CN109870580A - 血清蛋白标志物组在制备鉴别血吸虫病检测试剂盒中的应用及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种异戊烯半胱氨酸氧化酶和载脂蛋白的血清蛋白标志物组在制备鉴别经典型晚期血吸虫病和新发展晚期血吸虫病检测试剂盒中的应用，采用iTRAQ结合MRM技术，对经典型晚血病人、新发展晚血病人和正常人血清中的血清蛋白进行识别与验证，经典型晚血人群中，异戊烯半胱氨酸氧化酶表达量是新发晚血组的2~3倍；新发展晚血人群中，载脂蛋白表达量是经典晚血组的2倍。本发明还公开了一种用于鉴别经典型晚期血吸虫病和新发展晚期血吸虫病的检测试剂盒，包括异戊烯半胱氨酸氧化酶多克隆抗体、载脂蛋白的多克隆抗体、上样缓冲液和ELISA 96孔板。本发明的试剂盒能够准确的鉴别经典型和新发展晚期血吸虫病，具有极大的市场前景。

Description

血清蛋白标志物组在制备鉴别血吸虫病检测试剂盒中的应用 及检测试剂盒

技术领域

本发明属于晚期日本血吸虫病诊断蛋白标志物领域，具体涉及一种血清蛋白标志物组在制备鉴别经典型晚期血吸虫病和新发展晚期血吸虫病检测试剂盒中的应用及检测试剂盒。

背景技术

晚期血吸虫病（简称晚血）是由于反复或大量感染日本血吸虫尾蚴，治疗不及时，经过较长时期的病理发展过程而形成，是血吸虫病的终末形式，对患者生理健康构成严重威胁，甚至危及生命。随着血吸虫病综合防治措施的不断实施，尤其是晚血病人治疗救助项目的开展，使得患者的病情得到了较好的控制。但有资料显示，在已达到传播阻断标准较长时间的地区仍出现新的晚血病人（2013年，该现象由血吸虫病专家组会议定名为新发展晚期血吸虫病），但其与传统的晚血发生发展机理有何异同，需要进一步研究。在血吸虫病逐渐消除的进程中，对经典晚期血吸虫病人与新发展晚血病人进行鉴别，对考察地方血吸虫病防治工作具有重要意义，可以更好指导现场预防控制工作，故对两者区别诊断迫在眉睫。

毫无疑问，疾病生物标志物研究，特别是对体液标志物的研究，一直是生物医学研究领域比较热门的话题。近年来，血清标志物研究已经被广泛报道，作为一种新的血清生物标志物研究手段，蛋白质组学已经成为人们研究基因表达产物、蛋白质与感染性疾病发生发展关系的重要方法，并且已经应用于对细胞系、动物模型和患者组织、血清和体液中蛋白的分析，以识别寄生虫入侵、虫与宿主互作性的相关蛋白等方面的变化，从而揭示日本血吸虫病及其侵袭肝脏导致纤维化的发病机制，鉴定新的标志物或者药物靶点，探索炎症在疾病发生过程中的作用，为日本血吸虫病的诊治提供新思路。

现代生物标志物的研发一般分为三个阶段：发现阶段，验证阶段和确认阶段。在发现阶段，蛋白质组学的技术方法已经在生物标志物的发现和检测中获得广泛应用。目前较主流的一种基于串联质谱方法的蛋白质定量技术-iTRAQ (isobaric tag for relativeand absolute quantitation)，该技术通过对蛋白质酶解后肽段进行标记，利用串联质谱方法，可以对肽段进行精确鉴定和定量。iTRAQ技术较以往传统的双向电泳技术具有更明显的优势。iTRAQ技术可以涉及不同生命领域，并可同时对多达8种样品进行分析，且应用范围非常广，比如，iTRAQ技术在识别子宫内膜癌、肝细胞癌、乳腺癌等癌症细胞蛋白表达差异上也具有很好的效果。为了更加清楚的阐明胃癌的抗药分子机制，Hu等将iTRAQ技术带入了胃癌抗药性机制的研究中，并以抗长春新碱的SGC7901/VCR细胞系和其亲本细胞系SGC7901为研究对象，通过iTRAQ结合LC-MS/MS技术进行分析，发现了91种蛋白在SGC7901/VCR和SGC790中差异表达；随后使用Western印迹技术进一步对这些表达上存在差异的蛋白进行了功能验证，最终证实SGC7901/VCR中的MVP蛋白和抗药性有关。这一突破性发现，也进一步为iTRAQ技术在肿瘤中的广泛应用奠定了基础。目前，在血清iTRAQ的研究中大多数都采用等量蛋白混合和等量上样，也有一些研究者采用相同的体积上样。血清样品总量的差异主要是由于高丰度蛋白的存在。利用Proteinminer试剂盒去除血清中高丰度蛋白，减少了大部分高丰度蛋白的干扰，低丰度蛋白浓度也相应地有所提高，血清标本之间的差异也随之加大。在临床工作中血清中的蛋白质含量通常以单位体积为标准衡量。因此，以相同的体积混合和上样可能更为合理。然而，尽管血清在蛋白质组学中得到了广泛的应用，但利用血清中检测出来的很多蛋白质都没有临床验证，相对于蛋白质组学的应用前景来说，血清的研究还远远不够，因此，只有开发并应用更先进的蛋白质分离和鉴定技术，蛋白质组学才会有更美好的未来。

