KR20150045999A - 표적 핵산의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 검출 프로브의 사용량을 저감시켜도 검출 감도(S/N비)를 저하시키지 않고 표적 핵산을 고감도로 검출할 수 있는 표적 핵산의 검출 방법이 개시되어 있다. 표적 핵산과 혼성화하는 검출 프로브 및 지지체에 고정된 포착 프로브를 이용하는 샌드위치 혼성화법에 의한 표적 핵산의 검출 방법은, 검출 프로브 및/또는 포착 프로브의 핵산 분자 중 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있고, 표적 핵산과 검출 프로브 및/또는 포착 프로브가 혼성화하여 형성된 복합체에 광조사하여 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 갖는다.

Description

표적 핵산의 검출 방법{METHOD FOR DETECTING TARGET NUCLEIC ACID}
본 발명은 샌드위치 혼성화법에 의한 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
각종 생물의 유전 정보 해석의 연구가 시작되고 있고, 인간 유전자를 비롯하여 다수의 유전자와 그의 염기 서열, 또한 유전자 서열로 코딩되는 단백질 및 이들 단백질로부터 이차적으로 만들어지는 당쇄에 관한 정보가 급속하게 밝혀지고 있다. 서열이 밝혀진 유전자, 단백질, 당쇄 등의 고분자체의 기능에 대해서는 각종 방법으로 조사할 수 있다. 주된 것으로서는, 핵산에 대해서는 노던 블로팅 또는 서던 블로팅과 같은, 각종 핵산/핵산 간의 상보성을 이용하여 각종 유전자와 그 생체 기능 발현의 관계를 조사할 수 있다. 단백질에 대해서는 웨스턴 블로팅으로 대표되는 단백질/단백질 간의 반응을 이용하여 단백질의 기능 및 발현에 대하여 조사할 수 있다.
핵산 검출 방법의 하나로서 샌드위치 혼성화법이 알려져 있다. 샌드위치 혼성화법은 필터 상에 고정된 포착 프로브를 이용한다. 포착 프로브는 표적 핵산의 제1 부분에 상보적이다. 한 단계에 있어서, 필터에 결합한 포착 프로브를 표적 핵산 서열에 대하여 조사할 시료에 폭로하고, 추가로 표적 핵산의 제2 부분에 상보적인 표식이 부여된 검출 프로브에 폭로하는데, 상술한 제2 부분은 제1 프로브가 상보적인 표적의 부분과는 별도(즉, 이들과 중복되어 있지 않음)이다(특허문헌 1, 2, 비특허문헌 1). 이 방법은 필터 상에 시료를 고정화하는 데 필요로 하는 수고를 해소하고, 또한 제1 프로브를 지지체에 적합하게 선택할 수 있다.
미국 특허 제4,486,539호 일본 특허 공개 (평)7-75600호 공보
Sinikka Parkkinen et al., Journal of Medical Virology 20: 279-288(1986)
종래, 포착 프로브 고정화 지지체 상에서 샌드위치 혼성화법을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 경우, 검출 감도를 향상시키기 위해서 표적 핵산량에 대하여 과잉량의 검출 프로브의 사용을 필요로 하고 있었다. 예를 들어 문헌(일본 특허 공개 제2001-69997호 공보)에 의하면, 표적 핵산량에 대하여 25만배 당량의 검출 프로브가 필요하다고 되어 있다. 그러나, 과잉량의 검출 프로브를 사용하면, 잉여의 검출 프로브가 별도의 표적 핵산을 포착하기 위한 포착 프로브와 크로스 혼성화(비특이 흡착)하여, 그 결과 검출 감도(S/N비)가 저하된다는 과제가 있었다.
본 발명의 목적은 검출 프로브의 사용량을 저감시켜도 검출 감도(S/N비)를 저하시키지 않고 표적 핵산을 고감도로 검출할 수 있는 표적 핵산의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 예의 연구 결과, 샌드위치 혼성화법에 있어서, 표적 핵산과 검출 프로브 및/또는 포착 프로브가 혼성화하여 형성된 복합체에 있어서, 검출 프로브 및/또는 포착 프로브의 핵산 염기로 치환시킨 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 광조사에 의해 공유 결합을 형성시킴으로써, 과잉량의 검출 프로브를 사용하지 않고 표적 핵산을 고감도로 검출할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.
(1) 표적 핵산과 혼성화하는 검출 프로브 및 지지체에 고정된 포착 프로브를 이용하는 샌드위치 혼성화법에 의한 표적 핵산의 검출 방법으로서, 검출 프로브 및/또는 포착 프로브의 핵산 분자 중 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있고, 표적 핵산과 검출 프로브 및/또는 포착 프로브가 혼성화하여 형성된 복합체에 광조사하여, 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 갖는 검출 방법.
(2) 상기 검출 프로브의 핵산 분자 중 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 (1)에 기재된 검출 방법.
(3) 포착 프로브의 핵산 분자 중 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 (2)에 기재된 검출 방법.
(4) 광반응성기가 3-시아노비닐카르바졸기, p-카르바모일비닐페놀기, 4,5',8-트리메틸소랄렌기 및 N3-메틸-5-시아노비닐우라실기로부터 선택되는 적어도 1종인 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.
본 발명에 따르면, 사용하는 검출 프로브의 양을 저감시킬 수 있고, 그 때문에 포착 프로브와의 크로스 혼성화(비특이 흡착)을 억제할 수 있다. 그 결과, 검출 감도(S/N비)를 향상시킬 수 있으므로 미량의 표적 핵산을 고감도로 검출하는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 검출 방법에 제공되는 표적 핵산으로서는, 예를 들어 병원균이나 바이러스 등의 유전자나 유전병의 원인 유전자 등 및 그의 일부분 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이들의 표적 핵산을 포함하는 검체로서는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 변, 척수액, 타액, 면봉으로 채취한 액, 각종 조직액 등의 체액이나, 각종 조직, 파라핀 포매 검체(FFPE) 및 그의 절편, 각종 음식물 및 이들의 희석물 등을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 피검 물질이 되는 표적 핵산은 혈액이나 세포로부터 통상의 방법에 의해 추출한 검체 핵산일 수도 있고, 검체로부터 추출한 DNA나 RNA 등을 이용할 수 있다. DNA로서는, 염색체 DNA, 바이러스 DNA, 세균, 곰팡이 등의 DNA, RNA를 역전사한 cDNA, 이들의 일부인 단편 등을 이용할 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. RNA로서는 메신저 RNA, 리보솜 RNA, small RNA나 이들의 일부인 단편 등을 이용할 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 화학적으로 합성한 DNA 또는 RNA 등도 표적 핵산으로서 이용할 수 있다.
상기 검체 핵산에는 측정의 대상으로 하는 표적 핵산 이외의 핵산 성분(비표적 핵산)도 포함되어 있는 경우가 있다. 이들 비표적 핵산은 표적 핵산과의 성상의 차를 고려하여 제거하여도 상관없고, 제거하지 않고 피검 물질로서 이용할 수도 있다.
표적 핵산은 해당 표적 핵산을 주형으로 하여 PCR 등의 핵산 증폭법에 의해 증폭한 것이어도 되고, 이 경우 측정 감도를 대폭 향상시키는 것이 가능하다. 핵산 증폭 산물을 표적 핵산으로 하는 경우에는 형광 물질 등으로 표식한 뉴클레오티드삼인산의 존재하에서 증폭을 행함으로써 증폭 핵산을 표식하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 표적 핵산의 유무, 바이러스의 유전자형, 세균의 종 및 주, 곰팡이의 종 및 주 등을 구별한 검출, SNP(1 염기 다형)의 검출, 메신저 RNA의 검출, miRNA의 검출, CGH, 카피수 변동, 게놈 DNA 서열의 결락·중복·융합, 또는 전사 산물의 결락·중복·융합의 검출에 이용할 수 있다. 또한, 검출 프로브로부터의 신호 강도를 측정함으로써 표적 핵산의 정량에도 적용할 수 있다. 또한, 표적 핵산의 정량을 행하면, 필연적으로 표적 핵산의 검출이 행해지게 되므로 본 발명의 「검출 방법」은 정량을 수반하는 경우도 포함한다.
