CN104428424A - 目标核酸的检测方法 - Google Patents

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CN104428424A CN201380034120.7A CN201380034120A CN104428424A CN 104428424 A CN104428424 A CN 104428424A CN 201380034120 A CN201380034120 A CN 201380034120A CN 104428424 A CN104428424 A CN 104428424A
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Abstract

本发明公开了即使减少检测探针的使用量，也不降低检测灵敏度(S/N比)，能够高灵敏度地检测目标核酸的目标核酸的检测方法。通过使用与目标核酸杂交的检测探针以及固定于支持体的捕捉探针的夹心杂交法来进行的目标核酸的检测方法中，检测探针和/或捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团，具有对目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体进行光照射，从而在光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键的工序。

Description

目标核酸的检测方法
技术领域
本发明涉及利用夹心杂交法的目标核酸的检测方法。
背景技术
各种生物的遗传信息分析的研究已经开始，关于以人类基因为首的大量基因及其碱基序列、还有由基因序列所编码的蛋白质和由这些蛋白质二次加工成的糖链的信息正在迅速被阐明。对于序列被阐明的基因、蛋白质、糖链等高分子体的功能，可以通过各种方法来调查。作为主要的方法，对于核酸，可以利用RNA印迹(northern bloting)、或者DNA印迹(southernbloting)这样的各种核酸/核酸间的互补性来调查各种基因与其生物体功能表达的关系。对于蛋白质，可以利用以蛋白质印迹(western bloting)为代表的蛋白质/蛋白质间的反应来调查蛋白质的功能和表达。
作为核酸检测方法之一，已知夹心杂交法。夹心杂交法使用被固定于过滤器上的捕捉探针。捕捉探针与目标核酸的第1部分互补。在一个阶段中，使结合于过滤器的捕捉探针暴露于应对于目标核酸序列进行调查的样品，进一步暴露于与目标核酸的第2部分互补的带有标记的检测探针，但前述的第2部分与第1探针所互补的目标部分不同(即，与它们不重复)(专利文献1、2、非专利文献1)。该方法消除了在过滤器上固定化样品所需的工夫，另外可以选择第1探针使其适合支持体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第4,486,539号
专利文献2：日本特开平7-75600号公报
非专利文献
非专利文献1：Sinikka Parkkinen et al.,Journal of Medical Virology20:279-288(1986)
发明内容
发明要解决的课题
目前，在捕捉探针固定化支持体上使用夹心杂交法来检测目标核酸时，为了提高检测灵敏度，必须使用相对于目标核酸量为过量的检测探针。例如，根据文献(日本特开2001-69997号公报)，相对于目标核酸量，需要25万倍当量的检测探针。但是，如果使用过量的检测探针，则剩余的检测探针与用于捕捉其他目标核酸的捕捉探针交叉杂交(非特异性吸附)，其结果存在检测灵敏度(S/N比)降低这样的课题。
本发明的目的是提供即使减小检测探针的使用量，也不降低检测灵敏度(S/N比)，能够高灵敏度地检测目标核酸的目标核酸的检测方法。
用于解决课题的方法
本申请发明者们进行深入研究的结果发现，在夹心杂交法中，通过在目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体中，在检测探针和/或捕捉探针中替换了核酸碱基的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间通过光照射而形成共价键，从而不使用过量的检测探针也能够高灵敏度地检测目标核酸，于是完成了本发明。
即，本发明提供以下(1)～(4)。
(1)目标核酸的检测方法，是通过夹心杂交法来检测目标核酸的方法，所述夹心杂交法使用与目标核酸杂交的检测探针以及固定于支持体的捕捉探针，
检测探针和/或捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团，
该检测方法具有对目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体进行光照射，从而在光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键的工序。
(2)根据(1)所述的检测方法，检测探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团。
(3)根据(2)所述的检测方法，捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的检测方法，光反应性基团是选自3-氰基乙烯基咔唑基、对氨基甲酰基乙烯基苯酚基、4,5’,8-三甲基补骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基乙烯基尿嘧啶基中的至少1种。
发明的效果
根据本发明，能够降低使用的检测探针的量，因而能够抑制与捕捉探针的交叉杂交(非特异性吸附)。其结果能够提高检测灵敏度(S/N比)，所以能够高灵敏度地检测微量的目标核酸。
具体实施方式
作为供于本发明的检测方法的目标核酸，可列举例如，病原菌和/或病毒等的基因、遗传病的病原基因等及其一部分等，但不限于这些。另外，作为包含这些目标核酸的样本，可列举血液、血清、血浆、尿、粪便、脑脊液、唾液、粘液、各种组织液等体液、和/或各种组织、石蜡包埋样本(FFPE)及其切片、各种饮食物以及它们的稀释物等，但不限于这些。另外，成为被检物质的目标核酸可以是从血液和/或细胞通过常规方法提取的样本核酸，也可以使用从样本提取的DNA和/或RNA等。作为DNA，可以使用染色体DNA、病毒DNA、细菌、霉等的DNA、将RNA进行逆转录而得的cDNA、作为它们的一部分的片段等，但不限于这些。作为RNA，可以使用信使RNA、核糖体RNA、小RNA(small RNA)和/或作为它们的一部分的片段等，但不限于这些。另外，化学合成的DNA或者RNA等也可以作为目标核酸使用。
所述样本核酸有时还包含除了作为测定对象的目标核酸以外的核酸成分(非目标核酸)。这些非目标核酸既可以考虑与目标核酸的性状的差而除去，也可以不除去地作为被检物质使用。
目标核酸也可以是以该目标核酸作为模板通过PCR等核酸扩增法进行扩增而得的，这种情况下，可以大幅提高测定灵敏度。在以核酸扩增产物作为目标核酸的情况下，通过在用荧光物质等进行了标记的核苷三磷酸的存在下进行扩增，可以将扩增核酸进行标记。
本发明的方法可以在区别目标核酸的有无、病毒的基因型、细菌的种和株、霉的种和株等的检测、SNP(单碱基多态性)的检测、信使RNA的检测、miRNA的检测、CGH、拷贝数变化、基因组DNA序列的缺失·重复·融合、或者转录产物的缺失·重复·融合的检测中使用。另外，通过测定来自检测探针的信号强度，还可以应用于目标核酸的定量。此外，如果进行目标核酸的定量，则必然要进行目标核酸的检测，因此本发明的“检测方法”也包含伴随定量的情况。
