CN104271771A - 核酸的检测方法及核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸的检测方法,所述核酸的检测方法能够抑制在采用后染法的标记化工序中杂交至捕获探针上的靶核酸从支持体的脱离,并且与使用钠离子的方法相比能够以更低浓度且同等以上的灵敏度检测靶核酸。所述靶核酸的检测方法包括以下工序:(1)使捕获探针与靶核酸杂交、形成双链核酸的工序;使所形成的双链核酸与含有标记物及浓度10mM以上的二价金属阳离子的溶液接触、将该标记物导入该双链核酸中的工序;和对被导入所述双链核酸中的所述标记物进行检测的工序。
Description
技术领域
本发明涉及利用了捕获探针与核酸的杂交的核酸的检测方法。
背景技术
已经开始了对各种生物的遗传信息分析的研究,关于以人类基因为代表的多种基因及其碱基序列、以及基因序列编码的蛋白质及由这些蛋白质派生的糖链的信息正被迅速阐明。对于序列已明确的基因、蛋白质、糖链等生物高分子的功能,可以采用各种方法来研究。作为主要的方法,对于核酸,可以像Northern印迹法或Southern印迹法这样利用各种的核酸/核酸之间的互补性来研究各种基因与其生物功能表达之间的关系。对于蛋白质,可以像Western印迹法为代表的方法那样利用蛋白质-蛋白质之间的反应来研究蛋白质的功能及表达。
尤其是,对于基因诊断、病原菌的鉴定、或者单核苷酸多态性的检测等,出于检测想要研究的核酸(靶核酸)的目的,采用包含核酸的捕获探针。近年来,使用在支持体上固定了多个捕获探针的DNA芯片、DNA微阵列,用于对多种靶核酸的同时检测。具体而言,使被固定化于支持体上的捕获探针与靶核酸接触,通过捕获探针与靶核酸有无杂交来研究互补性,由此可以研究靶核酸的序列。关于靶核酸的杂交,例如通常采用以下方法:将标记物导入至靶核酸,使其与捕获探针接触后,检测该标记物的信号。
作为向靶核酸中导入标记物的方法,有在使其与捕获探针杂交前导入的方法和在杂交后导入的方法。其中,后者被称为后染法,是使经杂交的靶核酸与标记物接触而导入标记物的方法,由于在杂交后使其与标记物结合,所以可以使用尺寸较大的标记物,此外,为了放大检测信号,可以重复进行标记化工序(专利文献1、2)。而且,在后染法的标记化工序中使用含有500~1000mM左右的高浓度的钠离子等一价金属阳离子的标记液是已知的。
另一方面,已知二价金属阳离子是能活化各种核酸酶的物质,因此,在进行利用杂交的核酸检测方法时,已避免主动地使用二价金属阳离子,也尚无在后染法的标记化工序中使用二价金属阳离子的技术构思。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2011-188837号公报
专利文献2:日本特开2003-52383号公报
发明内容
在利用后染法的靶核酸的标记化中,需要清洗、除去未导入靶核酸中的标记物,但本发明人对以往的利用后染法的、对杂交至被固定化于支持体上的捕获探针上的靶核酸的标记化进行了检验,结果发现如下问题:在将标记物导入靶核酸中时、或在清洗·除去未被导入靶核酸中的标记物时,杂交至捕获探针上的靶核酸脱落,其结果导致检测信号减弱。
此外,本发明人的研究结果发现,利用以往的标记液中含有的500~1000mM左右的高浓度钠离子可以抑制一定程度的靶核酸的脱落,但是从试剂用量的削减、检测灵敏度的提高的观点考虑,找到与钠离子相比可以以更低浓度抑制同等以上的靶核酸脱落的物质成为课题。
即,本发明的目的在于,找到除了钠离子以外的、能抑制杂交至捕获探针上的靶核酸在采用后染法的标记化工序中从支持体脱离的物质,并且提供与钠离子相比能够以更低浓度且以同等以上的灵敏度检测靶核酸的核酸的检测方法。
本发明人进行了潜心研究,结果发现,通过在杂交至捕获探针上的靶核酸的标记化工序中使用含有二价金属阳离子(其是核酸的杂交工序中所避免的)的溶液,可以抑制清洗·除去未被导入靶核酸中的标记物时的靶核酸的脱离,其结果,与使用钠离子的情况相比,可以使检测信号达到同等以上,由此完成了本发明。
即,本发明由以下的(1)~(13)构成:
(1)一种靶核酸的检测方法,所述方法包括以下工序:
使捕获探针与靶核酸杂交、形成双链核酸的工序;
