CN108732253A - 用于血清蛋白质定量测定的肽段组合物及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于血清蛋白质定量测定的肽段组合物，其特征在于，所述肽段组合物包括至少两条同位素标记的肽段，所述同位素标记的肽段的序列包含任意一条序列表SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.72中所示的氨基酸序列片段。上述用于血清蛋白质定量测定的肽段或肽段组合物，可用于基质复杂以及样品量少的蛋白质的定量测定，应用范围广，价格较低。
Description
技术领域
本发明涉及食品级医学检验测定技术领域，特别是涉及一种用于血清蛋白质定量测定的肽段组合物及测定方法。
背景技术
随着人类基因组草图的完成，生命科学研究进入后基因组时代，而蛋白质组学研究是后基因组时代的核心内容之一，蛋白质组学是从整体的角度分析细胞内蛋白质的组成成分、表达水平以及修饰状态，进而了解蛋白质之间的相互作用与联系，达到揭示蛋白质功能与生命活动规律的目的。
作为蛋白质组学重要分支的之一的血清蛋白质组学，是通过分离技术获得特定人群的血清蛋白质，在蛋白质表达图谱的基础上，寻找与健康人群存在的差异蛋白质点或蛋白质峰，然后再通过鉴定技术确定差异蛋白，进而研究其结构和功能。
从1994年开始发展至今，蛋白质组学前10年的研究主要是对蛋白质进行定性研究，随着研究的不断深入，仅仅知道蛋白的种类及其修饰情况，已经不能满足研究工作的需要。研究发现，蛋白质量的多少以及其翻译后修饰程度的变化均与蛋白质的功能密切相关。因此，最近10年间定量蛋白质组研究迅速发展并成为蛋白质组学研究的主流。根据定量的目的不同，请参阅附图1所示，定量蛋白质组学可以分为两大类：相对定量蛋白质组学和绝对定量蛋白质组学。
目前对于目标蛋白的定量分析，多采用基于非内标肽段的绝对定量分析方法和基于稳定同位素标记的内标肽段的绝对定量分析方法。
基于稳定同位素标记肽段的绝对定量方式多采用制备一系列已知浓度的标准曲线，对检测待测样本的目标蛋白进行定量。具体的，有以下几种方法：(1)单纯使用标准品配制的外标，需要纯品标准品以及配置样品基质，可以用于基质不复杂和前处理过程不繁琐的样品，但是在实际检测上往往由于样品基质复杂无法使用；(2)添加稳定同位素标记的标准品配置的单一浓度内标，可以解决基质复杂和前处理过程繁琐的问题，但是单一浓度内标使得定量分析的线性范围狭窄，不能方便用于待测样品目标物浓度变化较大的血清样本中；(3)用与待测样品同样基质的不同浓度的标准品作为外标，然而实际测量中往往无法获得去除目标蛋白的空白基质以及相应的蛋白质标准品，即使目前能够获得的标准品蛋白质种类也很少，价格较高，测定成本较高；(4)添加稳定同位素标记的标准品配置的多个浓度内标，即先制备基于一个参考样本添加多个已知浓度的稳定同位素标记的标准品内标，根据稳定同位素的浓度计算出参考样本中的浓度，以此做标准曲线，在此基础上采用外标法测定待测样品的蛋白质浓度，既可以解决基质复杂和前处理过程繁琐的问题，又拓宽定量分析的线性范围，但是在测试未知样本时，每次都需要制备基于参考样本的标准曲线(通常大于5个点)，需要较多的样品量，测定过程复杂，当样品量过少时，无法采用该方法制备标准曲线，另外测量的准确性，完全取决于参考样本中目标蛋白浓度计算是否准确。
发明内容
基于此，有必要针对现有技术中无法便捷准确地定量测定血清中的蛋白质含量的问题，提供一种用于血清蛋白质定量测定的肽段组合物及测定方法。
本发明提供的一种用于血清蛋白质定量测定的肽段组合物，其中，所述肽段组合物包括至少两条同位素标记的肽段，所述肽段的序列包含任意一条序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.72中所示的氨基酸序列片段。
在其中一个实施例中，所述肽段组合物的肽段摩尔份数为：
本发明还提供了一种血清蛋白质定量测定方法，其中，所述测定方法包括如下的测定步骤：
S100、样品预处理；
对待测样品进行预处理，将其中的蛋白质酶解为肽段，制得酶解样品；
S200、标准品制备；
将如上所述的肽段组合物溶解，配置两个以上具有不同浓度的肽段组合物标准品溶液；
S300、测定样品制备；
向S100制备的平行酶解样品中分别加入S200制备的任意一个肽段组合物标准品溶液；
加入甲酸溶液，离心去除去氧胆酸钠，制得样品溶液；
S400、样品测定；
采用高效液相色谱-串联质谱测定S300制备的样品溶液；
S500、数据处理；
根据下式计算样品溶液的蛋白质浓度，之后根据处理过程换算为待测样品的蛋白质浓度：
式中：
C样品溶液特征肽段相应的特定蛋白质表示样品溶液特定蛋白质浓度；
AreaM样品溶液特征肽段表示样品溶液特征肽段显示的吸收峰面积；
AreaM标准品特征肽段表示标准品特征肽段显示的吸收峰面积；
CM标准品特征肽段表示标准品中特征肽段的浓度；
M表示具有不同浓度的标准溶液的个数。
在其中一个实施例中，所述S300测定样品制备还包括：
S310、固相萃取纯化，所述固相萃取纯化是将S300制备的样品溶液采用固相萃取柱进行纯化；
S320、氮吹回溶，所述氮吹回溶是将S310固相萃取纯化后的样品浓缩后回溶。
在其中一个实施例中，所述样品预处理包括：
以9倍体积的碳酸氢铵溶液稀释待测样品，制得稀释样品。
在其中一个实施例中，所述样品预处理还包括：
将所述稀释样品与去氧胆酸钠溶液以及碳酸氢铵溶液混合均匀；
加入三(2-羧乙基)膦溶液，于60℃孵育30～60min；
加入吲哚-3-乙酸溶液，于37℃避光孵育30～60min；
