CN103439321A - 一种电化学发光测定皮层肌动蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学和电化学发光检测技术领域。本发明涉及一种皮层肌动蛋白的电化学发光传感器及皮层肌动蛋白的测定方法，利用电化学还原制备纳米金和石墨烯修饰金电极，并将带有活性基团联吡啶钌连接的肽自组装在修饰电极上，构成电化学发光传感器。在目标物皮层肌动蛋白存在时，皮层肌动蛋白与肽结合，阻止了嗜热菌蛋白酶对肽的切割，产生强的电化学发光信号；反之，无皮层肌动蛋白存在时，嗜热菌蛋白酶切割肽，电化学发光信号减弱。以此现象实现对皮层肌动蛋白的测定。本方法的特点是方法简单、灵敏度高、仪器设备简单、费用低。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和电化学发光检测技术领域，特别涉及一种以末端标记了电化学发光信号探针的肽为识别元件测定皮层肌动蛋白的方法。
技术背景
在当前的生物医学研究和临床实践中，建立新的简单、快速、有效的方法对蛋白质进行检测是一个永恒不变的要求。现阶段最常用的分析测定方法是基于抗体识别和信号放大器结合而建立的方法。虽然这种方法是行之有效的，但由于抗体和信号放大器制备复杂，需要建立新的方法来替代这些需要复杂步骤的传统方法。
在本发明中，利用肽代替抗体作为识别单元来简化测定步骤。肽不仅有一个简单而确定的结构，而且对于许多分子，如蛋白质和小分子，具有强的专一性、亲和力。现在许多蛋白质结合肽已经由多肽识别元件（Peptide recognition module, PRM）筛选获得。[A. H. Y. Tong, B. Drees, G. Nardelli, G. D. Bader, B. Brannetti, L. Castagnoli, M. Evangelista, S. Ferracuti, B. Nelson, S. Paoluzi, M. Quondam, A. Zucconi, C. W. V. Hogue, S. Fields, C. Boone and G. Cesareni. A combined experimental and computational strategy to define protein interaction networks for peptide recognition modules, Science, 2002, 295, 321; H. Huang and S. S. Sidhu, Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections, Methods Mol. Biol., 2011, 781, 87.]
目前皮层肌动蛋白（Cor）测定方法主要有光度法（C. Luo, H. Pan, M. Mines, K.Watson, J. J. Zhang and G. H. Fan. CXCL12 induces tyrosine phosphorylation of cortactin, which plays a role in CXC chemokine receptor 4-mediated extracellular signal-regulated kinase activation and chemotaxis. J. Biol. Chem., 2006, 281, 30081）、电化学（H. Li, H. N. Xie, N. N. Yang, Y. Huang, L. Z. Sun and G. X. Li. Design of a bi-functional peptide for protein assays: observation of cortactin expression in human placenta. Chem. Commun., 2013, 49, 5387）等方法。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对皮层肌动蛋白的检测要求，但方法的操作复杂、设备昂贵。所以必须发展一种简单的新型检测方法。
发明内容
针对现有技术的不足以及本领域研究和应用的需求，本发明的目的是提供一种简单而灵敏的电化学发光检测皮层肌动蛋白的方法。
本发明可以选择性的对目标物进行测定，所建立的方法可以应用于实际样品的测定。
本发明的目的是这样实现的： 一种电化学发光测定皮层肌动蛋白的方法，
其特征在于具体包括如下步骤：
(1) 利用现有技术，制备金电极；
(2) 以氧化石墨烯为原料，利用电化学还原，制备石墨烯修饰电极（GR/GE）；
(3) 以氯金酸为原料，利用电化学还原，在石墨烯修饰电极上电沉积纳米金，制备纳米金和石墨烯修饰电极（Au/GR/GE）；
(4) 利用现有技术，将羧基化的电化学发光试剂与肽交联，制备电化学发光试剂标记的肽，即电化学发光探针（Ru-peptide）；
(5) 通过自组装Au-S键，将电化学发光探针组装在纳米金和石墨烯修饰电极表面，得电化学发光传感器；
(6) 利用嗜热菌蛋白酶对肽探针的切割作用，对皮层肌动蛋白进行检测；
上述（6）所述的皮层肌动蛋白进行检测，优选的，将电化学发光传感器浸泡在皮层肌动蛋白样品溶液中反应一段时间，取出洗涤；再将其浸泡在嗜热菌蛋白酶溶液中反应一段时间，取出后洗涤，测定电化学发光信号，根据电化学发光信号强弱对皮层肌动蛋白进行定量检测。
电化学发光信号的测定。
优选的，具体为，以修饰电极为工作电极，Ag/AgC1（饱和KCl）电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1) 本方法通过测得的电化学发光信号的变化来判断皮层肌动蛋白与肽的结合情况和嗜热菌蛋白酶切割肽的情况，可进而推断出目标物的定量信息。而电化学发光分析本质上具有内在的优势，即灵敏度高的特点，所建立的方法具有高的灵敏度。
(2) 本方法中无需复杂昂贵的仪器设备，成本低。
(3) 只需一条标记肽链就可以实现对目标物的测定；不使用显色剂，材料成本低，无健康危害风险。
附图说明
图1为基于嗜热菌蛋白酶切割肽纳米金和石墨烯修饰金电极电化学发光测定皮层肌动蛋白的原理示意图。
图2为皮层肌动蛋白与肽结合时间对电化学发光强度的影响。
图3为皮层肌动蛋白的标准曲线。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本发明涉及的一种皮层肌动蛋白的电化学发光传感器，利用电化学还原制备了纳米金和石墨烯修饰金电极，并将带有活性基团联吡啶钌连接的肽自组装在修饰电极上，构成电化学发光传感器。在目标物皮层肌动蛋白存在时，皮层肌动蛋白与肽结合，阻止了嗜热菌蛋白酶对肽的切割，产生强的电化学发光信号；反之，无皮层肌动蛋白存在时，嗜热菌蛋白酶切割肽，电化学发光信号减弱。以此现象实现对皮层肌动蛋白的测定。
本发明是通过以下措施来实现的：一种电化学发光测定皮层肌动蛋白的方法，包括以下步骤：
电化学还原纳米金和石墨烯修饰电极的制备，其特征是包括以下步骤：
（1）工作电极表面经1 μm、0.3 μm、0.05 μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5分钟（min），用二次水彻底冲洗后，吹干；
（2）优选的，将预处理后的金电极浸泡在0.1~2.0 mg/mL氧化石墨烯溶液中，通氮除氧。在-1.3 V（vs.SCE）电还原600 秒（s），取出电极后用二次蒸馏水冲洗后用氮气吹干，即得石墨烯修饰电极。
（3）优选的，将新制备的石墨烯修饰电极在5.0 mmol/L HAuCl4和0.5 mol/L KNO3混合溶液中于-0.4 V（vs.SCE）电位范围内使用恒电位法电沉积300 s，即得到纳米金和石墨烯修饰电极。取出该电极后用二次水去离子水冲洗，用氮气吹干后备用。
电化学发光探针的制备，其特征是包括以下步骤：
优选的，将2.0 mg肽溶解在10 ml无水乙醇中，然后向其中加入含5 mg的Ru-NHS（Ru(bpy)2(dcbpy)NHS）溶液，在4摄氏度下搅拌孵育过夜，得电化学发光探针（Ru-peptide）。
电化学发光探针传感器的制备，其特征是包括以下步骤：
优选的，将纳米金和石墨烯修饰电极浸泡在50 μL的电化学发光探针溶液（磷酸缓冲溶液pH 7.4 + 5 mM TCEP（磷酸三氯乙酯））中，在4摄氏度下搅拌孵育过夜，洗涤。然后浸泡于100 μL 1.0×10-3 M MCH反应半小时后，再用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次，吹干电极表面，即得。在4摄氏度下储存备用。
电化学发光法检测皮层肌动蛋白，其特征是包括以下步骤：
（1）优选的，将固定有电化学发光探针的纳米金和石墨烯修饰电极浸入100 μL含有中皮层肌动蛋白标准溶液或样品溶液中，在室温下反应1小时，取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次。然后再将电极浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分钟，然后取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次。
（2）优选的，将上述电极浸泡在50 μL含有嗜热菌蛋白酶溶液（5 nU/ml，50 mM Tris-HCl，0.5 mM CaCl2 和0.1 mM ZnCl2，pH 8.0）中反应10~200分钟（50摄氏度），取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次。然后再将电极浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分钟，然后取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次，以此电极为工作电极，进行电化学发光测定，根据电化学发光信号对皮层肌动蛋白进行定量测定。
