RU2751248C2 - Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena - Google Patents

Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena Download PDF

Info

Publication number
RU2751248C2
RU2751248C2 RU2019140937A RU2019140937A RU2751248C2 RU 2751248 C2 RU2751248 C2 RU 2751248C2 RU 2019140937 A RU2019140937 A RU 2019140937A RU 2019140937 A RU2019140937 A RU 2019140937A RU 2751248 C2 RU2751248 C2 RU 2751248C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
monilinia
species
primers
dna
laxa
Prior art date
Application number
RU2019140937A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019140937A3 (ru
RU2019140937A (ru
Inventor
Елена Валерьевна Михайлова
Наталья Николаевна Карпун
Елена Николаевна Воронина
Михаил Юрьевич Карташов
Иван Александрович Кутелев
Олег Александрович Иванов
Мария Тимуровна Аллямова
Анастасия Андреевна Ровенских
Фёдор Иванович Агеев
Диана Александровна Шимловская
Диана Валентиновна Михольская
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур" (ФГБНУ ВНИИЦиСК)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур" (ФГБНУ ВНИИЦиСК) filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур" (ФГБНУ ВНИИЦиСК)
Priority to RU2019140937A priority Critical patent/RU2751248C2/ru
Publication of RU2019140937A3 publication Critical patent/RU2019140937A3/ru
Publication of RU2019140937A publication Critical patent/RU2019140937A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2751248C2 publication Critical patent/RU2751248C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к тест-системе для обнаружения ДНК фитопатогенных грибов рода Monilinia, содержащей олигонуклеотидные праймеры и зонд. Изобретение позволяет оперативно распознавать фитопатогены Monilinia laxa, Monilinia fruticola, Monilinia fructigena и может быть использовано для экспресс-диагностики и фитокарантинного контроля. 5 табл., 5 пр., 6 ил.

