CN105301259A

CN105301259A - 血清rbp4蛋白作为肝癌病人血清标志物及其应用

Info

Publication number: CN105301259A
Application number: CN201510653875.6A
Authority: CN
Inventors: 何敏; 李洪涛; 邓小芳; 周怡
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2015-10-10
Filing date: 2015-10-10
Publication date: 2016-02-03

Abstract

一种血清RBP4(Retinol？binding？protein？4)蛋白作为肝癌病人血清标志物及其应用，所述血清RBP4蛋白在肝癌病人血清中表达水平明显降低，可利用iTRAQ结合MALDI-TOF/MS技术检测，质谱检测RBP4蛋白3条肽段在肝癌病人血清中表达水平明显低于正常人的血清中表达水平。RT-PCR、免疫组织化学和质谱多反应监测(multiple？reaction？monitoring，MRM)也验证RBP4蛋白在肝癌细胞、组织和病人血清中表达降低。适用于肝癌血清的辅助检测，发病机制研究和抗癌药物开发。

Description

血清RBP4蛋白作为肝癌病人血清标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种血清标志物的应用，具体为一种血清RBP4蛋白作为肝癌病人血清标志物及其应用。

背景技术

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。原发性肝癌早期一般无任何症状，一旦出现临床表现，病情大多已进入中、晚期，而且恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强，至今对肝癌的发病机制不清。因此，开发新的疾病标志物，对肝癌的防治具有重要意义。近年来，随着质谱技术的飞速发展和蛋白质组学研究的深入，产生了血清定量蛋白组学新技术，常用的几种方法有：ICAT-MS/MS、iTRAQ-MS/MS、2-D以及蛋白芯片等。其中，iTRAQ-MS/MS是一种检测灵敏度好、蛋白序列的覆盖率高以及重复性、可靠性好的实验手段。iTRAQ有如下优点:(1)标记过程简单,反应速度快,标记效率可高达97％以上,质谱检测较为灵敏。(2)能够和多肽的氨基端或多肽链赖氨酸残基上的氨基基团发生共价反应。(3)同一种多肽的离子化程度十分接近，标记后在RPHPLC上的峰位相同。(4)8种同位素标记的相同多肽在进行第一级质谱检测时，分子量完全相同,这种在同一峰位上的叠加效应可以增强了离子的强度，提高检测的灵敏性。(5)在碰撞诱导解离(collisioninduceddissociation,CID)后，进行二级质谱分析时,带不同同位素标签的同一多肽产生质量为113、114、115、116、117、118、119和121Da的报道离子(reporterion)。由于低分子量区是质谱定性(质量确定)和定量(丰度比较)较为准确的区域，在此区域比较8种报道离子的丰度，可以较为准确的获得不同样品间相同多肽的丰度差异。(6)代表多肽丰度报道离子的比较以及多肽前体的序列等信息，可在一次MS/MS串联质谱过程中同时获得。iTRAQ-MS/MS技术已经广发应用于多种疾病标志物的研究。为进一步揭示疾病的致病机制，引导新的药物靶标的发现提供了重要的线索。

转录组测序是发现功能基因和标志物的一种可行方法。20世纪70年代诞生第一代化学降解法测序，到二代测序技术已经具备高通量、高度并行等特点，但昂贵的费用成本成为其大范围应用的绊脚石，新发展起来的第三代测序技术以较低成本、长读长及高碱基识别率为测序技术发展带来广阔的前景，高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，已经广泛应用于多种肿瘤标志物研究。本发明就是血清定量蛋白组学技术结合新一代转录组测序技术在肝癌研究中的新发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清RBP4蛋白作为肝癌病人血清标志物及其应用，适用于肝癌血清辅助检测，发病机制研究和抗癌症药物开发。