在验证阶段采用质谱多反应监测 (multiple reaction monitoring，MRM) 对所筛得的差异蛋白进行进一步验证。蛋白质组学的研究对象是一个在时间和空间上动态变化的整体，具有极端的复杂性。随着蛋自质组学研究的深入和发展，尤其是差异蛋白质组学研究的进展，大量功能蛋白质和潜在疾病蛋白质标志物被发现并被鉴定，如何进一步探测这些蛋白质的表达丰度，以阐明其功能和在疾病研究中的意义，已变得越来越重要。仅仅依赖蛋白质大规模分离、鉴定的技术路线（双向凝胶电泳技术分离蛋白质，质谱技术鉴定蛋白质）已经不能满足这些研究的需求，因而迫切需要更高灵敏度和更高选择性的研究方法。MRM技术是基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式。作为一种高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，MRM技术逐步受到生物标志物研究者们关注，成为定量蛋白质组学研究中的重要技术。例如，在Whiteaker等的研究中，以小鼠为模型研究乳腺癌的生物标志物；用液相色谱串连质谱（LC-MS/MS）对肿瘤和正常乳房组织的蛋白质进行检测，筛查出700个以上差异蛋白质；再联合抗体和MRM技术最后鉴定了fubulin-2作为血浆中的生物标志物。实验结果进一步验证了MRM技术验证生物标志物的方法，在发现新型生物标志物研究中的可行性。Anderson等用MRM技术定量分析了人体血浆中53种高、中丰度蛋白质，其中47个数据同批变异系数为2％～22％，显示了定量的良好精密度，分析结果的动态范围达到4.5个数量级。Lin等用MRM定量测定了人体血浆中中等丰度蛋白质的实际浓度，测定结果表明其浓度范围达到了3～700nmol/L，12次反复测量变异系数(CV) 值小于25％。对于血浆中的低丰度蛋白质，Keshishian等也采用MRM和同位素稀释的方法进行了定量分析，在未进行蛋白质或多肽亲和富集的条件下，去除血浆6种高丰度蛋白质后，低丰度蛋白质的检测限在1～10mg/L，CV值在3％～15％，与质谱直接检测血浆蛋白的方法相比，分析性能改善了1000倍。Narumi等利用iTRAQ技术对人乳腺癌组织样本进行了大规模的磷酸化定量蛋白质组学分析，发现了133个差异磷酸化肽段，并利用MRM技术对其中的15个磷酸化肽段进行了进一步的定量验证，确认其定量结果的可信性。Ann等研究了早期多发性硬化症病人的脑脊液，通过iTRAQ技术对病人及正常人的脑脊液进行了定量分析，在鉴定到的1200个蛋白质中有5个蛋白质具有显著差异，结合文献报道，最终实现了在132个疾病组及正常人中11个蛋白质的MRM定量验证。实验结果显示了这种MRM技术进行绝对定量的高精密度，以及用于分析复杂样本的高动态范围。现如今，iTRAQ和MRM蛋白质组学的结合被认为是对识别和验证候选蛋白生物标记的一个非常强大的工具。

针对目前晚期血吸虫病的防治现状，在已达到传播阻断标准较长时间的地区仍出现新的晚血病人，该类病人的晚血症状与经典晚血一致，但是该类病人的晚血与血吸虫感染已无关，这就给血吸虫病的防治工作带来了一个问题，即人群筛查的新的“晚血”病人，究竟是属于经典的晚血还是新发展晚血。许多病人可能由于检测手段受到限制而未能明确，都被归为晚期血吸虫病，这样不仅容易耽误最佳治疗时间，也容易造成治疗方案的失当。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种鉴别传统经典型晚血和新发展晚期血吸虫病的血清标志物及检测试剂盒。