Description

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ выявления видов Monilinia laxa, М. fruticola, М. fructigena с помощью полимеразной цепной реакции. Способ предусматривает выделение ДНК, амплификацию участка гена cytB с использованием ДНК-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, двух праймеров и олигонуклеотидного зонда, 5'- и 3'-концы которого связаны с парой флуоресцентный краситель/«тушитель», комплементарных участкам гена cytB, идентичному у всех видов Monilinia, амплификацию участка района ITS2 с использованием ДНК-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, двух праймеров и олигонуклеотидного зонда, 5'- и 3'-концы которого связаны с парой флуоресцентный краситель/«тушитель», комплементарных участкам района ITS2 идентичному у всех видов царства Грибы и Растения, в качестве контроля выделения ДНК; и регистрацию процесса в «реальном времени» путем одновременного измерения интенсивности флуоресценции на нескольких длинах волн, соответствующих использованным красителям. Для определения видовой принадлежности Monilinia образцы положительные по накоплению флуоресценции в канале, соответствующем зонду cytB, подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле. Способ позволяет проводить определение трех видов М. laxa, М. fruticola, М. fructigena. Способ может быть использован для оперативного распознавания фитопатогена, экспресс-диагностики и фитокарантинного контроля.
Уровень техники
Аналоги изобретения: CN106755476A, ЕР1157129А2, RU 2422533 С1
В настоящее время разработано несколько молекулярно-генетических методов для идентификации видов монилии на основе ПЦР. Большинство из них направлено на идентификацию М. fructicola от остальных видов монилии, как наиболее частого объекта карантинного контроля. Идентификация различных видов монилии проводится либо электрофоретически после моноплексных постановок со специфичными праймерами, либо после мультиплексирования нескольких пар праймеров в одной пробирке.
Рост флуоресценции может быть обеспечен двумя разными способами. Во-первых, используется неспецифический флуоресцентный краситель, который флуоресцирует при взаимодействии с двухцепочечной ДНК - например, SYBR. При накоплении в пробирке продуктов амплификации можно наблюдать рост флуоресценции за счет связывания красителя с двухцепочечной ДНК. Данный метод выявления Monilinia fructicola был предложен в статье (Luo et al. 2007). К сожалению данный метод не позволяет отличать специфичный продукт амплификации от неспецифичного, так как SYBR связывается с любой ДНК, накопление которой идет в ПЦР.
В статье (Papavasileiou et al. 2016) описан способ, который основан на интеркалирующем красителе, однако, позволяет идентифицировать разные виды Monilinia в одной пробирке. В данном способе используется амплификация участка гена сурВ с помощью праймеров, комплементарных идентичной последовательности для всех видов Monilinia. Амплификация проводится в присутствии интеркалирующего красителя SYTO 9 Green. После амплификации проводится съем «кривой плавления», которая представляет собой зависимость логарифма изменения флуоресценции от температуры образца. В момент расплавления ампликона происходит резкое падение флуоресценции, что отражается на графике в виде пика, максимальная точка которого отражает характерную температуру плавления ампликона. Разные длина ампликона и его нуклеотидный состав приводят к разной температуре плавления ампликона. Однако, данная методика сложно стандартизуется и мало подходит для рутинных диагностических работ в связи с вариативностью значения температуры плавления ампликона от состава буфера для проведения ПЦР, а также прибора, на котором проводится амплификация и алгоритма обсчета данных программным обеспечением прибора.
Второй способ детекции накопления ПЦР продукта основан на резонансном переносе энергии флуоресценции. В данном случае флуорофор и его «тушитель» находятся на одном зонде, комплементарном средней части амплифицируемого фрагмента. Когда Taq-полимераза разрушает зонд в ходе ПЦР реакции за счет экзонуклеазной активности, сопряженной с синтезом ДНК, флуоресцентная группа переходит в раствор и отдаляется от «тушителя». Данный способ позволяет повысить специфичность определения ПЦР-продукта за счет введения дополнительного специфичного олигонуклеотида - зонда Реализация данного метода в отношении выявления видов Monilinia предложена в статье (van Brouwershaven et al. 2010). Авторы сконструировали праймеры и зонды на основании последовательности ITS региона таким образом, что один набор праймеров/зондов работает только на ДНК М. fructicola, а другой работает на всех других видах Монилии. К сожалению, данный подход не позволяет провести видовую идентификацию М. laxa и М. fructigena, а также в системе не предусмотрен внутренний контроль амплификации, что может приводить к появлению ложноотрицательных результатов.
Также Taq-man-система идентификации видов Monilinia используется в патенте CN106755476A. Патент основан на уникальных последовательностях гена laccase 2 у разных видов Monilinia (6 видов). Для каждого вида подобраны специфичные праймеры и зонды. Однако в разработанной системе все зонды содержат один флуорофор, таким образом для каждого образца требуется постановка 6 реакций. Также в предлагаемой тест-системе нет внутреннего контроля, что может приводить к появлению ложноотрицательных результатов.
Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ, предложенный (С. Guinet et al. 2016). Данный метод основан на мультиплексной амплификации видоспецифичного маркера MO368 для трех видов Monilinia (laxa, fruticola, frutigena) с использованием зондов, несущих красители, флуоресцирующие в трех различных каналах. Также для внутреннего контроля используется ITS2 локус, консервативный для грибов и растений. Этот метод мог бы служить прототипом создания тест-системы для выявления Monilinia, однако, он не позволяет использовать его в лабораториях где нет приборов с возможностью регистрации флуоресценции в режиме реального времени или если есть прибор с возможностью регистрации флуоресценции в режиме реального времени только по двум каналам. Также использование трех пар праймеров и трех зондов значительно удорожает производство такой тест-системы.
Сущность изобретения
Технической задачей изобретения является разработка точного, быстрого и дешевого способа идентификации заражения растений грибами рода Monilinia, а также возможности видовой идентификации для трех видов Монилии (М. laxa, М. fruticola, М. frutigena).
Техническим результатом, достигаемым при использовании способа, является:
• Прямое распознавание патогена и 100% специфичность анализа независимо от присутствия других возбудителей в пробах
• Возможность различать три вида Monilinia (М. laxa, М. fruticola, М. frutigena)
• Наличие внутреннего контроля для отслеживания качества выделения ДНК из образца
• Диагностика заболевания на начальных стадиях (чувствительность не менее 1 нг)
• Скорость выполнения анализа в течении 1 рабочего дня (возможность детекции в реальном времени)
• Доступность проведения анализа для лабораторий без возможности детекции результатов в режиме реального времени
• Снижение стоимости производства набора для детекции трех видов Monilinia.
Поставленная техническая задача достигается тем, что:
1) подбор праймеров и зондов для ДНК-тестирования осуществлялся таким образом, чтобы они были комплементарны области 100% гомологии гена cytB среди всех видов Monilinia и значительно отличалась от других видов грибов;
2) подбор праймеров для ДНК-тестирования осуществлялся таким образом, чтобы получаемый амплификационный фрагмент имел разную длину для разных видов Monilinia
3) для внутреннего контроля использовались праймеры для ITS2 локуса, консервативного для грибов и растений (G. Zhou et al.)
Предлагаемый способ заключается в том, что для выявления наличия Монилии анализируемую ДНК подвергают ПЦР-амплификации с использованием ДНК-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, двух праймеров и олигонуклеотидного зонда, 5'- и 3'-концы которого связаны с парой флуоресцентный краситель/«тушитель», комплементарных участкам гена cytB идентичному у всех видов Монилии (фиг. 1), а также двух праймеров и олигонуклеотидного зонда, 5'- и 3'-концы которого связаны с парой флуоресцентный краситель/«тушитель», комплементарных участкам района ITS2 идентичному у всех видов царства Грибы и Растения, в качестве контроля выделения ДНК (табл. 1).
Figure 00000001
Длительность анализа занимает 1,5 часа рабочего времени. Предлагаемый способ применим для образцов ДНК, выделенных из разных источников (плоды, листья, чистые культуры) и разными способами (СТАВ-хлороформной экстракции, сорбции на силикагеле). Для определения видовой принадлежности Монилии образцы положительные по накоплению флуоресценции в канале, соответствующем зонду cytB, подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле. Способ позволяет проводить определение трех видов Monilinia: laxa, fruticola, fructigena по различию в электрофоретической подвижности за счет различной длины продуктов амплификации (табл. 2).
Figure 00000002
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1. Для детекции результатов ПЦР используется только две пары праймеров и два зонда (включая внутренний контроль), что удешевляет использование метода
2. Для выявления различных видов Монилии используется форезная детекция, основанная на разной длине амплификационного продукта, что позволяет проводить детекцию и при отсутствии возможности проведения «ПЦР в реальном времени».
Краткое описание чертежей.
На фиг. 1 представлено расположение праймеров и зонда для выявления монилии. Область комплементарная последовательностям праймеров и зонда показана черным прямоугольником (А. прямой праймер, Б. зонд, В. Обратный праймер). Нижние три строки - другие виды фитопатогенных грибов.
На фиг. 2 показаны кривые накопления флуоресценции в образцах, выделенных из чистых культур различных видов Monilinia. (канал Fam - праймеры и зонд Mon-cytB, канал Hex - праймеры и зонд FP-ITS2(внутренний контроль).
На фиг. 3 представлены результаты электрофореза: 1 - М. laxa; 2 - М. fructicola; 3 - М. fructigena; М - маркер молекулярной массы (100 п.н).
На фиг. 4 представлен пример кривых накопления флуоресценции для разных концентраций ДНК М. laxa.
На фиг. 5 показана встречаемость различных видов Monilinia на плодах и деревьях Черноморского побережья и Абхазии.
На фиг. 6 Представлено филогенетическое древо для участка гена CYTB (жирным выделены виды, полученные в нашем исследовании).
Осуществление изобретения.
Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами выполнения способа:
Пример 1. Идентификация грибов рода Монилия (Monilinia) с помощью предложенного способа по ДНК, выделенной из чистых микробиологических культур.
Выделение изолятов грибов в чистую культуру проводили из пораженных монилиозом плодов и плодовых образований. Для выделения чистой культуры патогенного гриба мы использовали агаризованную синтетическую среду Чапека, в состав которой входят такие компоненты, как: MgSO4, безводный K3PO4, KCl, Fe2(SO4)3, NaNO3, декстроза, агар, дистиллированная вода. Моноспоровые изоляты грибов культивировали при комнатной температуре (22°С) в течении 3-5 дней.
Выделение ДНК из полученных чистых культур проводили с использованием коммерческого набора «Проба-НК» (ДНК-Технология, Россия) согласно инструкциям производителя. В качестве материала для выделения отделяли с помощью скальпеля часть мукора гриба с чашки. Степень очистки выделенных препаратов ДНК и их концентрацию определяли спектрофотометрическим методом на анализаторе NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Для оценки качества (содержания примесей) препарата нуклеиновых кислот используют отношение А260/А280, которое для чистого препарата ДНК приблизительно равно 1,8.
ПЦР в режиме реального времени проводили в суммарном объеме смеси 25 мкл. Стандартная реакционная смесь содержала 10 нг ДНК-матрицы, 1x qPCRmix-HS (Евроген, Россия), 10 пкмоль каждого праймера и 10 пкмоль флуоресцентного зонда. Амплификацию и учет уровня флуоресценции проводили в амплификаторе «"QuantStudio® 3 Real-Time PCR System"» (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, США) (табл. 3).
Figure 00000003
Реакционную ПЦР смесь, содержащую продукты амплификации, подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле при постоянном напряжении 5 В/см в буфере 1x ТАЕ. Гель окрашивали интеркалирующим красителем SYBR® Safe и визуализировали в УФ свете с использованием гель-документирующей системы ChemiDoc XRS+ (BioRad, США).
Пример 2. Определение чувствительности.
Для определения аналитической чувствительности разработанных праймеров и зонда были получены серийные 5-ти кратные разведения препарата ДНК. Для воспроизводимости определения показателя чувствительности данный эксперимент был повторен дважды (табл. 4).
ПЦР в режиме реального времени проводили в суммарном объеме смеси 25 мкл. Стандартная реакционная смесь содержала 10 нг ДНК-матрицы, 1x qPCRmix-HS (Евроген, Россия), 10 пкмоль каждого праймера и 10 пкмоль флуоресцентного зонда. Амплификацию и учет уровня флуоресценции проводили в амплификаторе «ДТ» (ДНК-технологии, Россия). Детекция уровня флуоресценции проводилась по каналу FAM.
Figure 00000004
Было показано, что минимальное количество ДНК, которое способны выявлять разработанные праймеры и зонд составило 0,08 нг на реакцию.
Пример 3. Определение специфичности.
Анализ специфичности проводился на панели образцов плодов, зараженных различными фитопатогенами грибковой и бактериальной природы (табл. 5).
Figure 00000005
Пример 4. Выявление грибов рода Монилия (Monilinia) с помощью разработанной тест-системы на растениях Черноморского побережья России и Абхазии.
В исследовании было проанализировано 106 образцов различных частей растений, с подозрением на заражение монилиозом по визуальным признакам. Сбор образцов проводился на территориях Сочинского, Туапсинского, Апшеронского и Крымского районов Краснодарского края, а также на территории черноморского побережья Абхазии. Среди исследуемых плодовых культур были яблоня, персик, слива, абрикос, черешня, груша, алыча, фейхоа, мандарины и мушмула.
Гомогенизацию исследуемых плодов проводили путем их растирания в фарфоровых ступках с 300 мкл стерильного физраствора. Выделение ДНК проводили с использованием набора «Проба-НК» (ДНК-технологии, Россия) согласно инструкции производителя.
ПЦР в режиме реального времени проводили в суммарном объеме смеси 25 мкл. Стандартная реакционная смесь содержала 10 нг ДНК-матрицы, 1x qPCRmix-HS (Евроген, Россия), 10 пкмоль каждого праймера. Амплификацию и учет уровня флуоресценции проводили в амплификаторе «ДТ» (ДНК-технологии, Россия). Видовую идентификацию выявленных изолятов грибов рода Monilinia проводили определением длины наработанных ампликонов. Разделение ампликонов проводилось электрофорезом в 2% агарозном геле.
По результатам ПЦР с использованием разработанных праймеров нами было выявлено 25 образцов (23%), содержащих ДНК монилий. На черноморском побережье Краснодарского края и Абхазии монилиоз, согласно данным исследования, может поражать яблоню, персик, сливу, мушмулу, алычу и черешню. Наиболее часто монилиозами инфицированы слива, персик и черешня. Исследованные образцы абрикоса, груши и фейхоа генетического материала монилии не содержали, что вероятнее всего связано с небольшой по объему выборкой данных видов плодов.
Пример 5. Определение нуклеотидных последовательностей и видовой принадлежности исследованных грибов рода Монилия (Monilinia).
Для подтверждения правильности видового определения обнаруженных грибов рода Monilinia было проведено секвенирование некоторых ампликонов методом Сенгера (секвенирование было проведено в ЦКП Геномика СО РАН, ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск). По полученным нуклеотидным последовательностям была, построена дендрограмма с использованием метода максимального правдоподобия (2-х параметрическая модель Кимуры, индекс поддержки ветвей рассчитан для 500 реплик (бутстреп анализом). Все определенные виды, кластеризовались в одни клады с такими же видами из других источников, что свидетельствует о правильности проведенной видовой идентификации.
--->
Перечень последовательностей
SEQ ID NO:1 ggaaggtgagtaggaaatacaga
SEQ ID NO:2 gtatagaaagcaattaaataacagatgt
SEQ ID NO:3 agttccgttaaatggataggtt
<---

