JPH0775600A - 標的核酸の検出法 - Google Patents
標的核酸の検出法Info
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- JPH0775600A JPH0775600A JP22353193A JP22353193A JPH0775600A JP H0775600 A JPH0775600 A JP H0775600A JP 22353193 A JP22353193 A JP 22353193A JP 22353193 A JP22353193 A JP 22353193A JP H0775600 A JPH0775600 A JP H0775600A
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- Japan
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- nucleic acid
- target nucleic
- cells
- hybridization
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 バックグラウンドの低減化が可能で、高感度
かつ高特異的な検出が可能な標的核酸の検出法の改良。 【構成】 細胞を超音波処理し、必要により遠心分離お
よび／または濾過操作を行った後、核酸精製操作なしに
直接、細胞から調製された標的核酸をプレート担体を用
いたサンドイッチハイブリダイゼーション法によって検
出することを特徴とする標的核酸の検出法。 【効果】 従来の超音波による細胞破砕の際、ビーズを
加え、細胞破砕液をそのままＲＮＡまたはＤＮＡの直接
ハイブリダイゼーションを行う方法に比べて、本発明で
は細胞中の標的核酸を迅速にかつ簡便に抽出し断片化す
ることを同時に行い、核酸の精製操作が不要となり、検
出時間を短縮する。
かつ高特異的な検出が可能な標的核酸の検出法の改良。 【構成】 細胞を超音波処理し、必要により遠心分離お
よび／または濾過操作を行った後、核酸精製操作なしに
直接、細胞から調製された標的核酸をプレート担体を用
いたサンドイッチハイブリダイゼーション法によって検
出することを特徴とする標的核酸の検出法。 【効果】 従来の超音波による細胞破砕の際、ビーズを
加え、細胞破砕液をそのままＲＮＡまたはＤＮＡの直接
ハイブリダイゼーションを行う方法に比べて、本発明で
は細胞中の標的核酸を迅速にかつ簡便に抽出し断片化す
ることを同時に行い、核酸の精製操作が不要となり、検
出時間を短縮する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はプレート担体を使用する
サンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸
の検出方法に関する。
サンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸
の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸ハイブリダイゼーション法は核酸の
相補性を利用したものであり、医学・薬学・生化学分野
において、高感度の反応技術として広範囲に利用されて
いる。また、核酸のサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン法は標的核酸と相補的塩基配列を有する２種の核酸プ
ローブを使用するため、バックグラウンドの低減化が可
能で、高感度かつ高特異的な検出が可能である。また、
核酸ハイブリダイゼーションにおける標的核酸は高分子
量のものより低分子量のものの方が反応性が高く、核酸
の断片化の方法としては、遺伝子のクローニングに用い
られているように、制限酵素を作用させる方法や、超音
波照射等の剪断力を利用する方法がある。
相補性を利用したものであり、医学・薬学・生化学分野
において、高感度の反応技術として広範囲に利用されて
いる。また、核酸のサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン法は標的核酸と相補的塩基配列を有する２種の核酸プ
ローブを使用するため、バックグラウンドの低減化が可
能で、高感度かつ高特異的な検出が可能である。また、
核酸ハイブリダイゼーションにおける標的核酸は高分子
量のものより低分子量のものの方が反応性が高く、核酸
の断片化の方法としては、遺伝子のクローニングに用い
られているように、制限酵素を作用させる方法や、超音
波照射等の剪断力を利用する方法がある。
【０００３】一方、細胞から核酸試料を調製する方法と
しては、一般に細胞を物理的あるいは化学的手段によっ
て破砕し、遊離の無細胞抽出液をさらにフェノール抽出
等による蛋白質除去、エタノール沈殿等による濃縮・脱
塩を繰り返すことにより精製操作を行っている。細胞破
砕の方法としては超音波照射、圧力室、微粒子による粉
砕、細胞の浸透圧変化等の物理的手段やアルカリ処理、
界面活性剤処理、細胞壁溶解酵素の作用等による化学的
手段がよく用いられている。
しては、一般に細胞を物理的あるいは化学的手段によっ
て破砕し、遊離の無細胞抽出液をさらにフェノール抽出
等による蛋白質除去、エタノール沈殿等による濃縮・脱
塩を繰り返すことにより精製操作を行っている。細胞破
砕の方法としては超音波照射、圧力室、微粒子による粉
砕、細胞の浸透圧変化等の物理的手段やアルカリ処理、
界面活性剤処理、細胞壁溶解酵素の作用等による化学的
