CN102912040A

CN102912040A - 检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物及其应用

Info

Publication number: CN102912040A
Application number: CN2012104278106A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 庞耀珊; 谢丽基; 谢志勤; 邓显文; 刘加波; 范晴; 罗思思
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2032-10-31
Also published as: CN102912040B

Abstract

本发明公开了一种检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物及其应用。本发明所提供的引物为引物组，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。实验证明，上述引物利用特异性强的钙黄绿素：氯化锰作为显色剂，通过环介导等温扩增检测对虾白斑综合征病毒速度快，灵敏度高，特异性强，对仪器要求不高，无需染色或显色，肉眼可直接判断结果，对虾苗引种和无特定病原体种虾培育以及对虾无公害健康养殖均有重要意义。

Description

检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物及其应用。

背景技术

对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）是近年来新发现的一种严重危害养殖对虾的病毒，根据国际病毒分类委员会（ICTV）第7次报告，该病毒属于线形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（Whispovirus）。该病毒宿主广泛，除了感染对虾引起对虾严重死亡外，还可以感染野生甲壳类、挠足类等其它40多种海洋环境生物。

由于WSSV危害严重，成为威胁对虾养殖业的主要疾病之一，因此，1995年被国际兽疫局（OIE）、联合各粮农组织（FAO）以及亚太地区水产养殖发展网络中心（NACA）同时列为必报的水生动物疫病。目前，WSSV的检测诊断方法主要包括聚合酶链反应（PCR）检测技术、核酸探针技术和ELISA检测技术等。其中，PCR检测技术以其简便快捷、特异性好、敏感性高等特点被OIE推荐为该病的检测手段之一。

环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）技术是2000年Notomi等在PCR基础上创建的另外一种形式的核酸扩增技术。与PCR技术相比，两者最大的差异在于靶基因引物的设计上。其中，PCR只使用一对与靶基因两端序列互补的上下游引物，而LAMP则针对靶基因的6个不同区域，设计4种特异引物——内侧引物对和外侧引物对，必要时再加上环形引物对，对靶基因进行扩增，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行扩增反应，因此其特异性和敏感性均比PCR更高。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增引物组。

本发明所提供的检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增引物组为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；

所述引物1（F3）、所述引物2（B3）、所述引物3（FIP）、所述引物4（BIP）、所述引物5（LF）和所述引物6（LB）的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为（1-2）：（1-2）：（1-3）：（1-3）：（1-2）：（1-2），如1：1：2：2：1：1；所述引物组B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为（1-2）：（1-2）：（1-3）：（1-3），如1：1：2：2。

在本发明的一个实施例中，所述引物1（F3）、所述引物2（B3）、所述引物5（LF）和所述引物6（LB）在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.6μM，所述引物3（FIP）和所述引物4（BIP）在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为1.2μM。

所述引物组中，引物1（F3）和引物2（B3）组成外侧引物对；引物3（FIP）和引物4（BIP）组成内侧引物对；引物5（LF）和引物6（LB）组成环形引物对。序列1由21个核苷酸组成，序列2由19个核苷酸组成，序列3由43个核苷酸组成，序列4由40个核苷酸组成，序列5由22个核苷酸组成，序列6由20个核苷酸组成。

本发明的又一个目的是提供一种检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂。

本发明所提供的检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂具体可包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg²⁺、Mn²⁺、钙黄绿素和所述引物组。

当所述引物组为所述引物组A时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述Mn²⁺、所述链置换型DNA聚合酶、所述钙黄绿素和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为0.3-1.5μM：0.3-1.5μM：0.6-3.0μM：0.6-3.0μM：0.3-1.5μM：0.3-1.5μM：0.4-3.6mM：1-9mM：0.03-1.25mM：4-40U：37.5-125mM：0.02-0.2mM，具体如0.6μM：0.6μM：1.2μM：1.2μM：0.6μM：0.6μM：2mM：7mM：0.04mM：8U：0.2mM；

当所述引物组为所述引物组B时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述Mn²⁺、所述链置换型DNA聚合酶、所述钙黄绿素和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为0.3-1.5μM：0.3-1.5μM：0.6-3.0μM：0.6-3.0μM：0.4-3.6mM：1-9mM：0.03-1.25mM：4-40U：37.5-125mM：0.02-0.2mM，具体如0.6μM：0.6μM：1.2μM：1.2μM：2mM：7mM：0.04mM：8U：0.2mM。

