CN103290099B - 一种咖啡浆果炭疽病菌快速分子检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的快速检测的特异引物组、环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)试剂盒及其应用。本发明所提供的引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。所述试剂盒还包括链置换型DNA聚合酶、Mg2+、甜菜碱、dNTPs和荧光显色剂。本发明所提供的试剂盒操作简单、特异性强、灵敏度高，检测灵敏度可达0.08pg/μL的咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)基因组DNA。
Description
技术领域
本发明涉及咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的快速检测的特异引物组、环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)试剂盒及其应用。
背景技术
刺盘孢属(Colletotrichum)真菌是具有重要经济意义和学术价值的类群，其中很多种类能够引起一些经济作物和花卉植物的植物病害，即炭疽病。咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)能够引起咖啡浆果的严重病变，是刺盘孢属中唯一一种我国植物病原真菌检疫对象(中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，2007)，它曾被作为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的复合种(species complex)处理，直到1993年才被重新作为一个新种确认(Waller，J.M.，Bridge，P.D.，et.al.1993.Characterization of thecoffee berry disease pathogen，Colletotrichum kahawae sp.nov.Mycol Res 97，989-994.)。但到目前为止，还没有建立起一个快速、简单和准确的特定识别咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的分子诊断(molecular diagnosis)的方法和技术平台。
此前，其它病原刺盘孢属真菌的鉴定检测都以ITS区(internal transcribed spacer ofrRNA)为靶序列(Sreenivasprasad，S.，Sharand，K.，et al.1996.PCR-based detection ofColletotrichum acutatum on strawberry.Plant Pathology 45，650-655；Natalia，A.R.P.，Eiko，E.K.，et al.2002.Identification and characterization of Colletotrichum spp.affecting fruitafter harvest in Brazil.Phytopathology 150，128-134；唐建辉，王伟，王源超，2006.西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的分子检测.中国农业科学39(10)：2028-2035)，方法也很复杂和费时，而且这些方法都是建立在刺盘孢属中许多复合种的基础上，无法对这些复合种中被重新确定的新种或隐含种(cryptic species)特异准确地区分和鉴定，因此，在刺盘孢属真菌的分类系统发生重大变化后，建立这些严重病原真菌的快速和准确的物种识别技术体系，需要重新选择合适的靶基因并利用最新的简单快速的技术方法。近些年来，ACT、TUB2、Apn2/Mat和GPDH等基因已经被用于刺盘孢属真菌的分子系统学研究中，而且已经证明Apn2/Mat是一个很好的分子标记(Silva，D.N.，Talhinhas，P.，Várzea，V.，Cai，L.，Paulo，O.S.，Batista，D.2011.Application of theApn2/MAT locus to improve the systematics of the Colletotrichum gloeosporioidescomplex：an example from coffee(Coffea spp.)hosts.Mycologia(DOI 10.3852/11-145))。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种非常出色的快速特异性检测的方法(Notomi，T.H.，Okavama，H.，Masubuchi，T.，et al.，2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res 28(12)：e63；Nagamine，K.，Hase，T.，Notomi，T.，2002.Accelerated reaction by loop-mediatedisothermalcation using loop primers.Molecular and Cellular Probes 16，223-229；Parida，M.，Sannarangaiah，S.，Dash，P.K.，Rao，P.V.L.，Morita，K.2008.Loop mediatedisothermal amplification(LAMP)：a new generation of innovative gene amplificationtechnique；perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases.Rev.Med.Virol.18：407-421)，整个反应过程在恒温条件下进行，反应速度特别快，只要30分钟到90分钟就可以完成，结果可用凝胶成像观察，也可以用比浊仪，甚至肉眼可以观察，具有操作简单、快速高效、特异性强、灵敏度高、鉴定简便等特点。近年来，在真菌的快速检测中也发挥了很好的作用。但是，基于关键技术的限制，特别是引物的设计以及与引物相关的检测试剂技术问题，目前尚未有应用LAMP检测病原刺盘孢属真菌的相关技术报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的环介导等温扩增引物组。
本发明所提供的引物组以Apn2/Mat基因为靶基因，由引物1、引物2、引物3和引物4组成，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