Claims (1)

  1. Тест-система для обнаружения ДНК фитопатогенных грибов рода Monilinia методом полимеразной цепной реакции, содержащая олигонуклеотидные праймеры, имеющие следующую структуру: SEQ ID NO: 1 5'-ggaaggtgagtaggaaatacaga-3' и SEQ ID NO: 2 5'-gtatagaaagcaattaaataacagatgt-3', соответствующие последовательности гена ITS2 идентичному у всех видов царства Грибы и Растения, и зонд SEQ ID NO: 3 5'-agttccgttaaatggataggtt-3', комлементарный участку гена cytB, идентичному у всех видов рода Monilinia.
RU2019140937A 2019-12-09 2019-12-09 Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena RU2751248C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019140937A RU2751248C2 (ru) 2019-12-09 2019-12-09 Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019140937A RU2751248C2 (ru) 2019-12-09 2019-12-09 Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019140937A3 RU2019140937A3 (ru) 2021-06-09
RU2019140937A RU2019140937A (ru) 2021-06-09
RU2751248C2 true RU2751248C2 (ru) 2021-07-12

Family

ID=76296752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019140937A RU2751248C2 (ru) 2019-12-09 2019-12-09 Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2751248C2 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101857894A (zh) * 2009-04-10 2010-10-13 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 检测美澳型核果褐腐病菌的引物、探针、试剂盒及方法
RU2465332C1 (ru) * 2011-08-08 2012-10-27 Общество с ограниченной ответственностью "Лесная диагностика" Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней лиственных пород - гриба polyporus squamosus методом полимеразной цепной реакции
CN106755476A (zh) * 2017-01-19 2017-05-31 中国农业大学 用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101857894A (zh) * 2009-04-10 2010-10-13 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 检测美澳型核果褐腐病菌的引物、探针、试剂盒及方法
RU2465332C1 (ru) * 2011-08-08 2012-10-27 Общество с ограниченной ответственностью "Лесная диагностика" Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней лиственных пород - гриба polyporus squamosus методом полимеразной цепной реакции
CN106755476A (zh) * 2017-01-19 2017-05-31 中国农业大学 用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUINET C. et al., One-Step Detection of Monilinia fructicola, M. fructigena, and M. laxa on Prunus and Malus by a Multiplex Real-Time PCR Assay, Plant Dis., 2016, Volume 100, Issue 12, pp. 2465-2474. *
GUINET C. et al., One-Step Detection of Monilinia fructicola, M. fructigena, and M. laxa on Prunus and Malus by a Multiplex Real-Time PCR Assay, Plant Dis., 2016, Volume 100, Issue 12, pp. 2465-2474. WANG J. et al., Detection and Identification of Six Monilinia spp. Causing Brown Rot Using TaqMan Real-Time PCR from Pure Cultures and Infected Apple Fruit, Plant Dis., 2018, Volume 102, Issue 8, pp. 1527-1533. *
WANG J. et al., Detection and Identification of Six Monilinia spp. Causing Brown Rot Using TaqMan Real-Time PCR from Pure Cultures and Infected Apple Fruit, Plant Dis., 2018, Volume 102, Issue 8, pp. 1527-1533. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019140937A3 (ru) 2021-06-09
RU2019140937A (ru) 2021-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Böhm et al. Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants
US20180195111A1 (en) 16s ribosomal rna universal primers and use thereof in microbiological analysis and diagnostics
AU2020102244A4 (en) Primer group, kit and detection method for rapidly detecting carbapenemases genes
CN115029459A (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a可视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及应用
CN111440886A (zh) 一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法
CN116287388A (zh) 一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒
RU2612137C1 (ru) Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica
CN107849566B (zh) 用于检测白粉病的方法和试剂盒
RU2751248C2 (ru) Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena
RU2550257C2 (ru) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТИПИЧНЫХ И АТИПИЧНЫХ ШТАММОВ Yersinia pestis СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА МЕТОДОМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ
RU2332464C1 (ru) Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба
CN116334280A (zh) 一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒
EP2999798A1 (en) Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by pcr, primers as well as bacteria and fungi detection kit
CN102936621A (zh) 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒
RU2644236C1 (ru) Способ генетического типирования штаммов yersinia pestis и yersinia pseudotuberculosis на основе анализа 13 vntr локусов в мультиплексной пцр реакции
CN104032000B (zh) 一种蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒
CN111676306A (zh) 作物胶孢炭疽病菌特异性ssr标记及其检测试剂盒
RU2455364C2 (ru) Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции
RU2478717C1 (ru) Способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба
US6518020B1 (en) Haemobartonella PCR methods and materials
RU2583924C1 (ru) СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-ДЕТЕКЦИИ Atopobium vaginae, Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens И Eggerthella spp. В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
CN116144660B (zh) 基于新crispr靶点的mrsa菌检测
RU2795019C1 (ru) Олигонуклеотиды для определения мутации S:P681R SARS-CoV-2
RU2755690C1 (ru) Способ детекции генов метициллин-резистентности mecA и mecC у стафилококков
RU2706570C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 40 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты)