CN106906279A - 一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系及检测方法。具体地，本发明提供了一种比例优化的LAMP扩增显色剂，以及包含所述显色剂的反应体系和试剂盒，本发明还提供了一种利用所述显色剂的LAMP检测方法。实验表明通过调整显色剂中钙黄绿素和Mn²⁺的比例，可以显著提高检测的准确率，快速、简便的检测钉螺体内血吸虫感染情况。

Description

一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系

技术领域

本发明涉及检测领域，具体地，涉及一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系。

背景技术

血吸虫病一直是一种严重危害人民身体健康和阻碍我国和全球许多国家社会经济发展的重要寄生虫病。经过多年持续努力，全国血吸虫病疫情得到了有效遏制。当前全国血吸虫病呈现低度流行态势，但传播媒介(钉螺)及渔船民等仍然较多，血吸虫病传播风险依然存在，2013年以来在血吸虫病传播阻断地区相继发现了血吸虫感染阳性钉螺，以及江西省、湖南省等地发生数例急性血吸虫病感染案例，加强血吸虫病传播风险监测应对显得十分迫切。然而现有的实验方法不能满足低感染态势下的预警监测，如钉螺压碎法结合镜检在低感染情况下容易漏检；哨鼠感染法实验监测疫水环境耗时长，需35天以上，检测滞后，不能预警。发展敏感、实用的感染性钉螺检测试剂显得非常必要和重要。

近年来，基于PCR技术的分子生物学方法如经典PCR、real-time PCR方法等在钉螺感染血吸虫检测中表现了其敏感性高、特异性强的优点，但由于这些方法需要昂贵的试验设备、操作比较繁琐，未能在血吸虫病防治现场大规模推广。因此，本领域迫切需要开发方便快捷、灵敏度高的钉螺体内感染血吸虫的检测方法。

发明内容

本发明提供了一种新的检测钉螺体内感染血吸虫的反应体系及检测方法。

本发明的第一方面，提供了一种LAMP扩增显色剂，所述的显色剂包含(a)钙黄绿素(Calcein)、(b)Mn²⁺、和(c)任选的相溶溶剂；

并且所述钙黄绿素和Mn²⁺的摩尔浓度比为1:(10-15)，较佳地为1:12。

在另一优选例中，所述的钙黄绿素的摩尔浓度为1.0-1.5mmol/L，较佳地为1.25mmol/L。

在另一优选例中，所述的Mn²⁺的摩尔浓度为10-20mmol/L，较佳地为15mmol/L。

在另一优选例中，所述相溶溶剂为C₂-C₆的二元醇或多元醇。

在另一优选例中，所述多元醇为甘油。

在另一优选例中，所述甘油的含量为40％-60％，较佳地为45％-55％，更佳地为50％，按显色剂的总重量计。

本发明的第二方面，提供了一种LAMP反应体系，所述的反应体系包含(A)本发明第一方面所述显色剂、(B)用于LAMP扩增的引物和酶、和(C)缓冲体系。

在另一优选例中，所述的反应体系中所述显色剂的含量为3％-5％，较佳地为4％，按反应体系的总体积计。

在另一优选例中，所述的反应体系中钙黄绿素的摩尔浓度为0.03-0.08mmol/L，较佳地为0.05mmol/L。

在另一优选例中，所述的反应体系中Mn²⁺的摩尔浓度为0.3-0.8mmol/L，较佳地为0.6mmol/L。

在另一优选例中，所述的酶为Bst DNA聚合酶。

在另一优选例中，所述的用于LAMP扩增的引物包含选自下组的引物：

第一引物对：

F3：GCTTTGTCCTTCGGGCATTA(SEQ ID NO.:1)

B3：GGTTTCGTAACGCCCAATGA(SEQ ID NO.:2)

第二引物对：

FIP：ACGCAACTGCCAACGTGACA TACTGGTCGGCTTGTTACTAGC(SEQID NO.:3)