手段がよく用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、核酸サ
ンドイッチハイブリダイゼーション法による検出のため
の試料調製においては、検体中の細胞破砕、蛋白質除去
等の煩雑な精製操作が必要であり、またハイブリダイゼ
ーションの効率を上げるために、制限酵素等で数百ベー
スに断片化する必要があるという問題点があった。また
従来から超音波による細胞破砕の際、ビーズを加えて破
砕を行い、細胞破砕液中のＲＮＡまたはＤＮＡの直接ハ
イブリダイゼーションを行うことが提案されている（特
開昭62-236478公報）。しかし該方法によると細胞破砕
の際、ビーズを加えるため、細胞破砕液をそのままＲＮ
ＡまたはＤＮＡの直接ハイブリダイゼーションを行うこ
とが困難である。しかも該方法では超音波の出力密度が
0.2W/mlと低いため、細胞破砕後の遊離した核酸が高分
子量であり、ハイブリダイゼーション効率の上昇は期待
できない。
ンドイッチハイブリダイゼーション法による検出のため
の試料調製においては、検体中の細胞破砕、蛋白質除去
等の煩雑な精製操作が必要であり、またハイブリダイゼ
ーションの効率を上げるために、制限酵素等で数百ベー
スに断片化する必要があるという問題点があった。また
従来から超音波による細胞破砕の際、ビーズを加えて破
砕を行い、細胞破砕液中のＲＮＡまたはＤＮＡの直接ハ
イブリダイゼーションを行うことが提案されている（特
開昭62-236478公報）。しかし該方法によると細胞破砕
の際、ビーズを加えるため、細胞破砕液をそのままＲＮ
ＡまたはＤＮＡの直接ハイブリダイゼーションを行うこ
とが困難である。しかも該方法では超音波の出力密度が
0.2W/mlと低いため、細胞破砕後の遊離した核酸が高分
子量であり、ハイブリダイゼーション効率の上昇は期待
できない。
【０００５】また、ゲルやフィルターを固相として用い
る方法も提案されている（特開平4-84899公報）が、該
方法では細胞抽出液中の細胞残査を除去しないとバック
グラウンドが上昇し、そのまま直接ハイブリダイゼーシ
ョンを行うことは困難である。しかも試料中の核酸変性
にアルカリ変性を行うこともあるため、試料中のＲＮＡ
を測定したい場合はＲＮＡが分解され測定不可能とな
る。
る方法も提案されている（特開平4-84899公報）が、該
方法では細胞抽出液中の細胞残査を除去しないとバック
グラウンドが上昇し、そのまま直接ハイブリダイゼーシ
ョンを行うことは困難である。しかも試料中の核酸変性
にアルカリ変性を行うこともあるため、試料中のＲＮＡ
を測定したい場合はＲＮＡが分解され測定不可能とな
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明に到
達した。すなわち本発明は細胞を超音波処理し、必要に
より遠心分離および／または濾過操作を行った後、核酸
精製操作なしに直接、細胞から調製された標的核酸をプ
レート担体を用いたサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン法によって検出することを特徴とする標的核酸の検出
法である。
点を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明に到
達した。すなわち本発明は細胞を超音波処理し、必要に
より遠心分離および／または濾過操作を行った後、核酸
精製操作なしに直接、細胞から調製された標的核酸をプ
レート担体を用いたサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン法によって検出することを特徴とする標的核酸の検出
法である。
【０００７】本発明では細胞をまず超音波処理する。細
胞としては動物、植物、微生物等の生物組織由来の細胞
や培養細胞を使用できる。該細胞を含む試料としては、
シャーレ上のコロニーの懸濁液、液体培養液、またその
遠心集菌液、場合によっては血液、体液などの試料をそ
のまま用いることも可能である。
胞としては動物、植物、微生物等の生物組織由来の細胞
や培養細胞を使用できる。該細胞を含む試料としては、
シャーレ上のコロニーの懸濁液、液体培養液、またその
遠心集菌液、場合によっては血液、体液などの試料をそ
のまま用いることも可能である。
【０００８】該処理に使用する超音波処理装置として
は、例えば本多電子（株）製超音波洗浄機W-103T型、
（株）カイジョー製卓上型超音波洗浄機CA-248 1II型や
その他の装置が使用できる。発振モードは、振動子の試
料への直接浸漬および容器中の試料への液媒体を介して
の間接的照射があるが、前者では試料のキャリーオーバ
ーを招く恐れがあり、したがって振動子の容器中の試料
への液媒体を会しての間接的照射が好ましい。
は、例えば本多電子（株）製超音波洗浄機W-103T型、
（株）カイジョー製卓上型超音波洗浄機CA-248 1II型や
その他の装置が使用できる。発振モードは、振動子の試
料への直接浸漬および容器中の試料への液媒体を介して
の間接的照射があるが、前者では試料のキャリーオーバ
ーを招く恐れがあり、したがって振動子の容器中の試料
への液媒体を会しての間接的照射が好ましい。
【０００９】処理容器としてはガラス製、ポリプロピレ
ン製のマイクロチューブが使用できるが、容器への核酸
の吸着性からガラス製のものよりも、好ましくはプラス
チック製、例えばエッペンドルフ社製0.5ml 容もしくは
1.5ml 容マイクロ遠心チューブなどがある。出力は20W
〜100W、好ましくは30W 〜50W 、発振周波数は20KHz〜6
