RU2644236C1 - Способ генетического типирования штаммов yersinia pestis и yersinia pseudotuberculosis на основе анализа 13 vntr локусов в мультиплексной пцр реакции - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу генетического типирования штаммов чумного микроба (Yersinia pestis) и псевдотуберкулезного микроба (Yersinia pseudotuberculosis) с использованием набора синтетических олигонуклеотидных праймеров и фрагментного анализа флуоресцентно-меченных ДНК-ампликонов на капиллярном ДНК-анализаторе. Набор из 13 пар праймеров, в отличие от существующих аналогов, позволяет проводить мультиплексную ПЦР в одной реакционной смеси. 1 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и медицинской микробиологии, в частности к внутривидовой дифференциации и молекулярному типированию штаммов возбудителя чумы и псевдотуберкулеза, и его рекомендуется использовать в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и учреждениях Роспотребнадзора для осуществления эпидемиологического мониторинга очагов и расследования эпидемических (эпизоотических) вспышек.

Чума и псевдотуберкулез являются инфекционными природно-очаговыми заболеваниями, опасными для человека. Чумной микроб был открыт на одиннадцать лет позднее псевдотуберкулезного. Сравнение их свойств сразу выявило большое сходство. В настоящее время близкое родство этих микробов доказано морфологическими, микробиологическими, биохимическими и молекулярно-генетическими методами. Причем по структуре генома к чумному микробу близки штаммы псевдотуберкулезного микроба, относящиеся к филогенетически наиболее патогенному и вирулентному 1-му (О:1b) серотипу [1].

Современные методы генотипирования Yersinia pestis позволяют не только дифференцировать отдельные внутривидовые группы и различать штаммы в составе внутривидовых филогенетических групп, но и отслеживать микроэволюцию на уровне отдельных бактериальных изолятов в ходе эпизоотии или эпидемии [2].

Молекулярно-генетический идентификационный анализ позволяет исследовать особые участки ДНК, сочетание которых строго специфично для каждого штамма, и, таким образом, удается получить уникальный генетический «портрет». Маркерные признаки, определяемые на уровне ДНК, характеризуются большой устойчивостью, то есть сохраняются в геноме микроорганизма в пределах экосистемы, в которой он находится, и также относительно стабильно сохраняются при музейном хранении.

Известны способы детекции, внутривидовой дифференциации и определения подвидового разнообразия штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с использованием молекулярно-генетических методов: полимеразной цепной реакции (ПЦР), ПЦР с гибризационной детекцией в реальном времени, секвенированием и группой методов фрагментного анализа [Патент RU №2354700, опубликован 10.05.2009; Патент № DE 10124342, опубликован 11.28.2002; Патент RU №2425891, опубликован 10.08.2011; Патент RU №2471872, опубликован 10.01.2013; Патент RU №2550257, опубликован 10.05.2015].

Однако при расследовании эпидемических проявлений чумы для эффективной идентификации возбудителя и установления источника происхождения наиболее информативным является VNTR-анализ (Variable-Number Tandem Repeats), что характеризуется вероятностью дискриминации свыше 90%, быстротой проведения анализа (в течение нескольких часов), высокой воспроизводимостью и относительно низкой себестоимостью, а также возможностью проведения успешного анализа даже при исследовании минимального количества образца.

В повседневной эпидемиологической практике здравоохранения и Роспотребнадзора применение VNTR-анализа возможно при различных ситуациях, например: при проведении эпизоотологического мониторинга природных очагов чумы России и государств-участников СНГ (исследование образцов от грызунов, блох, верблюдов, объектов окружающей среды и др.); в эпидемиологическом расследовании случаев заболевания человека чумой (вспышек чумы); в осуществлении санитарно-карантинного контроля в пунктах пропуска через Государственную границу Российской Федерации; при расследовании случаев биологического терроризма.

Мультилокусное VNTR-типирование патогенных микроорганизмов, в том числе Y. pestis, проводится с целью получения уникальных генетических «портретов» штаммов, что впоследствии позволяет проводить внутривидовую дифференциацию (принадлежность к внутривидовой группе), определять эволюционные связи, принадлежность к определенному природному очагу чумы (географическое происхождение). Получение этих данных позволяет эффективно проводить эпидемиологический мониторинг очагов и расследование эпидемических (эпизоотических) вспышек.