본 발명의 방법에는 표적 핵산을 그대로 적용하는 것도 가능하고, 표적 핵산의 단편화 처리물을 적용하는 것도 가능하다. 표적 핵산의 길이에 대하여 포착 프로브, 검출 프로브가 혼성화하면 특별히 제한은 없지만, 표적 핵산이 긴 경우(1500 염기 이상, 특히 4000 염기 이상의 경우)에는 단편화 처리에 의해 후술하는 바와 같이 적절한 길이로 단편화한 단편화 처리물을 적용하는 것이 바람직하다. 단편화 처리물은 발생한 핵산 단편으로부터 특정한 핵산 단편을 선택할 필요는 없고, 단편화 처리물을 그대로 본 발명의 방법에 제공할 수 있고, 그에 의해 검출 감도를 높이는 것이 가능하다.
단편화를 위해서 표적 핵산을 절단하는 방법으로서는, 초음파를 조사하여 절단하는 방법, 효소로 절단하는 방법, 제한 효소로 절단하는 방법, 네블라이저를 이용하는 방법, 산이나 알칼리로 절단하는 방법 등을 이용할 수 있다. 초음파로 절단하는 방법의 경우, 표적 핵산에 조사하는 초음파의 출력 강도와 조사 시간을 제어함으로써 원하는 길이로 절단하는 것이 가능하다.
지지체는 슬라이드 글래스, 멤브레인, 비즈 등을 이용할 수 있다. 지지체의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 유리, 세라믹, 실리콘 등의 무기 재료, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 아세트산셀룰로오스, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 실리콘 고무 등의 중합체 등을 들 수 있다. 복수의 포착 프로브를 지지체에 고정한 마이크로 어레이를 이용함으로써 복수 종류의 표적 핵산을 일제히 검출할 수 있다.
본 발명의 표적 핵산의 검출 방법은 샌드위치 혼성화법에 바람직하게 적용된다. 샌드위치 혼성화법에서는 지지체에 고정된 포착 프로브와 검출 프로브를 이용한다. 포착 프로브, 검출 프로브는 통상 각각 표적 핵산의 다른 일부분에 상보적인 염기 서열을 갖고, 표적 핵산과 혼성화하여 선택적으로 결합할 수 있는 물질이다. 표적 핵산과 검출 프로브 및/또는 포착 프로브가 혼성화하여 복합체가 형성된다. 이 복합체 중의 검출 프로브에 결합시킨 표식체를 검출(측정)함으로써 표적 핵산을 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서 포착 프로브로서는 구체적으로는 DNA, RNA, PNA(펩티드 핵산), LNA(Locked Nucleic Acid) 등의 핵산 유도체를 이용할 수 있다. 여기서 유도체란, 핵산의 경우, 형광단 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들어 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드 및 염기의 재구성, 이중 결합의 포화, 탈아미노화, 산소 분자의 황 분자로의 치환 등을 입은 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체 등의 화학수식 유도체를 의미한다.
특정한 염기 서열을 갖는 단일쇄 핵산은 해당 염기 서열 또는 그의 일부와 상보적인 염기 서열을 갖는 단일쇄 핵산과 선택적으로 혼성화하여 결합하므로 본 발명에서 말하는 포착 프로브에 해당한다. 본 발명에 이용하는 포착 프로브는 시판하는 것일 수도 있고, 또한 생세포 등으로부터 얻어진 것일 수도 있다. 포착 프로브로서 특히 바람직한 것은 핵산이다. 이 핵산 중에서도 올리고 핵산이라고 불리는 길이가 200 염기까지인 핵산은 합성기로 용이하게 인공적으로 합성이 가능하다.
포착 프로브는 표적 핵산 서열과 상보적인 서열을 포함하고 있을 수도 있고, 어떤 영역을 선택할 수도 있다. 이하에서 설명하는 검출 프로브의 서열과 중복되지 않는 것이 바람직하다. 또한, 표적 핵산이 상이한 영역과 혼성화하는 복수 종류의 포착 프로브를 이용할 수도 있다.
표적 핵산이 이중쇄 DNA 또는 이중쇄 RNA인 경우, 센스쇄, 안티센스쇄 중 어느 하나의 쇄에 대하여 상보적인 서열을 포착 프로브로서 선택할 수 있다. 이 경우, 이하에서 설명하는 검출 프로브와 포착 프로브는 동일한 쇄의 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
검체 핵산에 포함되는 상이한 표적 핵산을 구별하여 검출하는 경우에는, 예를 들어 환자에 감염되어 있는 바이러스의 형을 구별하여 검출하는 등, 검체 핵산에 포함될 수 있는 핵산 서열 중으로부터 특이성이 높은 서열 영역을 선택하는 것이 바람직하다. 즉, 포착 프로브로서 선택한 서열이 검체 핵산에 포함되는 모든 서열에 있어서 당해 영역 이외에 상동성이 높은 서열이 없는 것을 의미한다.
본 발명에서 이용하는 검출 프로브, 포착 프로브는 그의 어느 하나의 핵산 분자 중 적어도 1개의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있거나, 또는 검출 프로브, 포착 프로브의 양쪽 핵산 분자 중의 각각 적어도 1개의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있다.
여기서, 광반응성기란 특정한 파장의 광이 조사됨으로써 유기 합성 반응에 있어서의 반응성이 활성화되는 유기기(광반응성 부위)이다. 프로브 중의 핵산 염기가 광반응성기로 치환된 후의 프로브는 치환 전의 핵산 염기와 마찬가지로 표적 핵산과 혼성화하여 복합체를 형성하는 것이 가능하다. 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 포착 프로브 및/또는 검출 프로브와 표적 핵산이 혼성화하여 형성된 복합체에 당해 광반응성기의 광반응성 부위를 활성화할 수 있는 파장의 광을 조사하면, 당해 광반응성 부위가 활성화되고, 당해 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합이 형성된다.
이러한 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기 및 그의 유도체(WO2009/066447(EP2216338, US 2010-274000 A), 문헌 [Yoshinaga Yoshimura et al., Organic Letters 10: 3227-3230(2008)]), p-카르바모일비닐페놀기(문헌 [Takehiro Ami et al., Organic & Biomolecular Chemistry 5: 2583-2586(2007)]), 4,5',8-트리메틸소랄렌기(문헌 [Akio Kobori et al., Chemistry Letters 38: 272-273(2009)]) 및 N3-메틸-5-시아노비닐우라실기(문헌 [Kenzo Fujimoto et al., Chemical Communications: 3177-3179(2005)]) 등을 들 수 있다. 이들 문헌은 참조에 의해 본 명세서에 도입된 것으로 한다. 이들 중, 3-시아노비닐카르바졸기 및 그의 유도체(WO2009/066447)가 바람직하고, 특히 3-시아노비닐카르바졸기가 바람직하다.
여기서, 3-시아노비닐카르바졸기 및 그의 유도체는 WO2009/066447에 기재되어 있는 바와 같이 하기 화학식 (I)로 표시되는 기이다.
Figure pct00001
화학식 (I) 중, Ra는 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 내지 C7의 알콕시카르보닐기 또는 수소이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 시아노기, 아미드기, 카르복실기, C2 내지 C7의 알콕시카르보닐기 또는 수소이다. Ra가 시아노기, R1 및 R2가 수소인 경우가 3-시아노비닐카르바졸기이다. 또한, 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기 또는 그의 유도체를 이용할 때에는 포착 프로브 또는 검출 프로브 중의 당해 염기의 5'측에 푸린 염기를 인접하도록 설계하는 것이 바람직하다.
p-카르바모일비닐페놀기는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이다.
Figure pct00002
4,5',8-트리메틸소랄렌기는 하기 화학식 (III)으로 표시되는 기이다.
Figure pct00003
N3-메틸-5-시아노비닐우라실기는 하기 화학식 (IV)로 표시되는 기이다.