0KHz 、好ましくは28KHz 〜45KHz の範囲で使用でき
る。出力密度は0.2W/ml以上が好ましい。振動子はフェ
ライト振動子、チタン酸バリウム系磁器振動子、ボルト
締めランジュバン型振動子、バイモルフ型振動子、金属
磁歪振動子等が使用できるが、容器への超音波振動の伝
達性からボルト締めランジュバン型が好ましい。処理時
間は１分〜10分、好ましくは２分〜５分の範囲である。
ン製のマイクロチューブが使用できるが、容器への核酸
の吸着性からガラス製のものよりも、好ましくはプラス
チック製、例えばエッペンドルフ社製0.5ml 容もしくは
1.5ml 容マイクロ遠心チューブなどがある。出力は20W
〜100W、好ましくは30W 〜50W 、発振周波数は20KHz〜6
0KHz 、好ましくは28KHz 〜45KHz の範囲で使用でき
る。出力密度は0.2W/ml以上が好ましい。振動子はフェ
ライト振動子、チタン酸バリウム系磁器振動子、ボルト
締めランジュバン型振動子、バイモルフ型振動子、金属
磁歪振動子等が使用できるが、容器への超音波振動の伝
達性からボルト締めランジュバン型が好ましい。処理時
間は１分〜10分、好ましくは２分〜５分の範囲である。
【００１０】本発明では、超音波処理後の試料は、細胞
残査や遊離の核酸以外の成分の除去などの精製操作をす
ることなく、そのまま直接プレート担体を用いたサンド
イッチハイブリダイゼーションによる検出が可能であ
る。細胞残査や遊離の核酸以外の成分の除去などの精製
操作としては、試料のフェノール抽出、エタノール沈
殿、プロテアーゼ処理、界面活性剤処理等を意味する。
残査や遊離の核酸以外の成分の除去などの精製操作をす
ることなく、そのまま直接プレート担体を用いたサンド
イッチハイブリダイゼーションによる検出が可能であ
る。細胞残査や遊離の核酸以外の成分の除去などの精製
操作としては、試料のフェノール抽出、エタノール沈
殿、プロテアーゼ処理、界面活性剤処理等を意味する。
【００１１】本発明では場合によっては上記超音波処理
後に遠心分離および／または濾過操作を行って、細胞残
渣を除く処理をしてもよい。しかし、超音波処理後、プ
レートを担体としてサンドイッチハイブリダイゼーショ
ンすることにより、試料のフェノール抽出、エタノール
沈殿、プロテアーゼ処理、界面活性剤処理等が不要であ
ることを特徴とする。
後に遠心分離および／または濾過操作を行って、細胞残
渣を除く処理をしてもよい。しかし、超音波処理後、プ
レートを担体としてサンドイッチハイブリダイゼーショ
ンすることにより、試料のフェノール抽出、エタノール
沈殿、プロテアーゼ処理、界面活性剤処理等が不要であ
ることを特徴とする。
【００１２】本発明では次いで直接プレート担体を用い
たサンドイッチハイブリダイゼーション法によって標的
核酸を検出する。プレート担体を用いたサンドイッチハ
イブリダイゼーションによる検出法とは、標的核酸に相
補的な塩基配列を有する２種の核酸プローブを使用し、
一方の核酸プローブはプレート担体、例えばマイクロタ
イタープレートを固相として結合させ、標的核酸の捕捉
用プローブ（捕捉プローブ）とし、もう一方の核酸プロ
ーブは標識物質で標識し、検出用プローブ（標識プロー
ブ）とする。次いでプレート担体に捕捉プローブを固定
化し、試料中の標的核酸を必要により変性操作を行った
後、該プローブと結合させ、次いで標識プローブとさら
に前記結合核酸に結合させ、結合した標識あるいは遊離
した状態の標識を測定することにより、試料中の核酸を
検出する方法である。ここで変性処理とは標的核酸が二
本鎖である場合、熱変性やアルカリ変性、酸変性等によ
り一本鎖化を意味する。サンドイッチハイブリダイゼー
ションは１ステップでも２ステップでも良い。
たサンドイッチハイブリダイゼーション法によって標的
核酸を検出する。プレート担体を用いたサンドイッチハ
イブリダイゼーションによる検出法とは、標的核酸に相
補的な塩基配列を有する２種の核酸プローブを使用し、
一方の核酸プローブはプレート担体、例えばマイクロタ
イタープレートを固相として結合させ、標的核酸の捕捉
用プローブ（捕捉プローブ）とし、もう一方の核酸プロ
ーブは標識物質で標識し、検出用プローブ（標識プロー
ブ）とする。次いでプレート担体に捕捉プローブを固定
化し、試料中の標的核酸を必要により変性操作を行った
後、該プローブと結合させ、次いで標識プローブとさら
に前記結合核酸に結合させ、結合した標識あるいは遊離
した状態の標識を測定することにより、試料中の核酸を
検出する方法である。ここで変性処理とは標的核酸が二
本鎖である場合、熱変性やアルカリ変性、酸変性等によ
り一本鎖化を意味する。サンドイッチハイブリダイゼー
ションは１ステップでも２ステップでも良い。
【００１３】本発明において使用するプレートとしては
ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート等の
合成樹脂製のものがあり、蛋白質の結合性から高結合、
中結合、低結合タイプがある。核酸の結合性からポリス
チレン製高結合タイプが好ましい。プレートを固相担体
として使用することにより、ハイブリダイゼーション反
応の際、固相担体として用いる以外に反応容器としても
使用することができるので、吸引による洗浄操作が可能
であり、未反応物の除去が容易である。
ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート等の
合成樹脂製のものがあり、蛋白質の結合性から高結合、
中結合、低結合タイプがある。核酸の結合性からポリス
チレン製高結合タイプが好ましい。プレートを固相担体
