CN107385054A

CN107385054A - 旋毛虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN107385054A
Application number: CN201710671574.5A
Authority: CN
Inventors: 付宝权; 李婷婷; 张念章; 李文卉
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2017-08-08
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明公开了旋毛虫核酸的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液，并提供了旋毛虫核酸的快速检测方法。本发明的有益效果为：本发明是建立在分子生物学基础上的，先基于旋毛虫线粒体小亚基核糖体RNA(rrnS)基因设计了特定引物和探针，再应用重组酶聚合酶扩增‑测流层析的方法制备了快速检测旋毛虫核酸的试剂盒，敏感性高于传统PCR，特异性强，整个过程只需30分钟，结果的判定操作极其简便；得到核酸样品后整个反应过程可以在非实验室环境下进行，不仅适用于临床诊断而且可以应用于食品安全检测、养殖场现场检测、野生动物环境评估等多种领域。

Description

旋毛虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及旋毛虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒。

背景技术

旋毛虫是一种最大的细胞内寄生线虫，可以感染几乎所有的哺乳动物动物、某些鸟类及爬行类。其可以在同一个宿主体内完成整个生活史，不需要中间宿主。旋毛虫病是一个非常重要的公共卫生问题，不仅对人类的健康构成严重的威胁，而且给畜牧业生产、肉食品工业、外贸出口造成了严重的经济损失。人主要因为生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫包囊的猪肉或其他动物肉类而感染，严重时可致人死亡。目前尚未发现对该病的有效预防方法，主要的防治措施还是严格检验肉类食品的污染，鼓励人们不食生的肉类食物，另外在食用动物饲养过程中进行有效的药物杀虫也是一种预防人类感染的方法。综上，建立一种快速简便的旋毛虫检测方法显得尤为重要，用于环境评估，食品安全检测，养殖场现场诊断等，进而采取措施遏制传播。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了旋毛虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：旋毛虫核酸的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：

RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；

所述RPA引物探针混合液中的引物序列为：

上游引物：5′-CATGGTTAGGTGAGATATTGCCTGCAAATA-3′；

下游引物：5′-biotin-GGTCCTCCTTCCAGAAGATCTACTTTGTTA-3′；

探针序列为：

5′-FAM-CCCACTAAATTCCTTATGCACATATTGCCC-dSpacer-TCACCCTCATAAGAG-C3Spacer-3′；

其中，所述PBST溶液的制备方法为：将1mL的吐温-20溶于1000mL PBS溶液中，混匀即可。

其中，上述的旋毛虫核酸的快速检测试剂盒，每16μL所述RPA引物探针混合液的制备方法为：将上游引物21pmol，下游引物21pmol，探针6pmol混合于16μL纯水中。

本发明的第二个目的是提供了上述旋毛虫核酸的快速检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，所述检测方法使用上述的旋毛虫核酸的快速检测试剂盒，检测方法包括以下步骤：

1)对旋毛虫核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；

扩增时所使用的引物和探针为：

上游引物：5′-CATGGTTAGGTGAGATATTGCCTGCAAATA-3′；

下游引物：5′-biotin-GGTCCTCCTTCCAGAAGATCTACTTTGTTA-3′；

探针：

2)将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验，判定旋毛虫阳性或阴性。

进一步的，上述的旋毛虫核酸的快速检测方法，所述步骤1)中重组酶聚合酶扩增的反应体系为：旋毛虫核酸样品2μL，RPA引物探针混合液16μL，RPA反应预混液32μL，RPA反应冻干酶5mg；反应条件为：在25℃-45℃条件下反应5-25分钟。

进一步的，上述的旋毛虫核酸的快速检测方法，所述步骤2)中将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验的具体方法为：取2μL扩增产物与198μLPBST溶液混匀，然后吸取10μL混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μL PBST溶液的离心管中，5分钟后观察结果；

所述PBST溶液的制备方法为：将1mL的吐温-20溶于1000mL PBS溶液中，混匀即可。

进一步的，所述旋毛虫核酸来源于旋毛虫所有基因型。

本发明的有益效果为：本发明提供的旋毛虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒，是建立在分子生物学基础上的，先基于旋毛虫rrnS基因设计了特定引物和探针，该基因对所有的旋毛虫基因型高度保守，而又对其他病原高度特异，再应用重组酶聚合酶扩增(RPA)-测流层析的方法制备了快速检测旋毛虫核酸的试剂盒，敏感性高于传统PCR，特异性强，整个过程只需30分钟，结果的判定只需观察测流层析试纸条是否是两条杠，操作极其简便；得到核酸样品后整个反应过程可以在非实验室环境下进行，不仅适用于临床诊断而且可以应用于食品安全检测、养殖场现场检测、环境评估等多种领域。

附图说明

图1显示为本发明的试剂盒的敏感性实验结果。

图2显示为本发明的试剂盒的特异性实验结果。

具体实施方式

实施例1：

本发明的旋毛虫核酸快速检测试剂盒包括：

RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条(MileniaHybridtech 1strips,Milenia Biotec)，RPA试剂盒(TwistAmp nfo kit，TwistDx)提供的冻干酶和RPA反应预混液(29.5μL Rehydration Buffer和2.5μL 280mM Magnesium Acetate混合液)。

