CN101457258A - 一种血吸虫感染性钉螺检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种血吸虫感染性钉螺检测试剂盒及其检测方法，属于寄生虫病传播媒介检测领域。本发明提供一种基于环介导等温DNA扩增技术(LAMP)检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒和检测方法，该试剂盒是根据LAMP技术原理，设计扩增日本血吸虫非长未端重复反转录转座子基因(AF412214)的第20bp至231bp之间的DNA片段的6对特异性引物，构建用于检测感染性钉螺体内血吸虫基因的LAMP方法，达到区别血吸虫感染性钉螺和非常感染性钉螺之目的。该方法与常规的血吸虫感染性钉螺检测方法相比，具有操作简便快速、敏感特异、不需要特殊的设备等特点，适合于血吸虫病现场防治人员使用。

Description

一种血吸虫感染性钉螺检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于环介导等温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒及检测方法，属于一寄生虫病传播媒介检测领域。

背景技术

钉螺是血吸虫的唯一中间宿主，是血吸虫病的唯一的传播媒介。消灭血吸虫感染性钉螺可以阻断血吸虫病的传播与流行。对血吸虫感染性钉螺的分布进行调查，有选择性地进行化学灭螺是提高血吸虫病传播阻断效果，最大限度地保护生态平衡的一个重要手段。检测血吸虫感染性钉螺的方法有多种：

肉眼观察法

在自然光线下或人工灯光照射下，通过观察钉螺的第4螺层以下的螺壳的顔色与透光度的变化，以及钉螺肝组织与螺壳之间有无间隙来判断钉螺是否感染血吸虫。这个方法虽然简便易行，但误差大，准确性只有60％左右，漏检率高，不能鉴定血吸虫感染早期的钉螺。

压片镜检法

将钉螺外壳压碎，使钉螺软组织暴露出来，显微镜下通过观察钉螺组织中是否有血吸虫母胞蚴或尾蚴来判断钉螺是否感染了血吸虫。该方法对血吸虫感染晚期，尤其是对体内有发育成熟的血吸虫尾蚴存在的感染性钉螺检测的准确性很高，但对于处于血吸虫感染早期阶段钉螺仍不能检出，检测过程需要使用显微镜，不便于血吸虫病防治现场使用。

孵化法

将钉螺置于盛有清水的试管或其它玻璃容器中，室温下(22-25℃)孵育2-3小时，观察钉螺体内是否有血吸虫尾蚴孵出，以判断是否是血吸虫感染性钉螺。该方法同样操作简便，对血吸虫感染晚期的感染性钉螺检测出率高，但同样不能检出血吸虫感染早期的钉螺。

循环抗原检测法

先制备抗血吸虫循环抗原的特异性单克隆抗体，再构建检测血吸虫循环抗原的酶联免疫吸附法(ELISA)，以此方法来检测血吸虫感染性钉螺。该方法的优点是鉴定血吸虫感染性钉螺有很高的敏感性与特异性，但操作烦琐，技术、设备要求高，不适合于血吸虫病防治现场使用。

聚合酶链反应法

设计血吸虫基因特异性引物，通过对钉螺组织的DNA样本进行聚合酶链反应(PCR)扩增，观察钉螺DNA样本中是否存在血吸虫特异性DNA片段存在。该方法检测血吸虫感染性钉螺具有高度的敏感性与特异性，但是需要使用PCR仪，DNA电泳仪等昂贵设备，耗时长，成本高，难于在血吸虫病防治现场使用。

环介导等温DNA扩增法

选择血吸虫基因中的特异性DNA片段，根据环介导同温DNA扩增原理，设计4对或6对特异性引物，在同一个温度下对样本中的血吸虫特异性DNA片段进行扩增，通过肉眼观察扩增产物顔色的变化来判断样本中是否存在血吸虫特异性DNA片段，具有高度的特异性和敏感性，检测时间短，操作简便，能检测血吸虫感染早期的感染性钉螺，适合于血吸虫病现场防治人员对血吸虫感染性钉螺进行鉴定和用于大规模的分布调查。