使所形成的双链核酸与含有标记物及浓度为10mM以上的二价金属阳离子的溶液接触、将该标记物导入该双链核酸中的工序;和
对被导入至所述双链核酸中的所述标记物进行检测的工序。
(2)如(1)所述的方法,其中,所述捕获探针被固定化于支持体上。
(3)如(1)或(2)所述的方法,其中,所述二价金属阳离子为选自由镁离子、锌离子、锰离子及钙离子组成的组中的至少1种。
(4)如(1)~(3)中任一项所述的方法,其中,所述溶液中的二价金属阳离子浓度为50mM以上。
(5)如(1)~(4)中任一项所述的方法,其中,所述标记物为荧光物质。
(6)如(1)~(5)中任一项所述的方法,其中,所述标记物向所述靶核酸中的导入利用亲和素-生物素相互作用来进行。
(7)如(6)所述的方法,其中,所述靶核酸已被生物素化,所述标记物的导入通过使标记亲和素或标记链亲和素与所述靶核酸上的生物素相互作用来进行。
(8)如(1)~(5)中任一项所述的方法,其中,标记物向所述靶核酸中的导入如下进行:使将与所述杂交得到的双链核酸发生抗原抗体反应的经标记的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应。
(9)如(1)、(3)~(7)中任一项所述的方法,其中,在使所述捕获探针与所述靶核酸杂交的工序中,所述捕获探针处于未被固定在支持体上的游离状态,将所述捕获探针与所述靶核酸杂交得到的双链核酸固定化在支持体上。
(10)如(9)所述的方法,其中,所述双链核酸向所述支持体上的固定化如下进行:使将与所述双链核酸发生抗原抗体反应的、被固定化于支持体上的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应。
(11)一种核酸检测试剂盒,其包含捕获探针及含有浓度为10mM以上的二价金属阳离子的试剂。
(12)一种核酸检测试剂盒,其包含固定了捕获探针的支持体及含有浓度为10mM以上的二价金属阳离子的试剂。
(13)如权利要求11或12所述的试剂盒,其中,含有二价金属阳离子的所述试剂含有该二价金属阳离子和标记物。
根据本发明,能够以高灵敏度且重现性良好地检测杂交至捕获探针上的靶核酸。
具体实施方式
作为供给至本发明的检测方法中的靶核酸,可以举出例如病原菌或病毒等的基因、或遗传疾病的病源基因等以及它们的一部分等,但并不限定于这些。此外,作为包含这些靶核酸的待测试样,可以举出血液、血清、血浆、尿、粪便、脑脊液、唾液、拭子液、各种组织液等体液、或各种组织、石蜡包埋待测试样(FFPE)及其切片、各种饮食品以及它们的稀释物等,但并不限定于这些。此外,作为被测物质的靶核酸可以为通过常规方法从血液或细胞中提取的核酸,也可以使用从待测试样中提取的DNA或RNA等。作为DNA,可以使用标记化的DNA,病毒DNA,细菌、霉菌等的DNA,对RNA进行逆转录而得的cDNA,作为它们的一部分的片段等,但并不限定于这些。作为RNA,可以使用信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小RNA或作为它们的一部分的片段等,但并不限定于这些。此外,化学合成的DNA或RNA等也可以用作为靶核酸。
关于支持体,可以使用载玻片或树脂基板、膜(membrane)、珠粒(beads)等。对于支持体的材质,没有特别限定,可以举出玻璃、陶瓷、硅等无机材料,聚对苯二甲酸乙二醇酯、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚硅氧烷橡胶等聚合物等。
捕获探针是指能够与被测样品中包含的靶核酸直接地选择性结合的物质。在本发明的检测靶核酸的方法中,具体而言,可以使用DNA、RNA、PNA(肽核酸,Peptide Nucleic Acid)、LNA(锁核酸,Locked Nucleic Acid)、ENA(亚乙基桥联核酸,Ethylene-BridgedNucleic Acid)等核酸衍生物。此处,在核酸的情况下,衍生物表示化学修饰衍生物,其包括利用荧光物质等得到的标记化衍生物、经修饰的核苷酸(例如,含有卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸,及经历了碱基重构、双键的饱和、脱氨基化、氧分子取代为硫分子等的核苷酸等)的衍生物等。