本发明的方法中可以直接应用目标核酸，也可以应用目标核酸的片段化处理物。对于目标核酸的长度，只要捕捉探针、检测探针能杂交就不特别限制，在目标核酸较长的情况(1500个碱基以上、特别是4000个碱基以上的情况)下，优选应用通过片段化处理而片段化成如后述那样适当的长度而得的片段化处理物。片段化处理物不需要从产生的核酸片段中选择特定的核酸片段，可以将片段化处理物直接供于本发明的方法，从而可以提高检测灵敏度。
作为为了片段化而将目标核酸切断的方法，可以使用照射超声波而切断的方法、用酶切断的方法、用限制性酶切断的方法、使用雾化器的方法、用酸和/或碱切断的方法等。在用超声波切断的方法的情况下，可以通过控制照射于目标核酸的超声波的输出强度和照射时间来切断成所期望的长度。
支持体可以使用载玻片、膜、珠等。对支持体的材质不特别限定，可列举玻璃、陶瓷、硅等无机材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅胶等聚合物等。通过使用将多种捕捉探针固定于支持体上而成的微阵列，能够同时检测多种目标核酸。
本发明的目标核酸的检测方法优选应用夹心杂交法。在夹心杂交法中，使用固定于支持体的捕捉探针、以及检测探针。捕捉探针、检测探针是通常分别具有与目标核酸的不同部分互补的碱基序列，能与目标核酸杂交而选择性地结合的物质。目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交，形成复合体。通过检测(测定)与该复合体中的检测探针结合的标记体，能够检测目标核酸。
在本发明中，作为捕捉探针，具体可以使用DNA、RNA、PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)等的核酸衍生物。这里衍生物在核酸的情况下，是指利用荧光基团等形成的标识化衍生物、包含修饰核苷酸(例如受到了包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸和碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的替换等的核苷酸等)的衍生物等化学修饰衍生物。
具有特定碱基序列的单链核酸，与具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性地杂交而结合，因此相当于本发明中所说的捕捉探针。本发明中使用捕捉探针可以是市售的，另外，也可以是从活细胞等得到的。作为捕捉探针，特别优选的是核酸。该核酸中，被称为寡核酸的长度为200个碱基以下的核酸可以用合成仪容易地人工合成。
捕捉探针可以含有与目标核酸序列互补的序列，也可以选择任何区域。优选与以下所述的检测探针的序列不重复。另外，还可以使用与目标核酸的不同区域杂交的多种捕捉探针。
在目标核酸是双链DNA或双链RNA的情况下，可以选择与正义链、反义链的任一链互补的序列作为捕捉探针。这种情况下，以下所述的检测探针与捕捉探针优选选择同一链的序列。
在将样本核酸所含的不同目标核酸进行区别检测的情况下，例如，将感染患者的病毒的型进行区别检测等，优选从样本核酸所能包含的核酸序列中选择特异性高的序列区域。即，是指，选作捕捉探针的序列，在样本核酸所含的全部序列中，在除了该区域以外不存在同源性高的序列。
本发明中使用的检测探针、捕捉探针中的任一核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团，或者检测探针、捕捉探针两者的核酸分子中的各有至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团。
这里，光反应性基团是通过特定波长的光照射而有机合成反应中的反应性被激活的有机基团(光反应性部位)。探针中的核酸碱基被替换为光反应性基团后的探针，能够与替换前的核酸碱基同样地与目标核酸杂交而形成复合体。对核酸碱基被替换为光反应性基团后的捕捉探针和/或检测探针与目标核酸杂交而形成的复合体照射能激活该光反应性基团的光反应性部位的波长的光，则该光反应性部位被激活，在该光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。
作为这样的光反应性基团，可列举3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物(WO2009/066447(EP2216338,US 2010-274000A)、Yoshinaga Yoshimuraet al.,Organic Letters 10:3227-3230(2008))、对氨基甲酰基乙烯基苯酚基(Takehiro Ami et al.,Organic&Biomolecular Chemistry5:2583-2586(2007))、4,5’,8-三甲基补骨脂素基(Akio Kobori et al.,Chemistry Letters 38:272-273(2009))以及N3-甲基-5-氰基乙烯基尿嘧啶基(Kenzo Fujimoto et al.,Chemical Communications:3177-3179(2005)等。这些文献通过参照而被引入本说明书中。其中，优选3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物(WO2009/066447)，特别优选3-氰基乙烯基咔唑基。
这里，3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物如WO2009/066447所记载的那样，是下述式(I)所示的基团。
式(I)中，Ra是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢；R1以及R2分别独立地是氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基或氢。在Ra是氰基、R1以及R2是氢的情况下是3-氰基乙烯基咔唑基。此外，在作为光反应性基团使用3-氰基乙烯基咔唑基或其衍生物时，优选以在捕捉探针或检测探针中的该碱基的5’侧邻接嘌呤碱基的方式设计。
对氨基甲酰基乙烯基苯酚基是下述式(II)所示的基团。
4,5’,8-三甲基补骨脂素基是下述式(III)所示的基团。
N3-甲基-5-氰基乙烯基尿嘧啶基是下述式(IV)所示的基团。
这些光反应性基团是与构成核酸的核苷酸中的碱基原封不动地替换的基团，式(I)～(IV)所示的各光反应性基团中的自由的结合键与核苷酸中的糖部分直接键合。例如，式(I)所示的3-氰基乙烯基咔唑基(式(I)中，Ra为氰基、R1以及R2为氢的基团)与脱氧核糖如下结合。其他光反应性基团也同样地与糖结合。
上述的各光反应性基团以及它们与脱氧核糖等糖的结合物可以通过上述各个文献所记载的公知的方法来制造。此外，这些公知的方法是按照有机化学合成的常识的通常的合成方法。