として使用することにより、ハイブリダイゼーション反
応の際、固相担体として用いる以外に反応容器としても
使用することができるので、吸引による洗浄操作が可能
であり、未反応物の除去が容易である。
【００１４】標的核酸と相補鎖を有するプローブ核酸と
してはＤＮＡ合成機を用いてホスホアミダイト法で合成
したオリゴヌクレオチド、クローニングで得られたプラ
スミドＤＮＡの制限酵素断片等を用いることができる。
プローブ核酸のプレート担体への固定は共有結合法、イ
オン結合法、吸着法等を用いることができる。プローブ
の標識は螢光物質、酵素、抗体、ハプテン等を用いるこ
とができる。
してはＤＮＡ合成機を用いてホスホアミダイト法で合成
したオリゴヌクレオチド、クローニングで得られたプラ
スミドＤＮＡの制限酵素断片等を用いることができる。
プローブ核酸のプレート担体への固定は共有結合法、イ
オン結合法、吸着法等を用いることができる。プローブ
の標識は螢光物質、酵素、抗体、ハプテン等を用いるこ
とができる。
【００１５】本発明ではプレート担体を使用することに
より、洗浄操作が容易であり、他の担体使用時の場合の
遠心分離や濾過操作などの煩雑な操作が不要である。
より、洗浄操作が容易であり、他の担体使用時の場合の
遠心分離や濾過操作などの煩雑な操作が不要である。
【００１６】
【実施例】次に実施例を用いて本発明を説明する。 実施例１ 腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の検出 〔腸炎ビブリオ菌体超音波処理液〕腸炎ビブリオ菌体１
白金耳を１mlのＬＢ液体培地に植菌し、37℃で一夜振盪
培養後、培養液 100μｌを0.5ml 容マイクロ遠心チュー
ブにとり、本多電子（株）製超音波洗浄機W-103T型（出
力:35 Ｗ，発振周波数:45ＫＨｚ，振動子：ボルト締め
ランジュバン型振動子，発振方式：トランジスターによ
る自励発振）を用いて100ml 水浴中で２分間超音波処理
した（出力密度0.35W/ml）。
白金耳を１mlのＬＢ液体培地に植菌し、37℃で一夜振盪
培養後、培養液 100μｌを0.5ml 容マイクロ遠心チュー
ブにとり、本多電子（株）製超音波洗浄機W-103T型（出
力:35 Ｗ，発振周波数:45ＫＨｚ，振動子：ボルト締め
ランジュバン型振動子，発振方式：トランジスターによ
る自励発振）を用いて100ml 水浴中で２分間超音波処理
した（出力密度0.35W/ml）。
【００１７】〔ＴＤＨ遺伝子検出用捕捉プローブおよび
標識プローブの合成〕捕捉プローブおよび標識プローブ
は、ＤＮＡシンセサイザー391 型（アプライドバイオシ
ステムズ社製）を用いて、ホスホアミダイト法により合
成した。捕捉プローブの塩基配列は5'-CGGTCATTCTGCTGT
GTTCGTAAAAT-3'、標識プローブの塩基配列は5'-CCCCGGT
TCTGAXAGATATTGTT-3' である。配列中Ｘは５位にリンカ
ーアームを有するウリジンを示す。この標識プローブは
特開平4-20299 号公報に開示されたものである。
標識プローブの合成〕捕捉プローブおよび標識プローブ
は、ＤＮＡシンセサイザー391 型（アプライドバイオシ
ステムズ社製）を用いて、ホスホアミダイト法により合
成した。捕捉プローブの塩基配列は5'-CGGTCATTCTGCTGT
GTTCGTAAAAT-3'、標識プローブの塩基配列は5'-CCCCGGT
TCTGAXAGATATTGTT-3' である。配列中Ｘは５位にリンカ
ーアームを有するウリジンを示す。この標識プローブは
特開平4-20299 号公報に開示されたものである。
【００１８】〔標識プローブへの酵素結合〕標識を結合
していない上記合成標識プローブと、そのリンカーアー
ムを介してのアルカリフォスファターゼとの結合を文献
（Nucleic Acids Research,14,6155,1986）に従って行
った。
していない上記合成標識プローブと、そのリンカーアー
ムを介してのアルカリフォスファターゼとの結合を文献
（Nucleic Acids Research,14,6155,1986）に従って行
った。
【００１９】〔捕捉プローブと固相の結合〕固相はポリ
スチレン製のマイクロタイタープレート（マイクロライ
ト２、ダイナテック社製）を用い、上記方法で得られた
捕捉プローブをマイクロタイタープレートのウェルに 1
00μl ずつ分注し、25℃で一夜インキュベートし、捕捉
プローブをプレートに結合させた後、ＢＳＡ（牛血清ア
ルブミン）によりブロックを行った。
スチレン製のマイクロタイタープレート（マイクロライ
ト２、ダイナテック社製）を用い、上記方法で得られた
捕捉プローブをマイクロタイタープレートのウェルに 1
00μl ずつ分注し、25℃で一夜インキュベートし、捕捉
プローブをプレートに結合させた後、ＢＳＡ（牛血清ア
ルブミン）によりブロックを行った。
【００２０】〔腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の検出〕上記
方法により調製した試薬および試料を用いて、試料中の
腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の検出を以下の方法で行っ
た。試料である腸炎ビブリオ菌体超音波処理液は、NaOH
で処理し変性させた。対照として大腸菌を同じ方法で処
理し変性させた。プレートに変性させた試料を20μｌ、
ハイブリダイゼーションバッファーを 100μl 加え、軽
質流動パラフィン（ライトールホワイト、米国 Witco社
製）を80μl 重層し、50℃で60分間ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーション後、ウェルから
液を除き、１％ラウリル硫酸ナトリウムを含む洗浄液１
を200μｌ加え、50℃で５分間洗浄後、１×SSC 200μl
で洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識プローブ溶
液を 100μl 加え、軽質流動パラフィンを 100μl重層
し、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後、ウェルから液を除き、洗浄液
１を 200μl 加え、50℃で10分間洗浄し、次に0.5%トリ
トンX-100 を含む洗浄液２を 200μl 加え室温で10分間
洗浄し、さらに１×SSC 200μl で洗浄した後、アルカ
リフォスファターゼの発光基質であるルミフォス480
（和光純薬社製）を 100μl 加え、37℃で15分間酵素反
応を行った後、発光量をマイクロライト1000（ダイナテ
ック社製）で測定した。その結果を表１に示す。
方法により調製した試薬および試料を用いて、試料中の
腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の検出を以下の方法で行っ
た。試料である腸炎ビブリオ菌体超音波処理液は、NaOH
で処理し変性させた。対照として大腸菌を同じ方法で処
理し変性させた。プレートに変性させた試料を20μｌ、
ハイブリダイゼーションバッファーを 100μl 加え、軽
質流動パラフィン（ライトールホワイト、米国 Witco社
製）を80μl 重層し、50℃で60分間ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーション後、ウェルから
液を除き、１％ラウリル硫酸ナトリウムを含む洗浄液１
を200μｌ加え、50℃で５分間洗浄後、１×SSC 200μl
で洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識プローブ溶
液を 100μl 加え、軽質流動パラフィンを 100μl重層
し、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後、ウェルから液を除き、洗浄液
１を 200μl 加え、50℃で10分間洗浄し、次に0.5%トリ
トンX-100 を含む洗浄液２を 200μl 加え室温で10分間
洗浄し、さらに１×SSC 200μl で洗浄した後、アルカ
リフォスファターゼの発光基質であるルミフォス480
（和光純薬社製）を 100μl 加え、37℃で15分間酵素反
応を行った後、発光量をマイクロライト1000（ダイナテ
ック社製）で測定した。その結果を表１に示す。
【００２１】実施例２ ＬＢ寒天培地上の腸炎ビブリオ菌体１コロニーを0.5ml
容マイクロ遠心チューブ中のＴＥ緩衝液10μl中に懸濁
し、本多電子（株）製超音波洗浄機W-103T型（出力：35
Ｗ，発振周波数：45 KHz、振動子：ボルト締めランジュ
バン型振動子、発振方式：トランジスターによる自励発
振）を用いて、100ml 水浴中で２分間超音波処理し、腸
炎ビブリオ菌体超音波処理液を得た（出力密度0.35W/m
l）。腸炎ビブリオ菌体超音波処理液はNaOHで処理し変
性させた。対照として大腸菌を同じ方法で処理し変性さ
せた。プレートに変性させた試料を20μl 、ハイブリダ
イゼーションバッファーを 100μl 加え、軽質流動パラ
フィン（ライトールホワイト、米国 Witco社製）を80μ
ｌ重層し、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション後ウェルから液を除き、1%
ラウリル硫酸ナトリウムを含む洗浄液１を 200μl 加
え、50℃で５分間洗浄後、１×SSC 200μl で洗浄し、
アルカリフォスファターゼ標識プローブ溶液を 100μl
加え、軽質流動パラフィンを 100μl 重層し、50℃で60
分間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイガ
ーション後ウェルから液を除き、洗浄液１を 200μl 加
え、50℃で10分間洗浄し、次に0.5%トリトンX-100 を含
む洗浄液２を 200μl 加え室温で10分間洗浄し、さらに
1×SSC 200μl で洗浄した後、アルカリフォスファタ
ーゼの発光基質であるルミフォス 480（和光純薬社製）
を 100μl 加え、37℃で15分間酵素反応を行った後、発
光量をマイクロライト1000（ダイナテック社製）で測定
した。その結果を表１に示す。
容マイクロ遠心チューブ中のＴＥ緩衝液10μl中に懸濁
し、本多電子（株）製超音波洗浄機W-103T型（出力：35
Ｗ，発振周波数：45 KHz、振動子：ボルト締めランジュ
バン型振動子、発振方式：トランジスターによる自励発
振）を用いて、100ml 水浴中で２分間超音波処理し、腸
炎ビブリオ菌体超音波処理液を得た（出力密度0.35W/m
l）。腸炎ビブリオ菌体超音波処理液はNaOHで処理し変
性させた。対照として大腸菌を同じ方法で処理し変性さ
せた。プレートに変性させた試料を20μl 、ハイブリダ
イゼーションバッファーを 100μl 加え、軽質流動パラ
フィン（ライトールホワイト、米国 Witco社製）を80μ
ｌ重層し、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション後ウェルから液を除き、1%
