液,并使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价,酶免吸光值达到3.57;使用0.01mol/L的PBS冲洗细胞表面,弃去PBS后,加入胰酶消化液消化细胞,37℃放置5min,观察细胞呈细沙状散开,即为消化完成;加入含有2%小牛血清的病毒维持液,终止消化,然后按1:4-5进行第二次带毒细胞的传代扩增,然后于37℃、5%CO2培养;
第五步,当第四步扩增培养至第7天收取病毒液,并使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价,酶免吸光值达到3.78;显微镜观察细胞状态良好,无明显脱落、病变、死亡;使用0.01mol/L的PBS冲洗细胞表面,弃去PBS后,加入胰酶消化液消化细胞,37℃放置5min,观察细胞呈细沙状散开,即为消化完成;加入含有2%小牛血清的病毒维持液,终止消化,按1:4-5进行第三次带毒细胞的传代扩增,然后于37℃、5%CO2培养;
第六步,当第五步扩增培养至第7天收取病毒液,并使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价,酶免吸光值达到3.67;显微镜观察细胞状态良好,无明显脱落、病变、死亡,说明带毒细胞还有传代能力。因计划需求,终止继续传代培养。
结论:使用带毒细胞传代3次,每次培养的第7天,培养上清中病毒液效价基本相当,说明人副流感I型病毒培养细胞带毒传代在细胞生长和维持活率的同时,病毒分泌量也能稳定,同时培养规模扩大了64倍。
Claims (1)
1.一种人副流感I型病毒大规模培养的方法,其特征在于:包括下述步骤:
第一步,将人副流感I型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上,然后于37℃、5%CO2培养;
第二步,接种后,每天采用ELISA法检测上清中病毒效价,绘制病毒增殖曲线;
第三步,培养至第7天,收取病毒培养上清,使用胰酶消化液消化细胞,按1:4-5进行带毒细胞的传代扩增,然后于37℃、5%CO2培养;
第四步,重复第二步收取病毒液,重新添加病毒培养液,或重复第三步进行带毒细胞的传代扩增至所需规模。
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