具体制备方法为：

(1)引物探针混合液：本申请针对旋毛虫的rrnS基因引物和探针，具体核苷酸序列如下：

上游引物：5′-CATGGTTAGGTGAGATATTGCCTGCAAATA-3′；

下游引物：5′-biotin-GGTCCTCCTTCCAGAAGATCTACTTTGTTA-3′；

探针：

5′-FAM-CCCACTAAATTCCTTATGCACATATTGCCC-dSpacer-TCACCCTCATAAGAG-C3Spacer-3′；。

将上游引物21poml、下游引物21pmol、探针6pmol混合于16μL纯水中，得到引物探针混合液。

(2)PBST溶液：将1mL的吐温-20溶于1000mL PBS溶液当中，备用。

本发明的试剂盒的使用方法为：

RPA反应体系为：2μL的核酸样品，16μL的引物探针混合液，RPA反应预混液32μl，RPA反应冻干酶5mg；反应条件为：反应温度为25℃-45℃之间，反应时间为5到25分钟。

反应后吸取2μL RPA扩增产物与198μL PBST溶液混匀，接着吸取10μL混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，最后将试纸条竖着插入的装有200μL PBST溶液的离心管中，5分钟后观察结果，如果试纸条为两条杠，则为旋毛虫阳性，如果为一条杠则为阴性。

实施例2：

具体应用实施例：

应用本发明的试剂盒快速检测旋毛虫的方法如下：

(1)RPA扩增反应：

吸取2μL核酸样品，与准备好的16μL的引物探针混合液、32μL的RPA反应预混液一同加入到装有RPA反应冻干酶的离心管中，混匀。在25℃-45℃条件下(可以捂在手中或腋窝下)反应5-25分钟。

(3)反应产物的检测：

实施例3：

本发明的试剂盒的敏感性实验：

实验过程为：将纯化的旋毛虫提取DNA，并进行RPA扩增反应，每个扩增反应中加入的旋毛虫DNA的量分别为1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg。反应后按照前面提到的方法进行测流层析试纸条检测，结果显示，该方法可以检测到反应体系中加入100fg的旋毛虫DNA。

实验结果参见图1(注：对照条带的显现是为了显示试纸条功能正常，检测条带的显现表示阳性；NC为空白对照)。

实施例4：

本发明的试剂盒的特异性实验：

实验过程为：用弓形虫，捻转血矛线虫，前后盘吸虫，肿孔古柏线虫，大片吸虫，肝片吸虫，美丽筒线虫，弓首蛔虫，多头带绦虫，细粒棘球绦虫，多房棘球绦虫，小鼠，猪和人的DNA与旋毛虫DNA进行特异性分析，结果发现该试剂盒只能检测到旋毛虫DNA。

实验结果参见图2(注：对照条带的显现是为了显示试纸条功能正常，检测条带的显现表示阳性；1：旋毛虫；2：弓形虫；3：捻转血矛线虫；4：前后盘吸虫；5：肿孔古柏线虫；6：大片吸虫；7：肝片吸虫；8：美丽筒线虫；9：弓首蛔虫；10：多头带绦虫；11：细粒棘球绦虫；12：多房棘球绦虫；13：小鼠；14：猪；15：人；NC：空白对照)。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 旋毛虫核酸的快速检测方法及其快速检测试剂盒

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

CATGGTTAGGTGAGATATTGCCTGCAAATA

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

GGTCCTCCTTCCAGAAGATCTACTTTGTTA 27

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 探针

<400> 1

CCCACTAAATTCCTTATGCACATATTGCCCTCACCCTCATAAGAG

Claims

1.旋毛虫核酸的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：

RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；所述RPA引物探针混合液中的引物序列为：

上游引物：5′-CATGGTTAGGTGAGATATTGCCTGCAAATA-3′；

下游引物：5′-biotin-GGTCCTCCTTCCAGAAGATCTACTTTGTTA-3′；

探针序列为：

5′-FAM-CCCACTAAATTCCTTATGCACATATTGCCC-dSpacer-TCACCCTCATAAGAG-C3Spacer-3′。

2.一种利用所述权利要求1中所述旋毛虫核酸的快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对旋毛虫核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；

扩增时所使用的引物和探针为：

上游引物：5′-CATGGTTAGGTGAGATATTGCCTGCAAATA-3′；

下游引物：5′-biotin-GGTCCTCCTTCCAGAAGATCTACTTTGTTA-3′；

探针：

3.一种用于制备权利要求1中RPA引物探针混合液的方法，其特征在于，将上游引物、下游引物、探针混合于纯水中即可。

4.一种用于制备权利要求1中PBST溶液的方法，其特征在于，将1mL的吐温-20溶于1000mL PBS溶液中，混匀即可。

5.根据权利要求2所述的旋毛虫核酸的快速检测方法，其特征在于，所述步骤1)中重组酶聚合酶扩增的反应体系为：旋毛虫核酸样品2μL，RPA引物探针混合液16μL，RPA反应预混液32μL，RPA反应冻干酶5mg；反应条件为：在25℃-45℃条件下反应5-25分钟。

6.根据权利要求2所述的旋毛虫核酸的快速检测方法，其特征在于，所述步骤2)中将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验的具体方法为：取2μL扩增产物与198μL PBST溶液混匀，然后吸取10μL混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μL PBST溶液的离心管中，5分钟后观察结果。

7.根据权利要求2所述的旋毛虫核酸的快速检测方法，其特征在于：所述旋毛虫核酸来源于旋毛虫所有基因型。