发明内容

本发明的目的是提供一种环介导等温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒及检测方法，可以解决以往的血吸虫感染性钉螺检测方法敏感性不足、或需要复杂仪器设备等缺点，可用于血吸虫病流行区有螺地带血吸虫感染性钉螺的鉴定与分布调查。

为达到上述目的，本发明选择日本血吸虫基因非长未端重复反转录转座子基因(AF412214，SEQ ID NO.1)的第20bp至231bp之间的DNA片段(SEQID NO.6)作为环介导等温DNA扩增的靶DNA片段，根据环介等温DNA扩增的原理设计一组环介导等温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺的引物。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：构建一种环介导等温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，该试剂盒由一套引物混合物，10倍浓缩的环介导等温DNA扩增反应缓冲液，DNA聚合酶，阳性对照样本，阴性对照样本，显色试剂和样本DNA抽提试剂组成；

所述的一套引物混合物是由一对外引物和一对内引物组成，其名称和序列如下：

外引物1：SEQ ID NO.2，

外引物2：SEQ ID NO.3，

内引物1：SEQ ID NO.4，

内引物2：SEQ ID NO.5，

所述的一对外引物与一对内引物之间的摩尔数比例为1∶6～9；

所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为8U/μL；

所述10倍浓缩的环介导等温DNA扩增反应缓冲液组成是：200mmol三羟甲基氨基甲烷、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、60-120mmol/L硫酸镁、体积百分1％曲拉通-X100、4～10mol/L甜菜碱和116mmol/L的dNTP；

所述阳性对照样本为含本发明试剂盒检测的日本血吸虫靶DNA片段的重组质粒；

所述的阴性对照样本为灭菌去离子水；

所述的显色试剂为10倍浓缩的荧光试剂SYBR Green I溶液；

所述的样本DNA抽提试剂包括：含50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、体积百分0.5％Tween-20、pH8.0的样本裂解液；10mg/mL蛋白酶K；用0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液平衡到pH8.0的苯酚；氯仿；8mol/L醋酸胺；无水乙醇；70％乙醇；灭菌去离子水。

一套引物混合物为一对外引物与一对内引物，外引物与内引物之间的摩尔数比例为1:8；

所述的一套引物混合物的组成是：外引物1、2μmol；外引物2、2μmol；内引物1、16μmol；内引物2、16μmol。

10倍浓缩的环介导等温DNA扩增反应缓冲液组成，其中硫酸镁的优选浓度为80mmol，甜菜碱的优选浓度为8mol。

试剂盒中阳性对照样本为日本血吸虫基因组DNA的PCR扩增产物与TA克隆质粒pGEM-T连结构建的重组质粒，其中含血吸虫的SEQ ID NO.6基因序列；

制备的方法：以所述外引物对日本血吸虫基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物与TA克隆质粒pGEM-T连结构建的重组质粒，转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒DNA，经DNA测序确定含靶DNA片段；紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度后再用TE缓冲液稀释到10ng/μL，即为阳性对照样本；

TE缓冲液为pH值8.0、含200mmol/L三羟甲基氨基甲烷和1mmol/L四氨基二乙酸。

基于环介导等温DNA扩增LAMP的血吸虫感染性钉螺的检测方法，通过使用一套特异性引物，利用LAMP技术扩增血吸虫特定DNA片段区域，观察判断钉螺是否感染了血吸虫；

所用的一套特异性引物序列是SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5；

利用LAMP技术扩增血吸虫特异性DNA片段区域，该特定区域是日本血吸虫基因非长未端重复反转录转座子基因AF412214的第20bp至231bp之间长度为212bp的DNA片段；