ラウリル硫酸ナトリウムを含む洗浄液１を 200μl 加
え、50℃で５分間洗浄後、１×SSC 200μl で洗浄し、
アルカリフォスファターゼ標識プローブ溶液を 100μl
加え、軽質流動パラフィンを 100μl 重層し、50℃で60
分間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイガ
ーション後ウェルから液を除き、洗浄液１を 200μl 加
え、50℃で10分間洗浄し、次に0.5%トリトンX-100 を含
む洗浄液２を 200μl 加え室温で10分間洗浄し、さらに
1×SSC 200μl で洗浄した後、アルカリフォスファタ
ーゼの発光基質であるルミフォス 480（和光純薬社製）
を 100μl 加え、37℃で15分間酵素反応を行った後、発
光量をマイクロライト1000（ダイナテック社製）で測定
した。その結果を表１に示す。
【００２２】比較例１ 実施例１と同様の試薬および試料を用いてフィルター担
体でのサンドイッチハイブリダイゼーションを行った。
フィルターへの捕捉プローブの結合は、吸引法により行
い、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を用いてブロッキング
した。腸炎ビブリオ菌体超音波処理液はNaOHで処理し変
性させた。対照として大腸菌を同じ方法で処理し変性さ
せた。ハイブリバッグにフィルターを入れ、変性させた
試料を20μl 、ハイブリダイゼーションバッファーを 1
00μl 加え、ヒートシールし、50℃で60分間ハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ハ
イブリバッグから液を除き、1%ラウリル硫酸ナトリウム
を含む洗浄液１を 200μl 加え、50℃で５分間洗浄後、
1×SSC 200μl で洗浄し、アルカリフォスファターゼ
標識プローブ溶液を 100μl 加え、ヒートシールし、50
℃で60分間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリ
ダイゼーション後、ハイブリバッグから液を除き、洗浄
液１を 200μｌ加え、50℃で10分間洗浄し、次に0.5%ト
リトンX-100 を含む洗浄液２を 200μl 加え室温で10分
間洗浄し、さらに 1×SSC 200μl で洗浄した後、フィ
ルターをキュベットに移し、アルカリフォスファターゼ
の発光基質であるルミフォス 480（和光純薬社製）を 1
00μl 加え、37℃で15分間酵素反応を行った後、液をマ
イクロプレート（マイクロライト２、ダイナテック社
製）に入れ、発光量をマイクロライト1000（ダイナテッ
ク社製）で測定した。その結果を表１に示す。
体でのサンドイッチハイブリダイゼーションを行った。
フィルターへの捕捉プローブの結合は、吸引法により行
い、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を用いてブロッキング
した。腸炎ビブリオ菌体超音波処理液はNaOHで処理し変
性させた。対照として大腸菌を同じ方法で処理し変性さ
せた。ハイブリバッグにフィルターを入れ、変性させた
試料を20μl 、ハイブリダイゼーションバッファーを 1
00μl 加え、ヒートシールし、50℃で60分間ハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ハ
イブリバッグから液を除き、1%ラウリル硫酸ナトリウム
を含む洗浄液１を 200μl 加え、50℃で５分間洗浄後、
1×SSC 200μl で洗浄し、アルカリフォスファターゼ
標識プローブ溶液を 100μl 加え、ヒートシールし、50
℃で60分間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリ
ダイゼーション後、ハイブリバッグから液を除き、洗浄
液１を 200μｌ加え、50℃で10分間洗浄し、次に0.5%ト
リトンX-100 を含む洗浄液２を 200μl 加え室温で10分
間洗浄し、さらに 1×SSC 200μl で洗浄した後、フィ
ルターをキュベットに移し、アルカリフォスファターゼ
の発光基質であるルミフォス 480（和光純薬社製）を 1
00μl 加え、37℃で15分間酵素反応を行った後、液をマ
イクロプレート（マイクロライト２、ダイナテック社
製）に入れ、発光量をマイクロライト1000（ダイナテッ
ク社製）で測定した。その結果を表１に示す。
【００２３】比較例２ 実施例１と同様の試薬および試料を用いてゲル担体での
サンドイッチハイブリダイゼーションを行った。ゲルへ
の捕捉プローブの結合は吸着法により行い、デオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸を用いてブロッキングした。腸
炎ビブリオ菌体超音波処理液はNaOHで処理し変性させ
た。対照として大腸菌を同じ方法で処理し変性させた。
マイクロチューブにゲルを入れ、変性させた試料を20μ
l 、ハイブリダイゼーションバッファーを 100μl 加
え、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後遠心分離し上清液を除き、1%ラ
ウリル硫酸ナトリウムを含む洗浄液１を 200μl 加え、
50℃で５分間洗浄後、 1×SSC 200μl で洗浄し、アル
カリフォスファターゼ標識プローブ溶液を 100μl 加
え、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後遠心分離し上清液を除き、洗浄
液１を 200μl 加え、50℃で10分間洗浄し、次に0.5%％
トリトンX-100 を含む洗浄液２を 200μl 加え室温で10
分間洗浄し、さらに 1×SSC 200μｌで洗浄した後、ア
ルカリフォスファターゼの基質であるルミフォス 480
（和光純薬社製）を 100μl 加え、37℃で15分間酵素反
応を行った後、遠心分離し上清液をマイクロプレート
（マイクロライト２、ダイナテック社製）に入れ、発光
量をマイクロライト1000（ダイナテック社製）で測定し
た。その結果を表１に示す。
サンドイッチハイブリダイゼーションを行った。ゲルへ
の捕捉プローブの結合は吸着法により行い、デオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸を用いてブロッキングした。腸
炎ビブリオ菌体超音波処理液はNaOHで処理し変性させ
た。対照として大腸菌を同じ方法で処理し変性させた。
マイクロチューブにゲルを入れ、変性させた試料を20μ
l 、ハイブリダイゼーションバッファーを 100μl 加
え、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後遠心分離し上清液を除き、1%ラ
ウリル硫酸ナトリウムを含む洗浄液１を 200μl 加え、
50℃で５分間洗浄後、 1×SSC 200μl で洗浄し、アル
カリフォスファターゼ標識プローブ溶液を 100μl 加
え、50℃で60分間ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後遠心分離し上清液を除き、洗浄
液１を 200μl 加え、50℃で10分間洗浄し、次に0.5%％
トリトンX-100 を含む洗浄液２を 200μl 加え室温で10
分間洗浄し、さらに 1×SSC 200μｌで洗浄した後、ア
ルカリフォスファターゼの基質であるルミフォス 480
（和光純薬社製）を 100μl 加え、37℃で15分間酵素反
応を行った後、遠心分離し上清液をマイクロプレート
（マイクロライト２、ダイナテック社製）に入れ、発光
量をマイクロライト1000（ダイナテック社製）で測定し
た。その結果を表１に示す。
【００２４】比較例３ 実施例１の菌体超音波処理液を調製する際に、 100μl
のガラスビース (直径0.1 〜0.3mm)を加え、 200mlの水
浴中で超音波処理を行った。ガラスビーズを添加する以
外は、実施例１と同様にして腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子
の検出を行った。その結果を表１に示す。表１から明ら
かなようにビーズを使用するとバックグランドが高くな
った。
のガラスビース (直径0.1 〜0.3mm)を加え、 200mlの水
浴中で超音波処理を行った。ガラスビーズを添加する以
外は、実施例１と同様にして腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子
の検出を行った。その結果を表１に示す。表１から明ら
かなようにビーズを使用するとバックグランドが高くな
った。
【００２５】
【表１】
【００２６】表１から明らかなように、プレート担体を
用い、超音波処理試料を直接サンドイッチハイブリダイ
ゼーションする本発明の方法は、ゲルを担体とした方法
（比較例２）やフィルターを担体とした方法（比較例
１）に比べ、バックグラウンドが低いため、Ｓ／Ｎが高
く、良好な反応性を示した。
用い、超音波処理試料を直接サンドイッチハイブリダイ
ゼーションする本発明の方法は、ゲルを担体とした方法
（比較例２）やフィルターを担体とした方法（比較例
１）に比べ、バックグラウンドが低いため、Ｓ／Ｎが高
く、良好な反応性を示した。
【００２７】
【発明の効果】従来の超音波による細胞破砕の際、ビー
ズを加え、細胞破砕液をそのままＲＮＡまたはＤＮＡの
直接ハイブリダイゼーションを行う方法に比べて、本発
明では細胞中の標的核酸を迅速簡便に抽出、断片化が同
時に可能となるばかりか、核酸の精製操作が不要とな
り、検出時間を短縮することができる。
ズを加え、細胞破砕液をそのままＲＮＡまたはＤＮＡの
直接ハイブリダイゼーションを行う方法に比べて、本発
明では細胞中の標的核酸を迅速簡便に抽出、断片化が同
時に可能となるばかりか、核酸の精製操作が不要とな
り、検出時間を短縮することができる。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..26 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Thermostable Direct
Haemolysin）遺伝子の339番目から364番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する。 配列 CGGTCATTCT GCTGTGTTCG TAAAAT 26
Haemolysin）遺伝子の339番目から364番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する。 配列 CGGTCATTCT GCTGTGTTCG TAAAAT 26
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..24 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Thermostable Direct
Haemolysin）遺伝子の102番目から125番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GAATAGATAT TGTT 24
Haemolysin）遺伝子の102番目から125番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GAATAGATAT TGTT 24
Claims (3)
- 【請求項１】 細胞を超音波処理し、必要により遠心分
離および／または濾過操作を行った後、核酸精製操作な
しに直接、細胞から調製された標的核酸をプレート担体
を用いたサンドイッチハイブリダイゼーション法によっ
て検出することを特徴とする標的核酸の検出法。 - 【請求項２】 超音波処理条件が出力は20W〜100W、発
振周波数は20KHz〜60KHz、出力密度は0.2W/ml以上であ
ることを特徴とする請求項１記載の標的核酸の検出法。 - 【請求項３】 プレート担体を用いたサンドイッチハイ
ブリダイゼーション法が、プレート担体に標的核酸と相
補鎖を有するプローブ核酸（捕捉プローブ）を固定化
し、試料中の標的核酸を該核酸と結合させ、次いで標識
を結合した核酸（標識プローブ）とさらに前記結合核酸
に結合させ、結合した標識あるいは遊離した状態の標識
を測定することにより、試料中の核酸を検出する方法で
あることを特徴とする請求項１記載の標的核酸の検出
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22353193A JPH0775600A (ja) | 1993-09-08 | 1993-09-08 | 標的核酸の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22353193A JPH0775600A (ja) | 1993-09-08 | 1993-09-08 | 標的核酸の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0775600A true JPH0775600A (ja) | 1995-03-20 |
Family
ID=16799615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22353193A Pending JPH0775600A (ja) | 1993-09-08 | 1993-09-08 | 標的核酸の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0775600A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000060549A (ja) * | 1998-08-03 | 2000-02-29 | Becton Dickinson & Co | 超音波を用いた細胞破砕方法 |
| JP2011522521A (ja) * | 2008-05-05 | 2011-08-04 | ロスアラモス ナショナル セキュリティ，エルエルシー | 高度に単純化された側方流動ベースの核酸サンプル調製および受動的流体流動制御 |
| WO2013129457A1 (ja) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | 東レ株式会社 | 核酸の検出方法 |
| WO2014034753A1 (ja) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | 東レ株式会社 | 標的核酸の検出方法 |
-
1993
- 1993-09-08 JP JP22353193A patent/JPH0775600A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000060549A (ja) * | 1998-08-03 | 2000-02-29 | Becton Dickinson & Co | 超音波を用いた細胞破砕方法 |
| JP2011522521A (ja) * | 2008-05-05 | 2011-08-04 | ロスアラモス ナショナル セキュリティ，エルエルシー | 高度に単純化された側方流動ベースの核酸サンプル調製および受動的流体流動制御 |
| WO2013129457A1 (ja) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | 東レ株式会社 | 核酸の検出方法 |
| KR20140131960A (ko) | 2012-02-27 | 2014-11-14 | 도레이 카부시키가이샤 | 핵산의 검출 방법 |
| WO2014034753A1 (ja) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | 東レ株式会社 | 標的核酸の検出方法 |
| KR20150045999A (ko) | 2012-08-31 | 2015-04-29 | 도레이 카부시키가이샤 | 표적 핵산의 검출 방법 |
| JPWO2014034753A1 (ja) * | 2012-08-31 | 2016-08-08 | 東レ株式会社 | 標的核酸の検出方法 |
| US9416403B2 (en) | 2012-08-31 | 2016-08-16 | Toray Industries, Inc. | Method of detecting target nucleic acid |
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