例如，通式(V)中的3-氰基乙烯基咔唑基，在WO2009/066447的实施例中，通过将3-碘咔唑(3.52mmol)与丙烯腈(7.04mmol)在二烷中、在三苯基膦(0.53μmol)、乙酸钯(0.18μmol)以及三乙胺(4.23mmol)存在下以75℃加热回流11.5小时来制造。另外，3-氰基乙烯基咔唑与脱氧核糖的结合，在同一实施例中，通过在乙腈中，将3-氰基乙烯基咔唑(1.20mmol)与Hoffer’s chlorosugar(将脱氧核糖的1位的羟基替换为氯、将脱氧核糖的3位和6位的羟基替换为对甲苯酰氧基而得的物质)(1.24mmol)在KOH(3.87mmol)和TDA-1(34μmol)的存在下在室温搅拌20分钟，接着，在甲醇中，加入NaOMe(1.2mmol)在室温搅拌3.5小时，使脱氧核糖的3位和6位的羟基脱保护来制造。对氨基甲酰基乙烯基苯酚与脱氧核糖的结合物，在Takehiro Ami et al.,Organic&Biomolecular Chemistry 5:2583-2586(2007)所记载的方法中，同样地，通过使对碘苯酚与Hoffer’s chlorosugar反应而结合，再使其与甲基丙烯酸甲酯反应来制造。4,5’,8-三甲基补骨脂素基与脱氧核糖的结合物，在Akio Kobori et al.,Chemistry Letters38:272-273(2009)所记载的方法中，同样地使3-碘-4,5’,8-三甲基补骨脂素与Hoffer’s chlorosugar反应来制造。N3-甲基-5-氰基乙烯基尿嘧啶基与脱氧核糖的结合物，在Kenzo Fujimoto et al.,Chemical Communications:3177-3179(2005)所记载的方法中，同样地使2-碘-N3-甲基尿嘧啶核苷与丙烯腈反应来制造。在脱氧核糖是其他糖(例如核糖等)的情况下，也可以同样地获得光反应性基团与糖的结合物。
如果得到光反应性基团与糖的结合物，则包含该结合物的核酸可以通过作为常规方法的亚磷酰胺法而容易地制造。例如，上述式(V)所示的3-氰基乙烯基咔唑与脱氧核糖的结合物，在WO2009/066447的实施例中，通过在吡啶中，使该结合物(0.29mmol)、4,4-二甲氧基三苯甲基氯(0.35mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶在室温下反应18小时，对脱氧核糖的6位的羟基进行保护，将其(0.17mmol)在乙腈中与2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(0.17mmol)在室温下搅拌1小时，从而制造所需的亚磷酰胺化物。其他光反应性基团与脱氧核糖的结合物也可以同样地进行亚磷酰胺化。亚磷酰胺化是常规方法，用于该方法的试剂也有市售，所以可以容易地进行。
得到了作为光反应性基团与糖的结合物的亚磷酰胺化物，则可以使用市售的寡核苷酸合成仪，来合成具有所需的碱基序列的核酸。
此外，具有光反应性基团的核酸自身是作为阻碍所需的基因等的表达的试剂使用的周知的物质，包含光反应性基团、具有所需的碱基序列的核酸的合成作为商业服务被提供，通过委托进行该商业服务的公司来合成具有所需的碱基序列、且在所需的位置导入了所需的光反应性基团的核酸，也可以获得该核酸。
在本发明中，作为检测探针，具体可以使用DNA、RNA、PNA、LNA等的核酸衍生物。这里衍生物在核酸的情况下，是指利用荧光基团等形成的标识化衍生物、包含修饰核苷酸(例如受到了包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸和碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的替换等的核苷酸等)的衍生物等的化学修饰衍生物。
具有特定碱基序列的单链核酸，可以与具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性地杂交而结合，因此相当于本发明中所说的检测探针。本发明中使用的检测探针可以是市售的，另外，也可以是从活细胞等中获得的。作为检测探针，特别优选的是核酸。该核酸中，被称为寡核酸的长度为200个碱基以下的核酸可以用合成仪容易地合成。
在目标核酸是双链DNA的情况下，可以选择与正义链、反义链的任一链互补的序列作为检测探针。这种情况下，上述的捕捉探针与检测探针优选选择同一链的序列。
检测探针包含与目标核酸序列互补的序列即可，可以选择任意区域。但是，优选与上述的捕捉探针的序列不重复。
检测探针的序列希望与捕捉探针的碱基序列的同源性低，优选为20％以下，更优选为10％以下。这里，2个碱基序列的同源性，是以碱基尽可能多地一致的方式使2个序列对齐(根据需要导入间隙)，将一致的碱基数除以总碱基数(在2个碱基序列的碱基数不同时为较大的碱基序列的碱基数)而得的数值，可以通过FASTA、BLAST等市售的软件(在互联网也有提供)容易地算出。
在检测样本核酸所含的多种目标核酸的情况下，可以使用在检测对象的目标核酸之间同源性为100％的序列作为通用检测探针。在通用检测探针在检测对象的目标核酸之间同源性不是100％的情况下，也可以使用简并序列。关于简并序列可以参考“バイオ実験イラストレイテッド本当にふえるPCR”、(1999年)、中山广树编、(株)秀润社发行、121页～125页。
检测探针可以结合标记体。在检测探针是核酸的情况下，可以在5’末端或3’末端的任一端、或两端结合标记体。另外，也可以在检测探针内部导入标记体。标记体的结合可以使用化学反应、酶反应等。优选使用化学反应使其反应。进一步优选在化学合成检测探针时，在末端结合标记体。也可以在检测探针的内部结合标记体。标记体的结合可以使用化学反应，可以用合成仪插入生物素标记。例如，可以使用能从グレンリサーチ社获得的BiotinTEG Phosphoramidite、Biotin Phosphoramidite,Biotin-dT等来插入生物素标记。
针对一种目标核酸，检测探针可以使用一种碱基序列或同时使用多种碱基序列。在使用多种检测探针时，各个检测探针的碱基序列当然可以链长不同。为了提高目标核酸的检测的S/N比，优选使用多种检测探针。
在本发明中，作为能使用的标记体，可以使用蛋白质结合性物质、荧光色素、磷光色素、放射线同位素等用于标记的公知的物质。优选的是蛋白质结合性物质。作为蛋白质结合性物质的例子可列举生物素。生物素能够与亲和素或链霉亲和素结合。还可以使用在亲和素或链霉亲和素上结合了荧光色素的物质、结合了碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶的物质。在使用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶的情况下，添加各自的底物，底物与酶反应，结果产生发光反应。发光反应使用酶标仪、CCD照相机等来检测。
作为标记体可以使用测定简便、信号容易检测的荧光色素。具体可列举菁(菁2)、氨基甲基香豆素、萤光素、吲哚碳菁(菁3)、菁3.5、四甲基罗丹明、罗丹明红、德克萨斯红、吲哚碳菁(菁5)、菁5.5、菁7、オイスター(牡蛎)、BODIPY系色素、藻红蛋白等公知的荧光色素。荧光色素的检测可以用荧光显微镜和/或荧光扫描仪等来进行。
另外，作为标记体可以使用具有发光性的半导体微粒。作为这样的半导体微粒，可列举例如硒化镉(CdSe)、碲化镉(CdTe)、铟镓磷(InGaP)、黄铜矿系微粒、硅(Si)等。
将检测到的信号与周围噪声进行比较。具体地，将从固定有捕捉探针的基板上的位置得到的信号值、与从未固定捕捉探针的基板上的位置得到的信号值(噪声值)进行比较，将前者的数值与噪声值的比作为S/N比。
作为在支持体上固定化捕捉探针的方法，已知在支持体上面部合成寡核酸的方法、将预先合成好的寡核酸向支持体上面部滴加并进行固定的方法，任一种均可以适用。前者的方法有Ronald等的方法(美国专利第5705610号说明书)、Michel等的方法(美国专利第6142266号说明书)、Francesco等的方法(美国专利第7037659号说明书)。这些方法中在DNA合成反应时使用有机溶剂，因此支持体期望是对有机溶剂有耐性的材质。例如，可以使用利用日本特表平10-503841号公报所记载的方法制作的有凹凸结构的玻璃制支持体。特别是在Francesco等的方法中从支持体的背面照射光，控制DNA合成，因此支持体优选是具有透光性的材质。后者的方法可列举广田等的方法(日本特许第3922454号)和/或利用玻璃毛细管的方法。作为玻璃毛细管的一例，可以使用自制的玻璃毛细管和/或微量移液器((株)マイクロサポート社制；MP-005)等市售制品，但不限于这些方法。
从活细胞制备DNA或RNA可以通过公知的方法来进行，例如DNA的提取可以通过Blin等的方法(Blin等，Nucleic Acids Res.3：2303(1976))等来进行，另外，RNA的提取可以通过Favaloro等的方法[Favaloro等,Methods Enzymol.65:718(1980)]等来进行。作为固定化的核酸，进一步可以使用链状或环状的质粒DNA和/或染色体DNA、将它们通过限制性酶切断或化学地切断而得的DNA片段、在试管内通过酶等合成的DNA、或化学合成的寡核苷酸等。
本发明的检测方法可以利用夹心杂交法。夹心杂交法本身是周知的，使目标核酸中的2个不同区域分别与检测探针和捕捉探针杂交，将目标核酸用检测探针和捕捉探针夹心，以定量检测探针，从而定量目标核酸。本发明的方法具有对目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体进行光照射，从而在检测探针和/或捕捉探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键的工序。光照射可以根据所使用的光反应性基团，以包含该光反应性基团能被激活的波长的光进行。例如，作为光反应性基团使用3-氰基乙烯基咔唑基时，使用波长340～380nm的光。在使用上述的其他光反应性基团时，也可以使用波长340～380nm的光。作为光照射的装置，可以使用能够照射包含所述波长的光的透照仪、黑光灯、UV-LED、UV激光器等。
本发明中，检测探针、捕捉探针的任一者，或者检测探针以及捕捉探针的两者的核酸碱基被替换为光反应性基团。即，本发明的方法可以采用以下任一方法：(A)包括在仅检测探针与目标核酸之间形成共价键的工序的方法、(B)包括在仅捕捉探针与目标核酸之间形成共价键的工序的方法、(C)包含在检测探针以及捕捉探针的两者与目标核酸之间形成共价键的各工序的方法。
作为本发明的核酸的检测方法的例子，通过将各探针与目标核酸的杂交顺序、与导入光反应性基团的探针的选择进行组合，从而可列举例如以下的方法(1)～(7)。
方法(1)：使目标核酸与检测探针杂交。接着，使与检测探针杂交了的目标核酸、与固定于支持体的、至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的捕捉探针杂交。对这样形成的复合体进行光照射，在捕捉探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。
方法(2)：使目标核酸与至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的检测探针杂交。对这里形成的复合体进行光照射，在检测探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。使形成了该共价键的复合体与固定于支持体的捕捉探针杂交。
方法(3)：使目标核酸与至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的检测探针杂交。对这里形成的复合体进行光照射，在检测探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。使形成了该共价键的复合体，与固定于支持体的、至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的捕捉探针杂交。对这里形成的复合体进行光照射，在捕捉探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。
方法(4)：使目标核酸与固定于支持体的捕捉探针杂交。使形成的复合体与至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的检测探针杂交。对这里形成的复合体进行光照射，在检测探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。
方法(5)：使目标核酸与固定于支持体的、至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的捕捉探针杂交。对这里形成的复合体进行光照射，在捕捉探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。使形成了该共价键的复合体与检测探针杂交。
方法(6)：使目标核酸与固定于支持体的、至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的捕捉探针杂交。对这里形成的复合体进行光照射，在捕捉探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。使形成了该共价键的复合体与至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的检测探针杂交。对这里形成的复合体进行光照射，在检测探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键。
方法(7)：使目标核酸、至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的检测探针、以及固定于支持体的、至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团的捕捉探针同时接触，使检测探针以及捕捉探针与目标核酸杂交。对形成的复合体进行光照射，在检测探针以及捕捉探针中的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间分别形成共价键。
这些方法之中，优选方法(1)～(3)，更优选方法(2)或(3)。
使目标核酸与捕捉探针和/或检测探针杂交的工序，可以与目前完全同样地进行。反应温度和时间可根据杂交的核酸的链长来适宜选择，在核酸的杂交的情况下，通常为30℃～70℃左右、1分钟～十几小时，在免疫反应的情况下，通常为室温～40℃左右、1分钟～几小时左右。
各杂交工序中的检测探针的使用量，如果考虑降低检测探针的交叉杂交，则优选相对于目标核酸较少。具体地，优选为目标核酸的1～10000当量(摩尔比)，更优选为1～1000当量，进一步优选为1～100当量。
实施例
以下显示实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
核酸的调制
表1显示以下的实施例、比较例中使用的核酸。
作为目标核酸，使用具有序列号1所示的碱基序列的合成DNA“T-01”、具有序列号2所示的碱基序列的合成DNA“T-02”以及人基因组DNA。T-01由日本バイオサービス社合成。T-02由日本バイオサービス社合成。