由于具有特定碱基序列的单链核酸能够与具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性地杂交并结合,所以属于本发明中所称的捕获探针。本发明中使用的捕获探针可以为市售品,也可以为从生物细胞等中获得的物质。作为捕获探针,特别优选核酸。上述核酸中,被称为低聚核酸的、长度为200个碱基以下的核酸可以利用合成仪容易地人工合成。
作为将捕获探针固定化于支持体上的方法,已知在支持体的上表面部合成捕获探针的方法、和将预先合成的捕获探针滴加至支持体的上表面部并进行固定的方法。作为在支持体的上表面部合成捕获探针的方法,有Ronald等人的方法(美国专利第5705610号说明书)、Michel等人的方法(美国专利第6142266号说明书)、Francesco等人的方法(美国专利第7037659号说明书)。这些方法中,在捕获探针合成反应时使用有机溶剂,因此希望载体为对有机溶剂具有耐受性的材质,可以使用例如采用日本特表平10-503841号公报中记载的方法制作的具有凹凸结构的玻璃支持体。特别地,在Francesco等人的方法中,从支持体的背面照射光以控制捕获探针的合成,因此,支持体优选为具有透光性的材质。作为将捕获探针滴加至支持体的上表面部并进行固定的方法,可以采用广田等人的方法(日本专利第3922454号说明书)和玻璃毛细管。作为玻璃毛细管的一个例子,可以采用自制的玻璃毛细管或微量移液器(株式会社MicroSupport制,MP-005)等市售产品,但并不限定于这些方法。
本发明的特征在于,在利用使捕获探针与靶核酸杂交的核酸的检测方法中,通过使杂交至捕获探针上的核酸与含有标记物及二价金属阳离子的溶液接触,将标记物导入至该经杂交的核酸。以下,对杂交工序和标记物的导入工序进行说明。
捕获探针与靶核酸的杂交可以采用其本身公知的方法来进行。关于捕获探针与靶核酸杂交时的严格度,已知其为温度、盐浓度、探针的链长、探针的核苷酸序列的GC含量及杂交缓冲液中的离液剂(chaotropic agent)的浓度的函数,可以采用例如Sambrook,J.et al.(1998)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版),Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York中所记载的条件等。严格的温度条件为约30℃以上,通常为10~70℃左右。作为其他条件,有杂交时间、清洗剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度、以及有无运载体DNA(carrier DNA)等,通过组合这些条件,可以设定各种严格度。本领域技术人员可适当地确定用于获得作为下述捕获探针的功能的条件,所述捕获探针是为检测所期望的靶核酸而准备的。
捕获探针与靶核酸的杂交可以在将捕获探针固定化于支持体上的状态下进行,也可以在杂交后将其固定在支持体上。作为杂交后的捕获探针的固定化方法,可以使用例如与和靶核酸形成的双链特异性结合(发生抗原抗体反应)的、固相化了的抗体或其抗原结合性片段(Fab片段或F(ab’)2片段等)来进行(参见下述实施例)。
将标记物导入与捕获探针杂交了的靶核酸中的方法可以采用其本身公知的方法来进行,例如,可以举出如下方法:使含有标记物和二价金属阳离子的溶液与靶核酸接触之后,利用化学反应、酶反应、核酸杂交等导入标记物的方法;利用化学反应、酶反应、核酸杂交等向靶核酸中导入反应性官能团,使该官能团与含有标记物和二价金属阳离子的溶液接触之后、与标记物的官能团反应从而导入的方法。例如,利用酶反应向靶核酸中导入具有氨基的核酸,通过使其与具有与该氨基反应的琥珀酰亚胺基的标记物反应,从而能够导入标记物。此外,采用同样的方法,通过将生物素导入包含靶核酸的双链核酸中,使其与经标记的亲和素或链亲和素接触,由此能够经由亲和素-生物素反应导入标记物。此外,通过与插入到由靶核酸与核酸探针杂交形成的双链部分的嵌入型标记物接触,由此能够导入标记物。此外,还可以采用与双链发生抗原抗体反应的抗体或其抗原结合性片段(Fab片段或F(ab’)2片段等)进行(参见下述实施例)。