技术方案：本发明公开了一种血清蛋白标志物组在制备鉴别经典型晚期血吸虫病和新发展晚期血吸虫病检测试剂盒中的应用，所述血清蛋白标志物组为：异戊烯半胱氨酸氧化酶，其序列号为Q9UHG3；和载脂蛋白，其序列号为C9JF17，适用于经典型和新发展晚期血吸虫病血清辅助检测，发病机制研究和药物开发。

本发明采用iTRAQ结合MRM技术，对经典型晚血病人、新发展晚血病人和正常人血清中的血清蛋白进行识别与验证，实现了对异戊烯半胱氨酸氧化酶和载脂蛋白的验证，依此基础，提供鉴别经典晚血和新发晚血的检测试剂盒。

本发明中，经典型晚期血吸虫病人群中，异戊烯半胱氨酸氧化酶表达量是新发晚血组的2~3倍；新发展晚期血吸虫病人群中，载脂蛋白表达量是经典晚血组的2倍，以此可以鉴别经典型和新发展晚期血吸虫病。

本发明还公开了一种用于鉴别经典型晚期血吸虫病和新发展晚期血吸虫病的检测试剂盒，所述试剂盒包括异戊烯半胱氨酸氧化酶多克隆抗体和载脂蛋白的多克隆抗体。

具体而言，所述检测试剂盒还包含上样缓冲液和ELISA 96孔板。

所述抗体可通过商业途径获得，也可通过常规抗体制备方法获得，还可通过表达和纯化血清中标志物蛋白，用其免疫动物以获得免疫血清，再用常规方法纯化血清中的抗体而获得。

根据本发明的血清蛋白标志物组制备鉴别经典型晚期血吸虫病和新发展晚期血吸虫病的检测试剂盒的方法是：首先设计并合成异戊烯半胱氨酸氧化酶和载脂蛋白的氨基酸序列，用其免疫家兔以获得免疫血清，然后检测兔血清中的抗体效价，采用常规方法纯化抗体；加入磷酸盐缓冲液，制得检测试剂盒。

有益效果：本发明提供了一种鉴别经典型和新发展晚期血吸虫病的血清蛋白标志物组，同时加入了各种患病血清的平行比较，在扩大经典型和新发展晚期血吸虫病血样本收集基础上，同时加入了健康人血清样本，采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学结合MRM技术，结果更为可靠，可为临床应用提供有价值的信息。利用本发明的血清蛋白质标志物组制备得到的检测试剂盒能够准确的鉴别经典型和新发展晚期血吸虫病，具有极大的市场前景。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例1：iTRAQ技术检测经典型和新发展晚期血吸虫病患者与健康对照差异表达蛋白

1、检测样本

来自于昆山、常熟等晚血病人血清、新发晚血病人血清、健康人群血清各20例。清晨空腹采集2mL全血，4℃静置1~2h待血液凝固析出血清，3000g离心10min，收集上清液，冰上分装后存至-80℃备用。

2、检测方法

（1）使用Proteominer试剂盒去除血清中的高丰度蛋白：向富集好的蛋白样品加入终浓度10mM的DTT，56℃水浴1h；冷却至室温后，加入终浓度55mM的IAM，暗室放置45min；加1mL冷丙酮沉淀过夜，25000rpm 4℃离心15min弃上清液；简单风干沉淀残余丙酮，加适量LysisBuffer 3，冰浴超声5min，25000rpm 4℃离心15min取上清液，定量，电泳。Bradford法定量，用酶标仪测量OD595，依据OD595与蛋白浓度制作线性标准曲线。稀释待测蛋白质溶液若干倍，在20μl蛋白溶液中加入180μl定量工作液，读取OD595。依据标准曲线以及样品OD595计算样品蛋白浓度。

（2）蛋白酶解：取200μg蛋白溶液（已烷基化处理）加入到10KDa的超滤管中，20℃12000rpm离心20min，直至蛋白液全部离心至收集管底部，去底部溶液，超滤管中再加入0.5M TEAB 100μl，同上离心操作。重复此步骤3次，更换新的收集管。在超滤管中加入50μl0.5M的TEAB，按照蛋白：酶＝40:1的比例加入Trypsin酶，使用Parafilm（封口膜）将超滤管与管盖密封，放置于震荡仪上37℃反应过夜；12000rpm离心15min后，再加入100μl 0.5M的TEAB，12000rpm离心20min，收集管中溶液即酶解后肽段溶液。转出收集管底部的酶解消化液于1.5ml离心管中，冷冻抽干。