在本发明中，所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。

在本发明的一个实施例中，所述试剂具体由Bst DNA聚合酶、所述Bst DNA聚合酶缓冲溶液、所述甜菜碱、所述dNTPs、MnCl₂、MgSO₄、所述钙黄绿素和所述引物组A组成。所述Bst DNA聚合酶和所述Bst DNA聚合酶缓冲溶液均为New EnglandBiolabs公司产品。

在实际使用过程中，上述试剂的各组分在环介导等温扩增反应体系中的终浓度为：外侧引物F3（序列1）和B3（序列2），以及环形引物LF（序列5）和LB（序列6）各0.6μmol/L；内侧引物FIP（序列3）和BIP（序列4）各1.2μmol/L；dNTPs 2mmol/L；MgSO₄7mmol/L；MnCl₂0.04mmol/L；甜菜碱（Betaine）0.2mmol/L；Bst DNA聚合酶8U；钙黄绿素（Calcein）50mmol/L；1×BstDNA聚合酶缓冲溶液（pH8.8）。

本发明的还一个目的是提供一种检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒。

为了提高检测结果的准确性，本发明所提供试剂盒除了含有所述引物组或所述扩增试剂外，还含有阳性对照质粒和/或阴性对照质粒。

所述阳性对照质粒为含有序列表中序列7所示核酸分子的质粒；所述阴性对照质粒为所述阳性对照质粒去除序列表中序列7所示核酸分子后形成的质粒。

在本发明的一个实施例中，所述阳性对照质粒具体为将序列表中序列7所示的核酸分子与pMD18-T载体相连后所得的质粒；所述阴性对照质粒具体为pMD18-T载体。

所述引物组在制备所述试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有对虾白斑综合症病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

应用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒检测或辅助检测待测样品中是否含有对虾白斑综合症病毒的方法，包括如下步骤：用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在60℃条件下对所述待测样品进行时长60min的环介导等温扩增反应，之后在80℃放置5min终止反应，再置于10℃放置5min，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有对虾白斑综合症病毒：通过肉眼直接观察，如果所述待测样品反应产物（液）出现黄绿色荧光，则说明所述待测样品含有对虾白斑综合症病毒；如果所述待测样品反应液没有颜色变化，则说明所述待测样品不含有对虾白斑综合症病毒；

所述待测样品来源于淡水或海洋动物，如野生甲壳类、挠足类等水生动物，更加具体如对虾。

本发明应用环介导等温扩增技术原理，针对对虾白斑综合征病毒基因组保守区的ORF120序列，设计6条特异性扩增引物。其中，F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF、LB为环引物。通过利用特异性很强的钙黄绿素：氯化锰作为显色剂，并全面优化各种反应条件，建立了可视化WSSV-LAMP检测方法。经测试，该方法只能针对WSSV基因组DNA产生肉眼可见的黄绿色荧光扩增产物，其他对照样品无颜色反应，呈阴性；该方法最低能检测到1fg的WSSV ORF120基因克隆质粒DNA。回收外引物F3和B3扩增产物进行测序，利用NCBI homepage中的BLAST分析软件对测序结果进行分析。结果显示，测序结果与GenBank中收录的WSSV序列一致，说明本发明所设计的引物具有高度特异性，可用于对WSSV的检测。本发明对250份来自广西沿海地区养殖的对虾样品进行检测，同时与WSSV-PCR检测结果进行比较。结果显示，WSSV-LAMP与WSSV-PCR方法均同时检测到15份阳性样品，另外3份WSSV-LAMP检测为阳性、WSSV-PCR检测为阴性，两种方法检出率分别为7.2%和6.0%。这说明WSSV-LAMP对自然感染的临床样品阳性检出率比WSSV-PCR高。本发明对于虾苗引种和无特定病原体（SPF）种虾群培育以及对虾无公害健康养殖生产均有着十分重要的意义。高度灵敏的WSSV-LAMP检测技术可以在一定程度上避免了由于病毒含量较低而导致的假阴性结果而导致的漏诊，提高检测结果的准确性，把病毒感染的威胁降低到最低。