作为本发明中可以使用的标记物,可以使用有机荧光染料、磷光染料、量子点(dot)、荧光蛋白等荧光物质或放射性同位素,能够给出·接受电子的氧化还原类物质、以及结合了碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶的物质。此外,在这些标记物中,从检测的灵敏度方面或简便性来看可以优选使用荧光物质。
作为有机荧光染料,可以列举花菁(cyanine)(花菁2)、氨基甲基香豆素(aminomethylcoumarin)、荧光素、吲哚碳菁(indocarbocyanine)(花菁3)、花菁3.5、四甲基罗丹明、罗丹明红、德克萨斯红、吲哚碳菁(花菁5)、花菁5.5、花菁7、Oyster染料、BODIPY类染料等。此外,作为嵌入型的荧光染料,可以举出溴化乙锭、吖啶橙等;作为荧光性的蛋白质,可以举出藻红蛋白(phycoerythrin)(PE)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin)(APC)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)等已知的荧光物质。
此外,作为荧光物质,还可以使用具有发光性的半导体微粒。作为这样的半导体微粒,可以举出例如硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、碲化镉(CdTe)、磷化镓铟(InGaP)、黄铜矿类微粒、硅(Si)等。荧光信号的检测可以采用荧光显微镜或荧光扫描仪等进行。
如下文所述,向双链核酸中导入标记物后,需要清洗·除去未被导入双链核酸中的标记物,从提高检测灵敏度的观点考虑,抑制清洗·除去标记物时靶核酸从导入了标记物的双链核酸的脱离是重要的,本发明中,通过使用含有标记物和二价金属阳离子的溶液导入标记物,由此能够显著地抑制由清洗·除去标记物导致的靶核酸的脱离。
二价金属阳离子是指在溶液中能够释放2个电子而形成二价阳离子的元素·络合物,可以举出由铍离子、镁离子、钙离子、锶离子、钡离子、镭离子等碱土金属离子或锰离子、钴离子、锌离子等过渡金属构成的单原子离子,及硫氰合铁(III)离子、四氨合锌(II)离子、六氨合镍(II)离子等络离子。其中,考虑到在水中的溶解性和环境负荷的话,优选为选自由镁离子、锌离子、锰离子及钙离子组成的组中的至少1种以上,考虑到与双链核酸的结合稳定性的话,特别优选镁离子、锰离子。
所述溶液中的二价金属阳离子浓度为10mM以上,但从核酸的检测信号强度的观点考虑,优选为50mM以上,更优选为100mM以上。此外,从试剂量的削减以及溶液中的金属阳离子析出导致的噪声增加的观点考虑,优选为低于500mM。
接着,优选地,清洗除去未被导入双链核酸中的标记物。该清洗除去工序本身可以采用其本身公知的方法来进行。例如,可以使用含有表面活性剂(优选为Tween(商品名)系列等非离子性表面活性剂)的缓冲液(例如SSC等柠檬酸缓冲液)作为清洗液,在比杂交的温度通常低3℃~10℃左右的温度下清洗1分钟~10分钟。
接着,对被导入双链核酸中的标记物进行检测。关于检测工序本身,其可以采用公知的方法来进行,能够通过检测被导入双链核酸中的标记物的信号来进行。将检测到的信号与背景噪声进行比较。具体而言,对从固定有捕获探针的位置得到的信号值与从这以外的位置得到的信号值加以比较,前者的数值较高时,认为检测到了靶核酸。信号值的测定可以采用对于各标记而言公知的方法来进行,用于此的装置也有各种各样已被市售,因此可以使用市售的测定装置容易地进行。例如,当标记是荧光标记时,可以使用市售的DNA芯片扫描仪等容易地进行。需要说明的是,有时通过测定信号值也能够实现对靶核酸的定量,但对靶核酸的定量必然伴随着对靶核酸的检测,因此,对靶核酸进行定量的情况也包含在本发明的检测方法中。