（3）肽段标记：取出一定量iTRAQ标签试剂，待试剂恢复至室温后，每管试剂加入50μl异丙醇，涡旋震荡后低速离心，用0.5M TEAB溶解肽段样品，并加入到对应iTRAQ标签试剂中，iTRAQ试剂113、118标记为病例组，119、121标记健康对照组，室温静止2小时。

（4）采用岛津LC-20AB液相系统，分离柱为5um 4.6×250mm Gemini C₁₈柱对样品进行液相分离。用2mL流动相A（5％ACN pH9.8）复溶抽干的肽段样品并进样，以1mL/min的流速梯度洗脱：5％流动相B（95％CAN，pH9.8）10min，5％至35％流动相B 40min，35％至95％流动相B 1min，流动相B持续3min，5％流动相B平衡10min。在214nm波长下检测洗脱峰并每分钟收集一个组分，结合色谱洗脱峰图合并样品得到10个组分，然后冷冻抽干。

（5）经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive

（Thermo Fisher Scientific, an Jose, CA）进行DDA（data-dependentacquisition）模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1600m/z；分辨率设置为70000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率17500。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为15s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

（6）质谱数据采用通过Mascot和PD软件对实验中所得到的质谱数据与生物信息数据库在人类Uniprot数据库进行检索并定量分析进行比对，得到可信的蛋白质定量以及定性结果。

3、检测结果

2个上机重复合并分析，质谱共鉴定到729个蛋白，利用113，114，118，119，120，121进行标记时，其中≥2个unique肽段蛋白293个蛋白，鉴定过滤标准：PSM和Protein水平FDR≤1％。根据鉴定的蛋白质丰度比分布达到严格定量标准（log2比值≥0.6）的蛋白数：晚血病例组与正常对照组蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达蛋白质点为32个，表达上调的蛋白质点14个，下调的蛋白质点18个。

实施例2：质谱MRM在传统晚血与新发晚血中的验证

1、检测样本

来自于昆山、常熟等晚血病人血清、新发晚血病人血清、健康人群血清各20例。清晨空腹采集2mL全血，4℃静置1~2h待血液凝固析出血清，3000g离心10min，收集上清液，冰上分装后存至-80℃备用。

2、检测方法

实验方法的建立：

（1）挑选适合于进行MRM检测分析的相关靶蛋白；

（2）对所提取的蛋白进行质量评估；

（3）挑选适合于MRM检测的母子离子对；

（4）基于分析软件Skyline对质谱仪扫描参数—碰撞能量进行优化；

（5）对所得到的检测数据进行质量评估和分析。

样本分析：

（1）血清蛋白酶解：每个样品取12.5μg，合并为两管病例组和健康对照组，每

管中加入0.1μg/μl的BSA作为内参。用超滤管，取蛋白液，离心20min，去底部溶液，加入100μl TEAB，同上离心操作，重复步骤3次，更换新的收集管，在超滤管中加入50μl 0.5M的TEAB，按照40:1的比例加入胰蛋白酶，用parafilm将超滤管与管盖密封，放置于震荡仪上37℃反应过夜。12000rpm离心15min。加入50μl二次蒸馏水（两次）12000rpm离心20min收集，再加入100μl TEAB，12000rpm离心20min，收集管中即酶解后肽段溶液。转出收集管中底部的酶解消化液于1.5ml离心管中，冷冻抽干。

（2）MRM实验方法：将制备好的样品按照以下色谱质谱的参数设置进入液相系统SHIMADU Prominence HPLC和AB SCIEX5500质谱仪进行分析。仪器参数的设置如下：离子喷射电压：2300，进样体积：4μl，碰撞能量：软件依据母子离子对信息自动计算。时间：60.028min，单个循环时间：3.7518sec，液相设置：流速：0.3μl/min，流动相A液：98％水，2％乙腈，0.1％甲酸；流动相B液：2％水，98％乙腈，0.1％甲酸。