总之，本研究建立的WSSV-LAMP检测技术具有检测速度快，敏感性高，特异性好，对仪器要求不高，无需进一步染色或显色，利用肉眼就可直接对结果进行判断，十分适合于技术和设备均相对有限的基层单位应用。

附图说明

图1为检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒的特异性分析结果。其中，1为阳性对照质粒；2-5为WSSV阳性样品；6为SPF种虾组织样品；7为IHHNV感染样品；8为TSV感染样品；9为副溶血弧菌基因组样品；10为大肠杆菌基因组样品；11为阴性对照质粒。

图2为检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒的灵敏度分析结果。其中，1为100ng阴性对照质粒；2为100ng阳性对照质粒；3为10ng阳性对照质粒；4为1ng阳性对照质粒；5为100pg阳性对照质粒；6为10pg阳性对照质粒；7为1pg阳性对照质粒；8为100fg阳性对照质粒；9为10fg阳性对照质粒；10为1fg阳性对照质粒。

图3为WSSV-PCR检测对虾白斑综合症病毒的灵敏度分析结果。其中，泳道1为100bp DNA标准；泳道2为100ng阴性对照质粒；泳道3为100ng阳性对照质粒；泳道4为10ng阳性对照质粒；泳道5为1ng阳性对照质粒；泳道6为100pg阳性对照质粒；泳道7为10pg阳性对照质粒；泳道8为1pg阳性对照质粒；泳道9为100fg阳性对照质粒；泳道10为10fg阳性对照质粒；11为1fg阳性对照质粒。

图4为使用检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒对临床样品的检测结果。其中，1为阳性对照质粒；2-6为WSSV感染样品；7-11为非感染样品；12为阴性对照质粒。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生物技术公司；甜菜碱（Betaine）、Bst DNA聚合酶、MgSO₄购自New England Biolabs公司；钙黄绿素及MnCl₂购自International laboratory USA；PCR试剂盒、dNTPs、pMD 18-T载体购自大连TaKaRa公司。引物由invitrogen生物技术有限公司合成。

对虾白斑综合症病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、桃拉病病毒（TSV）记载在庞耀珊，谢芝勋，谢志勤等.二温式PCR检测对虾白斑病病毒.中国兽医杂志，2003，39（4）：43-45中，公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

副溶血弧菌、大肠杆菌记载在谢丽基，谢芝勋，庞耀珊等.贝类派琴虫PCR检测方法的建立及初步应用.2011，32（1）：82-85中，公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增试剂盒的制备及使用方法

一、检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物组的制备

本实施例检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物组由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成。这六个引物按照如下方法制备：根据GenBank中对虾白斑综合征病毒（WSSV）基因组保守区的ORF120序列（登录号：AF332093.1），利用在线软件Primer Explorer V4设计如下所示的LAMP引物：

F3（序列1，引物1）：5’-ACAGTGATGGAATTTCGTTTA-3’（GENBANK：AF332093.1的第133399-133419位）

B3（序列2，引物2）：5’-TCAACCTTACGTCCAACTC-3’（GENBANK：AF332093.1的第133583-133601位的反向互补序列）

FIP（序列3，引物3）：

5’-CGGTCGTTATTAATATAGGCGATCT-CTGACTGTCCATGCCAAT-3’（“-”前的序列为GENBANK：AF332093.1的第133490-133514位的反向互补序列；“-”后的序列为GENBANK：AF332093.1的第133432-133449位）

BIP（序列4，引物4）：

5’-CCGTGAACTGCTCCTTGTCA-CGTTATCATTTCCCCACTCG-3’（“-”前的序列为GENBANK：AF332093.1的第133523-133542位；“-”后的序列为GENBANK：AF332093.1的第133563-133582位的反向互补序列）