检测探针“D-01”、“D-02”、“D-05”、“D-06”、“D-09”、“D-10”、“D-11”、“D-12”是将5’末端以及3’末端进行了生物素标记(这里，3’末端为BiotinTEG标记)的合成DNA，由つくばオリゴサービス社合成。D-01是代替序列号3所示的碱基序列的第23位的碱基C，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基的合成DNA。D-02是代替序列号4所示的碱基序列的第3位的碱基A，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基的合成DNA。D-05是代替序列号5所示的碱基序列的第13位的碱基T，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基的合成DNA。D-06是代替序列号6所示的碱基序列的第13位的碱基T，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基的合成DNA。D-09是代替序列号7所示的碱基序列的第22位的碱基A，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基的合成DNA。D-10是代替序列号8所示的碱基序列的第23位的碱基T，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基的合成DNA。D-11是代替序列号9所示的碱基序列的第16位的碱基C，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基的合成DNA。D-12是代替序列号10所示的碱基序列的第21位的碱基T，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基的合成DNA。
检测探针“D-03”、“D-04”、“D-07”、“D-08”、“D-13”、“D-14”、“D-15”、“D-16”分别是具有序列号3、4、5、6、7、8、9、10所示的碱基序列，将5’末端以及3’末端进行了生物素标记(这里3’末端为BiotinTEG标记)的合成DNA，由オペロン社合成。
捕捉探针“C-01”是具有序列号11所示的碱基序列、在5’末端加入了氨基修饰的合成DNA，由オペロン社合成。
捕捉探针“C-02”是代替序列号12所示的碱基序列的第18位的碱基T，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基，5’末端进行了生物素标记的合成DNA，由つくばオリゴサービス社合成。
捕捉探针“C-03”是具有序列号12所示的碱基序列、5’末端进行了生物素标记的合成DNA，由オペロン社合成。
捕捉探针“C-04”是N’末端介由2分子的O接头(-NH(CH2CH2O)2CH2CO-)而进行了生物素标记、C’末端进行了赖氨酸修饰的PNA(肽核酸)，由PANAGENE社合成。
捕捉探针“C-05”是代替序列号13所示的碱基序列的第19位的碱基A，作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基、5’末端加入了氨基修饰的合成DNA，由つくばオリゴサービス社合成。
捕捉探针“C-06”、“C-07”、“C-08”、“C-09”、“C-10”是具有序列号13、14、15、16、17所示的碱基序列、5’末端加入了氨基修饰的合成DNA，由オペロン社合成。
表1
表1中，碱基序列中的“K”表示作为光反应性基团导入了3-氰基乙烯基咔唑基。另外，C-04中，N’末端以及C’末端分别表示PNA的氨基末端侧、羧基末端侧。
实施例1
在实施例1中，使目标核酸T-01与导入了光反应性基团的检测探针D-01以及D-02杂交，对形成的复合体进行光照射，在检测探针与目标核酸之间形成共价键，使该复合体与捕捉探针C-01杂交，检测目标核酸。
DNA芯片的制作
使用在东丽株式会社制的“3D-Gene”(注册商标)的基板(256柱基板)上固定了C-01作为捕捉探针的DNA芯片。
杂交与检测
将T-01(10μM)、与D-01(100μM)以及D-02(100μM)以相对于T-01的D-01、D-02的各使用量为1摩尔当量的方式混合，用10mM磷酸缓冲液(含有100mM氯化钠)稀释。将所得的溶液调整为0.1、1、100amol的3组摩尔浓度(各自的总液量为5μL)，分别进行以下的操作。
将混合溶液在95℃保持5分钟进行热激，然后缓慢冷却到室温，将所得的混合溶液溶液移至玻璃管，用透照仪照射365nm(10μW/cm2)的光20分钟。在这些溶液中加入1×杂交溶液(1重量％BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC、1重量％SDS(十二烷基硫酸钠)、50ng/ml鲑鱼精DNA的溶液、5重量％葡聚糖硫酸钠、30％甲酰胺)35μL，作为杂交用溶液。将该杂交用溶液的总量注入DNA芯片，放入在32℃加温的孵化器中。杂交按照“3D-Gene”的标准方案，一边以250转/分钟旋转搅拌，一边以32℃进行2小时。杂交后，将DNA芯片用加温至30℃的洗涤液(0.5×SSC、0.1重量％SDS(十二烷基硫酸钠))洗涤5分钟，然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。再准备将链霉亲和素藻红蛋白(プロザイム社)添加到染色溶液(50ng/μl链霉亲和素藻红蛋白、100mM MES，1M NaCl，0.05重量％Tween20、2mg/mlBSA(牛血清白蛋白))中而得的溶液，滴加到DNA芯片上。在35℃孵育5分钟。用加温至30℃的洗涤液(6×SSPE、0.01重量％Tween20)洗涤5分钟，然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。染色后的DNA芯片使用DNA芯片扫描仪(东丽)检测荧光信号。扫描仪的设定为激光器输出100％、光电倍增管的电压设定为70％。
目标核酸T-01的检测结果示于表2。表2中的数字显示S/N比。S/N比，是作为在固定了捕捉探针的基板上的位置检测到的信号值、与在未固定捕捉探针的基板上的位置检测到的信号值的比而算出的。S/N比小于等于1时，表示不能检测到目标核酸。
通过光照射而在目标核酸与检测探针之间形成共价键，从而即使检测探针相对于目标核酸的使用量是与目前相比非常少的1摩尔当量，也能够在0.1、1、100amol的各浓度检测目标核酸。
比较例1
除了在实施例1中，作为检测探针使用D-03代替D-01，使用D-04代替D-02，另外不进行对杂交所形成的复合体光照射而在检测探针与目标核酸之间形成共价键的工序以外，进行与实施例1同样的操作，将相对于目标核酸T-01为1摩尔当量的D-03以及D-04混合而调制混合溶液，检测目标核酸T-01。
另外，同样地，将相对于目标核酸T-01为1000摩尔当量的D-03以及D-04混合而调制混合溶液，检测目标核酸T-01。
以上的结果示于表2。
在比较例1中，使用1摩尔当量的检测探针时，与实施例1相比S/N比大幅降低，在1amol的浓度不能检测T-01。另外，即使在增加检测探针的使用量至1000摩尔当量的情况下，与实施例1相比S/N比也大幅降低，在0.1amol的浓度下不能检测T-01。
表2
由以上的实施例1以及比较例1的结果可知，在夹心杂交中，通过对目标核酸与导入了光反应性基团的检测探针杂交而形成的复合体进行光照射，而在检测探针与目标核酸之间形成共价键，从而即使减少所使用的检测探针量，也能够检测微量的目标核酸，另外能够高灵敏度地检测目标核酸。