（3）Skyline软件中肽段选择的参数设置：蛋白质组背景库：uniprot human；酶：Trypsin；最大漏切数：0；氨基酸数目：8～25；排除N末端氨基酸的个数：25；排除含有如下氨基酸的肽段：Cys Met；排除潜在的漏切末端：KK KR RK RR；结构修饰：Carbamidomethyl(C)；最大可变修饰数：3；最大中性丢失数目：1；母离子电荷数：2，3；子离子电荷数：1；离子类型：b，y；离子相符耐受度：0.5Th；质荷比范围：50Th～1200Th；每针最大离子数目：300；驻留时间：8ms。

（4）数据分析：用BSA (HLVDEPQNLIK) 肽段的积分峰面积进行样品测定的标准化，通过比较不同组之间某蛋白的积分峰面积差异，从而确定某蛋白在不同情况下表达量的相对变化。

3、结果

MRM技术对样品进行验证：综合iTRAQ筛选结果，MRM候选标志物的验证主要集中在iTRAQ差异表达蛋白的28个蛋白和9个并没有变化趋势的，但我们比较感兴趣的蛋白质上，并对这37个蛋白进行靶标验证，在挑选适合用于代表蛋白的高质量跃迁，且首要满足的条件就是能在质谱中响应出足够的信号强度，信噪比相对较高，能够呈现出峰形一致的峰簇。按照这一标准进行过滤，在对样本进行MRM实验以后，我们删掉了一些信噪比相对不好，质谱信号不稳定的子离子，最后得到含有对应23个蛋白的45个唯一肽段的母子离子对列表，并对23种蛋白在两组间样本中进行相对定量得到的MRM丰度（峰面积）进行差异倍数的比较。我们对MRM显著差异蛋白的标准，进行设定，要求差异倍数大于等于1.5倍，且p-value值小于0.05。

我们发现，经典晚血组、新发晚血组与健康人群组比较的差异蛋白有异戊烯半胱氨酸氧化酶（Prenylcysteine oxidase）和载脂蛋白（Apolipoprotein）。经典型晚期血吸虫病人群中，异戊烯半胱氨酸氧化酶表达量是新发晚血组的2~3倍；新发展晚期血吸虫病人群中，载脂蛋白表达量是经典晚血组的2倍，以此可以鉴别经典型和新发展晚期血吸虫病。

综上所述，本发明通过对来自于晚血病人血清、新发晚血病人血清、健康人群血清进行比较验证，寻找到了各组血清蛋白中差异表达的蛋白质，从而确定了我们所建立的蛋白标志物组的准确性与意义。

实施例3：血清蛋白标志物组制备的检测试剂盒。

试剂盒的组成：

试剂A：检测载脂蛋白的多克隆抗体；

试剂B：检测异戊烯半胱氨酸氧化酶的多克隆抗体；

试剂C：磷酸盐缓冲液；

D：ELISA 96孔板。

在具体实施方案中，可采用以下步骤使用此试剂盒鉴别经典型晚血和新发晚血：

（1）血清样本新鲜获取并保存与-80℃冰箱；

（2）血清样本按照原液、5倍稀释、10倍稀释分为三管；

（3）将两种抗体各滴加1μl 至96孔板中进行包被；

（4）按照ELISA方法，将血清样本加入96孔板，并通过显色计算OD值，按照OD值=（样本OD-空白对照OD）/阴性对照OD）>2.1为阳性。

若检测样本中A 抗体阳性，B抗体阴性，则结果判为该病例为新发展晚血；若A 抗体阴性，B抗体阳性，则结果判为该病例为经典晚血。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (5)

1.一种血清蛋白标志物组在制备鉴别经典型晚期血吸虫病和新发展晚期血吸虫病检测试剂盒中的应用，所述血清蛋白标志物组为：异戊烯半胱氨酸氧化酶，其序列号为Q9UHG3；和载脂蛋白，其序列号为C9JF17。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清蛋白标志物组是通过iTRAQ结合MRM技术，对经典型晚血病人、新发展晚血病人和正常人血清中的血清蛋白进行识别与验证出来的。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，经典型晚期血吸虫病人群中，异戊烯半胱氨酸氧化酶表达量是新发晚血组的2~3倍；新发展晚期血吸虫病人群中，载脂蛋白表达量是经典晚血组的2倍。

4.一种用于鉴别经典型晚期血吸虫病和新发展晚期血吸虫病的检测试剂盒，其特征在于，包括异戊烯半胱氨酸氧化酶多克隆抗体和载脂蛋白的多克隆抗体。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含上样缓冲液和ELISA 96孔板。