В настоящее время при VNTR-типировании рода Yersinia успешно используется около 100 VNTR локусов с размерами повторов от 2 до 60 н.о. [3, 4, 5], детекция которых осуществляется различными электрофоретическими методами в зависимости от размера повторов. Для выявления локусов с размерами повторов менее 10-15 н.о. используют проведение электрофореза в капиллярных ДНК анализаторах. Мультилокусное типирование проводится с локусами в разных комбинациях при этом каждый локус амплифицируется либо отдельно, либо инициирующие праймеры сочетаются максимум по 4-6 пар в одной ПЦР смеси [5]. В настоящее время для изучения геномного полиморфизма штаммов возбудителя чумы широкое применение получил многолокусный анализ вариабельных тандемных повторов (Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis - MLVA 25). За прототип изобретения был взят этот подход, в части получения специфичных фрагментов в мультиплексной ПЦР и детекцией результатов в автоматических капиллярных ДНК анализаторах с использованием четырех флуоресцентных цветовых каналов,.

Недостатком известного способа является то, что при постановке мультиплексной ПЦР для одного штамма ставятся несколько реакций, в которых объединяются не более 4-6 пар праймеров, что связано со сложностью согласования по термодинамическим параметрам праймеров, находящимся в одной реакционной смеси, кроме того использование локусов с протяженными нуклеотидными повторами не позволяет проводить одновременную детекцию в капиллярных ДНК анализаторах большего числа локусов, амплифицированных в мультиплексной ПЦР. Для уменьшения количества электрофорезов продукты ПЦР объединяют, что усложняет пробоподготовку в связи с тем, что это требует подбора эквимолярного соотношения полученных в амплификации фрагментов. Использование известного способа требует значительного количества временных и экономических затрат. Мультиплексирование большего числа локусно-специфичных праймеров в одной ПЦР реакции позволяет сокращать временные и экономические затраты пропорционально количеству объединенных в одной реакции пар праймеров. Кроме этого, у прототипа невысокая дифференцирующая способность, определенная по индексу разнообразия Нея (diversity index, DI) она составляет от 0,09 до 0,88 (0,52±0,1).

Технической задачей изобретения является разработка более быстрого, эффективного и экономичного способа генетического типирования штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с помощью мультиплексного VNTR анализа с использованием набора олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих высокую специфичность при одновременном использовании всех праймеров в одной ПЦР, подобранных на VNTR локусы и с возможность проведения анализа с помощью автоматических капиллярных анализаторов в диапазоне трех флуоресцентных цветовых каналов.

Технический результат заключается в обеспечении быстрого и надежного способа генетического типирования штаммов возбудителя чумы с помощью мультилокусного VNTR анализа, в сокращении времени и увеличении дифференцирующей способности способа определять индивидуальные генетические различия штаммов в отдельных внутривидовых филогенетических группах. Вместо трудоемкого и дорогостоящего анализа генома исследуемого штамма Y. pestis или Y. pseudotuberculosis индивидуально по каждому из множества VNTR-локусов для установления генотипа изучаемого штамма достаточно провести одну мультиплексную ПЦР с 13-ю парами подобранных праймеров.

Технический результат достигается способом, который включает выделение ДНК, постановку мультиплексной ПЦР и последующего фрагментного анализа флуоресцентно-меченных ДНК-ампликонов на генетическом анализаторе с помощью капиллярного гель-электрофореза, согласно изобретению постановку мультиплексной ПЦР осуществляют одновременно в одной реакции с набором из 13 пар флуоресцентно-меченных праймеров SEQ ID NO: 1-13, комплементарных участкам VNTR локусов хромосомы Y. pestis и Y. pseudotuberculosis: Y3298, Y3336, Y3515, Y4964, Y3701, Y0920, Y4577, Y4892, Y3885, Y4935, Y3653, Y3777, Y5160, генетический портрет штаммов получают после проведения фрагментного анализа путем определения количества повторов в каждом локусе с помощью таблицы.

Разработанный способ базируется на использовании специально подобранных высокоспецифичных флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных праймеров для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции для амплификации VNTR маркеров Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. Отличительной особенностью заявляемого способа является подбор VNTR локусов с высокой дифференцирующей способностью и конструирование набора праймеров, способных инициировать ПЦР одновременно в одной реакционной смеси.

Выбор VNTR локусов осуществлен в два этапа. На первом этапе осуществлен поиск VNTR локусов в хромосоме Y. pestis с последующим накоплением их характеристик в базе данных; на втором - проведено сравнение трех гомологичных геномов бактерий на предмет различия в количестве копий VNTR и выбор наиболее вариабельных VNTR-локусов. Для поиска и последующего изучения VNTR-локусов использовано разработанное программное средство [6]. Альтернативно, для сравнительного анализа данных использовался программный ресурс, доступный на сайте (http://minisatellites.u-psud.fr), также позволяющий проводить поиск тандемных повторов и сравнивать количество их копий в трех геномах. В результате были найдены и занесены в базу данных как ранее используемые по литературным данным, так и новые VNTR последовательности, которые отличались по количеству копий тандемных повторов в сравниваемых геномах.

Дизайн праймеров проведен с использованием модуля расчета параметров олигонуклеотидных праймеров разработанного программного средства [7]. Расчет термодинамических параметров праймеров проводился с использованием эмпирических формул и термодинамических констант ΔS, ΔН, ΔG (PNAS #83 рр3746-3750 6/86), что позволило обеспечить минимальное количество неспецифических (димерных) реакций при сохранении высокой чувствительности и специфичности. Характеристики рассчитанных олигонуклеотидных праймеров были сохранены в разработанной базе данных [8]. Для конструирования мультиплексного набора праймеров был создан SQL-запрос (Structured Query Language - «язык структурированных запросов») к базе данных, в котором были введены ограничения по размерам тандемных повторов (не более 7 н.о.) и количеству копий (не менее 2). При формировании наборов праймеров учитывались такие параметры, как размеры ампликонов, максимальная разница оптимальных температур амплификации и энергия образования димеров. Для этих расчетов было использовано разработанное программное средство, которое позволяет автоматически производить конструирование мультиплексных систем, предназначенных для проведения детекции полученных продуктов ПЦР амплификации при капиллярном гель-электрофорезе с использованием флуоресцентных красителей на автоматических ДНК-анализаторах [9]. Рассчитано более 200 тринадцати-локусных мультиплексных наборов, в которых получаемые при ПЦР ампликоны наиболее оптимально подобраны по сочетанию длин фрагментов в каждом из трех каналов детекции флуоресцентных красителей. Выбор лучшего варианта был проведен исходя из минимальной величины дисперсии значений оптимальной температуры отжига праймеров, GC состава праймеров и продукта амплификации. Таким образом, разработана система праймеров, позволяющая в одной реакционной смеси одновременно проводить амплификацию 13 VNTR локусов, 7 из которых были впервые использованы и не имеют аналогов по литературным данным: Y3298, Y3515, Y3701, Y3777, Y3885, Y4577, Y4935, а 6 ранее использовались для генетического типирования (табл.). Дифференцирующая способность всех этих локусов, определенная по индексу разнообразия Нея, рассчитанному по 40 сиквенсам штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, составила от 0,33 до 0,93 (0,72±0,1).

В наборе олигонуклеотидных праймеров для генотипирования Y. pestis и Y pseudotuberculosis по 13 VNTR-локусам использована система красителей FAM-R6G-TAMRA-ROX. Флуоресцентными красителями FAM (6-карбоксифлуоресцеин), R6G (6-Карбоксиродамин), TAMRA (Тетраметилкарбоксиродамин) метятся по 5' концу прямые праймеры для каждого из 13 локусов, а четвертый цветовой канал детекции флуоресценции ROX (Карбокси-Х-родамин) используется для визуализации стандарта молекулярных размеров. Применен стандарт Internal Lane Standart 600 (Cat. # DG2611, Promega Corporation, USA), к которому эквимолярно добавлены два флуоресцентно-меченных ROX фрагмента ДНК размерами 675 н.п. и 750 н.п., полученных путем амплификации на ДНК-матрице плазмиды pUC с использованием праймеров:

675F-ROX-5'-AAGACACGACTTATCGCCACTG-3'

675RR-5'-CTGGATGGAGGCGGATAAAG-3'

750F-ROX-5'-GGTAACAGGATTAGCAGAGCG-3'

750RR-5'-TACCAAACGACGAGCGTGAC-3'.