LF（序列5，引物5）：

5’-GGGAATGTTAAATATGTATCGG-3’（GENBANK：AF332093.1的第133451-133472位的反向互补序列）

LB（序列6，引物6）：

5’-GTGTCTTATCCCAACAAGTC-3’（GENBANK：AF332093.1的第133543-133562位）

二、检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增试剂的优化

本实施例的检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增试剂，包括BstDNA聚合酶、所述Bst DNA聚合酶缓冲溶液、甜菜碱、dNTPs、MnCl₂、MgSO₄、钙黄绿素和步骤1的引物组，其中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述Mn²⁺、所述链置换型DNA聚合酶、所述钙黄绿素和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为0.6μM：0.6μM：1.2μM：1.2μM：0.6μM：0.6μM：2mM：7mM：0.04mM：8U：50mM：0.2mM。该扩增试剂是通过建立并优化检测对虾白斑综合征病毒的LAMP反应体系得出的，具体方法如下：

（1）待测样品总DNA抽提

参照庞耀珊等（庞耀珊，谢芝勋，谢志勤等.二温式PCR检测对虾白斑病病毒.中国兽医杂志，2003，39（4）：43-45）方法，取临床上确诊感染了WSSV的对虾（谢芝勋，庞耀珊，邓显文等.多重RT PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用.病毒学报，2005年05期）的肝胰腺、鳃、肌肉组织等共约100mg进行组织匀浆，从中再取适量样品，利用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒按说明书步骤（天根生化科技有限公司）抽提对虾基因组DNA，置于-20℃保存备用。

（2）WSSV ORF120基因片段阳性质粒构建

合成WSSV-PCR引物XZ 301和XZ 302。以步骤（1）获得的对虾基因组DNA为模板，利用该引物扩增WSSV ORF120基因片段，回收PCR产物并克隆到pMD18-T载体，转化至DH5α感受态，并通过PCR和基因测序双重验证目的基因片段成功插入载体。将经测序表明携带有序列表中序列7所示DNA片段的重组质粒命名为pMD18-WSSV。提取阳性质粒pMD18-WSSV，置于-20℃保存备用。

XZ 301：5′-GATGAGACAGCCCAAGTTGTTAAAC-3′（序列7的第1-25位，GENBANK：AF332093.1的第133111-133135位）；

XZ 302：5′-CGAAATTCCATCACTGTAATTGCTTG-3′（序列7的第280-305位的反向互补序列，GENBANK：AF332093.1的第133390-133415位的反向互补序列）

（3）LAMP反应条件优化

以步骤（2）获得的阳性质粒pMD18-WSSV为模板，利用25μL LAMP反应体系进行扩增。反应体系含以下试剂：Bst DNA聚合酶缓冲溶液、Bst DNA聚合酶、引物、MgSO₄、甜菜碱、dNTPs、钙黄绿素、MnCl₂、H₂O、DNA模板。为了能得到最佳的扩增，对其中的甜菜碱（0.04～0.2mmol/L）、Bst DNA聚合酶（0.16～0.96U/μL）、MgSO₄（0.8～10mmol/L）、MnCl₂（0.02～1.25mmol/L）、钙黄绿素（25～125mmol/L）、引物（0.2～5μmol/L）和dNTPs（0.4～4mmol/L）的用量以及温度条件进行优化。

结果显示，在本研究所测试的WSSV-LAMP反应条件范围内，除了甜菜碱用量对扩增结果影响不大外，其它试剂，包括：Bst DNA聚合酶、MgSO₄、MnCl₂、钙黄绿素、引物和dNTPs用量，以及温度条件对WSSV-LAMP扩增均有一定程度的影响。经研究分析，最终确定WSSV-LAMP的最佳反应体系为：1×BstDNA聚合酶缓冲溶液（pH8.8）、8U Bst DNA聚合酶、7mmol/L MgSO₄、0.2mmol/L甜菜碱、0.04mmol/LMnCl₂、50mmol/L钙黄绿素、2mmol/L dNTPs，0.6μmol/L引物F3/B3/LF/LB，1.2μmol/L引物FIP/BIP，DNA模板适量，dH₂O定容至总体积25μL。反应程序为：60℃60min，80℃5min，10℃5min。在此条件下，通过肉眼直接观察反应产物，如果所述待测样品反应产物（液）出现黄绿色荧光，则说明所述待测样品含有对虾白斑综合症病毒；如果所述待测样品反应产物（液）没有颜色变化，则说明所述待测样品不含有对虾白斑综合症病毒。

三、检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增试剂盒的制备及使用方法

该试剂盒包括三个成分，分别是酶反应液，阳性对照质粒和阴性对照质粒。

（1）酶反应液：即不含DNA模板和dH₂O的步骤二优化后环介导等温扩增最佳反应体系；

（2）阳性对照质粒：步骤二构建的pMD18-WSSV重组质粒；

（3）阴性对照质粒：pMD18-T质粒。

该试剂盒可按照如下方法使用：

（a）取适量待测样品，加入到上述步骤（1）的酶反应液中，用dH₂O补足至25μL。同时分别做一组阳性对照和阴性对照，即将待测样品分别替换为适量的阳性对照质粒pMD18-WSSV和阴性对照质粒pMD18-T；

（b）将步骤（a）的待测样品反应体系、阳性对照反应体系和阴性对照反应体系均按照如下反应程序进行反应：60℃60min，80℃5min，10℃5min；

（c）取出反应管，观察各样品反应产物的颜色，根据如下标准对结果进行判断：如果阳性对照反应液出现黄绿色荧光，同时阴性对照反应液无颜色变化，则说明结果可信；在此前提下，所述待测样品反应液出现黄绿色荧光，则说明所述待测样品含有对虾白斑综合症病毒；如果所述待测样品反应液没有颜色变化，则说明所述待测样品不含有对虾白斑综合症病毒。

实施例2、检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒的特异性分析

利用实施例1优化后的LAMP体系和反应程序，对25份PCR方法（引物为XZ 301和XZ 302）或测序方法验证为WSSV阳性的样品总DNA、5份其它对照样品总DNA（包括从美国夏威夷海洋研究所SPF种虾场引进）的SPF种虾组织样品总DNA、IHHNV感染的对虾样品总DNA（谢芝勋，庞耀珊，邓显文等.多重RT PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用.病毒学报，2005年05期）、TSV感染的对虾样品总DNA（谢芝勋，庞耀珊，邓显文等.多重RT PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用.病毒学报，2005年05期）、副溶血弧菌基因组DNA、大肠杆菌基因组DNA）、以及实施例1构建的阳性对照质粒pMD18-WSSV和阴性对照质粒pMD18-T进行扩增，通过扩增产物的颜色变化（判断标准详见实施例1步骤三中（c））来判断待测样品阴、阳性的符合情况。

结果显示，25份PCR方法或测序方法验证为WSSV阳性的样品总DNA的扩增产物与阳性对照质粒扩增产物均呈肉眼可见的黄绿色荧光，为阳性反应；5份其它对照样品总DNA的扩增产物与阴性对照质粒扩增产物的颜色均无变化，为阴性反应，检测结果与预期一致，符合率为100%。其中部分样品的检测结果如图1所示。

进一步，对其中5份WSSV-LAMP检测阳性的样品，利用F3和B3外引物进行PCR扩增，扩增产物纯化并连接到pMD18-T克隆载体后进行测序，所得测序结果利用NCBI homepage网页上提供的BLAST软件与GenBank中的参考序列（GENBANK：AF332093.1）进行比对，分析序列的同源性。测序结果分析表明，与GenBank中的WSSV参考序列（GENBANK：AF332093.1）高度同源，进一步证实了扩增产物为WSSV目的序列。

以上结果表明，本发明所提供的检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒有很好的特异性。

实施例3、检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒的灵敏度分析

利用Beckman UV-800紫外分光光度计测定WSSV阳性质粒DNA（实施例1构建的阳性对照质粒pMD18-WSSV）的起始浓度，按10倍递进稀释法将WSSV阳性质粒DNA稀释至1fg/μL，取1μL各浓度稀释液分别加入到实施例1优化后的LAMP体系和PCR反应体系（引物为XZ 301和XZ 302，庞耀珊，谢芝勋，谢志勤等.二温式PCR检测对虾白斑病病毒.中国兽医杂志，2003，39（4）：43-45）中进行扩增，比较两种方法的敏感性。WSSV-LAMP通过扩增产物的颜色变化（判断标准详见实施例1步骤三中（c））来判断待测样品的阴阳性；WSSV-PCR通过将扩增产品进行琼脂糖凝胶电泳成像的方法来判断待测样品的阴阳性（阳性样品有大小约为305bp的目的条带）。实验同时设置WSSV阴性对照（以浓度为100ng/μL的阴性对照质粒pMD18-T作为待测样品）。