BIP：TGGTAGACGATCCACCTGACCCCTCGCGCACATGTTAAACTC(SEQID NO.:4)。

在另一优选例中，所述的反应体系中第一引物对与第二引物对的摩尔浓度之比为1：(6-10)，较佳地为1：(7-9)，更佳地为1：8。

在另一优选例中，所述的反应体系还包含待测DNA模板。

在另一优选例中，所述的待测DNA模板为钉螺DNA粗提物。

在另一优选例中，所述的待测DNA模板为1-50个钉螺的DNA粗提物。

在另一优选例中，所述的缓冲液包含浓度为1.6M的甜菜碱(Betanine)、2.5M的dNTP、和0.8M的硫酸镁。

本发明的第三方面，提供了一种LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含(A)本发明第一方面所述显色剂、和(B)用于LAMP扩增的引物和酶。

在另一优选例中，所述试剂盒还包含(C)缓冲体系

在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测钉螺体内感染血吸虫核酸的检测。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包含阳性对照DNA，所述阳性对照DNA是长度为250-350bp的28S ribsomal质粒DNA片段。

在另一优选例中，所述的阳性对照DNA是长度为300bp的28S ribsomal质粒DNA片段。

本发明的第四方面，提供了一种非诊断性非治疗性的检测钉螺体内感染血吸虫的方法，包括以下步骤：

(i)提供一待测钉螺DNA样品；

(ii)在本发明第一方面所述的显色剂存在下，对待测钉螺DNA样品进行LAMP扩增反应；

(iii)观察反应体系的颜色变化，判断钉螺体内感染血吸虫的情况。

在另一优选例中，步骤(iii)中，如果反应体系的颜色变为绿色，表示检测样品中含有血吸虫DNA；如果反应体系的颜色为棕黄色，表示检测样品中不含有血吸虫DNA。

在另一优选例中，在步骤(iii)之前还包括对反应体系保温的步骤。

在另一优选例中，步骤(iii)中，保温温度为60-65℃，较佳地为63-65℃。

在另一优选例中，步骤(iii)中，保温时间为0.5-42h，较佳地为1-2h。

本发明的第五方面，提供了一种本发明第一方面所述的显色剂的用途，所述显色剂用于制备一制剂，所述制剂用于血吸虫的检测。

在另一优选例中，所述的制剂用于日本血吸虫的检测

在另一优选例中，所述的制剂用于钉螺体内感染血吸虫的检测。

在另一优选例中，所述的制剂用于钉螺体内感染血吸虫的核酸的检测。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了不同阳性钉螺、阴性钉螺混合比例的LAMP检测结果。

图2显示了不同实验室采用本发明的LAMP检测试剂进行检测的结果。其中图2A显示了上海市疾病预防控制中心的检测结果，图2B显示了湖北省疾病预防控制中心寄生虫病所的检测结果，图2C显示了标准参考结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和摸索，首次意外地发现了一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系及检测方法。实验表明，利用LAMP检测方法，通过调整显色剂中钙黄绿素和Mn²⁺的比例，可以显著提高检测的准确率，快速、简便的检测钉螺体内血吸虫感染情况。

环介导等温扩增法

环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新颖的恒温核酸扩增结果，这种方法应用针对6个靶序列的4条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst)在等温条件下(60-65℃左右)保温1～2h，即可实现核酸的大量扩增,通过肉眼观察扩增产物颜色的变化即可判断样本中是否存在特异性DNA扩增片段。

因其敏感、快速、不需特殊仪器设备的优点，自LAMP技术发明至今，LAMP方法已经广泛用于多种寄生虫病原体的检测。

血吸虫

血吸虫也称裂体吸虫(schistosoma)，是一种寄生在宿主静脉中的扁形动物。对人体危害较大的血吸虫有曼氏、埃及以及日本血吸虫。日本裂体吸虫(S.japonicum,即日本血吸虫)主要见于中国大陆、日本、台湾、印度尼西亚和菲律宾。

日本血吸虫的生活史比较复杂，包括在终宿主体内的有性世代和在中间宿主钉螺体内的无性世代的交替。生活史分成虫、虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫等7个阶段。日本血吸虫成虫寄生于人及多种哺乳动物的门脉-肠系膜静脉系统。雌虫产卵于静脉末梢内，虫卵主要分布于肝及结肠肠壁组织，虫卵发育成熟后，肠粘膜内含毛蚴虫卵脱落入肠腔，随粪便排出体外。含虫卵的粪便污染水体，在适宜条件下，卵内毛蚴孵出。毛蚴在水中遇到适宜的中间宿主钉螺，侵入螺体并逐渐发育。先形成袋形的母胞蚴，其体内的胚细胞可产生许多子胞蚴，子胞蚴逸出，进入钉螺肝内，其体内胚细胞陆续增殖，分批形成许多尾蚴。尾蚴成熟后离开钉螺，常常分布在水的表层，人或动物与含有尾蚴的水接触后，尾蚴经皮肤而感染。尾蚴侵入皮肤，脱去尾部，发育为童虫。童虫穿入小静脉或淋巴管，随血流或淋巴液带到右心、肺，穿过肺泡小血管到左心并运送到全身。大部分童虫再进入小静脉，顺血流入肝内门脉系统分支，童虫在此暂时停留，并继续发育。当性器官初步分化时，遇到异性童虫即开始合抱，并移行到门脉-肠系膜静脉寄居，逐渐发育成熟至成虫并交配产卵。

钙黄绿素

钙黄绿素又称3,3’-双(甲胺二乙酸)荧光素、荧光素络合腙。英文名称为Calcein，是一种激发光波长在495nm处，发射光波长在515nm处的钙离子荧光指示剂。在其浓度大于100mM时，钙黄绿色荧光自我淬灭。它常被用做络合物指示剂，用来滴定EDTA螯合的钙离子，并且用荧光检测法测定钙离子浓度。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用材料与方法

1.显色剂的配制

显色剂中钙黄绿素(Calcein)与Mn²⁺的摩尔浓度比例为1：12，并加入甘油(最终浓度为50％)利于冻存，应用时每25μL反应体系加1μL显色剂。

2.扩增引物

选用日本血吸虫核糖体基因(28S ribsomal DNA,Sj28S)

一对外引物序列：

F3：GCTTTGTCCTTCGGGCATTA(SEQ ID NO.:1)

B3：GGTTTCGTAACGCCCAATGA(SEQ ID NO.:2)

一对内引物序列:

FIP：ACGCAACTGCCAACGTGACATACTGGTCGGCTTGTTACTAGC(SEQ ID NO.:3)

BIP：TGGTAGACGATCCACCTGACCCCTCGCGCACATGTTAAACTC(SEQ ID NO.:4)

本发明将4个引物采用高浓度混合，FIP、BIP的摩尔浓度为40μmol/L，F3、B3的摩尔浓度为5μmol/L，应用时每25μL反应体系加1μL引物混合物。

3. 2×LAMP缓冲液

终浓度1.6M浓度的甜菜碱(Betanine)、2.5M dNTP、0.8M硫酸镁(MgSO4)，应用时每25μL反应体系加12.5μL缓冲液。

4.阳性对照

以28S ribsomal DNA的300bp左右片段构建到pGEM-T载体上，提取重组质粒DNA，作为扩增阳性对照。

5.酶

实施例中所用酶为Bst DNA聚合酶，购自New England Biolabs公司。

6.LAMP检测方法

6.1反应体系配制：按25μl反应体系进行环介导等温扩增(LAMP)反应。按照设计，取无菌处理的0.2mL PCR反应管，分别加入DNA模板2.0μl、2×LAMP反应缓冲液12.5μl、靶序列扩增引物溶液1.0μl、、BstDNA聚合酶(Bst)1.0μl、1.0μl显色试剂(Calcein)、无核酸酶水(H₂O)7.5μl。同时每次实验均应设置1管阳性对照(PC-DNA)和1管阴性对照(NC)。

6.2等温扩增反应：将反应管置浮标上，于65℃水浴锅，恒温孵育60～90min。

6.3结果判定：肉眼观察反应管内液体颜色变化，液体变成绿色判定为阳性；阴性为(棕)黄色。若阴性对照反应管内液体显示绿色，说明实验室或检测系统可能受到其它DNA污染，需重新试验。