Возможно использование размерного стандарта GeneScan™ 1000 ROX™ (Applied Biosystems Cat # 401098).

Способ осуществляют следующим образом.

Для работы используют образцы ДНК, выделенной из чистой культуры Y. pestis в соответствии со стандартными методами, обеспечивающими качественную очистку ДНК от белков и примесей и предотвращающими деградацию материала в ходе выделения. Концентрация рабочего раствора тотальной недеградированной ДНК для проведения ПЦР должна быть не менее 10 нг/мкл. Генотипирование по VNTR локусам проводят в несколько этапов, включающих проведение подготовки образцов ДНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР), пробоподготовки продуктов амплификации, капиллярный гель-электрофорез на автоматических ДНК-анализаторах, компьютерную программную обработку первичных данных и, собственно, получение итоговых генотипов исследуемых образцов.

Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин.

ПЦР проводят в пробирках или плашках объемом 0,2 или 0,5 мл. Объем реакционной смеси может варьировать от 15 до 50 мкл. Рекомендуемый объем 25 мкл. Реакционная смесь для ПЦР включает в себя смесь олигонуклеотидных праймеров по 1,5-2,5 пмоль каждого; 0,2 мМ концентрацию каждого из четырех dNTP; от 10 до 50 нг исследуемого образца геномной ДНК; буфер для Taq-полимеразы; 1,5 мМ Mg²⁺ и 2,5 ед. Taq-ДНК-полимеразы.

Программа для мультиплексной амплификации 13-локусному набору олигонуклеотидных праймеров: начальная денатурация: 94°С - 4 мин; 30 циклов: 94°С - 30 с, 58°С - 60 с, 72°С - 90 с; заключительная элонгация: 72°С - 5 мин. Рекомендуется использовать амплификаторы фирм: Applied Biosystems, Forster Sity, I-Cycler, BioRad (USA). Параметры ПЦР в условиях работы конкретной лаборатории могут потребовать коррекции, проводящейся опытным путем.

За основу методики проведения капиллярного гель электрофореза на автоматических ДНК-анализаторах был взят протокол GenePrint PowerPlex 16 System (Part # TMD012, Promega Corporation, USA) для ABI PRISM 310 Genetic Analyser.

ПЦР-продукты разводят деионизованной водой до концентрации 10 пМ/мкл (обычно полученные амплификаты разводят в 20-100 раз). Исходная концентрация зависит от качества и концентрации исходной ДНК-матрицы, оптимизации ПЦР, применяемой полимеразы и расходных материалов.

Реакция денатурации ПЦР-продукта в формамиде ставится в общем объеме 10 мкл. В пробирки или плашки для автоматического анализатора переносят по 1 мкл ПЦР-продукта, 1 мкл маркера молекулярной массы, 8 мкл Hi-Di формамида. Размерный стандарт представляет собой смесь искусственно синтезированных олигонуклеотидных фрагментов длиной от 60 до 750 н.о. (60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 675, 750) с химически привитой флюоресцентной группой (ROX), которая при облучении флюоресцирует в спектре красного цвета (520 нм). Полученную смесь денатурируют 5 мин при 95°С, затем сразу охлаждают либо во льду, либо при 4°С (5 минут).

Фрагментный анализ VNTR локусов проводят с помощью капиллярного гель-электрофореза. Продукты ПЦР и размерный стандарт в денатурирующем буфере разделяют на генетических анализаторах, например ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA). Для анализа полученных данных используется прилагаемое к прибору программное обеспечение (GeneMapper™ ID 4.1, Applied Biosystems, USA). Результаты в итоге представлены в виде разноцветных пиков (каждый из цветов соответствует определенному флуоресцентному красителю) - электрофореграммы, с обозначенным размером продуктов, который устанавливается по стандарту длины, добавляемому при пробоподготовке в каждый образец. Определение аллельных вариантов производится по количеству тандемных повторов по алгоритму, созданному в программе GeneMapper, либо по таблице в соответствии с формулой: N_sh=(L_a-(L_min-L_t×N))/L_t, где: N_sh - количество тандемных повторов в локусе у исследуемого штамма; L_a - размер аллели VNTR локуса у исследуемого штамма (и.о.); L_min - минимальный размер аллели локуса (и.о.); L_t - размер тандемного повтора (и.о.); N - количество тандемных повторов в аллели минимального размера.

Результаты определения размеров аллелей по анализируемым штаммам экспортируются в файл для дальнейшего анализа и записи их в базу данных. Для этого было использовано разработанное программное средство [10]. Программный алгоритм решает следующие задачи: 1) выбраковку неспецифических пиков флуоресценции, связанных с: а) неправильным решением цветовой матрицы сигналов; б) продуктами неспецифической ПЦР; г) недостаточной чистотой электрофоретической системы; д) раздвоением пика; 2) определение размера аллели (н.о.) и ее номера по количеству тандемных повторов; 3) накопление результатов в базе данных.

Накопленные в базе данных генетические характеристики и различные паспортные данные штаммов путем SQL запросов могут быть экспортированы в специализированные программы для дальнейшей статистической обработки с целью решения различных задач: микробиологических, молекулярно-генетических, эпидемиологических.

Таким образом, фрагментный анализ на автоматическом капиллярном ДНК-анализаторе амплифицированных фрагментов позволяет за один гель-электрофорез определить генотип штамма по 13 VNTR локусам. Генотипы представлены в виде размеров длин фрагментов соответствующих ампликонов в нуклеотидах, что соответствует определенному количеству тандемных повторов. Оценка информативности выбранных маркеров по доступным литературным данным и генетическим базам данных показала высокий потенциал данного набора праймеров для генетической дифференциации штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis внутри вида и даже внутри популяции. Точность генотипирования не менее 99% (определенная по 40 сиквенсам). Погрешность измерений длин фрагментов ДНК не более 1 нуклеотида. Воспроизводимость результатов должна обеспечиваться точным соблюдением всех условий генотипирования.

Пример 1. Определение генетического «паспорта» штамма Y. pestis.

Из двухсуточной агаровой культуры исследуемого штамма выращенного при 28°С, стандартным метод выделена ДНК, проведена мультиплексная ПЦР с 13 парами праймеров. Размеры фрагментов определены после проведения гель-электрофореза на автоматическом ДНК-анализаторе (ABI PRISM 310 Genetic Analyser), используя прилагаемое программное обеспечение (GeneMapper™ ID 4.1). В результате получен следующий генетический аллельный паспорт штамма, представленный в виде «локус -количество повторов (размер в н.о.)»: Y3298 - 8(151 и.о.), Y3701 - 4(243 и.о.), Y3336 - 11(391 и.о.), Y3515 - 8(527 и.о.), Y4964 - 7(654 и.о.), Y4577 - 7(101 и.о.), Y3885 - 2(200 и.о.), Y4892 - 11(348 и.о.), Y0920 - 8(574 и.о.), Y4935 - 3(209 и.о.), Y5160 - 4(325 и.о.), Y3777 - 1(379 и.о.), Y3653 - 6(477 и.о.). Сравнение полученного генотипа с 30 полногеномными сиксенсами Y. pestis, находящимися в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), свидетельствует об его уникальности (чертеж).

Пример 2. Определение генетического «паспорта» штамма Y. pseudotuberculosis.

Из двухсуточной агаровой культуры исследуемого штамма, выращенного при 28°С, стандартным метод выделена ДНК, проведена мультиплексная ПЦР с 13 парами праймеров. Размеры фрагментов определены после проведения гель-электрофореза на автоматическом ДНК-анализаторе, используя прилагаемое программное обеспечение. В результате получен следующий генетический аллельный паспорт штамма: Y3298 - 10(165 и.о.), Y3701 - 5(249 и.о.), Y3336 - 2(337 и.о.), Y3515 - 6(515 и.о.), Y4964 - 9(668 и.о.), Y4577 - 8(106 н.о), Y3885 - 3(205 и.о.), Y4892 - 14(369 и.о.), Y0920 - 7(567 и.о.), Y4935 - 4(212 и.о.), Y5160 - 3(320 и.о.), Y3777 - 2(385 и.о.), Y3653 - 9(489 и.о.). Сравнение полученных аллельных вариантов с 30 полногеномными сиксенсами Y. pestis, находящимися в базе данных GenBank, показало, что данные аллельные варианты локусов Y3298, Y3336, Y3885 и Y0920 являются уникальными для Y. pseudotuberculosis.

Предлагаемый способ отличается высокой чувствительностью и специфичностью, высокой точностью, обладает высоким дискриминирующим потенциалом и является более экономичным. Таким образом, вместо трудоемкого и дорогостоящего анализа генома исследуемого штамма Y. pestis и Y. pseudotuberculosis индивидуально по каждому из множества VNTR-локусов для установления генотипа изучаемого штамма достаточно провести одну мультиплексную ПЦР с 13-ю парами праймеров, комплементарным полиморфным локусам, и последующей детекцией результата за один гель-электрофорез на автоматическом капиллярном ДНК-анализаторе.

Заявляемый способ предназначен: для выявления генотипов по VNTR локусам хромосом штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis в образцах ДНК, полученных из чистой культуры микроорганизма для генетической идентификации штаммов в лабораториях молекулярной диагностики инфекционных заболеваний; для установления эволюционных связей между штаммами в пределах одной популяции, для получения дополнительной информации при эпидемиологическом расследовании с применением молекулярно-генетических методов анализа; для научных исследований в области популяционной генетики видов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и изучении межвидовых отношений рода Yersinia.

Список литературы

1. Achtman М., Zurth К., Morelli G., Guiyoule A., Carniel E. 1999. Yersinia pestis, the cause of plague, is recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis // Proc. U.S. Natl. Acad. Sci. Vol. 96, No. 24. P. 14043-14048.

2. Бондарева O.C., Савченко С.С., Ткаченко Г.А., Абуева А.И., Муратова Ю.О., Антонов В.А. Современные подходы к генотипированию возбудителей особо опасных инфекций. // Эпидемиология и инфекционные болезни, №1, 2014. С. 34-44.

3. Klevytska A.M., Price L.B., Schupp J.M., et al. Identification and characterization of variable-number tandem repeats in the Yersinia pestis genome. // J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 3179-3185.

4. Le Fleche P., Hauck Y., Onteniente L., et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis. // BMC Microbiol. 2001; 1/2. 1471-2180.

5. Li Y., Cui Y., Cui В., et al. Features of Variable Number of Tandem Repeats in Yersinia pestis and the Development of a Hierarchical Genotyping Scheme. // PLoS ONE 2013: 8 (6) e66567.

6. Яшечкин Ю.И. «Программа поиска VNTR локусов геномов микроорганизмов и расчета олигонуклеотидных праймеров для их выявления в ПЦР и формирование базы данных» Свидетельство о Госрегистрации №2012613395 от 10.04.2012.

7. Яшечкин Ю.И. «Программа расчета согласованных по термодинамическим параметрам олигонуклеотидных праймеров для мультиплексной ПЦР и формирования базы данных» Свидетельство о Госрегистрации №2010612350 от 31.03.2010.

8. Яшечкин Ю.И., Найденова Е.В., Бугоркова Т.В., Щербакова С.А. База данных «Нуклеотидные последовательности и характеристики геномов, вариабельных тандемных повторов, олигонуклеотидных праймеров и зондов штаммов возбудителей бактериальных и вирусных инфекций I-II групп патогенности» Свидетельство о Госрегистрации №2011620585 от 19.08.2011.

9. Pourcel С.,

F., Neubauer Н., еt al. Tandem repeats analysis for the high resolution phylogenetic analysis of Yersinia pestis. // BMC Microbiol. 2004, 4: 22

10. Яшечкин Ю.И. «Программа для интерпретации результатов мини-сателлитного анализа геномов бактерий и формирования базы данных» Свидетельство о Госрегистрации №2015611565 от 30.01.2015.

Claims (1)

1. Способ генетического типирования штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis методом VNTR анализа, включающий выделение ДНК, постановку мультиплексной ПЦР и последующий фрагментный анализ флуоресцентно-меченных ДНК-ампликонов на генетическом анализаторе с помощью капиллярного гель-электрофореза, отличающийся тем, что постановку мультиплексной ПЦР осуществляют одновременно в одной реакции с набором из 13 пар флуоресцентно-меченных праймеров SEQ ID NO: 1-13, комплементарных участкам VNTR локусов хромосомы Y. pestis и Yersinia pseudotuberculosis: Y3298, Y3515, Y3701, Y3777, Y3885, Y4935, Y3336, Y4964, Y0920, Y4577, Y4892, Y3653, Y5160; генетический портрет штаммов получают после проведения фрагментного анализа, путем определения количества повторов в каждом локусе.

Images