接下来,对本发明的核酸的检测试剂盒的优选实施方式进行说明。本发明的核酸的检测试剂盒至少具有:捕获探针及含有二价金属阳离子的试剂。所述含有二价金属阳离子的试剂优选为含有该二价金属阳离子和标记物的试剂。此外,捕获探针也可以被固定化于支持体上。本发明的检测试剂盒中所包含的固定化有捕获探针的支持体为将所述捕获探针固定化于所述支持体上而得到的。此外,本发明的试剂盒中所包含的含有二价金属阳离子的试剂可以为干燥状态,也可以为溶液状态,为干燥状态时,可以包含用于溶解其的溶剂。此外,作为本发明的检测试剂盒中可以包含的试剂,可以举出含有所述标记物的试剂、pH调节用试剂、表面活性剂、含有用于防止标记物吸附在支持体上的蛋白质或核酸的试剂等,这些试剂可以为干燥状态,也可以为溶液状态,可以为各自独立的试剂,也可以为适当混合而成的试剂,为干燥状态时,可以包含用于溶解它们的溶剂。
通过下述实施例对本发明进行更详细的说明。但是,本发明并不由这些实施例限定技术范围。
实施例1
(1)DNA芯片的制作
关于捕获探针,通过Operon公司委托合成了在5’末端经氨基修饰的寡DNA。捕获探针的碱基序列示于表1中。将该捕获探针固定于东丽株式会社制的“3D-Gene”基板(256柱基板)上,用作评价用DNA芯片。
(2)靶核酸的制备
作为靶核酸,通过Operon公司委托合成具有与捕获探针互补的序列、且在5’末端导入了生物素的30个碱基的寡DNA(表1)。靶核酸的碱基序列示于表1中。用1×杂交溶液(如下文所述)将该寡DNA稀释至200fmol/L,作为待测试样DNA。
表1
探针序列5’→3’ | ||
捕获探针 | GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA | 5’末端氨基化 |
靶核酸 | TCTGAAGTAGATATGGCAGCACATAATGAC | 5’末端生物素化 |
(3)杂交
向5μL待测试样DNA中加入35μL的1×杂交溶液(1重量%BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC、1重量%SDS(十二烷基硫酸钠)、50ng/mL鲑鱼精DNA的溶液、5重量%葡聚糖硫酸钠、30%甲酰胺),得到了杂交溶液。将其全部注入DNA芯片中,放置于加热为32℃的孵育器中。关于杂交,按照“3D-Gene”的标准操作规程,在以250rpm旋转搅拌的同时于32℃进行2小时。杂交后,用加热至30℃的清洗液(0.5×SSC、0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠))对DNA芯片清洗5分钟,然后使用旋转干燥机(spin dryer)(和研药)进行干燥。
作为待测试样DNA的标记化时添加的二价金属阳离子,添加了镁离子。将1M六水氯化镁添加至用于对待测试样DNA进行标记化的含有荧光物质的缓冲液(50ng/μL SAPE(链亲和素藻红蛋白,Prozyme公司)、100mM MES(2-吗啉乙磺酸钠盐)、0.05重量%Tween20(商品名)、2mg/mL BSA(牛血清白蛋白))中,进行调整,使镁离子的终浓度分别为10、20、50、100、200、300、500mM,得到了标记液。需要说明的是,来自MES的钠离子浓度为74mM。将这些标记液滴加至DNA芯片上,于35℃孵育5分钟。用加热至30℃的清洗液(6×SSPE缓冲液、0.01重量%Tween 20(商品名))清洗5分钟后,使用旋转干燥机(和研药)进行干燥。对完成标记的DNA芯片,使用DNA芯片扫描仪(东丽株式会社制)检测了荧光信号。关于扫描仪的设定,激光输出功率为100%,光电倍增管的电压设定为70%。
比较例1
在待测试样DNA的标记化时不添加二价金属阳离子,将用于对待测试样DNA进行标记化的含有荧光物质的缓冲液(50ng/μL SAPE(链亲和素藻红蛋白,Prozyme公司)、100mM MES(2-吗啉乙磺酸钠盐)、0.05重量%Tween 20(商品名)、2mg/mL BSA(牛血清白蛋白))直接作为标记液。需要说明的是,来自MES的钠离子浓度为74mM。将该标记液滴加至DNA芯片上,于35℃孵育5分钟。用加热至30℃的清洗液(6×SSPE、0.01重量%Tween 20(商品名))清洗5分钟后,使用旋转干燥机(和研药)进行干燥,在与实施例1同样的条件下检测了荧光信号。
参考例1
准备了向含有荧光物质的缓冲液(50ng/μL SAPE(链亲和素藻红蛋白,Prozyme公司)、100mM MES(2-吗啉乙磺酸钠盐)、0.05重量%Tween 20(商品名)、2mg/mL BSA(牛血清白蛋白))中添加了规定量的氯化钠而得的溶液。此时,进行调整,使得钠离子的终浓度为500mM或1000mM,得到了标记液。将这些标记液滴加至DNA芯片上,于35℃下孵育5分钟。用加热至30℃的清洗液(6×SSPE、0.01重量%Tween 20(商品名))清洗5分钟后,使用旋转干燥机(和研药)进行干燥,在与实施例1同样的条件下检测了荧光信号。
将实施例1、比较例1及参考例1的结果示于表2中。由实施例1和比较例1的结果可知,通过向待测试样DNA的标记化试剂中添加镁离子,检测信号增强。此外,由实施例1和参考例1的结果可知,与添加钠离子的情况相比,向待测试样DNA的标记化试剂中添加了镁离子的情况下,以更低浓度观察到了同等以上的检测信号,特别是当镁离子的浓度为50mM以上时,检测信号大幅改善。需要说明的是,未固定捕获探针的点(spot)的检测信号(噪声)为230~270。
表2
参考例2
(1)双链DNA的熔融温度(Tm)测定
作为通过在对待测试样DNA进行标记化时添加二价金属阳离子来改善检测信号的机制,推测为下述可能性:仅由于杂交时的盐浓度上升,导致通过捕获探针与待测试样DNA的杂交而形成的双链DNA的稳定性增加,即,仅是由Tm上升导致的。因此,为了评价在添加阳离子的条件下的双链DNA的双链稳定性,对各种阳离子浓度下的双链DNA的Tm进行了测定。
对于Tm测定溶液,准备了如下溶液:向500μL的100mM的MES中添加1M六水氯化镁水溶液,进行调整使得镁离子的终浓度分别为0、10、20、50、100、200、300、500mM而得的溶液;100mM的MES本身;向500μL的100mM的MES中添加5M的氯化钠,进行调整使得钠离子的终浓度为500mM、1000mM而得的溶液。在各Tm测定溶液中,添加表3中记载的1mM的Oligo 1和Oligo 2(Oligo 1和Oligo 2的序列为互补的)的合成DNA使其终浓度为2μM,使得双链DNA形成。对于测定溶液中的双链DNA的Tm测定,使用Tm分析系统(株式会社岛津制作所制,TMSPC-8)及紫外可见近红外分光光度计(株式会社岛津制作所制,UV-1650PC)进行,使用分析软件(株式会社岛津制作所制,Lab Solution)以积分法确定了使用8联微量多联池(光程长10mm)测定(测定温度范围为20~95℃,升温速度为1.0℃/min)得到的数据。
表3
探针序列5’→3’ | |
Oligo 1 | GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA |
Oligo 2 | TCTGAAGTAGATATGGCAGCACATAATGAC |
将各种不同的阳离子浓度下的Tm测定的结果示于表4中。由该结果可知,与未添加镁离子的情况相比,添加镁离子使得Tm上升,但是镁离子的浓度为10mM以上时,Tm几乎没有变化,此外,还发现以500mM、1000mM添加钠离子时,也具有与将镁离子添加为10mM以上时同等的Tm。即,确认到虽然通过添加二价金属阳离子使得双链DNA的Tm值一定程度地上升,但是Tm的上升并不有助于检测信号的改善。
表4
实施例2
作为对待测试样DNA进行标记化时添加的二价金属阳离子,添加了钙离子、锰离子或锌离子。将1M二水氯化钙、1M氯化锰水溶液、1M氯化锌水溶液添加至含有荧光物质的缓冲液(50ng/μLSAPE(链亲和素藻红蛋白,Prozyme公司)、100mM MES(2-吗啉乙磺酸钠盐)、0.05重量%Tween 20(商品名)、2mg/mL BSA(牛血清白蛋白))中,进行调整使得钙离子、锰离子的终浓度分别为100mM或500mM,得到了标记液。将这些标记液滴加至DNA芯片上,35℃下孵育5分钟。用加热至30℃的清洗液(6×SSPE、0.01重量%Tween 20(商品名))清洗5分钟后,使用旋转干燥机(和研药)进行干燥,在与实施例1同样的条件下检测了荧光信号。
将检测结果示于表5中。与实施例1中的镁离子同样,在添加了钙离子或锰离子的情况下,检测信号较之未添加二价金属阳离子的情况(比较例1)也有所改善。此外,与参考例1中所示的钠离子的浓度为500mM或1000mM的情况相比,也显示出显著的信号改善。需要说明的是,未固定捕获探针的点的检测信号(噪声)为230~270。
表5
实施例3
在本实施例中,对由添加二价金属阳离子引起的检测信号的偏差进行了检验。作为对待测试样DNA进行标记化时添加的二价金属阳离子,添加了镁离子。将1M六水氯化镁添加至用于对待测试样DNA进行标记化的含有荧光物质的缓冲液(50ng/μL SAPE(链亲和素藻红蛋白,Prozyme公司)、100mM MES(2-吗啉乙磺酸钠盐)、0.05重量%Tween 20(商品名)、2mg/mL BSA(牛血清白蛋白))中,进行调整使得镁离子的终浓度为100mM,得到了标记液。需要说明的是,来自MES的钠离子浓度为74mM。将这些标记液滴加至DNA芯片上,于35℃孵育5分钟。用加热至30℃的清洗液(6×SSPE缓冲液、0.01重量%Tween 20(商品名))清洗5分钟后,使用旋转干燥机(和研药)进行干燥。对完成标记的DNA芯片,使用DNA芯片扫描仪(东丽株式会社制)检测荧光信号。关于扫描仪的设定,激光输出功率为100%,光电倍增管的电压设定为70%。将作为DNA芯片内的检测信号偏差的指标的CV值示于表6中。需要说明的是,CV值由下式算出:(4个点的标准偏差)/(4个点的信号平均值)×100。
比较例3
采用与比较例1同样的方法进行了待测试样DNA的杂交及标记化。将作为DNA芯片内的检测信号偏差的指标的CV值示于表6中。CV值的计算使用与实施例3同样的方法进行。
参考例3
准备了向含有荧光物质的缓冲液(50ng/μL SAPE(链亲和素藻红蛋白,Prozyme公司)、100mM MES(2-吗啉乙磺酸钠盐)、0.05重量%Tween 20(商品名)、2mg/mL BSA(牛血清白蛋白))中添加了规定量的氯化钠而得的溶液。此时,进行调整使得钠离子的终浓度为1000mM,得到了标记液。将这些标记液滴加至DNA芯片上,于35℃孵育5分钟。用加热至30℃的清洗液(6×SSPE、0.01重量%Tween 20(商品名))清洗5分钟后,使用旋转干燥机(和研药)进行干燥,在与实施例1同样的条件下检测了荧光信号。将作为DNA芯片内的检测信号偏差的指标的CV值示于表6中。CV值的计算使用与实施例3同样的方法进行。
表6显示,与未添加镁的情况或添加1000mM钠的情况相比,在添加了100mM镁的情况下,CV值显著改善。即,显示了各点之间的偏差改善。
表6
实施例4、比较例4
本实施例中,对检测灵敏度是否因在对下述DNA·RNA双链进行标记的检测试剂1中添加氯化镁而提高进行了检验,所述DNA·RNA双链是靶核酸杂交至未固定于支持体上的捕获探针而得的。通过使得DNA·RNA双链形成,采用对HPV(人乳头瘤病毒)进行检测的Hybrid Capture 2(商品名,Qiagen公司)检验了本发明的效果。Hybrid Capture 2(商品名)的原理如下:使互补RNA杂交至HPV的DNA上之后,使用识别DNA·RNA双链的抗体,在基体材料上进行捕获(Capture)。进一步地,通过结合识别经标记的DNA·RNA双链的抗体,进行标记并检测。对检测灵敏度是否因在标记反应时添加氯化镁溶液而提高进行了检验。按照所附手册实施了Hybrid Capture 2(商品名)的反应。
(1)待测试样的制备
作为待测试样DNA,从人类科学(Human Science)研究资源库(Bank)购买了从人乳头瘤病毒的基因组DNA克隆得到的重组质粒pHPV16。pHPV16总长度为16,600个碱基对。向进行了调整从而含有1amol的pHPV16的待测试样溶液、以及进行了调整从而含有0.01amol的pHPV16的待测试样溶液中添加25μL待测试样提取试剂。用涡旋混合器(Vortex mixer)搅拌后,在设定为65℃的水浴中反应45分钟。
(2)杂交
在25μL按照手册调整过的探针液中添加75μL待测试样,用旋转振荡器(1,100rpm)振荡搅拌约3分钟。接着在设定为65℃的杂交仪内反应60分钟。
(3)Hybrid Capture(商品名)