（3）电化学发光测定，优选的，取1 mL 0.1 M TPA（pH 7.4 0.10 M磷酸缓冲溶液、0.10 M NaCl）到检测池中，电化学发光信号为分析信号，进行皮层肌动蛋白的测定，参数设置为：高压800 v，放大级数为3。
本发明的基本原理如图1所示。
本发明中的皮层肌动蛋白与电极作用时间，具体特征如下：
皮层肌动蛋白与电极作用时间（即皮层肌动蛋白与肽结合时间）。优选的，实验结果如图2所示。当作用时间大于50分钟时，电化学发光信号变化趋势减弱。所以，优选的，作用时间为60分钟。
实施例：一种电化学发光测定皮层肌动蛋白的方法
1.实验部分
1.1仪器与试剂
羧基化的吡啶钌（Ru(bpy)2(dcbpy)NHS：二(2,2'-联吡啶) (2,2'-吡啶-4,4'-二碳酸)琥珀酰胺钌，Ru-NHS）、N,N′-二环己基碳二亚胺（EDC）、嗜热菌蛋白酶、TPA（美国Sigma公司）；皮层肌动蛋白（武汉华美生物工程有限公司）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，上海延长生化公司）；氯金酸（HAuCl4，中国上海试剂一厂）；磷酸三氯乙酯（TCEP）、巯基己醇（MCH）（阿拉丁试剂有限公司）。
所用的肽（纯度>95%，百奥泰生物科技）序列如下：
11-mercaptoundecanoic acid-GLSKKRPPPPPPGHKRT。
CHI660B型电化学工作站（上海辰华仪器公室）；MPI-E型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）；三电极系统：以修饰电极为工作电极，Ag/AgC1（饱和KCl）电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
1.2实验步骤
1.2.1 电化学还原纳米金和石墨烯修饰电极的制备
将金电极表面经1 μm、0.3 μm、0.05 μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5分钟，用二次水彻底冲洗后，吹干。
将预处理后的金电极浸泡在1.0 mg/mL的氧化石墨烯溶液中，通氮除氧。在-1.3 V（vs.SCE）电还原600 s，取出电极后用二次蒸馏水冲洗后用氮气吹干，即可在金电极表面形成一层电化学还原GR修饰膜，此修饰电极表示为GR/GE。
将新制备的GR/GE在5.0 mmol/L HAuCl4和0.5 mol/L KNO3混合溶液中于-0.4 V（vs.SCE）电位范围内使用恒电位法电沉积300 s，即可得到Au/GR/GE修饰电极。取出该电极后用二次水去离子水冲洗，用氮气吹干后备用。
1.2.2电化学发光探针的制备
将2.0 mg肽溶解在10 ml无水乙醇中，然后向其中加入含5 mg Ru-NHS、2 mg EDC和4 mg NHS溶液，在4摄氏度下搅拌孵育过夜，得电化学发光探针（Ru-peptide）。
1.2.3电化学发光探针在修饰金电极上的固定
将Au/GR/GE浸泡在50 μL的Ru-peptide溶液（磷酸缓冲溶液pH 7.4 + 5 mM TCEP）中，在4摄氏度下搅拌孵育过夜，洗涤。然后浸泡于100 μL 1.0×10-3 M MCH反应半小时后，再用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次，吹干电极表面，在4摄氏度下储存备用。
1.2.4电化学发光法检测皮层肌动蛋白
将固定有电化学发光探针的Au/GR/GE浸入100 μL含有中皮层肌动蛋白标准溶液或样品溶液中，在室温下反应1小时，取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次。然后再将电极浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分钟，然后取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次。
将上述电极浸泡在50 μL含有嗜热菌蛋白酶溶液（(50 μl，5 nU/ml，50 mM Tris-HCl，0.5 mM CaCl2，0.1mM ZnCl2，pH 8.0)）中反应100分钟（50摄氏度），取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次。然后再将电极浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分钟，然后取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次。取1 mL 0.1 M TPA（pH 7.4 0.10 M磷酸缓冲溶液、0.10 M NaCl）到检测池中，以此电极为工作电极，进行电化学发光测定。电化学发光选定参数设置为：高压800 v，放大级数为3。
1.3结果与讨论
皮层肌动蛋白结合时间的优化
皮层肌动蛋白与其特异性识别的肽结合，阻碍了嗜热菌蛋白酶的切割作用，皮层肌动蛋白量越大，切割的肽越少，在电极表面的电化学发光信号探针越多最终产生的电化学发光信号越强。不同的结合时间能引起电化学发光强度的不同，为了选择合适的皮层肌动蛋白结合时间，考察了皮层肌动蛋白和肽结合时间对电化学发光强度的影响，实验结果如图2所示。从图2可以看出，电化学发光强度在10～40分钟内随着结合时间增长而增加，在50分钟趋于最大值，而在50～80分钟内随着结合时间增加，发光强度增加趋势变弱。考虑到肽与低浓度皮层肌动蛋白结合需要最佳时间，选取结合时间为60分钟。
方法的线性范围及检出限
在最佳条件下，研究了不同浓度皮层肌动蛋白与电化学发光强度之间的关系，得到了检测皮层肌动蛋白的标准曲线，线性范围及线性方程。当皮层肌动蛋白的浓度在1.0×10-11～3.0×10-8 g/mL之间时，体系的电化学发光强度随着皮层肌动蛋白浓度的增大而增大。得到皮层肌动蛋白的非线性方程为IECL = -196.08*exp(-x/0.52) - 5981.74*exp(-x/11.87) + 6201.42 （IECL为体系的电化学发光强度；x为皮层肌动蛋白的浓度，ng/mL；n = 7，R2 = 0.9990）。皮层肌动蛋白的浓度在1.0×10-11～1.0×10-9 g/mL之间时，电化学发光强度随着皮层肌动蛋白浓度的增大而增大，线性方程为IECL = 690.49x + 33.807 （R2 = 0.9995）（图3）。该方法检测限为3 pg/mL (3σ)。对浓度2.0 ng/mL的皮层肌动蛋白进行7次平行重复测定的RSD为3.7%，表明本法有较好的重现性。
Claims (2)
1.一种电化学发光测定皮层肌动蛋白的方法，其特征在于通过测定电极表面标记肽的电化学发光信号的变化数据来获得皮层肌动蛋白的定量信息的方法；
所述的分析方法包括以下步骤：
（1）电化学发光探针传感器的构建：
a 电化学还原纳米金和石墨烯修饰电极的制备：将金电极浸泡在0.1~2.0 mg/mL氧化石墨烯溶液中，在-1.3 V电还原600 s，得石墨烯修饰电极；将所得的石墨烯修饰电极在5.0 mmol/L HAuCl4和0.5 mol/L KNO3混合溶液中于-0.4 V电沉积300 s；
b 电化学发光探针的制备：将2.0 mg肽溶解在10 mL无水乙醇中，然后向其中加入含5 mg的Ru-NHS（羧基化的吡啶钌）溶液，在4摄氏度下搅拌孵育过夜；
c 电化学发光探针传感器的构建：将纳米金和石墨烯修饰电极浸泡在50 μL的电化学发光探针溶液中，在4摄氏度下搅拌孵育过夜，洗涤后浸泡于100 μL 1.0×10-3 M巯基己醇反应半小时后，再用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次，得电化学发光探针传感器；
（2） 电化学发光法检测皮层肌动蛋白：
a 电化学发光探针传感器浸入100 μL含有中皮层肌动蛋白标准溶液或样品溶液中，在室温下反应，取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次，然后再将电极浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分钟，然后取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次；
b 将电极浸泡在50 μL含有嗜热菌蛋白酶溶液中反应10~200分钟，取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次，然后再将电极浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分钟，然后取出电极，用pH 7.4磷酸缓冲溶液冲洗电极三次，以此电极为工作电极，进行电化学发光测定，根据电化学发光信号对皮层肌动蛋白进行定量测定。
2.权利要求1进行电化学发光测定，其特征在于：准确移取1 mL 0.1 M TPA（用pH为7.4的磷酸缓冲溶液配制）到检测池中，以具备电化学发光探针传感器功能的金电极作为工作电极，进行电化学发光测定，电化学发光选定参数设置为：高压800 v，放大级数为3。
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