所述引物组中所述引物1(F3)、所述引物2(B3)、所述引物3(FIP)和所述引物4(BIP)在环介导等温扩增反应体系中的使用配比(摩尔比)为1∶1∶8∶8。
所述引物组中，引物1(F3)和引物2(B3)组成外侧引物对；引物3(FIP)和引物4(BIP)组成内侧引物对。序列1由20个核苷酸组成，序列2由25个核苷酸组成，序列3由45个核苷酸组成，序列4由41个核苷酸组成。
本发明的又一个目的是提供检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的环介导等温扩增试剂。
本发明所提供的试剂包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱(Betaine)、dNTPs、Mg2+、以及上述引物组。
所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶、和所述甜菜碱在环介导等温扩增试剂中的配比为0.2μM∶0.2μM∶1.6μM∶1.6μM∶1.4mM∶8mM∶8U∶0.8M。
在本发明的实施例中，所述链置换型DNA聚合酶具体为Bst DNA聚合酶或所述Bst DNA聚合酶的大片段。
本发明所提供的试剂还包括荧光显色剂。在本发明的实施例中，所述荧光显色剂具体为钙黄绿素(Calcein)。
在本发明的实施例中，所述试剂具体由Bst DNA聚合酶(或Bst DNA聚合酶大片段)、甜菜碱、dNTPs、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、吐温20、钙黄绿素和本发明所提供的引物组组成。
在实际使用过程中，上述试剂的各组分在环介导等温扩增反应体系中的终浓度为：内引物FIP(序列3)和BIP(序列4)各1.6μmol/L，外引物F3(序列1)和B3(序列2)各0.2μmol/L，dNTPs 1.4mmol/L，甜菜碱(Betaine)0.8mol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，MgSO4 8mmol/L，吐温200.1％(体积百分含量)，Bst DNA聚合酶8U，钙黄绿素(Calcein)0.16mmol/L。
本发明的另一个目的是提供检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的环介导等温扩增试剂盒。
本发明所提供的试剂盒包含本发明所提供的引物组，或本发明所提供的试剂。
所述检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的环介导等温扩增引物组在制备检测或辅助检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)中的应用也属于本发明的保护范围。
应用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒检测或辅助检测待测样品中是否含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的方法，包括如下步骤：用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在63℃-65℃，如65℃条件下对所述待测样品进行时长1h的环介导等温扩增反应，反应结束后，具体按照如下1)-3)中至少一种方法确定所述待测样品中是否含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)：
1)通过肉眼直接观察，如果所述待测样品反应液出现大量白色沉淀物，则说明所述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；
2)在环介导等温扩增反应体系中加入终浓度为0.16mmol/L的钙黄绿素(Calcein)作为荧光显色剂，在紫外灯下观察所述待测样品反应液颜色，如果为绿色荧光，则说明所述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；
3)将所述待测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)。
所述待测样品为微生物样品或是植物样品，可以为DNA。
在本发明的实施例中，所述咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)具体为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578。
本发明提供了以Apn2/Mat基因为靶基因的用于检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的特异性引物组、试剂及试剂盒，其检测灵敏度达到0.08pg/μL的模板基因组DNA，具有特异性强、灵敏度高特点；整个检测反应处于恒温条件下进行，不需要PCR仪等特殊设备，只要水浴锅等在恒温条件下就能完成，反应时间只要60分钟，因此具有操作简单、快速高效的特点；检测结果用比浊仪，甚至肉眼就可以观察，更实用和方便。
附图说明
图1为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578的LAMP检测结果。其中，A为紫外线下钙黄绿素(Calcein)荧光反应结果；B为GelRed染色的凝胶电泳结果。A和B中，1均为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418；2均为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578。
图2为LAMP反应温度条件的优化结果。其中A为浊度仪实时显示反应结果图；B为紫外线下钙黄绿素(Calcein)荧光反应结果。A和B中，1均表示咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418；2均表示近源种C.fructicola MFLU 090228；3均表示阳性对照。
图3为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的LAMP反应特异性检测结果。其中，A为紫外线下钙黄绿素(Calcein)荧光反应结果；B为GelRed染色的凝胶电泳结果。A和B中，1-13均依次表示C.kahawae IMI319418、C.kahawae IMI363578、C.horii、C.fructicola、C.siamense、C.asianum、C.gloeosporioides、C.musae、C.jasmini-sambac、C.fragariae、C.simmondsii、CK1、CK2。B中的泳道M为Marker(自上而下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图4为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的LAMP反应灵敏性检测结果。其中，A为紫外线下钙黄绿素(Calcein)荧光反应结果；B为GelRed染色的凝胶电泳结果。A和B中，1-11均依次表示咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418纯化后基因组DNA在25μL的LAMP反应体系中的质量顺次为4ng、2ng、1.0ng、0.2ng、0.1ng、0.02ng、0.01ng、0.002ng、0.001ng、0.0002ng和0ng。B中的泳道M为Marker(自上而下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)IMI319418：参考文献Phoulivong S，Cai L，Chen H，McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010.Colletotrichum gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers44：33-43.
咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)IMI363578：参考文献Phoulivong S，Cai L，Chen H，McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010.Colletotrichum gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers44：33-43.
Colletotrichum asianum MFLU 090233：参考文献Phoulivong S，Cai L，Chen H，McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010.Colletotrichumgloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers 44：33-43.
Colletotrichum fragariae ICMP 17927：参考文献Silva，D.N.，Talhinhas，P.，Várzea，V.，Cai，L.，Paulo，O.S.，Batista，D.2011.Application of the Apn2/MAT locus to improve thesystematics of the Colletotrichum gloeosporioides complex：an example from coffee(Coffea spp.)hosts.Mycologia(DOI 10.3852/11-145).
Colletotrichum fructicola MFLU 090228：参考文献Prihastuti H，Cai L，Chen H，McKenzie EHC，Hyde KD.2009.Characterization of Colletotrichum species associatedwith coffee berries in northern Thailand.Fungal Divers 39：89-109
Colletotrichum gloeosporioides CBS953.97：参考文献Phoulivong S，Cai L，Chen H，McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010.Colletotrichumgloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers 44：33-43.
Colletotrichum horii ICMP 12942：参考文献Wikee S，Cai L，Pairin N，McKenzie EHC，Su YY，Chukeatirote E，Thi HN，Bahkali AH，Moslem MA，Abdelsalam K.2011.Colletotrichum species from jasmine(Jasminum sambac).Fungal Divers 46：171-182.
Colletotrichum jasmini-sambac CLTA-01：参考文献Wikee S，Cai L，Pairin N，McKenzie EHC，Su YY，Chukeatirote E，Thi HN，Bahkali AH，Moslem MA，Abdelsalam K.2011.Colletotrichum species from jasmine(Jasminum sambac).Fungal Divers 46：171-182.
Colletotrichum musae CBS 116870：参考文献Abd-Elsalam K.A.，Roshdy S.，AminO.E.，Rabani M.2010.First morphogenetic identification of the fungal pathogenColletotrichum musae(Phyllachoraceae)from imported bananas in Saudi Arabia.Geneticsand Molecular Research 9(4)：2335-2342.
Colletotrichum siamense MFLU 090230：参考文献Wikee S，Cai L，Pairin N，McKenzie EHC，Su YY，Chukeatirote E，Thi HN，Bahkali AH，Moslem MA，Abdelsalam K.2011.Colletotrichum species fromjasmine(Jasminum sambac).Fungal Divers 46：171-182.
Colletotrichum simmondsii BRIP28519：参考文献Phoulivong S，Cai L，Chen H，McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010.Colletotrichumgloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers 44：33-43.