将100μL杂交反应溶液移至捕获板的孔中,使用旋转振荡器(1,100rpm)于25℃振荡60分钟,进行反应。反应后,除去上清液。
检测反应
将检测试剂1(碱性磷酸酶标记抗DNA·RNA复合物小鼠单克隆抗体)注入75μL,使其于25℃反应30分钟。此时,准备向检测试剂1中添加了终浓度为100mM的氯化镁的溶液(有Mg)和未添加氯化镁的溶液(无Mg),分别用于反应。反应后,用清洗液进行清洗,添加检测试剂2(二钠2-氯-5-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2’-(5’-氯)三环[3.3.11]癸烷}-4-基)-1-苯基磷酸酶溶液,disodium2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxethane-3,2’-(5’-chloro)tricycle[3.3.11]decan}-4-yl)-1-phenyl phosphatase溶液),使其在25℃下反应15分钟。反应后,使用光度计测定了发光量。将检测结果示于表7中。
由其结果可知,与未添加镁的情况相比,在添加镁的情况下,发光信号提高。需要说明的是,同时测定的阴性对照的发光信号为3730。如上所述,显示在Hybrid Capture(商品名)的检测反应中,添加镁对提高灵敏度有效。
[表7]
产业上的可利用性
本发明可以用于基因诊断、病原菌的鉴定、或者单核苷酸多态性的检测等核酸的检测。
Claims (13)
1.一种靶核酸的检测方法,所述方法包括以下工序:
使捕获探针与靶核酸杂交、形成双链核酸的工序;
使所形成的双链核酸与含有标记物及浓度10mM以上的二价金属阳离子的溶液接触、将该标记物导入该双链核酸中的工序;和
对被导入至所述双链核酸中的所述标记物进行检测的工序。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述捕获探针被固定化于支持体上。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中,所述二价金属阳离子为选自由镁离子、锌离子、锰离子及钙离子组成的组中的至少1种。
4.如权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,所述溶液中的二价金属阳离子浓度为50mM以上。
5.如权利要求1~4中任一项所述的方法,其中,所述标记物为荧光物质。
6.如权利要求1~5中任一项所述的方法,其中,所述标记物向所述靶核酸中的导入利用亲和素-生物素相互作用来进行。
7.如权利要求6所述的方法,其中,所述靶核酸已被生物素化,所述标记物的导入通过使标记亲和素或标记链亲和素与所述靶核酸上的生物素相互作用来进行。
8.如权利要求1~5中任一项所述的方法,其中,标记物向所述靶核酸中的导入如下进行:使将与所述杂交得到的双链核酸发生抗原抗体反应的经标记的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应。
9.如权利要求1、3~7中任一项所述的方法,其中,在使所述捕获探针与所述靶核酸杂交的工序中,所述捕获探针处于未被固定在支持体上的游离状态,将所述捕获探针与所述靶核酸杂交得到的双链核酸固定化于支持体上。
10.如权利要求9所述的方法,其中,所述双链核酸向所述支持体上的固定化如下进行:使将与该双链核酸发生抗原抗体反应的、被固定化于支持体上的抗体或其抗原结合性片段与所述双链核酸发生抗原抗体反应。
11.一种核酸检测试剂盒,其包含捕获探针及下述试剂,所述试剂含有浓度为10mM以上的二价金属阳离子。
12.一种核酸检测试剂盒,其包含固定了捕获探针的支持体及下述试剂,所述试剂含有浓度为10mM以上的二价金属阳离子。
13.如权利要求11或12所述的试剂盒,其中,含有二价金属阳离子的所述试剂含有该二价金属阳离子和标记物。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150107 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |