CN115961057A

CN115961057A - 包虫病检测引物、探针、试剂盒及应用

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Publication number: CN115961057A
Application number: CN202211713891.6A
Authority: CN
Inventors: 孙晓明; 高姗姗; 经珍珠; 王新杰; 张阿敏; 张棕瑶
Original assignee: Beijing Yisen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Yisen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-12-29
Also published as: CN115961057B

Abstract

本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种包虫病检测引物、探针、试剂盒及应用。所述包虫病检测引物包括上游引物Hy‑F和下游引物Hy‑R；所述上游引物Hy‑F和下游引物Hy‑R是根据细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫的rrnS基因序列设计得到。将所述检测引物应用于包虫病的荧光定量PCR检测，能够灵敏地检测包虫病，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，检测结果快速、有效。

Description

包虫病检测引物、探针、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种包虫病检测引物、探针、试剂盒及应用。

背景技术

包虫病(Hydatidosis)又称棘球蚴病(Echinococcosis)。该病不仅是传播最广泛的寄生虫病之一，也是公共卫生方面治疗和预防费用最高的疾病之一，呈地方性流行，是由棘球属的绦虫的幼虫寄生于人或动物机体组织所引发的传染病。包虫病的早期临床表现无自觉症状，全身健康状况良好，病程进展缓慢，潜伏期1-30年。在分类学上可以分为四个虫种:细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)、多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis，Em)、伏氏棘球绦虫(Echinococcus vogeli，Ev)和少节棘球绦虫(Echinococcus oligarthrus，Eo)。这四种棘球属绦虫可引起不同类型的包虫病。包虫病有“虫癌”之称。该病直接导致器官或屠体死亡，间接影响人和动物的健康。采取早期诊断、早期治疗以及积极防治动物传染源的综合性防治措施，对控制包虫病对人类健康和畜牧业发展的影响十分重要。

包虫病的诊断目前主要依靠于B超、影像学检查和病理学检查等。因方法自身限制，易造成小病灶、非典型病灶的误诊和漏诊。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的包虫检测方法。随着分子生物学技术的发展，近年来出现了一系列检测包虫病的新方法，如多重PCR检测法、粪抗原ELISA法、粪DNA检测方法等。目前这些检测方法，均是针对细粒棘球绦虫或者多房棘球绦虫单独设计的引物和探针，增加了检测成本；多重PCR因其在一个反应体系中加入了二对以上的引物，容易与亲缘关系较近的病原发生交叉反应，并且引物对之间也易发生互补结合、易产生干扰反应现象，因此，存在特异性差问题。ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低。

目前在包虫病检测方面已开发了多种PCR检测方法，Trachsel,D.等开发了一种多重PCR来区分多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和带绦虫的感染；Shang等开发了多重PCR检测方法，用于3种棘球绦虫的特异性和敏感性检测。目前尚未发现能在一个反应管条件下，同时针对细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫四个致病虫种，进行有效检测的技术方案。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的一个目的在于提供一种能同时用于检测和鉴定4种包虫病病原的产品，能够快速、有效地进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。

为了实现上述目的，本发明提供了一种包虫病检测引物，包括上游引物Hy-F和下游引物Hy-R；

所述上游引物Hy-F的核苷酸序列包括SEQ ID No.1，或，SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；

所述下游引物Hy-R的核苷酸序列包括SEQ ID No.2，或，SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明还提供了与所述引物配套使用的探针，包括探针Hy-P；所述探针Hy-P的核苷酸序列包括SEQ ID No.3，或，SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQIDNO.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明还提供了一种包虫病检测试剂盒，所述试剂盒包括所述引物，和/或，所述探针。

优选的，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水中的至少一种。

优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供了所述引物，或者所述探针，或者所述试剂盒在非疾病诊断目的的棘球绦虫检测中的应用。

优选的，所述棘球绦虫的DNA中含有目的片段，所述目的片段的核苷酸序列包括SEQ ID No.4，或，SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

优选的，所述棘球绦虫包括多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫、少节棘球绦虫、细粒棘球绦虫中的至少一种。