LAMP检测体系如下表所述

实施例1

检测灵敏度实验

按阳性钉螺：阴性钉螺为1:5、1:10、1:20、1:50、1：80和1:160的比例进行混合，利用本发明的显色剂进行LAMP检测，反应管加显色剂后变绿色为阳性，棕黄色为阴性。

结果如图1所示，阳性钉螺：阴性钉螺比例1:5、1:10、1:20、和1:50时，反应体系为绿色，呈阳性反应，表明50只钉螺中有1只阳性感染螺即可被检测出，本发明的检测方法灵敏度高。

实施例2

实地采集样本检测实验

利用本发明的显色剂对5个血吸虫病流行省采集的232份钉螺混合样本进行LAMP检测，每个混合样本中约含有50个钉螺。利用显微镜检测法检测上述232份钉螺混合样本，并对二者检测结果进行比较。同时，利用结果可靠的PCR检测法对上述样本进行检测，评价LAMP检测与显微镜检测结果的可靠性。

结果如下表所示，检测LAMP检测阳性率达6.47％，与PCR方法的敏感性相近6.03％，说明本发明的检测结果可靠，准确性高。显微镜检方法仅检出一例阳性样本，检测阳性率仅为0.04％，灵敏度很低。本发明的检测阳性率远高于显微镜检方法，检测结果的准确率和灵敏度都很高，同时检测方法简单，对仪器设备的要求低，易于推广。

实施例3

本发明检测试剂在部分省级实验室的检测结果

将本发明的LAMP检测试剂以及核酸参考品下发给全国4家省级实验室，开展实验室室间比对实验。

结果如下表所示，4家省级参比实验室反馈的检测结果与参考结果均完全符合，部分检测结果如图2所示。结果表明本发明的检测试剂准确性高。

省级参比实验室	LAMP检测符合率(％)
		上海市疾病预防控制中心	100％
湖北省疾病预防控制中心寄生虫病所	100％
		湖南省血吸虫病防治所	100％
安徽省血吸虫病防治研究所	100％

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种LAMP扩增显色剂，其特征在于，所述的显色剂包含(a)钙黄绿素(Calcein)、(b)Mn²⁺、和(c)任选的相溶溶剂；

并且所述钙黄绿素和Mn²⁺的摩尔浓度比为1:(10-15)，较佳地为1:12。

2.如权利要求1所述的显色剂，其特征在于，所述的钙黄绿素的摩尔浓度为1.0-1.5mmol/L，较佳地为1.25mmol/L。

3.如权利要求1所述的显色剂，其特征在于，所述的Mn²⁺的摩尔浓度为10-20mmol/L，较佳地为15mmol/L。

4.一种LAMP反应体系，其特征在于，所述的反应体系包含(A)权利要求1所述显色剂、(B)用于LAMP扩增的引物和酶、和(C)缓冲体系。

5.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述的反应体系中所述显色剂的含量为3％-5％，较佳地为4％，按反应体系的总体积计。

6.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述的用于LAMP扩增的引物包含选自下组的引物：

第一引物对：

F3：GCTTTGTCCTTCGGGCATTA(SEQ ID NO.:1)

B3：GGTTTCGTAACGCCCAATGA(SEQ ID NO.:2)

第二引物对：

FIP：ACGCAACTGCCAACGTGACA TACTGGTCGGCTTGTTACTAGC(SEQID NO.:3)

BIP：TGGTAGACGATCCACCTGACCCCTCGCGCACATGTTAAACTC(SEQID NO.:4)。

7.一种LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含(A)权利要求1所述显色剂、和(B)用于LAMP扩增的引物和酶。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测钉螺体内感染血吸虫核酸的检测。

9.一种非诊断性非治疗性的检测钉螺体内感染血吸虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(i)提供一待测钉螺DNA样品；

(ii)在权利要求1所述的显色剂存在下，对待测钉螺DNA样品进行LAMP扩增反应；

(iii)观察反应体系的颜色变化，判断钉螺体内感染血吸虫的情况。

10.一种权利要求1所述的显色剂的用途，其特征在于，所述显色剂用于制备一制剂，所述制剂用于血吸虫的检测。