(1)、钉螺样本DNA的提取：将钉螺外壳压破，剪取约3mm³的钉螺肝组织，置于一个无菌的玻璃匀浆器中，加入0.5mL样本裂解液，手工匀浆，破碎组织；将匀浆液转移到一无菌的1.5mL塑料离心管中，加入蛋白酶K溶液10μL，混匀，55℃水浴保温1小时；10,000rpm离心10min，将上清液转移到一新的1.5mL塑料离心管中；加入2倍体积苯酚，颠倒混匀200次，再以10,000rpm离心10min，将上清液转移到另一的1.5mL塑料离心管中；加入2倍体积氯仿颠倒混匀200次，再以10,000rpm离心10min，将上清液转移到另一的1.5mL塑料离心管中；加入0.1体积8mmol/L醋酸胺，混匀，加入2倍体积无水乙醇，混匀，以10,000rpm离心10min，去掉上清液，沉淀物用70％乙醇洗涤2次；在室温下干燥沉淀物，再加入20μL无菌去离子水溶解沉淀的DNA；

(2)、环介导等温DNA扩增：取3个0.2mL PCR用薄壁管，分别标记为阳性对照管，检测管，阴性对照管；各管中加入如下成分：10倍LAMP缓冲液2.5μL，2mmol dNTP 8μL，引物混合物2.5μL；阳性对照管加入阳性对照样本DNA 1μL；检测管中加入待检样本DNA 1μL；阴性对照管中加入去离子水1μL；最后各管中加入去离子水10μL；混匀，100℃水浴煮沸5min，立即至冰上冷却，加入1μL8U的Bst DNA聚合酶，混匀，短暂离心后置60℃水浴箱保温60min；然后转移到80℃水浴保温5min；

(3)、结果判断：选用如下两种观察方法之一，观察判断钉螺是否感染了血吸虫；

方法1)：将含1μg/ml溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入pH8.0、含0.04mol/L三羟甲基氨基甲烷和1mmol/L四胺基二乙酸的电泳缓冲液，使凝胶浸于液面下3-5mm，取5μL扩增产物与2μL的含0.25％溴酚兰、质量浓度40％蔗糖水溶液的凝胶载样缓冲液混合，加入凝胶孔中，以1-5V/cm的电压进行电泳，使样本向阴极移动，当溴酚蓝移到凝胶的三分之二处时停止电泳，将凝胶放在紫外灯上，观察扩增产物中有无梯形DNA条带出现，有梯形DNA条带出现，样本为阳性；无梯形DNA条带出现，样本为阴性；

方法2)：在反应管中加入2μL 10倍浓缩的荧光试剂SYBR Green I，混匀，在自然光下观察反应物是否出现绿色荧光，有绿色荧光出现，样本为阳性；无绿色荧光出现，样本为阴性。

本发明的有益效果：本发明构建了用于检测感染性钉螺体内血吸虫基因的LAMP方法，达到区别血吸虫感染性钉螺和非常感染性钉螺之目的。该方法与常规的血吸虫感染性钉螺检测方法相比，具有操作简便快速、敏感特异、不需要特殊的设备等特点，适合于血吸虫病现场防治人员使用。

附图说明

图1：M、50bp DNA低分子标志物，1、LAMP扩增产物，2、阴性对照。

图2：1、LAMP扩增产物，2、阴性对照。

图3：M、100bp DNA低分子标志物，1～10、DNA模板量分别为10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，阴性对照。

图4：1～10、DNA模板量分别为10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，阴性对照。

图5：M、100bp DNA低分子标志物；1、日本血吸虫基因组DNA；2、华支睾吸虫基因组DNA；3、恶性疟原虫基因组DNA；4、大肠杆菌基因组DNA。

图6：1、日本血吸虫基因组DNA；2、华支睾吸虫基因组DNA；3、恶性疟原虫基因组DNA；4、大肠杆菌基因组DNA；5、无离子水对照。

具体实施方式

实施例1：灵敏性研究

1)标准靶DNA分子模板的制备

取纯化的阳性对照样本DNA，用TE缓冲液进行稀释10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg。

2)、环介导等温DNA扩增与结果判断

取一0.2mL PCR用薄壁管10个，按顺序编号，分别加入如下成分：10倍LAMP缓冲液2.5μL；dNTP(2mM)8μL；10倍引物混合物2.5μL；1～9管加入不同浓度的DNA样本1μL，第10号管为阴性对照加入1μL去离子水；各管再加入去离子水10μL。混匀，100℃水浴煮沸5min，立即至冰上，加入1μL(8U)Bst DNA聚合酶，混匀，短暂离心后置60℃水浴箱保温60min；然后转移到80℃水浴保温5min。将扩增产物取5μL与2μL的含0.25％溴酚兰、质量浓度40％蔗糖水溶液的凝胶载样缓冲液混合，加入凝胶孔中。以1-5V/cm的电压进行电泳，电泳结束将凝胶放在紫外灯上进行观察，1～8管均有梯形DNA条带出现，荧光强度逐渐减弱，第9、10管没有条带出现为阴性。如附图3所示。

在反应管中加入2μL 10倍浓缩的荧光试剂SYBR Green I，混匀，在自然光下观察1～8管均有出现绿色荧光，第9、10管没有发生顔色改变。附图4。

说明该方法的敏感性为1fg/μL DNA。

实施例2：特异性研究

分别取血吸虫基因组DNA、肝吸虫基因组DNA，疟原虫基因组DNA，大肠杆菌基因组DNA，用本发明试剂盒进行扩增，同时以灭菌去离子水做阴性对照。只有血吸虫基因组出现阳性反应，其余样本均为阴性反应。附图5，6。

实施例3：现场钉螺样本检测

在血吸虫病流行区现场收集钉螺1000只。提取基因组DNA。用本发明的试剂盒进行检测，同时以常规PCR方法检测进行对照。结果，1000只钉螺用本发明的环介导同温DNA扩增试剂盒检测有56只钉螺为阳性，阳性率为5.6％，而用PCR方法检测，有52个钉螺为阳性，阳性率为5.2％，显示环介导等温DNA扩增方法的敏感性比常规PCR方法的灵敏性高，操作更加简单。

序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>4120

<212>DNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>1

<210>SEQ ID NO.2：

<211>19

<212>DNA

<400>2

<210>SEQ ID NO.3：

<211>18

<212>DNA

<400>3

<210>SEQ ID NO.4：

<211>42

<212>DNA

<400>4

<210>SEQ ID NO.5：

<211>39

<212>DNA

<400>5

<210>SEQ ID NO.6：

<211>212

<212>DNA

<400>6

Claims (5)

1、一种血吸虫感染性钉螺检测试剂盒，其特征是该试剂盒由一套引物混合物，10倍浓缩的环介导等温DNA扩增反应缓冲液，DNA聚合酶，阳性对照样本，阴性对照样本，显色试剂和样本DNA抽提试剂组成；

所述的一套引物混合物是由一对外引物和一对内引物组成，其名称和序列如下：

外引物1：SEQ ID NO.2，

外引物2：SEQ ID NO.3，

内引物1：SEQ ID NO.4，

内引物2：SEQ ID NO.5，

所述的一对外引物与一对内引物之间的摩尔数比例为1:6～9；

所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为8U/μL；

所述10倍浓缩的环介导等温DNA扩增反应缓冲液组成是：200mmol三羟甲基氨基甲烷、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、60-120mmol/L硫酸镁、体积百分1％曲拉通-X100、4～10mol/L甜菜碱和16mmol/L的dNTP；

所述阳性对照样本为含本发明试剂盒检测的日本血吸虫靶DNA片段的重组质粒；

所述的阴性对照样本为灭菌去离子水；

所述的显色试剂为10倍浓缩的荧光试剂SYBR Green I溶液；

所述的样本DNA抽提试剂包括：含50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、体积百分0.5％Tween-20、pH8.0的样本裂解液；10mg/mL蛋白酶K；用0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液平衡到pH8.0的苯酚；氯仿；8mol/L醋酸胺；无水乙醇；70％乙醇；灭菌去离子水。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是一套引物混合物为一对外引物与一对内引物，外引物与内引物之间的摩尔数比例为1:8；

所述的一套引物混合物的组成是：外引物1、2μmol；外引物2、2μmol；内引物1、16μmol；内引物2、16μmol。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是10倍浓缩的环介导等温DNA扩增反应缓冲液组成，其中硫酸镁的优选浓度为80mmol，甜菜碱的优选浓度为8mol。