优选的，所述应用包括如下步骤：

S1、提取样品DNA；

S2、以步骤S1所述样品DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增反应；

S3、分析PCR产物。

优选的，所述非疾病诊断目的的棘球绦虫检测包括如下任意一种：

(1)检测食品中是否含有棘球绦虫；

(2)检测工作环境中是否含有棘球绦虫。

有益效果：

本发明提供了一种包虫病检测引物，包括上游引物Hy-F和下游引物Hy-R；所述上游引物Hy-F和下游引物Hy-R是根据细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫(Genbank Accession分别为：NC_008075、NC_000928、NC_009461和NC_009462)的rrnS基因序列设计得到，能分别检测细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫中的任何一种包虫病病原，也可同时用于检测和鉴定4种包虫病病原的混合感染。将所述检测引物应用于包虫病的荧光定量PCR检测，能够灵敏地检测包虫病，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，检测结果快速、有效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。

图1是本发明实施例1所述荧光定量PCR扩增的实验结果，其中，序号1-4依次代表多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫、少节棘球绦虫和细粒棘球绦虫；

图2是本发明实施例2所述荧光定量PCR检测包虫的特异性验证结果，其中，序号1-9依次代表细粒棘球绦虫、石渠棘球绦虫、加拿大棘球绦虫、狮棘球绦虫、亚洲带绦虫、肥胖带绦虫、带状带绦虫、猪肉绦虫和灭菌去离子水；

图3是本发明实施例3所述荧光定量PCR检测包虫的灵敏度验证结果；其中，序号1-9依次代表3×10⁶个/mL、3×10⁵个/mL、3×10⁴个/mL、3×10³个/mL、3×10²个/mL、3×10¹个/mL、3个/mL、3×10^-1个/mL和灭菌去离子水；

图4是本发明实施例3中包虫Taqman-MGB探针法荧光定量PCR的标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种包虫病检测引物，包括上游引物Hy-F和下游引物Hy-R；

所述上游引物Hy-F的核苷酸序列包括SEQ ID No.1(5’-GCTAAGTCTATGTGCTGCKTAT-3’，K＝G or T)，或，SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

比如，所述上游引物Hy-F的核苷酸序列还可以包括SEQ ID No.5(5’-TAAGCTAAGTCTATGTGCTGCK-3’，K＝G or T)或SEQ ID No.6(5’-AGCTAAGTCTATGTGCTGCKT-3’，K＝G or T)等。

所述下游引物Hy-R的核苷酸序列包括SEQ ID No.2(5’-ACCTTGTTACGACTTACCTCAR-3’，R＝A or G)，或，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

比如，所述下游引物Hy-R的核苷酸序列还可以包括SEQ ID No.7(5’-ACCTTGTTACGACTTACCTCAYTA-3’，Y＝C or T)，或SEQ ID No.8(5’-CCTTGTTACGACTTACCTCAYT-3’，Y＝C or T)等。

本领域技术人员可根据本发明公开的内容，人工合成所述引物，将它们用来定性或定量检测包虫，能获得如本发明所述的预期效果。因此，任何基于商业目的合成如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的引物，并将其放入标有“定量检测包虫”用途的商品包装盒内的行为，或采用如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物用于商业检测包虫的行为，均落入本发明请求保护的范围。

本发明还提供了与所述引物配套使用的探针，包括探针Hy-P；所述探针Hy-P的核苷酸序列包括SEQ ID No.3(5’-TACACACCGCCCGTCACCCT-3’)，或，SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

比如，所述引物配套使用的探针Hy-P的核苷酸序列还可以包括SEQ ID No.9(5’-AGCTCAGGTACACACCGCCC-3’)，或SEQ IDNo.10(5’-GCTCAGGTACACACCGCCCG-3’)等。

本发明根据细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫(Genbank Accession分别为：NC_008075、NC_000928、NC_009461和NC_009462)的rrnS基因序列设计引物，合成特异性引物及Taqman-BHQ1探针。设计了单个反应管中一对特异性引物和探针的荧光定量PCR检测方法，在一个反应体系中能够同时扩增4种棘球绦虫的基因，既弥补了形态学方法检出率低、费时费力的不足，又避免了免疫学方法假阳性高的缺点。采用荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测包虫病，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。

在本发明提供的具体实施方式中，所述探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团，5’端标记FAM荧光报告基团。上述“BHQ1”和“FAM”基团均为本领域常见的荧光基团，本领域技术人员还可以选用其它本领域常见的荧光淬灭基团和荧光报告基团来替换本文的“BHQ1”和“FAM”，均落入本发明请求保护的范围。例如，常见的荧光淬灭基团还包括：BHQ系列、TAMRA、DABCYL等；常见的荧光报告基团还可以选自：TET、HEX、5-TAMRA、ROX、TexasRed-X、Cy3(TYETM 563)、Cy5(TYETM 665)、JOE等。

本发明还提供了一种包虫病检测试剂盒，所述试剂盒包括所述引物。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒还包括所述探针。

在本发明中，所述包虫病检测试剂盒优选为荧光定量PCR检测试剂盒。优选的，所述试剂盒还包括用于进行荧光定量PCR检测的常规试剂。

在本发明中，所述试剂盒优选包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水中的至少一种。

在优选的实施方式中，所述试剂盒中包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、ddH₂O；和/或，包括所述DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、ddH₂O在内的商品化PCR反应缓冲液；

在进一步优选的实施例中，所述商品化PCR反应混合液为2×Premix EX Taq。本领域商品化的PCR反应混合液还有多种，本领域技术人员可以选用其它品牌和其它类型的PCR反应缓冲液。

优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

优选的，所述棘球绦虫的DNA中含有目的片段，所述目的片段的核苷酸序列包括SEQ ID No.4(少节棘球绦虫DNA目的片段序列：TAGTTTTAGTTAAGCTAAGTCTATGTGCTGCGTATAAGAGTTTTTGTGTGTTACATTTATAAGAATGTTATTGAAAGATGGTGTTGTATTTAGGACTTAATAGTAATGTTAAATGAGTTTGTTGATGTGAATAGAGTTTAGCTCAGGTACACACCGCCCGTCACCCTCGGTTTATATTGAGGTAAGTCGTAACAAGGTA)，或，SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

比如，所述目的片段的核苷酸序列还可以包括SEQ ID No.11(细粒棘球绦虫DNA中含有目的片段的核苷酸序列：TAGTTTTAGTTAA GCTAAGTCTATGTGCTGCTTATTGGAGTTTTTGTGTGTTACATTAATAAGGGTGTTATTGTAAGATGATGTGATTTAGGACTTAATAGTAATGTTAAATGAGTTTGTTGATGTGAAGAGAGTTTAGCTCAGGTACACACCGCCCGTCACCCTCGGTTGTTATTGAGGTAAGTCGTAACAAGGT)，或SEQID No.12(伏氏棘球绦虫DNA中含有目的片段的核苷酸序列:TAGTTTTAGTTAAGCTAAGTCTATGTGCTGCTTATG AGAGTTTTTGTGTGTTACATTGATAAGTGTGTTGTTGAAAGAGAACATGATTTAGGACTTAATAGTAATGTTGAAATGAGTTTGTTGATGTGAAGTGAGTTTAGCTCAGGTACACACCGCCCGTCACCCTCGGTTGTTATTGAGGTAAGTCGTAACAAGGT)，或SEQ ID No.13(多房棘球绦虫DNA中含有目的片段的核苷酸序列:TAGTTTTAGTT AAGCTAAGTCTATGTGCTGCTTATAAGAGTTTTTGTGTGTTACATTGATAGGAATATTGTTGTAATATGGTATTGTTTAGGACTTAATAGTAATGTTTGAATTAGTTTGTTGATGTGAATTGAGTTTAGCTCAGGTACACACCGCCCGTCACCCTCGGTTATTACTGAGGTAAGTCGTAACAAGGTA)等。

优选的，所述应用包括如下步骤：

S1、提取样品DNA；

S3、分析PCR产物。

在本发明可选的具体实施方式中，所述PCR扩增反应体系优选包括：上游引物(10pmol/L)0.4μL、下游引物(10pmol/L)0.4μL、Taqman探针(10pmol/L)0.8μL、所述待测样品的DNA(50ng/μL)1μL、2×Premix EX Taq 10μL、灭菌去离子水7.4μL。

在进一步的实施过程中，所述荧光定量PCR的反应程序包括：37℃2min，50℃10min，95℃3min为第一步循环；95℃15s，60℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

本发明所述非疾病诊断目的的棘球绦虫检测优选包括如下任意一种：

(1)检测食品中是否含有棘球绦虫；

(2)检测工作环境中是否含有棘球绦虫。

本发明通过设计特异性引物和探针并优化荧光定量PCR的反应体系，可分别检测每一个目的虫种，也可同时检测4个虫种混合感染。本发明提供了荧光定量PCR非诊断性检测方法，同时制备了基于该方法的检测试剂盒。

本发明利用Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR检测包虫病，一方面采用了单拷贝基因，一方面采用Taqman-BHQ1探针荧光定量，其灵敏度约是普通PCR的100倍。

本发明提供的荧光实时定量PCR方法具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。

本发明提供的荧光实时定量PCR方法简便、快速，整个过程(包括加样)可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。

本发明通过大量实验验证：本发明的引物探针/试剂盒/检测方法比常规方法准确性更高、特异性优良，同时最低检出限可达3个/mL，说明敏感性非常高；同时所述检测试剂盒批内变异系数在0.30％-0.39％之间，批间变异系数在1.24％-1.84％之间，说明稳定性良好。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。

实验例1荧光定量PCR检测包虫方法

1、设计引物和Taqman-BHQ1探针

根据国内已发现包虫株的rrnS基因序列，找出包虫基因序列的特异性保守序列，并设计多对引物和探针。经过比对筛选，最终确定一组最佳引物和一条Taqman-BHQ1探针，目的片段为185bp，其核苷酸序列为：

TAGTTTTAGTTAAGCTAAGTCTATGTGCTGCGTATAAGAGTTTTTGTGTGTTACATTTATAAGAATGTTATTGAAAGATGGTGTTGTATTTAGGACTTAATAGTAATGTTAAATGAGTTTGTTGATGTGAATAGAGTTTAGCTCAGGTACACACCGCCCGTCACCCTCGGTTTATATTGAGGTAAGTCGTAACAAGGTA。

上游引物Hy-F：

5’-GCTAAGTCTATGTGCTGCKTAT-3’；

下游引物Hy-R：

5’-ACCTTGTTACGACTTACCTCAR-3’；R＝A or G；

Taqman探针Hy-Taqman-BHQ1：

5’FAM-TACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ1-3’。

其中，探针的5’端标记FAM报告荧光基团(也可以选择HEX等其他基团)。探针的3’端标记BHQ1淬灭荧光基团。

2、包虫DNA提取

利用DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号KG203)分别提取四种包虫(细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫)和亲缘关系较近的其他绦虫(石渠棘球绦虫、加拿大棘球绦虫、狮棘球绦虫、亚洲带绦虫、肥胖带绦虫、带状带绦虫、猪肉绦虫)的全基因组DNA，对提取的DNA进行PCR检测并测序，并将测序得到的序列放入NCBI数据库中进行比对以确定虫种，分别制备成浓度为50ng/μL的DNA溶液。置于-20℃冰箱备用。

3、阳性对照品：含有包虫rrnS保守基因片段的pEASY-T1载体质粒，所述rrnS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

阳性对照品通过以下方式制备得到：采用设计的引物扩增提取的包虫DNA，扩增出的rrnS基因部分序列(SEQ ID NO.4)克隆到pEASY-T1(全式金公司)，转化后进行菌落PCR鉴定，阳性菌落培养后提取质粒进行测序。测序结果正确的质粒采用NanoDrop2000超微量分光光度计精确定量，随后制备出100ng/μL的标准品用作为阳性对照品。

4、荧光定量PCR扩增：

按照如下表1所示的反应体系进行Taqman-BHQ1探针法荧光定量PCR：

表1反应体系

试剂	使用量(μL)
		上游特异引物Hy-F	0.4
下游特异引物Hy-R	0.4
		2×Premix EX Taq	10
荧光探针引物Hy-Taqman-BHQ1	0.8
		DNA模板(检测样品)	1
灭菌去离子水	7.4

将检测样品的DNA模板加入PCR管中，放置于荧光定量PCR仪中进行扩增。同时设置阴性对照，阴性对照为灭菌去离子水。

荧光定量PCR反应条件如下：37℃2min，50℃10min，95℃3min为第一步循环；95℃15s，60℃30s，为第二步40个循环；所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

实验结果如图1所示：包虫DNA使用荧光定量PCR检测为阳性扩增，多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫、少节棘球绦虫和细粒棘球绦虫Ct值依次分别为20.07、20.10、21.38和20.75，呈S形扩增曲线。阴性样品则无扩增曲线。从扩增曲线上可以看到，在扩增的前期，特别是在荧光临界值(threshold)附近，曲线重合性较好。

实验例2、荧光定量PCR检测包虫的特异性验证

利用总DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号DP419)提取:细粒棘球绦虫、石渠棘球绦虫、加拿大棘球绦虫、狮棘球绦虫、亚洲带绦虫、肥胖带绦虫、带状带绦虫、猪肉绦虫的基因组DNA。将提取的基因组DNA作为模板，灭菌去离子水作为阴性对照，进行本发明所述的Taqman探针法荧光定量PCR反应，记录结果。

实验结果如图2所示：细粒棘球绦虫DNA模板在20.78Ct处有扩增，扩增曲线呈S形，石渠棘球绦虫、加拿大棘球绦虫、狮棘球绦虫、亚洲带绦虫、肥胖带绦虫、带状带绦虫、猪肉绦虫DNA模板以及阴性对照样品无非特异性扩增。所得结果与预期完全吻合。

实验例3、荧光定量PCR检测包虫的灵敏度验证及标准曲线的建立

常规的检测包虫的方法参照中华人民共和国卫生行业标准WS/T664—2019《包虫病控制》，取患病动物早上排出的新鲜粪便，并盛放在专用的粪便盒内，将盛放有新鲜粪便的粪便盒放置在医用冷冻盒中，将处于冷冻状态的粪便样品，取10-20g，并倒入稀释容器中，额外添加15-20ml的粪便稀释液，充分搅拌，获得样液；随后加入适量生理盐水混合均匀，使用细胞计数器在显微镜下进行计数，并计算样品浓度。

荧光定量PCR检测包虫方法使用已知浓度的包虫悬浊液DNA核酸提取物进行10倍倍比稀释后进行检测，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用Ct值和模板起始浓度制作标准曲线，列出线性关系方程，将样本的Ct值代入方程可对未知样品进行绝对定量测定。

包虫在洛克液-鸡蛋-血清培养基中，置37℃培养48h后，进行镜检计数，然后将浓度为3×10⁶个/mL的包虫培养液进行10倍梯度稀释。提取各梯度浓度的包虫基因组DNA作为模板，无菌水作为阴性对照，进行Taqman探针法荧光定量PCR反应。

实验结果如图3所示：20μL反应体系中，最低检测下限为3个/mL；在最佳反应条件下，最低检测限3个/mL的基因组DNA起始模板的Ct值大约为38.07，因此反应循环数40可满足最低检测要求。从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，S曲线基线平整，指数区明显，斜率较大。

标准曲线如图4所示：扩增效率为106.20％，相关系数为0.99，说明在该条件下模板的扩增情况较为理想。Ct值与起始模板的对数存在线性关系方程：y＝-3.18log(x)+43.55。式中，y为样本Ct值，x为样品浓度。

将上述标准浓度为3×10⁶个/mL的包虫培养液，取1mL混入1g新鲜无包虫的粪便样本中。同时进行常规镜检和荧光定量PCR检测进行定量检测，无菌水作为阴性对照。

结果如下表2所示：常规检测的最低检测下线为300个/mL；荧光定量PCR最低检测下限为3个/mL(最低检出限：3个/mL)。荧光定量PCR检测结果的准确性要更高，更接近样品的真实浓度。

表2最低检测下限对比

标准样品浓度(个/mL)	常规镜检计数(个/mL)	荧光定量PCR方法(个/mL)
			<![CDATA[3×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[2.68×10<sup>6</sup>]]>	<![CDATA[3×10<sup>6</sup>]]>
<![CDATA[3×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[2.32×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[3×10<sup>5</sup>]]>
			<![CDATA[3×10<sup>4</sup>]]>	<![CDATA[1.95×10<sup>4</sup>]]>	<![CDATA[3×10<sup>4</sup>]]>
<![CDATA[3×10<sup>3</sup>]]>	<![CDATA[2.39×10<sup>3</sup>]]>	<![CDATA[3×10<sup>3</sup>]]>
			<![CDATA[3×10<sup>2</sup>]]>	270	<![CDATA[3×10<sup>2</sup>]]>
<![CDATA[3×10<sup>1</sup>]]>	无	<![CDATA[3×10<sup>1</sup>]]>
			3	无	3
<![CDATA[3×10<sup>-1</sup>]]>	无	无
			阴性对照	无	无

实验例4、包虫荧光定量PCR检测试剂盒的制备及检测

1、试剂盒的制备：

配制如下试剂并保存。

试剂1：包虫荧光PCR反应液1mL，具体体系如下表3所示：

表3包虫荧光PCR反应液

试剂	使用量(μL)
		上游特异引物Hy-F	22.3
下游特异引物Hy-R	22.3
		2×Premix EX Taq	55.8
荧光探针引物Hy-Taqman-BHQ1	44.6
		灭菌去离子水	352.8

试剂2：阳性对照(包虫阳性质粒)1mL；

试剂3：阴性对照(灭菌去离子水)1mL。

2、试剂盒的稳定性分析

选取3个已知阳性的样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。

批内重复检测：将3个已知阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。

批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。

每管包虫荧光定量PCR反应体系(20μL)为：需19μL试剂1，阳性样品、试剂3(阳性对照)或试剂4(阴性对照)1μL。

Taqman探针法荧光定量PCR扩增反应条件为：37℃2min，50℃10min，95℃3min为第一步循环；95℃15s，60℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

稳定性检测分析结果如表4所示：批内变异系数在0.30％-0.39％之间，批间变异系数在1.24％-1.84％之间，说明本试剂盒稳定性良好。

表4试剂盒稳定性分析

本发明提供的特异性引物、探针和试剂盒，可分别检测每一个目的虫种(即细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫中的任何一种)，也可同时检测4个目的虫种的混合感染。本发明提供的非诊断目的的棘球绦虫荧光定量PCR检测方法准确性、特异性和敏感性高，检测试剂盒的稳定性好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.包虫病检测引物，其特征在于，包括上游引物Hy-F和下游引物Hy-R；

所述上游引物Hy-F的核苷酸序列包括SEQ ID No.1，或，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；

所述下游引物Hy-R的核苷酸序列包括SEQ ID No.2，或，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

2.与权利要求1所述引物配套使用的探针，其特征在于，包括探针Hy-P；所述探针Hy-P的核苷酸序列包括SEQ ID No.3，或，SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

3.包虫病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物，和/或，权利要求2所述探针。

4.根据权利要求3所述包虫病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水中的至少一种。

5.根据权利要求3或4所述包虫病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

6.权利要求1所述引物，或者权利要求2所述探针，或者权利要求3-5任意一项所述试剂盒在非疾病诊断目的的棘球绦虫检测中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述棘球绦虫的DNA中含有目的片段，所述目的片段的核苷酸序列包括SEQ ID No.4，或，SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述棘球绦虫包括多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫、少节棘球绦虫、细粒棘球绦虫中的至少一种。

9.根据权利要求6-8任意一项所述应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取样品DNA；

S2、以步骤S1所述样品DNA为模板，利用权利要求1所述引物进行PCR扩增反应；

S3、分析PCR产物。

10.根据权利要求6-8任意一项所述应用，其特征在于，所述非疾病诊断目的的棘球绦虫检测包括如下任意一种：

(1)检测食品中是否含有棘球绦虫；

(2)检测工作环境中是否含有棘球绦虫。