Figure pct00004
이들 광반응성기는 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 중의 염기와 그대로 치환되는 것이고, 화학식 (I) 내지 (Ⅳ)로 표시되는 각 광반응성기 중의 프리(free)한 결합손이 뉴클레오티드 중의 당 부분과 직접 결합한다. 예를 들어 화학식 (I)로 표시되는 3-시아노비닐카르바졸기(화학식 (I) 중, Ra가 시아노기, R1 및 R2가 수소인 것)는 데옥시리보오스와 다음과 같이 결합한다. 다른 광반응성기도 마찬가지로 당과 결합한다.
Figure pct00005
상기한 각 광반응성기 및 그것과 데옥시리보오스 등의 당의 결합물은 상기한 각각의 문헌에 기재되어 있는 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 이 공지된 방법은 유기 화학 합성의 상식을 따른 통상의 합성 방법이다.
예를 들어 화학식 (V) 중의 3-시아노비닐카르바졸기는 WO2009/066447의 실시예에서는 3-요오드화카르바졸(3.52mmol)과 아크릴로니트릴(7.04mmol)을 디옥산 중 트리페닐포스핀(0.53㎛ol), 팔라듐아세테이트(0.18㎛ol) 및 트리에틸아민(4.23mmol)의 존재하, 75℃, 11.5시간 가열 환류함으로써 제조되고 있다. 또한, 3-시아노비닐카르바졸과 데옥시리보오스의 결합은 동 실시예에서는 아세토니트릴 중 3-시아노비닐카르바졸(1.20mmol)과 호퍼의 클로로슈가(Hoffer's chlorosugar)(데옥시리보오스의 1위치의 히드록실기를 염소로, 데옥시리보오스의 3위치와 6위치의 히드록실기를 p-톨루오일옥시기로 치환한 것)(1.24mmol)를 KOH(3.87mmol)와 TDA-1(34㎛ol)의 존재하에서 실온에서 20분간 교반하고, 계속해서 메탄올 중 NaOMe(1.2mmol)를 첨가하여 실온에서 3.5시간 교반하여 데옥시리보오스의 3위치와 6위치의 히드록실기를 탈보호함으로써 제조되고 있다. p-카르바모일비닐페놀과 데옥시리보오스의 결합물은 문헌 [Takehiro Ami et al., Organic & Biomolecular Chemistry 5: 2583-2586(2007)]에 기재된 방법에서는 마찬가지로 p-요오도페놀과 호퍼의 클로로슈가를 반응시켜 결합시키고, 이것에 메틸메타크릴레이트를 반응시킴으로써 제조되고 있다. 4,5',8-트리메틸소랄렌기와 데옥시리보오스의 결합물은 문헌 [Akio Kobori et al., Chemistry Letters 38: 272-273(2009)]에 기재된 방법에서는 마찬가지로 3-요오드화4,5',8-트리메틸소랄렌과 호퍼의 클로로슈가를 반응시켜 제조하고 있다. N3-메틸-5-시아노비닐우라실기와 데옥시리보오스의 결합물은 문헌 [Kenzo Fujimoto et al., Chemical Communications: 3177-3179(2005)]에 기재된 방법에서는 마찬가지로 2-요오드화N3-메틸우리딘과 아크릴로니트릴을 반응시켜 제조하고 있다. 데옥시리보오스가 다른 당(예를 들어 리보오스 등)인 경우에도 마찬가지로 광반응성기와 당의 결합물을 얻을 수 있다.
광반응성기와 당의 결합물이 얻어지면, 이것을 포함하는 핵산은 통상의 방법인 포스포르아미다이트법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어 상기 화학식 (V)로 표시되는 3-시아노비닐카르바졸과 데옥시리보오스의 결합물은 WO2009/066447의 실시예에서는 피리딘 중 해당 결합물(0.29mmol)과 4,4-디메톡시트리틸클로리드(0.35mmol)와 4-(디메틸아미노)피리딘을 실온에서 18시간 반응시켜 데옥시리보오스의 6위치의 히드록실기를 보호하고, 이것(0.17mmol)을 아세토니트릴 중 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포르아미다이트(0.17mmol)와 실온에서 1시간 교반함으로써 원하는 포스포르아미다이트화물을 제조하고 있다. 다른 광반응성기와 데옥시리보오스의 결합물도 마찬가지로 하여 포스포르아미다이트화하는 것이 가능하다. 포스포르아미다이트화는 통상의 방법이고, 이를 위한 시약도 시판되고 있으므로 용이하게 행할 수 있다.
광반응성기와 당의 결합물의 포스포르아미다이트화물이 얻어지면, 시판하고 있는 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 원하는 염기 서열을 갖는 핵산을 합성할 수 있다.
또한, 광반응성기를 갖는 핵산 자체는 원하는 유전자 등의 발현을 저해하는 시약으로서 이용되고 있는 주지의 것이고, 광반응성기를 포함하고, 원하는 염기 서열을 갖는 핵산의 합성은 상업 서비스로서 제공되고 있어, 이 상업 서비스를 행하고 있는 회사에 원하는 염기 서열을 갖는 핵산으로서, 원하는 위치에 원하는 광반응성기를 도입한 것의 합성을 의뢰함으로써도 해당 핵산을 입수하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서 검출 프로브로서는 구체적으로는 DNA, RNA, PNA, LNA 등의 핵산 유도체를 이용할 수 있다. 여기서 유도체란 핵산의 경우, 형광단 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들어 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드 및 염기의 재구성, 이중 결합의 포화, 탈아미노화, 산소 분자의 황 분자로의 치환 등을 입은 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체 등의 화학 수식 유도체를 의미한다.
특정한 염기 서열을 갖는 단일쇄 핵산은 해당 염기 서열 또는 그 일부와 상보적인 염기 서열을 갖는 단일쇄 핵산과 선택적으로 혼성화하여 결합하므로 본 발명에서 말하는 검출 프로브에 해당한다. 본 발명에 이용하는 검출 프로브는 시판하는 것일 수도 있고, 또한 생세포 등으로부터 얻어진 것일 수도 있다. 검출 프로브로서 특히 바람직한 것은 핵산이다. 이 핵산 중에서도 올리고 핵산이라고 불리는 길이가 200 염기까지인 핵산은 합성기로 용이하게 합성이 가능하다.
표적 핵산이 이중쇄 DNA인 경우, 센스쇄, 안티센스쇄 중 어느 하나의 쇄에 대하여 상보적인 서열을 검출 프로브로서 선택할 수 있다. 이 경우, 상술한 포착 프로브와 검출 프로브는 동일한 쇄의 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
검출 프로브는 표적 핵산 서열과 상보적인 서열을 포함하고 있으면 되고, 어떤 영역을 선택하여도 된다. 단, 상술한 포착 프로브의 서열과 중복되지 않는 것이 바람직하다.
검출 프로브의 서열은 포착 프로브와 염기 서열의 상동성이 낮은 것이 바람직하고, 바람직하게는 20% 이하고, 보다 바람직하게는 10% 이하이다. 여기서, 2개의 염기 서열의 상동성은 염기가 가능한 한 많이 일치하도록 2개의 서열을 정렬시키고(필요에 따라 갭을 넣음), 일치한 염기수를 전체 염기수(2개의 염기 서열의 염기수가 상이한 경우에는 큰 쪽의 염기수)로 제산함으로써 얻어지는 수치이고, FASTA나 BLAST 등의 시판되는 소프트웨어(인터넷으로도 제공되고 있음)에 의해 용이하게 산출 가능하다.
검체 핵산에 포함되는 복수 종류의 표적 핵산을 검출하는 경우, 검출 대상의 표적 핵산의 사이에 상동성이 100%인 서열을 공통 검출 프로브로서 이용할 수 있다. 공통 검출 프로브는 검출 대상의 표적 핵산 사이에서 상동성이 100%가 아닌 경우, 축중 서열을 이용하여도 된다. 축중 서열에 대해서는 문헌 [「바이오 실험 일러스트레이티드 정말로 증가하는 PCR」, (1999년), 나카야마 히로키 편, (주)슈쥰샤 발행, 121페이지 내지 125페이지]를 참고로 할 수 있다.