实施例1、LAMP反应栓测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)
一、检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的环介导等温扩增引物组的制备
本实施例检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的环介导等温扩增引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成。这四个引物按照如下方法制备：根据本实验室已经克隆的咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)及该属最新发表的8个近源种和1个较远源种(表1)的Apn2/Mat基因序列，应用ClustalX 1.81和BioEdit 7.0软件对这些基因序列进行比对分析，找到多态性丰富的区域，使用在线软件Primers-Primer Explore(Fujitsu Ltd.，Tokyo，Japan)(http://primer explorer.jp/e/)，结合一般引物设计的基本原则，设计并人工合成出一组特异性LAMP检测引物，包括F3、B3、FIP和BIP，所述引物核苷酸序列(5′-3′)分别描述如下：
F3(序列1，引物1)：CAAGACTTACCTTGCGCCAG
B3(序列2，引物2)：GGCTTGCAGCTTATAATTACAGTTC
FIP(序列3，引物3)：
GGTTCGTCAGATCCAGTCATCTCC TT CCACAAACCTTT GTGCGGT
BIP(序列4，引物4)：
CGTCTGCTTCGATGGCAAC T GCGAATACATGGGTTGTGAAT
二、利用咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)模式菌株验证步骤一的引物组
本实施例用于检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的环介导等温扩增试剂具体由Bst DNA聚合酶大片段、甜菜碱、dNTPs、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、吐温20、钙黄绿素和步骤一的引物组组成。其中，引物1、引物2、引物3、引物4、dNTPs、Mg2+、Bst DNA聚合酶大片段、和甜菜碱在环介导等温扩增试剂中的配比为0.2μM∶0.2μM∶1.6μM∶1.6μM∶1.4mM∶8mM∶8U∶0.8M。
以下将以咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的模式菌株验证利用步骤一制备所得引物组进行LAMP反应检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的准确度，具体方法如下所述：
1、采用CTAB法(Yang and Liu.2005.Dactylella coccinella sp.nov.，an anamorphicspecies.Mycotaxon，91：127-132.)提取咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578的基因组DNA，作为LAMP反应的模板，具体操作如下：用无菌手术刀刮下无培养基的真菌培养物约100mg于无菌研钵中，倒入液氮，用研钵将菌丝充分研磨，以无菌药勺将研磨出的菌丝粉末转入1.5ml的离心管中(此步也可用石英砂研磨来代替)；在离心管中加入600μl的2％CTAB缓冲液(配方：CTAB的终浓度为2％(w/v)、Tris-HCl的终浓度为100mmol/L、NaCl的终浓度为1.4mol/L、EDTA的终浓度为20m mol/L、PVP的终浓度为1％(w/v)，pH 8.0)，65℃温浴1h，中间轻摇动离心管3次使溶液混匀；加入300μl Tris饱和酚，盖上离心管帽，颠倒离心管，充分混匀。再加入300μl氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，充分混匀，轻摇动离心管10min，12000r/min离心10min并移上清至另一无菌离心管中；加入600μl氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，充分混匀，轻摇动离心管10min，12000r/min离心10min并移上清至另一无菌离心管中；重复上述步骤1-2次至液面分界处无明显沉淀出现。12000r/min离心10min，移上清至另一只无菌离心管中；加入0.8-1倍体积的预冷的异丙醇，混匀后-20℃放置30min以上，12000r/min离心10min，后弃上清；加入200μl浓度为70％的乙醇轻弹离心管充分浸洗，使沉淀重悬，重复2-3次，必要时12000r/min离心10min，去上清，室温下在净化工作台干燥至无液滴挂壁；用50-100μl TE缓冲液(配方：终浓度为10mM的Tris-HCl、终浓度为1mM的EDTA，pH 8.0)溶解DNA沉淀，得到，-20℃冰箱保存备用。
2、以Apn2/Mat基因为靶基因，采用步骤一制备所得的引物组，对步骤1制备所得的咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578基因组DNA分别作为模板进行LAMP反应。其中，LAMP反应体系：内引物FIP(序列3)和BIP(序列4)的终浓度各为1.6μmol/L，外引物F3(序列1)和B3(序列2)的终浓度各为0.2μmol/L，dNTPs终浓度为1.4mmol/L，甜菜碱(Betaine)终浓度为0.8mol/L，Tris-HCl(pH 8.8)终浓度为20mmol/L，KCl终浓度为10mmol/L，(NH4)2SO4终浓度为10mmol/L，MgSO4终浓度为8mmol/L，吐温20终浓度为0.1％，Bst DNA聚合酶大片段8U，模板(上述步骤1制备的表1中各菌株的基因组DNA)2μL，钙黄绿素(Calcein)1μL(浓度为4mM高效液相色谱(HPLC)纯化的钙黄绿素的二甲基亚砜(DMSO)溶液)，双蒸水定容至25μL。LAMP反应条件为：将上述25μL LAMP反应体系迅速置于65℃水浴锅，反应1h后，置于80℃5min，终止反应。
3、LAMP反应结果的判断有3种方法：1)通过肉眼直接观察，如果所述待测样品反应液出现大量白色沉淀物，则说明所述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；2)在紫外灯下观察所述待测样品反应液颜色，如果为绿色荧光，则说明所述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；3)将所述待测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)。
检测结果如图1所示：紫外灯下，两个待测样品的反应液显示绿色荧光；同时琼脂糖凝胶电泳结果也同样显示为连续的梯状条带，显示咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578的检测结果均为阳性。与实际情况相符。这表明利用步骤一制备所得引物组进行LAMP反应检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的检测结果确实可信。
实施例2、LAMP检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)反应温度条件的优化
本实施例利用步骤一制备所得引物组，以咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418、近源种C.fructicola MFLU 090228，以及阳性对照(λ噬菌体Hind III片段(6,557bp)插入的质粒DNA，Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan，Lot No.18001)为实验材料，在不同温度(61℃、63℃、65℃)下进行LAMP反应，从而优化影响LAMP反应的重要参数-温度。具体操作如下：
1、采用CTAB法(Yang and Liu.2005.Dactylella coccinella sp.nov.，an anamorphicspecies.Mycotaxon，91：127-132.)提取基因组DNA模板，具体操作同实施例1中步骤二1。
2、以Apn2/Mat基因为靶基因，采用实施例1中步骤一制备所得的引物组，对步骤1制备所得的待测样品基因组DNA模板进行LAMP反应。LAMP反应体系同实施例1中步骤二2，反应条件中将温度设置为61℃、63℃和65℃三种，其余与实施例1中步骤二2相同。
3、LAMP反应结果的判断：具体的判断方法同实施例1中步骤二3。
结果如图2所示，在选择的3个实验材料中，在61℃、63℃和65℃三个温度下进行120分钟反应，只有在61℃反应温度下近源种C.fructicola MFLU 090228出现阳性反应(浊度仪和荧光反应)，63℃和65℃则为阴性，同时咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和阳性对照都出现阳性反应，说明61℃反应温度下会出现假阳性。相比63℃而言，65℃的效果更优。这表明65℃为利用本发明所提供的引物组进行LAMP反应的优化温度。
实施例3、LAMP检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的特异性分析
本实施例利用步骤一制备所得引物组，以咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418、咖啡浆果炭疽病菌菌(C.kahawae)IMI363578、8个近源种，以及1个较远源种(表1)为实验材料进行LAMP反应，分析本发明所提供的引物组的特异性。具体操作如下：
1、采用CTAB法(Yang and Liu.2005.Dactylella coccinella sp.nov.，an anamorphicspecies.Mycotaxon，91：127-132.)提取基因组DNA模板，具体操作同实施例1中步骤二1。通过Biospec-NANO(UV-VIS Spectrophotometers，Shimadzu，Japan)仪器精确定量为20-30ng/uL。
2、以Apn2/Mat基因为靶基因，采用实施例1中步骤一制备所得的引物组，对步骤1制备所得的待测样品基因组DNA模板进行LAMP反应。LAMP反应体系及反应条件同实施例1中步骤二2。同时设置CK1和CK2两个空白对照(CK1和CK2均为用灭菌的超纯水替代模板DNA)。
3、LAMP反应结果的判断：具体的判断方法同实施例1中步骤二3。
检测结果如图3所示：紫外灯下，咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578这两个待测样品的反应液显示绿色荧光，同时琼脂糖凝胶电泳结果也同样显示为连续的梯状条带；而其他9个样品在紫外灯下均没有绿色荧光产生，琼脂糖凝胶电泳结果也没有连续的梯状条带。即咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578的检测结果均为阳性；8个近源种的模式菌株，以及1个远源菌株的模式菌株的检测结果均为阴性(表1)。这表明本发明所提供的引物组在LAMP反应检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)时表现出较高的特异性。
表1LAMP分析Colletotrichum属实验菌株及Apn2/MAT基因的检测结果
注：其中●表示阳性结果；○表示阴性结果。
实施例4、LAMP检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的灵敏度分析
本实施例利用步骤一制备所得引物组，以咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418为实验材料进行LAMP反应，选择一系列纯化基因组DNA的浓度梯度(4ng-0.2pg/25uL)，分析本发明所提供的引物组的灵敏度。具体操作如下：
1、采用CTAB法(Yang and Liu.2005.Dactylella coccinella sp.nov.，an anamorphicspecies.Mycotaxon，91：127-132.)提取基因组DNA模板，具体操作同实施例1中步骤二1。
2、以Apn2/Mat基因为靶基因，采用实施例1中步骤一制备所得的引物组，对步骤1制备所得的基因组DNA模板进行LAMP反应。LAMP反应体系及反应条件同实施例1中步骤二2。共11组反应液，在25μl的反应体系中添加咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418基因组DNA模板用量依次为4.0ng、2.0ng、1.0ng、0.2ng、0.1ng、0.02ng、0.01ng、0.002ng、0.001ng、0.0002ng和0ng。
3、LAMP反应结果的判断：具体的判断方法同实施例1中步骤二3。
检测结果如图4所示：紫外灯下，咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418基因组DNA模板用量为4.0ng、2.0ng、1.0ng、0.2ng、0.1ng、0.02ng、0.01ng和0.002ng的8组反应液显示绿色荧光，同时琼脂糖凝胶电泳结果也同样显示为连续的梯状条带；而咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418基因组DNA模板用量为0.002ng、0.001ng、0.0002ng和0ng的4个样品在紫外灯下均没有绿色荧光产生，琼脂糖凝胶电泳结果也没有连续的梯状条带。这表明本发明所提供的引物组在LAMP反应检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)时表现出较高的灵敏度，具体可达0.08pg/μL的模板基因组DNA的浓度。
Claims (10)
1.检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的环介导等温扩增引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
2.检测咖啡浆果炭疽病菌的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg2+和权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为0.2μM：0.2μM：1.6μM：1.6μM：1.4mM：8mM：8U：0.8M。
4.根据权利要求2或3所述的试剂，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或所述Bst DNA聚合酶的大片段。
5.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括荧光显色剂。
6.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂由Bst DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、吐温20、钙黄绿素和权利要求1所述的引物组组成。
7.检测咖啡浆果炭疽病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述引物组，或权利要求2-6中任一所述试剂。
8.权利要求1所述引物组在制备权利要求7所述试剂盒中的应用。
9.权利要求1所述引物组，或权利要求2-6中任一所述试剂，或权利要求7所述试剂盒在检测和/或辅助检测待测样品中是否含有咖啡浆果炭疽病菌中的应用；所述应用中，利用权利要求1所述引物组，或权利要求2-6中任一所述试剂，或权利要求7所述试剂盒对所述待测样品进行环介导等温扩增反应；所述环介导等温扩增反应为63℃-65℃条件下的恒温反应；
所述待测样品为微生物样品或是植物样品。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的温度为65℃。
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