4、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是试剂盒中阳性对照样本为日本血吸虫基因组DNA的PCR扩增产物与TA克隆质粒pGEM-T连结构建的重组质粒，其中含血吸虫的SEQ ID NO.6基因序列；

制备的方法：以所述外引物对日本血吸虫基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物与TA克隆质粒pGEM-T连结构建的重组质粒，转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒DNA，经DNA测序确定含靶DNA片段；紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度后再用TE缓冲液稀释到10ng/μL，即为阳性对照样本；

TE缓冲液为pH值8.0、含200mmol/L三羟甲基氨基甲烷和1mmol/L四氨基二乙酸。

5、一种基于环介导等温DNA扩增LAMP的血吸虫感染性钉螺的检测方法，其特征是通过使用一套特异性引物，利用LAMP技术扩增血吸虫特定DNA片段区域，观察判断钉螺是否感染了血吸虫；

所用的一套特异性引物序列是SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5；

利用LAMP技术扩增血吸虫特异性DNA片段区域，该特定区域是日本血吸虫基因非长未端重复反转录转座子基因AF412214的第20bp至231bp之间长度为212bp的DNA片段；

(1)、钉螺样本DNA的提取：将钉螺外壳压破，剪取约3mm³的钉螺肝组织，置于一个无菌的玻璃匀浆器中，加入0.5mL样本裂解液，手工匀浆，破碎组织；将匀浆液转移到一无菌的1.5mL塑料离心管中，加入蛋白酶K溶液10μL，混匀，55℃水浴保温1小时；10,000rpm离心10min，将上清液转移到一新的1.5mL塑料离心管中；加入2倍体积苯酚，颠倒混匀200次，再以10,000rpm离心10min，将上清液转移到另一的1.5mL塑料离心管中；加入2倍体积氯仿颠倒混匀200次，再以10,000rpm离心10min，将上清液转移到另一的1.5mL塑料离心管中；加入0.1体积8mmol/L醋酸胺，混匀，加入2倍体积无水乙醇，混匀，以10,000rpm离心10min，去掉上清液，沉淀物用70％乙醇洗涤2次；在室温下干燥沉淀物，再加入20μL无菌去离子水溶解沉淀的DNA；

(2)、环介导等温DNA扩增：取3个0.2mLPCR用薄壁管，分别标记为阳性对照管，检测管，阴性对照管；各管中加入如下成分：10倍LAMP缓冲液2.5μL，2mmol dNTP 8μL，引物混合物2.5μL；阳性对照管加入阳性对照样本DNA1μL；检测管中加入待检样本DNA1μL；阴性对照管中加入去离子水1μL；最后各管中加入去离子水10μL；混匀，100℃水浴煮沸5min，立即至冰上冷却，加入1μL8U的Bst DNA聚合酶，混匀，短暂离心后置60℃水浴箱保温60min；然后转移到80℃水浴保温5min；

(3)、结果判断：选用如下两种观察方法之一，观察判断钉螺是否感染了血吸虫；

方法1)：将含1μg/ml溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入pH8.0、含0.04mol/L三羟甲基氨基甲烷和1mmol/L四胺基二乙酸的电泳缓冲液，使凝胶浸于液面下3-5mm，取5μL扩增产物与2μL的含0.25％溴酚兰、质量浓度40％蔗糖水溶液的凝胶载样缓冲液混合，加入凝胶孔中，以1-5V/cm的电压进行电泳，使样本向阴极移动，当溴酚蓝移到凝胶的三分之二处时停止电泳，将凝胶放在紫外灯上，观察扩增产物中有无梯形DNA条带出现，有梯形DNA条带出现，样本为阳性；无梯形DNA条带出现，样本为阴性；

方法2)：在反应管中加入2μL 10倍浓缩的荧光试剂SYBR Green I，混匀，在自然光下观察反应物是否出现绿色荧光，有绿色荧光出现，样本为阳性；无绿色荧光出现，样本为阴性。

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