实施例2
在实施例2中，使目标核酸T-01、与检测探针D-03以及D-04杂交而形成的复合体，与导入了光反应性基团的捕捉探针C-02杂交，对所形成的复合体进行光照射，在捕捉探针与目标核酸之间形成共价键，检测目标核酸。
捕捉探针固定珠的制作
使用在亲和素涂覆珠(サーモサイエンティフィック社制)上固定C-02作为捕捉探针，用生物素水溶液进行封闭处理而得的捕捉探针固定珠。
杂交与检测
将T-01(10μM)与作为检测探针的D-03(100μM)以及D-04(100μM)以相对于T-01的D-03、D-04的各使用量为1摩尔当量的方式混合，用10mM磷酸缓冲液(含有100mM氯化钠)稀释，使总液量为200μL，T-01的终浓度为0.25μM。将该混合溶液在95℃保持5分钟进行热激，然后缓慢冷却至室温。在“オムニフィット”(株式会社アイシス的注册商标)玻璃柱(内径3mm、两末端有2μm的不锈钢片的柱塞)中，放入固定了C-02的珠，加入上述混合溶液(200μL)后，一边搅拌5分钟，一边用黑光灯照射365nm的光。将溶液过滤后，将上述珠用50％DMSO水溶液清洗后，添加Cy3-链霉亲和素的水溶液(0.01μM)进行染色。将溶液过滤后，将上述珠用50％DMSO水溶液清洗。染色后的珠使用搭载了CCD照相机的荧光显微镜(オリンパス社制)进行检测。其结果示于表3。
实施例3
在实施例3中，使目标核酸T-01、与导入了光反应性基团的检测探针D-01以及D-02杂交，对形成的复合体进行光照射，在检测探针与目标核酸之间形成共价键，使该复合体与捕捉探针C-03杂交，检测目标核酸。
捕捉探针固定珠的制作
使用在亲和素涂覆珠(サーモサイエンティフィック社制)上固定C-03，用生物素水溶液进行封闭处理而得的捕捉探针固定珠。
杂交与检测
将T-01(10μM)、与D-01(100μM)以及D-02(100μM)以相对于T-01的D-01、D-02的各使用量为1摩尔当量的方式混合，用10mM磷酸缓冲液(含有100mM氯化钠)稀释，使总液量为400μL，T-01的终浓度为0.25μM。将该混合溶液在95℃保持5分钟进行热激，然后缓慢冷却至室温，将所得的混合溶液移至玻璃管，用透照仪照射365nm(10μW/cm2)的光20分钟。在“オムニフィット”玻璃柱(内径3mm、两末端有2μm的不锈钢片的柱塞)中加入固定了C-03的珠，加入上述混合溶液(200μL)后，搅拌5分钟。将溶液过滤后，将上述珠用50％DMSO水溶液清洗后，添加Cy3-链霉亲和素的水溶液(0.01μM)进行染色。将溶液过滤后，将上述珠用50％DMSO水溶液清洗。染色后的珠使用荧光显微镜(オリンパス社制)进行检测。其结果示于表3。
实施例4
除了在实施例3中，作为捕捉探针使用C-04代替C-03以外，进行与实施例3同样的操作，检测目标核酸T-01。其结果示于表3。
实施例5
在实施例5中，使目标核酸T-01、与导入了光反应性基团的检测探针D-01以及D-02杂交，对形成的复合体进行光照射，在检测探针与目标核酸之间形成共价键，进一步使该复合体与导入了光反应性基团的捕捉探针C-02杂交，对所形成的复合体进行光照射，在捕捉探针与目标核酸之间共价键，检测目标核酸。
捕捉探针固定珠的制作
使用在亲和素涂覆珠(サーモサイエンティフィック社制)上固定C-02作为捕捉探针，用生物素水溶液进行封闭处理而得的捕捉探针固定珠。
杂交与检测
将T-01(10μM)、与D-01(100μM)以及D-02(100μM)以相对于T-01的D-01、D-02的各使用量为1摩尔当量的方式混合，用10mM磷酸缓冲液(含有100mM氯化钠)稀释，使总液量为200μL，T-01的终浓度为0.25μM。将该混合溶液在95℃保持5分钟进行热激，然后缓慢冷却至室温，将所得混合溶液移至玻璃管，用透照仪照射365nm(10μW/cm2)的光20分钟。在“オムニフィット”玻璃柱(内径3mm、两末端有2μm的不锈钢片的柱塞)中放入固定了C-02的珠，加入上述混合溶液(200μL)后，一边搅拌5分钟，一边用黑光灯照射365nm的光。将溶液过滤后，将上述珠用50％DMSO水溶液清洗后，添加Cy3-链霉亲和素的水溶液(0.01μM)，染色。将溶液过滤后，将上述珠用50％DMSO水溶液清洗。染色后的珠使用荧光显微镜(オリンパス社制)进行检测。其结果示于表3。
比较例2
除了在实施例2中，作为捕捉探针使用C-03代替C-02，另外不进行对杂交所形成的复合体光照射而在捕捉探针与目标核酸之间形成共价键的工序以外，进行与实施例2同样的操作，将相对于目标核酸T-01为1摩尔当量的D-03以及D-04混合而调制混合溶液，检测目标核酸T-01。
另外，同样地，将相对于目标核酸T-01为100摩尔当量的D-03以及D-04混合而调制混合溶液，检测目标核酸T-01。以上的结果示于表3。
表3
实施例2～5的任一情况下，通过在检测探针和/或捕捉探针与目标核酸之间形成共价键，从而即使检测探针相对于目标核酸的量为1摩尔当量，也能够高灵敏度地检测0.05nmol的浓度的目标核酸。另外，可知在仅检测探针与目标核酸之间形成共价键的情况、在仅捕捉探针与目标核酸之间形成共价键的情况、在检测探针以及捕捉探针的两者与目标核酸之间形成共价键的情况的任一情况，均能够以高灵敏度检测目标核酸。特别在与检测探针以及捕捉探针两者形成共价键的情况下，能够高灵敏度地检测。进而，作为探针不仅可以使用核酸，也可以使用肽核酸。
另一方面，在比较例2中使用1当量的检测探针时，与各实施例相比，S/N比大幅降低。另外，在使用100当量的检测探针时，S/N比与实施例相比也相当低，即使增加检测探针的使用量，检测灵敏度也不改善。
如上可知，在夹心杂交中，通过对目标核酸与导入了光反应性基团的检测探针和/或检测探针杂交而形成的复合体进行光照射，在检测探针和/或检测探针与目标核酸之间形成共价键，从而即使在减少了所使用的检测探针量的情况下，也能够高灵敏度地检测微量的目标核酸。
实施例6
除了在实施例1中，使用T-02代替T-01作为目标核酸，使用D-05以及D-06代替D-01以及D-02作为检测探针，使用C-05代替C-01作为捕捉探针，以及将T-02(10μM)与D-05(100μM)以及D-06(100μM)以相对于T-02的D-05、D-06的各使用量为1摩尔当量方式混合，用10mM磷酸缓冲液(含有100mM氯化钠)稀释，将所得的溶液调制成0.1、0.01amol的2组摩尔浓度，在DNA芯片上杂交后，将DNA芯片用黑光灯照射365nm的光5分钟以外，进行与实施例1同样的操作，检测目标核酸T-02。其结果示于表4。
通过光照射在目标核酸与检测探针、以及目标核酸与捕捉探针之间形成共价键，从而即使检测探针相对于目标核酸的使用量是与目前相比非常少的1摩尔当量，也能够在0.1、0.01amol的各浓度检测目标核酸。
比较例3
除了在实施例6中，使用D-07以及D-08代替D-05以及D-06作为检测探针，使用C-06代替C-05作为捕捉探针，不进行对杂交所形成的复合体光照射而在检测探针与目标核酸之间形成共价键的工序，另外在DNA芯片上杂交后，不进行对DNA芯片光照射而在捕捉探针与目标核酸之间形成共价键的工序以外，进行与实施例6同样的操作，检测目标核酸T-02。
另外，同样地，对目标核酸T-02混合10万摩尔当量的D-07以及D-08而调制混合溶液，检测目标核酸T-02。以上结果示于表4。
在比较例3中，不仅在使用1摩尔当量的检测探针时，即使在使用10万摩尔当量时，与实施例6相比S/N比也大幅降低，不能检测T-02。
表4
由以上的实施例6以及比较例3的结果可知，在夹心杂交中，通过对目标核酸与导入了光反应性基团的检测探针杂交而形成的复合体进行光照射而在检测探针与目标核酸之间形成共价键，并且在DNA芯片上对目标核酸与导入了光反应性基团的捕捉探针杂交而形成的复合体进行光照射而在捕捉探针与目标核酸之间形成共价键，从而即使在减少了所使用的检测探针量的情况下，也能够高灵敏度地检测微量的目标核酸。
实施例7
研究本发明在SNPs(单核苷酸多态性，single nucleotidepolymorphisms)检测中的应用。在本实施例中由于使用人基因组DNA，因而目标核酸是双链核酸。
DNA芯片的制作
使用在东丽株式会社制的“3D-Gene”(注册商标)的基板(256柱基板)上固定了表1的捕捉探针C-07(野生型)、C-08(Gly12Ser突变型)、C-09(Gly12Arg突变型)、C-10(Gly12Cys突变型)的DNA芯片。
样本DNA的制备
作为样本DNA使用从A549细胞提取的DNA。已知A549细胞是来源于肺癌组织的培养细胞，发生了Gly12Ser的突变。将从A549细胞提取的5μg的DNA通过超声波处理(コバリス、s220)而片段化，将片段化后的基因组DNA中的600ng用于检测。片段化的处理条件按照制造商推荐的方法。片段的长度使用生物分析仪(アジレント社)进行评价。此外，已知一个细胞包含2pg的DNA。另外由于SNPs基因在每1个细胞中存在2拷贝，因而基因组DNA 600ng中包含SNPs基因的序列1amol。
杂交与检测
以相对于基因组DNA 600ng(1amol)，检测探针D-09、D-10、D-11、D-12的各使用量为100摩尔当量(即各检测探针为100amol)的方式调制样本DNA(各自的总液量为5μL)，分别进行以下的操作。
将混合溶液在95℃保持5分钟进行热激，然后缓慢冷却至室温，将所得的混合溶液移至玻璃管中，用透照仪照射365nm(10μW/cm2)的光20分钟。在这些溶液中加入1×杂交用溶液(1重量％BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC、0.1重量％SDS(十二烷基硫酸钠)、50ng/ml鲑鱼精DNA的溶液、5重量％葡聚糖硫酸钠、30％甲酰胺)35μL，作为杂交用溶液。将该杂交用溶液的总量注入DNA芯片，放置在以32℃加温的孵化器中。杂交按照“3D-Gene”的标准方案，一边以250转/分钟旋转搅拌一边在32℃进行2小时。杂交后，将DNA芯片用加温至30℃的洗涤液(0.5×SSC、0.1重量％SDS(十二烷基硫酸钠))洗涤5分钟，然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。进而，准备将链霉亲和素藻红蛋白(プロザイム社)添加在染色溶液(50ng/μl链霉亲和素藻红蛋白、100mM MES，1M NaCl，0.05重量％Tween20、2mg/mlBSA(牛血清白蛋白))中而得的溶液，滴加于DNA芯片上。在35℃孵育5分钟。用加温至30℃的洗涤液(6×SSPE、0.01重量％Tween20)洗涤5分钟，然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。染色后的DNA芯片使用DNA芯片扫描仪(东丽)检测荧光信号。扫描仪的设定为激光器输出100％、光电倍增管的电压设定为70％。
目标核酸的检测结果示于表5。Gly12Ser突变的捕捉探针“C-08”的S/N比最高。已知A549细胞加入了Gly12Ser突变，与本检测结果一致。
通过光照射而在目标核酸与检测探针之间形成共价键，从而即使检测探针相对于目标核酸的使用量是与目前相比较少的100摩尔当量，也能够检测作为双链核酸的基因组DNA，并且能够正确地检测SNPs。
比较例4
除了在实施例7中，使用D-13、D-14、D-15、D-16代替D-09、D-10、D-11、D-12作为检测探针，不进行对杂交所形成的复合体光照射而在检测探针与目标核酸之间形成共价键的工序以外，进行与实施例7同样的操作，检测目标核酸。
另外，同样地，按照现有方法对目标核酸混合10万摩尔当量的D-13、D-14、D-15、D-16而调制混合溶液，检测目标核酸。以上结果示于表5。
在比较例4中，当使用100摩尔当量的检测探针时，野生型的捕捉探针C-07的S/N比最高，Gly12Ser突变完全不能检测。即使使用10万摩尔当量的检测探针时，与实施例7相比S/N比也大幅降低，不能检测Gly12Ser突变。
表5
序列表自由文本
序列号1：合成DNA
序列号2：合成DNA
序列号3：合成DNA(5’末端以及3’末端生物素化)
序列号4：合成DNA(5’末端以及3’末端生物素化)
序列号5：合成DNA(5’末端以及3’末端生物素化)
序列号6：合成DNA(5’末端以及3’末端生物素化)
序列号7：合成DNA(5’末端以及3’末端生物素化)
序列号8：合成DNA(5’末端以及3’末端生物素化)
序列号9：合成DNA(5’末端以及3’末端生物素化)
序列号10：合成DNA(5’末端以及3’末端生物素化)
序列号11：合成DNA(5’末端氨基化)
序列号12：合成DNA(5’末端生物素化)
序列号13：合成DNA(5’末端氨基化)
序列号14：合成DNA(5’末端氨基化)
序列号15：合成DNA(5’末端氨基化)
序列号16：合成DNA(5’末端氨基化)
序列号17：合成DNA(5’末端氨基化)

Claims (4)

1.目标核酸的检测方法，是通过夹心杂交法来检测目标核酸的方法，所述夹心杂交法使用与目标核酸杂交的检测探针以及固定于支持体的捕捉探针，
检测探针和/或捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团，
该检测方法具有对目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体进行光照射，从而在光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键的工序。
2.根据权利要求1所述的检测方法，检测探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团。
3.根据权利要求2所述的检测方法，捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的检测方法，光反应性基团是选自3-氰基乙烯基咔唑基、对氨基甲酰基乙烯基苯酚基、4,5’,8-三甲基补骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基乙烯基尿嘧啶基中的至少1种。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058584A (zh) * 2017-06-07 2017-08-18 浙江殷欣生物技术有限公司 一种核酸杂交化学发光检测方法
CN110684849A (zh) * 2019-12-05 2020-01-14 苏州绘真医学检验有限公司 基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2015182601A1 (ja) * 2014-05-27 2017-04-20 東レ株式会社 標的核酸の検出方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101374965A (zh) * 2006-01-17 2009-02-25 私募蛋白质体公司 测试样品的多元化分析
WO2010056579A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Magic Technologies, Inc. Methods and compositions in particle-based detection of target molecules using covalent bond forming reactive pairs

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI63596C (fi) 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
US5252296A (en) 1990-05-15 1993-10-12 Chiron Corporation Method and apparatus for biopolymer synthesis
EP0726962B1 (en) 1991-12-23 2006-06-07 Chiron Corporation Sets of HIV probes for use in solution phase sandwich hybridisation assays
JPH0775600A (ja) 1993-09-08 1995-03-20 Toyobo Co Ltd 標的核酸の検出法
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US7393645B2 (en) * 1996-11-05 2008-07-01 Clinical Micro Sensors, Inc. Compositions for the electronic detection of analytes utilizing monolayers
DE19741232C5 (de) 1997-09-18 2008-07-10 Still Gmbh Speicherbremse für ein Fahrzeug
EP1105539A2 (en) * 1998-08-21 2001-06-13 Naxcor Assays using crosslinkable immobilized nucleic acids
US6242266B1 (en) 1999-04-30 2001-06-05 Agilent Technologies Inc. Preparation of biopolymer arrays
US7407746B2 (en) 2001-02-08 2008-08-05 Ngk Insulators, Ltd. Biochip and method for producing the same
US7037659B2 (en) 2002-01-31 2006-05-02 Nimblegen Systems Inc. Apparatus for constructing DNA probes having a prismatic and kaleidoscopic light homogenizer
WO2004020675A2 (en) 2002-08-29 2004-03-11 Naxcor, Inc. Polymorphism detection among homologous sequences
EP2216338B1 (en) * 2007-11-19 2013-03-20 Japan Advanced Institute of Science and Technology Light-responsive artificial nucleotide having photo-crosslinking ability
JP4814904B2 (ja) * 2008-04-16 2011-11-16 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 核酸類の配列選択的な精製方法
JP2011036150A (ja) * 2009-08-07 2011-02-24 Olympus Corp 標的核酸分子の定量方法及び標的核酸分子定量キット
JP5795317B2 (ja) * 2010-09-10 2015-10-14 株式会社Ｌｓｉメディエンス 光を用いた核酸の増幅抑制方法および高感度な選択的核酸増幅方法
JP2012147704A (ja) * 2011-01-18 2012-08-09 Olympus Corp 標的核酸分子の検出方法
EP2829614A4 (en) 2012-03-21 2016-03-16 Olympus Corp METHOD FOR DETECTING A TARGET NUCLEIC ACID MOLECULE

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101374965A (zh) * 2006-01-17 2009-02-25 私募蛋白质体公司 测试样品的多元化分析
WO2010056579A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Magic Technologies, Inc. Methods and compositions in particle-based detection of target molecules using covalent bond forming reactive pairs

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIO KOBORI ET AL.: "Synthesis and Photoinduced Cross-linking Reactions of 4,5",8-Trimethylpsoralen-incorporated Oligodeoxyribonucleotide", 《CHEMISTRY LETTERS》 *
KENZO FUJIMOTO ET AL.: "Photoinduced DNA end capping via N3-methyl-5-cyanovinyl-2"-deoxyuridine", 《CHEM. COMMUN.》 *
YOSHINAGA YOSHIMURA AND KENZO FUJIMOTO: "Ultrafast Reversible photo-cross-linking reaction:toward in situ DNA manipulation", 《ORGANIC LETTERS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058584A (zh) * 2017-06-07 2017-08-18 浙江殷欣生物技术有限公司 一种核酸杂交化学发光检测方法
CN110684849A (zh) * 2019-12-05 2020-01-14 苏州绘真医学检验有限公司 基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法

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