本发明的技术方案是：一种血清RBP4(Retinolbindingprotein4)蛋白作为肝癌病人血清标志物，是利用iTRAQ(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)结合MALDI-TOF/MS技术检测肝癌病人和正常人的血清，和利用IonProton^TM基因测序仪测序肝癌细胞Smmc-7721及对照组正常肝细胞L-02，共同发现的生物标志物，RBP4蛋白在肝癌病人血清中表达水平明显低于正常人的血清中表达水平，同时其mRNA水平上也是在肝癌细胞表达水平明显低于正常人的细胞中表达水平。RT-PCR、免疫组织化学和质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring，MRM)也验证RBP4蛋白在肝癌细胞、组织和病人血清中表达降低。

所述RBP4蛋白在肝癌血清和组织中的表达降低是指以下3个肽段表达水平降低：FSGTWYAMAK，YWGVASFLQK，QEELCLAR。

本发明的显著效果在于：

采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学和基于二代测序的转录组学技术，整合蛋白质组学和转录组学数据实现对肝癌的全面系统的研究，得到一种血清RBP4蛋白作为肝癌病人血清标志物，该标志物经过RT-PCR、免疫组织化学和质谱MRM验证，结果更为可靠，可为临床应用提供有价值的信息。

附图说明

图1RBP4蛋白肽段FSGTWYAMAK的iTRAQ标记相对定量。

A：RBP4蛋白的肽段FSGTWYAMAK的二级图谱；B，肽段FSGTWYAMAK的定量结果，显示与正常人相比，该肽段在肝癌血清中的表达明显降低。

图2.免疫组织化学检测RBP4的表达水平。

免疫组化法验证RBP4不同表达等级在癌与非癌的分布，与正常细胞株相比，RBP4在肝癌组织中表达明显下降。

图3.质谱MRM检测血清RBP4的表达水平。

质谱MRM验证RBP4在血清中的表达，与正常对照和肝炎相比，RBP4的表达水平在肝癌病人血清中明显低表达。图中正常对照以Normal表示，肝炎以Hepatitis表示，肝癌以HCC表示。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1

血清定量蛋白组技术检测RBP4蛋白在肝癌病人血清中表达降低

1.检测样本：

肝癌病人、肝硬化病人、肝炎病人和正常对照血清各10例。清晨空腹采集2mL全血,4℃静置1-2h待血液凝固析出血清,3000g离心10min,收集上清液,冰上分装后存至-80℃备用。

2.检测方法：

(1)采用安捷伦多重亲和去除系统human14色谱柱去除血清中的高丰度蛋白；

(2)每组血清定量100μg，按照iTRAQ试剂盒说明书进行胰蛋白酶酶解、分别用iTRAQ试剂113、114、115、116标记健康对照组、肝炎组、肝硬化组、肝癌组，然后混合、冻干；

(3)混合干燥的iTRAQ标记样品用缓冲液A复溶，缓冲液A由10mmol/LKH₂PO₄,25％CAN,pH2.7组成，通过强阳离子交换色谱柱将混合样品分20个馏份；

(4)每个馏份分别进行c18反相分离、点靶和质谱鉴定；

(5)质谱数据采用ProteinPilot3.0软件，对人类Uniprot数据库进行检索并定量分析；

(6)统计学处理应用SPSS14.0软件进行统计学分析.计量数据以mean±SD表示,两样本均数间的比较采用t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

3.检测结果：质谱共鉴定到RBP4蛋白包含FSGTWYAMAK、YWGVASFLQK、QEELCLAR在内的共10个唯一肽段。总体覆盖率33.8％，其中116/113＝0.3481,P＜0.05,RBP4蛋白在肝癌病人血清中表达水平明显降低。结果如图1所示。

实施例2

RBP4蛋白包含FSGTWYAMAK、YWGVASFLQK、QEELCLAR肽段在内，针对该蛋白制备一抗，免疫组织化学检测发现RBP4在肝癌组织中低表达。

1.检测样本：

手术切除的肝癌组织76例，对照组为相同病人的癌旁组织76例。

2.检测方法：

(1)脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100％酒精-100％酒精-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精。在前面两个试剂中放10min，后面6个试剂为5min。

(2)抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3％H2O2浸泡10min，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中火中蒸煮3min，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温。