经测定，WSSV-LAMP对10倍系列稀释的阳性克隆质粒DNA最低检测量为1fg（图2），相同样品PCR的最低检测量为1pg（图3），灵敏度提高了1000倍，这提示WSSV-LAMP更适合于WSSV感染量较低或病毒感染初期的样品检测。高度灵敏的WSSV-LAMP检测技术可以在一定程度上避免由于病毒含量较低而导致的假阴性结果而导致的漏诊，提高检测结果的准确性，把病毒感染的威胁降低到最低。

实施例4、使用检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒检测临床样品

同时利用实施例1优化后的LAMP体系（WSSV-LAMP检测技术）和PCR反应体系（引物为XZ 301和XZ 302，庞耀珊，谢芝勋，谢志勤等.二温式PCR检测对虾白斑病病毒.中国兽医杂志，2003，39（4）：43-45）（WSSV-PCR技术），分别对250份来来自广西沿海地区不同养殖场的对虾样品总DNA进行检测，比较两种方法的检出率。WSSV-LAMP通过扩增产物的颜色变化（判断标准详见实施例1步骤三中（c））来判断待测样品的阴阳性；WSSV-PCR通过将扩增产品进行琼脂糖凝胶电泳成像的方法来判断待测样品的阴阳性（阳性样品有大小约为305bp的目的条带）。

结果显示，WSSV-LAMP和WSSV-PCR均同时检测到的阳性样品共有15份；另外，WSSV-LAMP检测为阳性、而WSSV-PCR检测为阴性的样品有3份。计算WSSV-LAMP的阳性检出率为7.2%，WSSV-PCR的阳性检出率为6.0%。说明WSSV-LAMP对自然感染的临床样品阳性检出率比WSSV-PCR高。部分样品的WSSV-LAMP检测结果见图4。

Claims

1.检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为（1-2）：（1-2）：（1-3）：（1-3）：（1-2）：（1-2）；所述引物组B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为（1-2）：（1-2）：（1-3）：（1-3）。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为1：1：2：2：1：1；所述引物组B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为1：1：2：2。

4.检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg²⁺、Mn²⁺、钙黄绿素和权利要求1-3中任一所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述Mn²⁺、所述链置换型DNA聚合酶、所述钙黄绿素和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为0.3-1.5μM：0.3-1.5μM：0.6-3.0μM：0.6-3.0μM：0.3-1.5μM：0.3-1.5μM：0.4-3.6mM：1-9mM：0.03-1.25mM：4-40U：37.5-125mM：0.02-0.2mM；或

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述Mn²⁺、所述链置换型DNA聚合酶、所述甜菜碱和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为0.3-1.5μM：0.3-1.5μM：0.6-3.0μM：0.6-3.0μM：0.4-3.6mM：1-9mM：0.03-1.25mM：4-40U：37.5-125mM：0.02-0.2mM。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述Mn²⁺、所述链置换型DNA聚合酶、所述钙黄绿素和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为0.6μM：0.6μM：1.2μM：1.2μM：0.6μM：0.6μM：2mM：7mM：0.04mM：8U：50mM：0.2mM；或

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述Mn²⁺、所述链置换型DNA聚合酶、所述甜菜碱和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为0.6μM：0.6μM：1.2μM：1.2μM：2mM：7mM：0.04mM：8U：50mM：0.2mM。

7.根据权利要求4-6中任一所述的试剂，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。

8.根据权利要求4-7中任一所述的试剂，其特征在于：所述试剂由Bst DNA聚合酶、所述Bst DNA聚合酶缓冲溶液、所述甜菜碱、所述dNTPs、MnCl₂、MgSO₄、所述钙黄绿素和权利要求1-3中任一所述的引物组组成。

9.检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有下述a）和b）：

a）阳性对照质粒和/或阴性对照质粒；

b）权利要求1或2所述引物组，或权利要求3-7中任一所述扩增试剂；

10.如下c）或d）的应用：

c）权利要求1-3中任一所述的引物组在制备权利要求9所述试剂盒中的应用；

d）权利要求1-3中任一所述引物组，或权利要求4-8中任一所述试剂，或权利要求9所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有对虾白斑综合症病毒的产品中的应用。