검출 프로브에는 표식체를 결합시킬 수 있다. 검출 프로브가 핵산인 경우, 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 하나 또는 양쪽에 표식체를 결합시킬 수 있다. 또한, 검출 프로브 내부에도 표식체를 도입하는 것이 가능하다. 표식체의 결합에는 화학 반응, 효소 반응 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 화학 반응을 이용하여 반응시킨다. 더욱 바람직하게는 검출 프로브를 화학 합성할 때에 말단에 표식체를 결합시킨다. 검출 프로브의 내부에도 표식체를 결합시킬 수 있다. 표식체의 결합에는 화학 반응을 이용할 수 있고, 합성기로 비오틴 표식을 삽입할 수 있다. 예를 들어 그렌리서치사로부터 입수 가능한 비오틴(Biotin)TEG 포스포아미다이트, 비오틴 포스포아미다이트, 비오틴-dT 등을 이용하여 비오틴 표식을 삽입할 수 있다.
검출 프로브는 1종류의 표적 핵산에 대하여 1종 또는 복수종의 염기 서열을 동시에 사용할 수 있다. 복수종의 검출 프로브를 사용할 때, 각각의 검출 프로브는 염기 서열은 물론 쇄 길이가 상이하여도 상관없다. 표적 핵산의 검출 S/N비를 향상시키기 위해서 복수종의 검출 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용할 수 있는 표식체로서는 단백질 결합성 물질, 형광 색소, 인광 색소, 방사선 동위체 등, 표식에 이용하는 공지된 물질을 이용할 수 있다. 바람직한 것은 단백질 결합성 물질이다. 단백질 결합성 물질의 예로서 비오틴을 들 수 있다. 비오틴은 아비딘 또는 스트렙트아비딘과 결합할 수 있다. 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 형광 색소가 결합한 것, 알칼리 포스파타아제나 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 등의 효소가 결합한 것을 이용할 수 있다. 알칼리 포스파타아제나 호스 래디쉬 퍼옥시다아제를 이용하는 경우에는 각각의 기질을 첨가하고, 기질과 효소가 반응한 결과, 발광 반응이 발생한다. 발광 반응은 플레이트 판독기나 CCD 카메라 등을 이용하여 검출한다.
표식체로서 측정이 간편하고, 신호를 검출하기 쉬운 형광 색소를 이용하여도 된다. 구체적으로는 시아닌(시아닌 2), 아미노메틸쿠마린, 플루오로세인, 인도카르보시아닌(시아닌 3), 시아닌 3.5, 테트라메틸로다민, 로다민 레드, 텍사스 레드, 인도카르보시아닌(시아닌 5), 시아닌 5.5, 시아닌 7, 오이스터, BODIPY계 색소, 피코에리트린 등의 공지된 형광 색소를 들 수 있다. 형광 색소의 검출은 형광 현미경이나 형광 스캐너 등에 의해 행할 수 있다.
또한, 표식체로서 발광성을 갖는 반도체 미립자를 이용하여도 된다. 이러한 반도체 미립자로서는 예를 들어 카드뮴셀레늄(CdSe), 카드뮴텔루륨(CdTe), 인듐갈륨인(InGaP), 칼코파이라이트계 미립자, 실리콘(Si) 등을 들 수 있다.
검출된 시그널은 주변 노이즈와 비교된다. 구체적으로는 포착 프로브가 고정되어 있는 기판 상의 위치로부터 얻어진 시그널 값과 포착 프로브가 고정되어 있지 않은 기판 상의 위치로부터 얻어진 시그널 값(노이즈 값)을 비교하고, 전자의 수치와 노이즈 값의 비를 S/N비로 한다.
지지체에 포착 프로브를 고정화하는 방법으로서는 지지체 상면부에서 올리고 핵산을 합성하는 방법과, 미리 합성해 둔 올리고 핵산을 지지체 상면부에 적하하여 고정하는 방법이 알려져 있고, 모두 적용할 수 있다. 전자의 방법에는 로날드(Ronald) 등의 방법(미국 특허 제5705610호 명세서), 미쉘(Michel) 등의 방법(미국 특허 제6142266호 명세서), 프란세스코(Francesco) 등의 방법(미국 특허 제7037659호 명세서)이 있다. 이들 방법에서는 DNA 합성 반응시에 유기 용매를 이용하기 때문에 지지체는 유기 용매에 내성이 있는 재질인 것이 바람직하다. 예를 들어 일본 특허 공표 (평)10-503841호 공보에 기재된 방법을 이용하여 제조한 요철 구조를 가진 유리제 지지체를 이용할 수 있다. 특히 프란세스코 등의 방법에 있어서는 지지체의 이면으로부터 광을 조사하고, DNA 합성을 제어하기 때문에, 지지체는 투광성을 갖는 재질인 것이 바람직하다. 후자의 방법에는 히로타 등의 방법(일본 특허 제3922454호)이나 유리 모세관를 이용하는 방법을 들 수 있다. 유리 캐필러리의 일례로서는 자작한 유리 모세관나 마이크로 피펫((주)마이크로서포트사 제조; MP-005) 등의 시판 제품을 이용할 수 있지만, 이들 방법으로 한정되는 것은 아니다.
생세포로부터의 DNA 또는 RNA의 제조는 공지된 방법, 예를 들어 DNA의 추출에 대해서는 블린(Blin) 등의 방법(문헌 [Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303(1976)]) 등에 의해, 또한 RNA의 추출에 대해서는 파발로로(Favaloro) 등의 방법(문헌 [Favaloro et.al., Methods Enzymol. 65: 718(1980)]) 등에 의해 행할 수 있다. 고정화되는 핵산으로서는 또한 쇄상 또는 환상의 플라스미드 DNA나 염색체 DNA, 이들을 제한 효소에 의해 또는 화학적으로 절단한 DNA 단편, 시험관 내에서 효소 등에 의해 합성된 DNA, 또는 화학 합성한 올리고뉴클레오티드 등을 이용할 수도 있다.
본 발명의 검출 방법은 샌드위치 혼성화법에 의한 것이다. 샌드위치 혼성화법 자체는 주지이며, 표적 핵산 중의 상이한 2개의 영역을 각각 검출 프로브와 포착 프로브와 혼성화시켜 표적 핵산을 검출 프로브와 포착 프로브로 샌드위치하고, 검출 프로브를 정량함으로써 표적 핵산을 정량하는 것이다. 본 발명의 방법은 표적 핵산과 검출 프로브 및/또는 포착 프로브가 혼성화하여 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브 및/또는 포착 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 갖는다. 광조사는 사용한 광반응성기로 따라 이것이 활성화되는 파장을 포함하는 광으로 행할 수 있다. 예를 들어 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 이용할 때에는 파장 340 내지 380nm의 광을 이용할 수 있다. 상기한 다른 광반응성기를 이용할 때에도 파장 340 내지 380nm의 광을 이용할 수 있다. 광조사시키는 장치로서는 상기 파장을 포함하는 광을 조사할 수 있는 트랜스 일루미네이터, 블랙 라이트, UV-LED, UV 레이저 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서는 검출 프로브, 포착 프로브 중 어느 하나 또는 검출 프로브 및 포착 프로브의 양쪽의 핵산 염기가 광반응성기로 치환된다. 즉, 본 발명의 방법은 (A) 검출 프로브만과 표적 핵산의 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 포함하는 방법, (B) 포착 프로브만과 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 포함하는 방법, (C) 검출 프로브 및 포착 프로브의 양쪽과 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키는 각 공정을 포함하는 방법의 모두를 채택할 수 있다.
본 발명의 핵산 검출 방법의 예로서, 각 프로브와 표적 핵산의 혼성화의 순서와, 광반응성기를 도입하는 프로브의 선택의 조합에 따라 예를 들어 다음 방법 (1) 내지 (7)을 들 수 있다.
방법 (1): 표적 핵산과 검출 프로브를 혼성화시킨다. 계속해서, 검출 프로브와 혼성화한 표적 핵산과, 지지체에 고정된 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 포착 프로브를 혼성화시킨다. 이렇게 하여 형성된 복합체에 광조사하여 포착 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시킨다.
방법 (2): 표적 핵산과, 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 검출 프로브를 혼성화시킨다. 여기서 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시킨다. 이 공유 결합을 형성시킨 복합체를 지지체에 고정된 포착 프로브와 혼성화시킨다.
방법 (3): 표적 핵산과, 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 검출 프로브를 혼성화시킨다. 여기서 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시킨다. 이 공유 결합을 형성시킨 복합체를 지지체에 고정된 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 포착 프로브와 혼성화시킨다. 여기서 형성된 복합체에 광조사하여 포착 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시킨다.
방법 (4): 표적 핵산과, 지지체에 고정된 포착 프로브를 혼성화시킨다. 형성된 복합체와, 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 검출 프로브를 혼성화시킨다. 여기서 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시킨다.
방법 (5): 표적 핵산과, 지지체에 고정된 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 포착 프로브를 혼성화시킨다. 여기서 형성된 복합체에 광조사하여 포착 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시킨다. 이 공유 결합을 형성시킨 복합체와 검출 프로브를 혼성화시킨다.
방법 (6): 표적 핵산과, 지지체에 고정된 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 포착 프로브를 혼성화시킨다. 여기서 형성된 복합체에 광조사하여 포착 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시킨다. 이 공유 결합을 형성시킨 복합체와, 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 검출 프로브를 혼성화시킨다. 여기서 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시킨다.
방법 (7): 표적 핵산과, 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 검출 프로브와, 지지체에 고정한 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 포착 프로브를 동시에 접촉시켜 검출 프로브 및 포착 프로브와 표적 핵산을 혼성화시킨다. 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브 및 포착 프로브 중의 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 각각 공유 결합을 형성시킨다.
이들 방법 중 방법 (1) 내지 (3)이 바람직하고, 방법 (2) 또는 (3)이 보다 바람직하다.
표적 핵산과 포착 프로브 및/또는 검출 프로브와 혼성화시키는 공정은 종래와 완전히 마찬가지로 행할 수 있다. 반응 온도 및 시간은 혼성화시키는 핵산의 쇄 길이에 따라 적절히 선택되지만, 핵산의 혼성화의 경우, 통상 30℃ 내지 70℃ 정도에서 1분간 내지 수십시간, 면역 반응의 경우에는 통상 실온 내지 40℃ 정도에서 1분간 내지 수시간 정도이다.
각 혼성화 공정에서의 검출 프로브의 사용량은 검출 프로브의 크로스 하이브리디제이션의 저감을 고려하면, 표적 핵산에 대하여 적은 편이 바람직하다. 구체적으로는 표적 핵산에 1 내지 10000당량(몰비)이 바람직하고, 1 내지 1000당량이 보다 바람직하고, 1 내지 100당량이 더욱 바람직하다.
<실시예>
이하에 실시예를 나타내며 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
핵산의 제조
이하의 실시예, 비교예에 사용한 핵산을 표 1에 나타낸다.
표적 핵산으로서는 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열을 갖는 합성 DNA 「T-01」 및 서열 번호 2로 나타나는 염기 서열을 갖는 합성 DNA 「T-02」 및 인간 게놈 DNA를 이용하였다. T-01은 닛폰바이오서비스사에서 합성하였다. T-02는 닛폰바이오서비스 사에서 합성하였다.
검출 프로브 「D-01」, 「D-02」, 「D-05」, 「D-06」, 「D-09」, 「D-10」, 「D-11」, 「D-12」는 5' 말단 및 3' 말단을 비오틴 표식(여기서 3' 말단은 비오틴TEG 표식)한 합성 DNA이고, 츠쿠바올리고서비스사에서 합성하였다. D-01은 서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열의 23번째의 염기인 C 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 합성 DNA이다. D-02는 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열의 3번째의 염기인 A 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 합성 DNA이다. D-05는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열의 13번째의 염기인 T 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 합성 DNA이다. D-06은 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열의 13번째의 염기인 T 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 합성 DNA이다. D-09는 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열의 22번째의 염기인 A 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 합성 DNA이다. D-10은 서열 번호 8로 나타나는 염기 서열의 23번째의 염기인 T 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 합성 DNA이다. D-11은 서열 번호 9로 나타나는 염기 서열의 16번째의 염기인 C 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 합성 DNA이다. D-12는 서열 번호 10으로 나타나는 염기 서열의 21번째의 염기인 T 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 합성 DNA이다.
검출 프로브 「D-03」, 「D-04」, 「D-07」, 「D-08」, 「D-13」, 「D-14」, 「D-15」, 「D-16」은 각각 서열 번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 나타나는 염기 서열을 갖고, 5' 말단 및 3' 말단을 비오틴 표식(여기서, 3' 말단은 비오틴TEG 표식)한 합성 DNA이고, 오페론사에 합성하였다.
포착 프로브 「C-01」은 서열 번호 11로 나타나는 염기 서열을 갖고, 5' 말단에 아미노기 수식을 넣은 합성 DNA이고, 오페론사에서 합성하였다.
포착 프로브 「C-02」는 서열 번호 12로 나타나는 염기 서열의 18번째의 염기인 T 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입하고, 5' 말단을 비오틴 표식한 합성 DNA이고, 츠쿠바올리고서비스사에서 합성하였다.
포착 프로브 「C-03」은 서열 번호 12로 나타나는 염기 서열을 갖고, 5' 말단을 비오틴 표식한 합성 DNA이고, 오페론사에서 합성하였다.
포착 프로브 「C-04」는 N' 말단에 2분자의 O 링커(-NH(CH2CH2O)2CH2CO-)를 통하여 비오틴 표식, C' 말단에 리신 수식한 PNA(펩티드 핵산)이고, 파나진(PANAGENE)사에서 합성하였다.
포착 프로브 「C-05」는 서열 번호 13으로 나타나는 염기 서열의 19번째의 염기인 A 대신에 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입하고, 5' 말단에 아미노기 수식을 넣은 합성 DNA이고, 츠쿠바올리고서비스사에서 합성하였다.
포착 프로브 「C-06」, 「C-07」, 「C-08」, 「C-09」, 「C-10」은 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17로 나타나는 염기 서열을 갖고, 5' 말단에 아미노기 수식을 넣은 합성 DNA이고, 오페론사에서 합성하였다.
Figure pct00006
표 1에 있어서 염기 서열 중의 「K」는 광반응성기로서 3-시아노비닐카르바졸기를 도입한 것을 나타낸다. 또한, C-04에 있어서 N' 말단 및 C' 말단이란 각각 PNA의 아미노 말단측, 카르복실 말단측을 나타낸다.
실시예 1
실시예 1에서는 표적 핵산 T-01과, 광반응성기가 도입된 검출 프로브 D-01 및 D-02를 혼성화시키고, 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키고, 이 복합체를 포착 프로브 C-01과 혼성화시켜 표적 핵산을 검출하였다.
DNA 칩의 제조
도레이사 제조의 「3D-진(Gene)」(등록 상표)의 기판(256주 기판)에 포착 프로브로서 C-01을 고정한 것을 이용하였다.
혼성화와 검출
T-01(10μM)과, D-01(100μM) 및 D-02(100μM)를 T-01에 대한 D-01, D-02의 각 사용량이 1몰 당량이 되도록 혼합하고, 10mM 인산 완충액(100mM 염화나트륨 함유)으로 희석하였다. 얻어진 용액을 0.1, 1, 100amol의 3가지의 몰 농도가 되도록 조정(각각의 총 액량 5μL)하고, 각각 이하의 조작을 행하였다.
혼합 용액을 히트 블록으로 95℃, 5분간 유지하고, 그 후 천천히 실온까지 냉각한 것을 유리 튜브에 옮기고, 트랜스 일루미네이터로 20분간, 365nm(10μW/cm2)의 광을 조사하였다. 이들 용액에 1X혼성화 용액(1중량% BSA(소 혈청 알부민), 5×SSC, 1중량% SDS(도데실황산나트륨), 50ng/ml 연어 정자 DNA의 용액, 5중량% 덱스트란황산나트륨, 30% 포름아미드)을 35μL 첨가하고, 혼성화 용액으로 하였다. 이 혼성화 용액을 전량 DNA 칩에 주입하고, 32℃으로 가온한 인큐베이터에 세팅하였다. 혼성화는 「3D-진」의 표준 프로토콜에 따라 250rpm으로 선회 교반을 하면서 32℃에서 2시간 행하였다. 혼성화 후, DNA 칩을 30℃으로 가온한 세정액(0.5×SSC, 0.1중량% SDS(도데실황산나트륨))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 또한, 스트렙토아비딘피코에리트린(프로자임사)을 염색 용액(50ng/μl 스트렙토아비딘피코에리트린, 100mM MES, 1M NaCl, 0.05중량% 트윈(Tween) 20, 2mg/ml BSA(소 혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하고, DNA 칩 상으로 적하하였다. 35℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 30℃으로 가온한 세정액(6XSSPE, 0.01중량% 트윈20)으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 염색 완료의 DNA 칩은 DNA 칩 스캐너(도레이)를 이용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100%, 포토 멀티플라이어의 전압 설정을 70%로 하였다.
표적 핵산 T-01의 검출 결과를 표 2에 나타냈다. 표 2 중의 숫자는 S/N비를 나타낸다. S/N비는 포착 프로브가 고정되어 있는 기판 상의 위치에서 검출된 시그널 값과 포착 프로브가 고정되어 있지 않은 기판 상의 위치에서 검출된 시그널 값의 비로서 산출하였다. S/N비가 1보다 크지 않을 때에는 표적 핵산을 검출할 수 없었음을 의미한다.
광조사에 의해 표적 핵산과 검출 프로브 간에 공유 결합을 형성시킴으로써, 표적 핵산에 대한 검출 프로브의 사용량이 종래보다 매우 적은 1몰 당량이어도 0.1, 1, 100amol의 각 농도에 있어서 표적 핵산을 검출할 수 있었다.
비교예 1
실시예 1에 있어서 검출 프로브로서 D-01 대신 D-03을 사용하고, D-02 대신 D-04를 사용하고, 또한 혼성화시켜 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 행하지 않은 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하고, 표적 핵산 T-01에 대하여 1몰 당량의 D-03 및 D-04를 혼합한 것을 제조하고, 표적 핵산 T-01을 검출하였다.
또한, 마찬가지로 하여 표적 핵산 T-01에 대하여 1000몰 당량의 D-03 및 D-04를 혼합한 것을 제조하고, 표적 핵산 T-01을 검출하였다.
이상의 결과를 표 2에 나타냈다.
비교예 1에서는 검출 프로브를 1몰 당량 사용하였을 때에는 실시예 1과 비교하여 S/N비는 크게 저하되고, 1amol의 농도에 있어서 T-01을 검출할 수 없었다. 또한, 검출 프로브의 사용량을 증가시켜 1000몰 당량으로 하였을 경우에도 실시예 1과 비교하여 S/N비는 크게 저하되고, 0.1amol의 농도에 있어서 T-01을 검출할 수 없었다.
Figure pct00007
이상의 실시예 1 및 비교예 1의 결과로부터 샌드위치 혼성화에 있어서 표적 핵산과 광반응성기를 도입한 검출 프로브가 혼성화하여 형성되는 복합체에 대하여 광조사하여 검출 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시킴으로써, 사용하는 검출 프로브량을 저감시켜도 미량의 표적 핵산을 검출 할 수 있게 되고, 또한 고감도로 표적 핵산을 검출할 수 있음을 알았다.
실시예 2
실시예 2에서는 표적 핵산 T-01과, 검출 프로브 D-03 및 D-04를 혼성화시켜 형성된 복합체를 광반응성기가 도입된 포착 프로브 C-02와 혼성화시키고, 형성된 복합체에 광조사하여 포착 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시켜 표적 핵산을 검출하였다.
포착 프로브 고정 비즈의 제조
아비딘 코팅 비즈(서모사이언티픽사 제조)에 포착 프로브로서 C-02를 고정하고, 비오틴 수용액으로 블로킹 처리한 것을 이용하였다.
혼성화와 검출
T-01(10μM)과, 검출 프로브로서 D-03(100μM) 및 D-04(100μM)를 T-01에 대한 D-03, D-04의 각 사용량이 1몰 당량이 되도록 혼합하고, 10mM 인산 완충액(100mM 염화나트륨 함유)으로 희석하고, 총 액량 200μL, T-01의 최종 농도를 0.25μM으로 하였다. 이 혼합 용액을 히트 블록으로 95℃, 5분간 유지하고, 그 후 천천히 실온까지 냉각하였다. 「옴니피트」(가부시키가이샤 아이시스의 등록 상표) 유리 칼럼(내경 3mm, 양쪽 말단에 2㎛의 스테인리스 프릿츠의 칼럼 마개)에 C-02를 고정한 비즈를 넣고, 상기 혼합 용액(200μL)을 첨가한 후, 5분간 교반하면서 블랙 라이트로 365nm의 광을 조사하였다. 용액을 여과 후, 상기 비즈를 50% DMSO 수용액으로 세정 후, Cy3-스트렙트아비딘의 수용액(0.01μM)을 첨가하여 염색하였다. 용액을 여과 후, 상기 비즈를 50% DMSO 수용액으로 세정하였다. 염색 완료의 비즈는 CCD 카메라를 탑재한 형광 현미경(올림푸스사 제조)을 이용하여 검출하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.
실시예 3
실시예 3에서는 표적 핵산 T-01과, 광반응성기가 도입된 검출 프로브 D-01 및 D-02를 혼성화시키고, 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브와 표적 핵산 사이에서 공유 결합을 형성시키고, 이 복합체를 포착 프로브 C-03과 혼성화시키고, 표적 핵산을 검출하였다.
포착 프로브 고정 비즈의 제조
아비딘 코팅 비즈(서모사이언티픽사 제조)에 C-03을 고정하고, 비오틴 수용액으로 블로킹 처리한 것을 이용하였다.
혼성화와 검출
T-01(10μM)과, D-01(100μM) 및 D-02(100μM)를 T-01에 대한 D-01, D-02의 각 사용량이 1몰 당량이 되도록 혼합하고, 10mM 인산 완충액(100mM 염화나트륨 함유)로 희석하고, 총 액량 400μL, T-01의 최종 농도를 0.25μM으로 하였다. 이 혼합 용액을 히트 블록으로 95℃, 5분간 유지하고, 그 후 천천히 실온까지 냉각한 것을 유리 튜브에 옮기고, 트랜스 일루미네이터로 20분간, 365nm(10μW/cm2)의 광을 조사하였다. 「옴니피트」 유리 칼럼(내경 3mm, 양쪽 말단에 2㎛의 스테인리스 프릿츠의 칼럼 마개)에 C-03을 고정한 비즈를 넣고, 상기 혼합 용액(200μL)을 첨가한 후, 5분간 교반하였다. 용액을 여과 후, 상기 비즈를 50% DMSO 수용액으로 세정 후, Cy3-스트렙트아비딘의 수용액(0.01μM)을 첨가하여 염색하였다. 용액을 여과 후, 상기 비즈를 50% DMSO 수용액으로 세정하였다. 염색 완료의 비즈는 형광 현미경(올림푸스사 제조)을 이용하여 검출하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.
실시예 4
실시예 3에 있어서 포착 프로브로서 C-03 대신 C-04를 이용한 것 이외에는 실시예 3과 마찬가지의 조작을 행하고, 표적 핵산 T-01을 검출하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.
실시예 5
실시예 5에서는 표적 핵산 T-01과, 광반응성기가 도입된 검출 프로브 D-01 및 D-02를 혼성화시키고, 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키고, 또한 이 복합체를 광반응성기가 도입된 포착 프로브 C-02와 혼성화시키고, 형성된 복합체에 광조사하여 포착 프로브와 표적 핵산 사이 공유 결합을 형성시켜 표적 핵산을 검출하였다.
포착 프로브 고정 비즈의 제조
아비딘 코팅 비즈(서모사이언티픽사 제조)에 포착 프로브로서 C-02를 고정하고, 비오틴 수용액으로 블로킹 처리한 것을 이용하였다.
혼성화와 검출
T-01(10μM)과, D-01(100μM) 및 D-02(100μM)를 T-01에 대한 D-01, D-02의 각 사용량이 1몰 당량이 되도록 혼합하고, 10mM 인산 완충액(100mM 염화나트륨 함유)로 희석하고, 총 액량 200μL, T-01의 최종 농도를 0.25μM으로 하였다. 이 혼합 용액을 히트 블록으로 95℃, 5분간 유지하고, 그 후 천천히 실온까지 냉각한 것을 유리 튜브에 옮기고, 트랜스 일루미네이터로 20분간, 365nm(10μW/cm2)의 광을 조사하였다. 「옴니피트」 유리 칼럼(내경 3mm, 양쪽 말단에 2㎛의 스테인리스 프릿츠의 칼럼 마개)에 C-02를 고정한 비즈를 넣고, 상기 혼합 용액(200μL)을 첨가한 후, 5분간 교반하면서 블랙 라이트로 365nm의 광을 조사하였다. 용액을 여과 후, 상기 비즈를 50% DMSO 수용액으로 세정 후, Cy3-스트렙트아비딘의 수용액(0.01μM)을 첨가하여 염색하였다. 용액을 여과 후, 상기 비즈를 50% DMSO 수용액으로 세정하였다. 염색 완료의 비즈는 형광 현미경(올림푸스사 제조)을 이용하여 검출하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.
비교예 2
실시예 2에 있어서 포착 프로브로서 C-02 대신 C-03을 사용하고, 또한 혼성화시켜 형성된 복합체에 광조사하여 포착 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 행하지 않은 것 이외에는 실시예 2와 마찬가지의 조작을 행하고, 표적 핵산 T-01에 대하여 1몰 당량의 D-03 및 D-04를 혼합한 것을 제조하고, 표적 핵산 T-01을 검출하였다.
또한, 마찬가지로 하여 표적 핵산 T-01에 대하여 100몰 당량의 D-03 및 D-04를 혼합한 것을 제조하고, 표적 핵산 T-01을 검출하였다. 이상의 결과를 표 3에 나타냈다.
Figure pct00008
실시예 2 내지 5의 모든 경우에 검출 프로브 및/또는 포착 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시킴으로써, 표적 핵산에 대한 검출 프로브량이 1몰 당량이어도 0.05nmol의 농도의 표적 핵산을 감도 좋게 검출할 수 있었다. 또한, 검출 프로브만과 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시킨 경우, 포착 프로브만과 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시킨 경우, 검출 프로브 및 포착 프로브의 양쪽과 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시킨 경우의 모든 경우에 고감도로 표적 핵산을 검출할 수 있음을 알았다. 특히, 검출 프로브 및 포착 프로브의 양쪽에서 공유 결합을 형성시킨 경우에 고감도로 검출할 수 있었다. 또한, 프로브로서는 핵산뿐만 아니라 펩티드 핵산도 사용할 수 있음을 알았다.
한편, 비교예 2에서는 검출 프로브를 1당량 이용하였을 때에는 각 실시예와 비교하여 S/N비는 크게 저하되었다. 또한, 검출 프로브를 100당량 이용하였을 때에도 S/N비는 실시예와 비교하여 상당히 낮고, 검출 프로브의 사용량을 증가시켜도 검출 감도가 개선되지 않았다.
이상과 같이 샌드위치 혼성화에 있어서 표적 핵산과, 광반응성기를 도입한 검출 프로브 및/또는 검출 프로브가 혼성화하여 형성되는 복합체에 대하여 광조사하여 검출 프로브 및/또는 검출 프로브와 표적 핵산 사이에서 공유 결합을 형성시킴으로써, 사용하는 검출 프로브량을 저감시킨 경우이어도 미량의 표적 핵산을 고감도로 검출할 수 있음을 알았다.
실시예 6
실시예 1에 있어서 표적 핵산으로서 T-01 대신 T-02, 검출 프로브로서 D-01 및 D-02 대신 D-05 및 D-06, 포착 프로브로서 C-01 대신 C-05를 이용한 것, 및 T-02(10μM)와 D-05(100μM) 및 D-06(100μM)을 T-02에 대한 D-05, D-06의 각 사용량이 1몰 당량이 되도록 혼합하고, 10mM 인산 완충액(100mM 염화나트륨 함유)로 희석한 용액을 0.1, 0.01amol의 2가지의 몰 농도가 되도록 조정하고, DNA 칩 상에서의 혼성화 후, DNA 칩을 블랙 라이트로 365nm의 광을 5분간 조사한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하고, 표적 핵산 T-02를 검출하였다. 그 결과를 표 4에 나타냈다.
광조사에 의해 표적 핵산과 검출 프로브 및 표적 핵산과 포착 프로브 사이에 공유 결합을 형성시킴으로써, 표적 핵산에 대한 검출 프로브의 사용량이 종래보다 매우 적은 1몰 당량이어도 0.1, 0.01amol의 각 농도에 있어서 표적 핵산을 검출할 수 있었다.
비교예 3
실시예 6에 있어서 검출 프로브로서 D-05 및 D-06 대신 D-07 및 D-08을 사용하고, 포착 프로브로서 C-05 대신 C-06을 사용하고, 혼성화시켜 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 행하지 않고, 또한 DNA 칩 상에서의 혼성화 후, DNA 칩을 광조사하여 포착 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 행하지 않은 것 이외에는 실시예 6과 마찬가지의 조작을 행하고, 표적 핵산 T-02를 검출하였다.
또한, 마찬가지로 하여 표적 핵산 T-02에 대하여 10만몰 당량의 D-07 및 D-08을 혼합한 것을 제조하고, 표적 핵산 T-02를 검출하였다. 이상의 결과를 표 4에 나타냈다.
비교예 3에서는 검출 프로브를 1몰 당량 이용한 때뿐만 아니라 10만몰 당량 이용한 때이어도 실시예 6과 비교하여 S/N비는 크게 저하되고, T-02를 검출할 수 없었다.
Figure pct00009
이상의 실시예 6 및 비교예 3의 결과로부터 샌드위치 혼성화에 있어서 표적 핵산과 광반응성기를 도입한 검출 프로브가 혼성화하여 형성되는 복합체에 대하여 광조사하여 검출 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키고, 또한 DNA 칩 상에서 표적 핵산과 광반응성기를 도입한 포착 프로브가 혼성화하여 형성되는 복합체에 대하여 광조사하여 포착 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시킴으로써, 사용하는 검출 프로브량을 저감시킨 경우이어도 미량의 표적 핵산을 고감도로 검출할 수 있음을 알았다.
실시예 7
본 발명의 SNPs(단일 염기 다형성) 검출에 대한 적용을 검토하였다. 본 실시예에서는 인간 게놈 DNA를 이용하기 때문에 표적 핵산은 이중쇄 핵산이다.
DNA 칩의 제조
도레이사 제조의 「3D-진」(등록 상표)의 기판(256주 기판)에 표 1의 포착 프로브 C-07(야생형), C-08(Gly12Ser 변이형), C-09(Gly12Arg 변이형), C-10(Gly12Cys 변이형)을 고정한 것을 이용하였다.
검체 DNA의 제조
검체 DNA로서 A549 세포로부터 추출한 DNA를 이용하였다. A549 세포는 폐암 조직 유래의 배양 세포이고, Gly12Ser 변이가 생겨 있는 것이 알려져 있다. A549 세포로부터 추출한 5μg의 게놈 DNA를 초음파 처리(고바리스, s220)에 의해 단편화하고, 단편화한 게놈 DNA 중 600ng를 검출에 이용하였다. 단편화의 처리 조건은 제조사 권장의 방법에 따랐다. 단편의 길이는 바이오 애널라이저(애질런트사 제조)를 이용하여 평가하였다. 또한, 하나의 세포에는 2pg의 DNA가 포함되어 있는 것이 알려져 있다. 또한 SNPs 유전자는 1세포당 2카피 존재하기 때문에 게놈 DNA 600ng에는 SNPs 유전자의 서열이 1amol 포함되어 있게 된다.
혼성화와 검출
게놈 DNA 600ng(1amol)에 대하여 검출 프로브 D-09, D-10, D-11, D-12의 각 사용량이 100몰 당량(즉, 각 검출 프로브가 100amol)이 되도록 검체 DNA를 제조(각각의 총 액량 5μL)하고, 각각 이하의 조작을 행하였다.
혼합 용액을 히트 블록으로 95℃, 5분간 유지하고, 그 후 천천히 실온까지 냉각한 것을 유리 튜브에 옮기고, 트랜스 일루미네이터로 20분간, 365nm(10μW/cm2)의 광을 조사하였다. 이 용액에 1X혼성화 용액(1중량% BSA(소 혈청 알부민), 5×SSC, 1중량% SDS(도데실황산나트륨), 50ng/ml 연어 정자 DNA의 용액, 5중량% 덱스트란황산나트륨, 30% 포름아미드)을 35μL 첨가하고, 혼성화 용액으로 하였다. 이 혼성화 용액을 전량 DNA 칩에 주입하고, 32℃으로 가온한 인큐베이터에 세팅하였다. 혼성화는 「3D-진」의 표준 프로토콜에 따라 250rpm으로 선회 교반을 하면서 32℃에서 2시간 행하였다. 혼성화 후, DNA 칩을 30℃으로 가온한 세정액(0.5×SSC, 0.1중량% SDS(도데실황산나트륨))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 또한, 스트렙토아비딘 피코에리트린(프로자임사)을 염색 용액(50ng/μL 스트렙토아비딘 피코에리트린, 100mM MES, 1M NaCl, 0.05중량% 트윈 20, 2mg/ml BSA(소 혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하고, DNA 칩 상으로 적하하였다. 35℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 30℃으로 가온한 세정액(6XSSPE, 0.01중량% 트윈20)으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 염색 완료의 DNA 칩은 DNA 칩 스캐너(도레이)를 이용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100%, 포토 멀티플라이어의 전압 설정을 70%로 하였다.
표적 핵산의 검출 결과를 표 5에 나타냈다. Gly12Ser 변이의 포착 프로브 「C-08」의 S/N비가 가장 높았다. A549 세포는 Gly12Ser 변이가 들어 있는 것이 알려져 있고, 본 검출 결과와 일치하였다.
광조사에 의해 표적 핵산과 검출 프로브 사이에서 공유 결합을 형성시킴으로써, 표적 핵산에 대한 검출 프로브의 사용량이 종래보다도 적은 100몰 당량이어도 이중쇄 핵산인 게놈 DNA를 검출할 수 있고, 또한 SNPs를 정확하게 검출할 수 있었다.
비교예 4
실시예 7에 있어서 검출 프로브로서 D-09, D-10, D-11, D-12 대신 D-13, D-14, D-15, D-16을 사용하고, 혼성화시켜 형성된 복합체에 광조사하여 검출 프로브와 표적 핵산 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 행하지 않은 것 이외에는 실시예 7과 마찬가지의 조작을 행하고, 표적 핵산을 검출하였다.
또한, 마찬가지로 하여 종래의 방법에 따라 표적 핵산에 대하여 10만몰 당량의 D-13, D-14, D-15, D-16을 혼합한 것을 제조하고, 표적 핵산을 검출하였다. 이상의 결과를 표 5에 나타냈다.
비교예 4에서는 검출 프로브를 100몰 당량 이용한 때에는 야생형의 포착 프로브 C-07의 S/N비가 가장 높고, Gly12Ser 변이는 전혀 검출할 수 없었다. 검출 프로브를 10만몰 당량 이용한 때이어도 실시예 7과 비교하여 S/N비는 크게 저하되고, Gly12Ser 변이를 검출할 수 없었다.
Figure pct00010
서열표 프리텍스트
서열 번호 1: 합성 DNA
서열 번호 2: 합성 DNA
서열 번호 3: 합성 DNA(5' 말단 및 3' 말단 비오틴화)
서열 번호 4: 합성 DNA(5' 말단 및 3' 말단 비오틴화)
서열 번호 5: 합성 DNA(5' 말단 및 3' 말단 비오틴화)
서열 번호 6: 합성 DNA(5' 말단 및 3' 말단 비오틴화)
서열 번호 7: 합성 DNA(5' 말단 및 3' 말단 비오틴화)
서열 번호 8: 합성 DNA(5' 말단 및 3' 말단 비오틴화)
서열 번호 9: 합성 DNA(5' 말단 및 3' 말단 비오틴화)
서열 번호 10: 합성 DNA(5' 말단 및 3' 말단 비오틴화)
서열 번호 11: 합성 DNA(5' 말단 아미노화)
서열 번호 12: 합성 DNA(5' 말단 비오틴화)
서열 번호 13: 합성 DNA(5' 말단 아미노화)
서열 번호 14: 합성 DNA(5' 말단 아미노화)
서열 번호 15: 합성 DNA(5' 말단 아미노화)
서열 번호 16: 합성 DNA(5' 말단 아미노화)
서열 번호 17: 합성 DNA(5' 말단 아미노화)
SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. <120> Method for detecting a target nucleic acid <130> PF000493-PCT <160> 17 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gaaaaataaa ctgtaaatca tattcctccc catgtcgtag gtactcctta aagttagtat 60 ttttatatgt agtttctgaa gtagatatgg cagcacataa tgacatattt gtactgcgtg 120 tagtatcaac aacagtaaca aa 142 <210> 2 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 tcagaggtaa ccatagaacc actaggtgta ggaaaataat ttgaactggc taaatttgca 60 gtagacccag agcctttaat gtataaatcg tctggtacat tttcaccaac agtaccagcc 120 ctattaaata aatgtctaac 140 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (biotin-labelings at the 5'-end and 3'-end) <400> 3 tttgttactg ttgttgatac tac 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (biotin-labelings at the 5'-end and 3'-end) <400> 4 gaatatgatt tacagtttat ttttc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (biotin-labelings at the 5'-end and 3'-end) <400> 5 acatttattt aatagggctg gtact 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (biotin-labelings at the 5'-end and 3'-end) <400> 6 ctagtggttc tatggttacc tctga 25 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (biotin-labelings at the 5'-end and 3'-end) <400> 7 acatgtcaca cataaggtta aaacactatc aaatactcca 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (biotin-labelings at the 5'-end and 3'-end) <400> 8 cagtcatttt cagcaggcct tataataaaa ataatgaaaa 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (biotin-labelings at the 5'-end and 3'-end) <400> 9 gatcatattc gtccacaaaa tgattctgaa ttagctgtat 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (biotin-labelings at the 5'-end and 3'-end) <400> 10 gaatggtcct gcaccagtaa tatgcatatt aaaacaagat 40 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (an amino group at the 5'-end) <400> 11 gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (a biotin-labeling at the 5'-end) <400> 12 gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga 30 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (an amino group at the 5'-end) <400> 13 tttttgattt atacattaaa ggctctgggt ctact 35 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (an amino group at the 5'-end) <400> 14 agttggagct ggtggcgtag g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (an amino group at the 5'-end) <400> 15 agttggagct agtggcgtag g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (an amino group at the 5'-end) <400> 16 agttggagct cgtggcgtag g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA (an amino group at the 5'-end) <400> 17 agttggagct tgtggcgtag g 21

Claims (4)

  1. 표적 핵산과 혼성화하는 검출 프로브 및 지지체에 고정된 포착 프로브를 이용하는 샌드위치 혼성화법에 의한 표적 핵산의 검출 방법으로서,
    검출 프로브 및/또는 포착 프로브의 핵산 분자 중 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있고,
    표적 핵산과 검출 프로브 및/또는 포착 프로브가 혼성화하여 형성된 복합체에 광조사하여, 광반응성기와 표적 핵산 중의 핵산 염기 사이에 공유 결합을 형성시키는 공정을 갖는 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 검출 프로브의 핵산 분자 중 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 포착 프로브의 핵산 분자 중 적어도 하나의 핵산 염기가 광반응성기로 치환되어 있는 검출 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 광반응성기가 3-시아노비닐카르바졸기, p-카르바모일비닐페놀기, 4,5',8-트리메틸소랄렌기 및 N3-메틸-5-시아노비닐우라실기로부터 선택되는 적어도 1종인 검출 방법.
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