(3)血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，然后放入室温或37℃温箱中半小时。

(4)加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存过夜。

(5)加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于室温或37℃温箱中半小时。

(6)将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，滴加试剂C液,然后置于室温或37℃温箱中10-15min。

(7)加显色剂：将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀。

(8)复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色。

(9)封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。

3.结果：对肝癌组织RBP4蛋白表达与临床表征作相关分析，显示表达水平随AFP值增加而降低，P<0.05。RBP4不同表达等级在癌与非癌的分布，与正常细胞株相比，RBP4在肝癌组织中表达明显下降，结果如图2所示。

实施例3

质谱MRM验证RBP4在肝癌血清中低表达

1.检测样本：

肝癌病人、肝硬化病人、肝炎病人和正常对照血清各10例；

2.检测方法：

实验方法的建立：(1)选取目标蛋白；(2)选择特异性肽段FSGTWYAMAK，YWGVASFLQK，QEELCLAR；(3)离子对设计；(4)质谱优化。

样本分析：

(1)血清蛋白酶解：取10μL10倍稀释的血清样品，加入5倍体积的冷丙酮，-20℃中沉淀4小时；3000g冷冻离心10分钟，弃去上层丙酮溶液。沉淀中加入10μL50mM碳酸氢铵溶液，1μL1％的RapiGest。加入DTT至终浓度5mM，60℃温浴30分钟。冷却至室温，加入新鲜配制的IAA至终浓度15mM，室温下避光温浴30分钟。按底物：胰蛋白酶50:1的量加入胰蛋白酶，37℃下酶切16小时。加入TFA至终浓度为0.5％，37℃下温浴30-45分钟，15,000g离心10分钟，小心转移全部上清，冷冻浓缩干后，用流动相A复溶。

(2)色谱分析条件：NanoLC2DTM液相系统，预柱购自Eksigent公司，ChromXPnanoLCTrapColumn，350um×0.5mm，分析柱购自Eksigent公司，ChromXPnanoLCColumn，75um×150mm，流速：300nL/min。流动相A液：98％水，2％乙腈，0.1％甲酸；流动相B液：2％水，98％乙腈，0.1％甲酸。

(3)质谱分析条件：实验设备ABI4000QTRAP三级四极杆-离子阱混合型质谱仪。仪器参数的设置如下：离子喷射电压：2300V；；气帘气：25；离子源气1：10；离子源温度IHT:150；去簇电压：100。

(4)数据分析：用50fmolβ半乳糖苷酶酶切产物的积分峰面积进行样品测定的标准化，通过比较不同组之间某蛋白的积分峰面积差异，从而确定某蛋白在不同情况下表达量的相对变化。

3.结果：MRM技术对RBP4的三个肽段FSGTWYAMAK，YWGVASFLQK，QEELCLAR的定量结果显示，RBP4在肝癌病人血清中低表达，P<0.001，结果如图3所示。

Claims

1.一种血清RBP4(Retinolbindingprotein4)蛋白作为肝癌病人血清标志物，其特征在于，RBP4是一种单一肽链的蛋白质，包括181个氨基酸残基，分子量约为21KD，RBP4主要来源于肝细胞，广泛分布于人体血清、尿液及其他体液中，属于分泌型视黄醇类蛋白；利用iTRAQ(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)结合MALDI-TOF/MS技术检测肝癌病人和正常人的血清，RBP4蛋白在肝癌病人血清中表达水平明显低于正常人的血清中表达水平；利用IonProton^TM基因测序仪对肝癌细胞Smmc-7721及对照组正常肝细胞L-02进行高通量转录组测序，在mRNA水平上RBP4在肝癌细胞表达水平明显低于正常人的细胞中表达水平，RT-PCR、免疫组织化学和质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring，MRM)也验证RBP4蛋白在肝癌细胞、组织和病人血清中表达降低。

2.根据权利要求1所述的血清RBP4蛋白作为肝癌病人血清标志物，其特征在于，所述RBP4蛋白在肝癌病人血清中的表达降低是指以下3个肽段表达水平降低：

FSGTWYAMAK

YWGVASFLQK

QEELCLAR。