加入二硫苏糖醇溶液，于37℃孵育30～60min；
加入胰蛋白酶溶液，于37℃孵育10～16h，制得酶解样品。
在其中一个实施例中，所述碳酸氢铵溶液的浓度为25mmol/L。
在其中一个实施例中，所述三(2-羧乙基)膦溶液的浓度为50mmol/L，所述加入三(2-羧乙基)膦溶液后，三(2-羧乙基)膦的终浓度为5mmol/L；
所述吲哚-3-乙酸溶液的浓度为100mmol/L，所述加入吲哚-3-乙酸溶液后，吲哚-3-乙酸的终浓度为10mmol/L；
所述二硫苏糖醇溶液的浓度为100mmol/L，所述加入二硫苏糖醇溶液后，二硫苏糖醇的终浓度为10mmol/L；
所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.9mg/mL，对应每微升待测样品加入胰蛋白酶的量为7～8μL。
在其中一个实施例中，所述具有不同浓度的标准溶液的个数为3-5。
在其中一个实施例中，所述甲酸溶液的质量浓度为1％，所述加入甲酸溶液后的甲酸终质量浓度为0.5％。
上述用于血清蛋白质定量测定的肽段或肽段组合物，可用于基质复杂以及样品量少的蛋白质的定量测定，应用范围广，价格较低。
上述血清蛋白质定量测定方法，可用于基质复杂以及样品量的蛋白质的定量测定，方法简单，样品处理量少，准确性高。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为现有定量蛋白质组学分类示意图；
图2为本发明测定方法测定步骤示意图；
图3为本发明实施例1的72种蛋白质检测的总离子流图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的用于血清蛋白质定量测定的肽段或肽段组合物及测定方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
对于目标蛋白的定量分析，科学家们还发展了一种选择反应检测质谱技术(Selected Reaction Monitoring,SRM)。该技术是在三重四级杆质谱仪上完成的，Q1和Q3扫描离子，Q2作为碰撞池，并将所有碎片离子传输到Q3。在1次MRM实验中，只有预先选择的具有特定m/z值的母离子会被传输通过Q1。在Q2中，这些母离子被碰撞诱导解离(Collision-induced Dissociation，CID)，接下来所有产生的碎片离子被送到Q3。只有具有预先设定的m/z值的子离子能够通过Q3，到达检测器，其余的离子都不再被检测。每个母离子和其对应的子离子为1个离子对。通过母离子和子离子的2次选择，去除了干扰离子，降低了化学背景，大大提高了灵敏度。
请参阅图2所示，本发明方法通过基质加入多点定量法结合MRM法测定复杂基质中的多种蛋白质含量。具体包括如下处理步骤：
S100、样品预处理。
对待测样品进行预处理，使其中的蛋白质变性、还原、烷基化、酶解，蛋白质酶解为肽段，制得酶解样品，其中每种蛋白质都具有其特有的特征肽段，请参阅表1所示，列举了血清中72中蛋白质及其对应的特征肽段的氨基酸序列，其中特征肽段的氨基酸序列如本发明序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.72所示。
优选的，待测样品预处理包括以下处理步骤：
以9倍体积的碳酸氢铵溶液稀释待测样品，制得稀释样品，其中碳酸氢铵溶液的浓度为25mmol/L；
将所述稀释样品与去氧胆酸钠溶液以及碳酸氢铵溶液混合均匀；
加入三(2-羧乙基)膦溶液，于60℃孵育30～60min；
加入吲哚-3-乙酸溶液，于37℃避光孵育30～60min；
加入二硫苏糖醇溶液，于37℃孵育30～60min；
加入胰蛋白酶溶液，于37℃孵育10～16h，制得酶解样品。
S200、标准品制备。
配置两个以上已知的具有不同浓度的标准品溶液，标准品为稳定同位素标记的待测样品蛋白质的特征肽段标准品，即配置包含任意一条本发明序列表SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.72中所示的氨基酸序列片段的肽段。配置的特征肽段标准品中所含肽段的种类，可以根据待测样品以及测定目标蛋白质种类进行选择，例如测定表1中全部种类的蛋白质含量，则选择72种分别包括本发明序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.72中任意一条所示的氨基酸序列片段的肽段组合物作为标准品，制备两个以上不同浓度的并包含72种肽段的肽段组合物标准品溶液。
优选的，配置3个具有不同浓度的肽段组合物标准品溶液，具体的，肽段组合物标准品溶液的归一化浓度分别为：8.3～12.5fmol/μL，25fmol/μL和50～75fmol/μL。
S300、测定样品制备。
向若干平行的酶解样品中分别添加不同浓度的肽段组合物标准品溶液，加入甲酸溶液后离心去除去氧胆酸钠，制得样品溶液。
优选的，甲酸溶液的质量浓度为1％，加入甲酸溶液后的甲酸终质量浓度为0.5％。
优选的，还包括以下处理步骤：
S310、固相萃取纯化，所述固相萃取纯化是将S300制备的样品溶液采用固相萃取柱进行纯化；
S320、氮吹回溶，所述氮吹回溶是将S310固相萃取纯化后的样品浓缩后回溶。
S400、样品测定，采用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)采用MRM法分析，分析时会显示特征肽段峰和对应的稳定同位素标记的特征肽段峰(对峰)。
S500、数据处理，由于稳定同位素标记的特征肽段峰的浓度已知，且响应程度跟浓度成正比的，根据对峰的响应程度的不同，进而计算出待测样品中特征肽段的浓度，之后根据处理过程换算为待测样品的蛋白质浓度。
具体的，可以采用下式计算样品溶液的蛋白质浓度：
式中：
C样品溶液特征肽段相应的特定蛋白质表示样品溶液特定蛋白质浓度；
AreaM样品溶液特征肽段表示样品溶液特征肽段显示的吸收峰面积；
AreaM标准品特征肽段表示标准品特征肽段显示的吸收峰面积；
CM标准品特征肽段表示标准品中特征肽段的浓度。
优选的，本发明方法将通过预处理后的待测测样品均分3份，分别加入任一种已知浓度的稳定同位素标记的肽段组合物标准品溶液，进而计算出待测样品中目标蛋白的含量，不需要针对于不同批次的样本制备标准曲线，检测灵活，降低了检测成本，提高了检测速度。
需要说明的是，本发明具体实施例中测定的是血清中的72中蛋白质，然而本发明方法不限于测定血清中的蛋白质，也不限于测定具体实施例中列举的72中蛋白质，测定蛋白质的种类和数量可以根据待测样品以及测量目的进行组合或变更。
请参阅表1所示，是本发明测定的血清蛋白质种类以及其对应的特征肽段的氨基算序列，其中，通用蛋白质数据库(Universal Protein，Unitprot)是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库，Unitprot登记号(Unitprot Accession No.)是通用蛋白数据库查询蛋白质时特定序列的代码，具有唯一性和永久性，本发明为了便于确认蛋白质的具体种类，在表1中列举了其Unitprot登记号，以便在中英文名称不能确认蛋白质的具体种类时区分确认，另外，常用的参照数据库为SWISS-PROT。
表1血清中蛋白质及其特征肽段
以下以α白蛋白对表1中各列的含义进行说明。第一列中给出了α白蛋白质对应的中英文名称为α白蛋白(Afamin)；第二列给出了α白蛋白的Uniprot等级号为P43652；第三列给出了α白蛋白对应的特征肽段的氨基酸序列；即为序列表中的SEQ ID NO.1序列；第四列给出了一种归一化浓度为25fmol/μL时α白蛋白的特征肽段的摩尔份数；第五列给出了α白蛋白的特征肽段摩尔分数的浮动范围，即α白蛋白的特征肽段能够在42.9±20％的范围内浮动调整。
以下结合实施例对本发明的方法进行具体说明。
实施例1
S100、样品预处理：
取10μL的待测样品至蛋白低吸附管，加入90μL的25mmol/L碳酸氢铵溶液稀释，涡旋混匀，制得稀释样品；
取500μL蛋白低吸附管，分别加入177μL的25mmol/L碳酸氢铵溶液，37μL的10％去氧胆酸钠溶液，30μL的稀释样品，涡旋混匀；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的50mmol/L三(2-羧乙基)膦溶液，使三(2-羧乙基)膦终浓度为5mmol/L，涡旋混匀5s，60℃孵育30min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的100mmol/L吲哚-3-乙酸溶液，使吲哚-3-乙酸终浓度为10mmol/L，涡旋混匀5s，37℃避光孵育30min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的100mmol/L二硫苏糖醇溶液，使二硫苏糖醇终浓度为10mmol/L，涡旋混匀5s，37℃孵育30min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入23.3μL的0.9mg/mL胰蛋白酶溶液，涡旋混匀5s，37℃孵育10h，制得酶解样品A1。
按照S100的样品预处理方法分别制备平行酶解样品A1、酶解样品A2、酶解样品A3。
S200、标准品制备：
取分别包含序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.72中任意一条所示的氨基酸序列的72种肽段的肽段组合物，制备归一化浓度分别为12.5fmol/μL，25fmol/μL和50fmol/μL的肽段组合物标准品溶液，其中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.72中任意一条所示的氨基酸序列的浓度比例如表1所示。
S300、测定样品制备：
取227μL的酶解样品A1，向其中加入50μL的12.5fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液C1；
取227μL的酶解样品A2，向其中加入50μL的25fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液C2；
取227μL的酶解样品A3，向其中加入50μL的50fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液C3。
S310、SPE柱纯化：
用1mL的甲醇活化，用1mL的水平衡，向SPE柱加入444μL的样品溶液C1，加入556μL的0.1％甲酸溶液，用1mL水清洗SPE柱，用300μL的50％乙腈溶液/0.1％甲酸洗脱，洗脱液收集在离心管中。
其中，SPE纯化柱为Oasis HLB 1cc(10mg)Extraction Cartridges。
S320、氮吹回溶：
将步骤S310的洗脱液用氮吹回溶法，氮气吹干后用0.1％甲酸溶液回溶至200μL。
按照步骤S310以及S320方法纯化以及浓缩回溶样品溶液C2、样品溶液C3。
S400、样品测定：
采用高效液相色谱-串联质谱测定S300制备的3个样品溶液C1-样品溶液C3。
高效液相色谱-串联质谱条件如下：
色谱柱：C18填料，粒径＝1.8μm，内径＝2.1mm，长大于等于150mm；
自动进样器温度：4℃；
柱温：50℃；
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；
流速：0.4mL/min。
其中，高效液相色谱-串联质谱为Agilent 1290-6495LC-MS/MS。
请参阅表2和表3所示，分别是本发明实施例1高效液相色谱的梯度条件以及质谱条件。
表2色谱梯度条件
| 时间 | 流动相B(％) |
| 0 | 1.5 |
| 1.5 | 6.3 |
| 16 | 13.5 |
| 18 | 13.77 |
| 33 | 22.5 |
| 38 | 40.5 |
| 39 | 81 |
| 42.9 | 81 |
| 43 | 1.5 |
表3质谱条件
S500、数据处理：
根据下式计算样品溶液的蛋白质浓度，之后根据预处理过程计算待测样品的蛋白质浓度：
式中：
C样品溶液特征肽段相应的特定蛋白质表示样品溶液特定蛋白质浓度；
AreaM样品溶液特征肽段表示样品溶液特征肽段显示的吸收峰面积；
AreaM标准品特征肽段表示标准品特征肽段显示的吸收峰面积；
CM标准品特征肽段表示标准品中特征肽段的浓度。
请参阅图3所示，为实施例1的72种蛋白质检测的总离子流图，其测定结果如表4所示。
表4实施例1测定结果
实施例2
S100、样品预处理：
取20μL的待测样品至蛋白低吸附管，加入180μL的25mmol/L碳酸氢铵溶液稀释，涡旋混匀，制得稀释样品；
取500μL蛋白低吸附管，分别加入177μL的25mmol/L碳酸氢铵溶液，37μL的10％去氧胆酸钠溶液，30μL的稀释样品，涡旋混匀；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的50mmol/L三(2-羧乙基)膦溶液，使三(2-羧乙基)膦终浓度为5mmol/L，涡旋混匀5s，60℃孵育60min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的100mmol/L吲哚-3-乙酸溶液，使吲哚-3-乙酸终浓度为10mmol/L，涡旋混匀5s，37℃避光孵育60min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的100mmol/L二硫苏糖醇溶液，使二硫苏糖醇终浓度为10mmol/L，涡旋混匀5s，37℃孵育60min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入23.3μL的0.9mg/mL胰蛋白酶溶液，涡旋混匀5s，37℃孵育16h，制得酶解样品A4。
按照S100的样品预处理方法分别制备平行酶解样品A5、酶解样品A6、酶解样品A7。
S200、标准品制备：
取分别包含序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.72中任意一条所示的氨基酸序列的72中肽段的肽段组合物，制备归一化浓度分别为2.5fmol/μL，12.5fmol/μL、25fmol/μL、125fmol/μL的肽段组合物标准品溶液。
S300、测定样品制备：
取227μL的酶解样品A4，向其中加入50μL的2.5fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液C4；
取227μL的酶解样品A5，向其中加入50μL的12.5fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液C5；
取227μL的酶解样品A6，向其中加入50μL的25fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液C6；
取227μL的酶解样品A7，向其中加入50μL的125fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液C7。
S310、SPE柱纯化：
用1mL的甲醇活化，用1mL的水平衡，向SPE柱加入444μL的样品溶液C4，加入556μL的0.1％甲酸溶液，用1mL水清洗SPE柱，用300μL的50％乙腈溶液/0.1％甲酸洗脱，洗脱液收集在离心管中。
S320、氮吹回溶：
将步骤S310的洗脱液用氮吹回溶法，用0.1％甲溶液回溶至200μL。
按照S310以及S320方法纯化以及浓缩回溶样品溶液C5、样品溶液C6以及样品溶液C7。
S400、样品测定：
采用高效液相色谱-串联质谱测定S300制备的4个样品溶液C4-样品溶液C7。
高效液相色谱-串联质谱条件与实施例1相同。
S500、数据处理：
根据下式计算样品溶液的蛋白质浓度，之后根据预处理过程计算待测样品的蛋白质浓度：
式中：
C样品溶液特征肽段相应的特定蛋白质表示样品溶液特定蛋白质浓度；
AreaM样品溶液特征肽段表示样品溶液特征肽段显示的吸收峰面积；
AreaM标准品特征肽段表示标准品特征肽段显示的吸收峰面积；
CM标准品特征肽段表示标准品中特征肽段的浓度。
测定结果如表5所示。
表5实施例2测定结果
对比例
对比例标准曲线制备：
取20μL的待测样品至蛋白低吸附管，加入180μL的25mmol/L碳酸氢铵溶液稀释，涡旋混匀，制得稀释样品；
取500μL蛋白低吸附管，分别加入177μL的25mmol/L碳酸氢铵溶液，37μL的10％去氧胆酸钠溶液，30μL的稀释样品，涡旋混匀；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的50mmol/L三(2-羧乙基)膦溶液，使三(2-羧乙基)膦终浓度为5mmol/L，涡旋混匀5s，60℃孵育30min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的100mmol/L吲哚-3-乙酸溶液，使吲哚-3-乙酸终浓度为10mmol/L，涡旋混匀5s，37℃避光孵育30min；
向500μL蛋白低吸附管中加入38μL的100mmol/L二硫苏糖醇溶液，使二硫苏糖醇终浓度为10mmol/L，涡旋混匀5s，37℃孵育30min；
向500μL蛋白低吸附管中加入23.3μL的0.9mg/mL胰蛋白酶溶液，涡旋混匀5s，37℃孵育10h，制得酶解样品。
按照上述方法制备平行6份酶解样品，混合均匀后平分为酶解样品B1-酶解样品B6。
取分别包含列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.72中任意一条所示的氨基酸序列的72中肽段的肽段组合物，制备归一化浓度分别为0.5fmol/μL、2.5fmol/μL、12.5fmol/μL、25fmol/μL、125fmol/μL、250fmol/μL的标准品溶液。
取227μL的酶解样品B1，向其中加入50μL的0.5fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液D1；
取227μL的酶解样品B2，向其中加入50μL的2.5fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液D2；
取227μL的酶解样品B3，向其中加入50μL的12.5fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液D3；
取227μL的酶解样品B4，向其中加入50μL的25fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液D4。
取227μL酶解样品B5，向其中加入50μL的125fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液D5。
取227μL的酶解样品B6，向其中加入50μL的250fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液D6。
SPE柱纯化：
用1mL的甲醇活化，用1mL的水平衡，向SPE柱加入444μL的样品溶液D1，加入556μL的0.1％甲酸溶液，用1mL水清洗SPE柱，用300μL的50％乙腈溶液/0.1％甲酸洗脱，洗脱液收集在离心管中。
将上述洗脱液采用氮吹回溶法，用0.1％甲溶液回溶至200μL。
按照上述方法分别用SOE柱纯化以及采用氮吹回溶样品溶液D2-样品溶液D6。
以与实施例1相同的样品测定方法测定样品溶液D1-D6，制得标准曲线。
对比例样品制备：
取10μL的待测样品至蛋白低吸附管，加入90μL的25mmol/L碳酸氢铵溶液稀释，涡旋混匀，制得稀释样品；
取500μL蛋白低吸附管，分别加入177μL的25mmol/L碳酸氢铵溶液，37μL的10％去氧胆酸钠溶液，30μL的稀释样品，涡旋混匀；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的50mmol/L三(2-羧乙基)膦溶液，使三(2-羧乙基)膦终浓度为5mmol/L，涡旋混匀5s，60℃孵育30min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的100mmol/L吲哚-3-乙酸溶液，使吲哚-3-乙酸终浓度为10mmol/L，涡旋混匀5s，37℃避光孵育30min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入38μL的100mmol/L二硫苏糖醇溶液，使二硫苏糖醇终浓度为10mmol/L，涡旋混匀5s，37℃孵育30min；
向上述500μL蛋白低吸附管中加入23.3μL的0.9mg/mL胰蛋白酶溶液，涡旋混匀5s，37℃孵育16h，制得酶解样品D7。
取227μL酶解样品，向其中加入50μL的25fmol/μL标准样品溶液，加入277μL的1％甲酸溶液，以12000r/min离心10min，沉淀去除去氧胆酸钠，制得样品溶液D7。
SPE柱纯化：
用1mL的甲醇活化，用1mL的水平衡，向SPE柱加入444μL的样品溶液D7，加入556μL的0.1％甲酸溶液，用1mL水清洗SPE柱，用300μL的50％乙腈溶液/0.1％甲酸洗脱，洗脱液收集在离心管中。
将上述洗脱液采用氮吹回溶法，用0.1％甲溶液回溶至200μL。
以与实施例1相同的样品测定方法测定样品溶液D7。
根据下式计算样品溶液D1-D6的蛋白质浓度，之后根据D1-D6的测定结果绘制标准曲线；根据标准曲线计算出样品溶液D7的浓度。
式中，
C样品溶液特定蛋白质表示样品溶液特定蛋白质浓度；
Area样品溶液特征肽段表示样品溶液特定肽段显示的吸收峰面积；
Area标准品特征肽段表示标准品特定肽段显示的吸收峰面积；
C样品溶液特征肽段表示标准品中特定肽段的浓度。
测定结果如表6所示。
表6对比例测定结果
比较实施例1、实施例2以及对比例发现，本发明的方法更加可靠，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)更小，且本申请实施例的需要的操作步骤更加精简，减少了实验时间以及耗材使用量。
对比实施例1和2发现，实施例1中采用3点内标相对于实施例4的4点内标更加准确可靠(其中，以RSD＜20％为定量可靠性标准)，此外，实施例若采用4点内标需要啊的操作步骤以及耗材更多，可见采用3点内标法具有更加有益的效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州量康科技有限公司
<120> 用于血清蛋白质定量测定的肽段组合物及测定方法
<130> JLP16110090BJ
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 1
Asp Ala Asp Pro Asp Thr Phe Phe Ala Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 2
Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 3
Gly Val Thr Phe Leu Leu Arg
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(13)
<400> 4
Leu Gly Asn Gln Glu Pro Gly Gly Gln Thr Ala Leu Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 5
Phe Ser Val Val Tyr Ala Lys
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 6
Ala Ile Gly Tyr Leu Asn Thr Gly Tyr Gln Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe His Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 8
Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 9
Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 10
Thr Gly Ile Ser Pro Leu Ala Leu Ile Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 11
Thr Ala Ala Gln Asn Leu Tyr Glu Lys
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Val Leu Asn Gln Glu Leu Arg
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 13
Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Ala Phe Leu Leu Thr Pro Arg
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 15
Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 16
Ala Thr Val Val Tyr Gln Gly Glu Arg
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 17
Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys
1 5 10
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(20)
<400> 18
Ser Val Val Leu Ile Pro Leu Gly Ala Val Asp Asp Gly Glu His Ser
1 5 10 15
Gln Asn Glu Lys
20
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 19
Leu Asn Asn Gly Glu Ile Thr Gln His Arg
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 20
Val Leu Asp Ala Leu Gln Ala Ile Lys
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 21
Gly Val Ala Ser Leu Phe Ala Gly Arg
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 22
Leu Val Gly Gly Leu His Arg
1 5
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 23
Glu Gly Gly Gln Thr Ala Pro Ala Ser Thr Arg
1 5 10
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 24
Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 25
Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 26
Ala Glu Val Asp Asp Val Ile Gln Val Arg
1 5 10
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 27
Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 28
Thr Ser Glu Ser Gly Leu Pro Ser Thr Arg
1 5 10
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 29
Val Val Gly Gly Leu Val Ala Leu Arg
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 30
Pro Ala Phe Ser Ala Ile Arg
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 31
Ile Ala Phe Ser Ala Thr Arg
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 32
Phe Gln Ser Val Phe Thr Val Thr Arg
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 33
Tyr Thr Thr Glu Ile Ile Lys
1 5
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 34
Thr Asn Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Val Arg
1 5 10
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 35
His Ala Phe Ile Leu Gln Asp Thr Lys
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 36
Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val Lys
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 37
Val Gly Asp Thr Leu Asn Leu Asn Leu Arg
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 38
Val Phe Gln Phe Leu Glu Lys
1 5
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 39
His Thr Ser Leu Gly Pro Leu Glu Ala Lys
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 40
Ser Asp Leu Glu Val Ala His Tyr Lys
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 41
Val Val Glu Glu Ser Glu Leu Ala Arg
1 5
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 42
Glu Glu Leu Leu Pro Ala Gln Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(13)
<400> 43
His Gly Asn Thr Asp Ser Glu Gly Ile Val Glu Val Lys
1 5 10
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 44
Ile Thr Gln Asp Ala Gln Leu Lys
1 5
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 45
Ala Leu Asp Phe Ala Val Gly Glu Tyr Asn Lys
1 5 10
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 46
Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn Thr Lys
1 5 10
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(18)
<400> 47
His Thr Ser Val Gln Thr Thr Ser Ser Gly Ser Gly Pro Phe Thr Asp
1 5 10 15
Val Arg
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 48
Gly Tyr His Leu Asn Glu Glu Gly Thr Arg
1 5 10
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 49
Thr Ala Ser Asp Phe Ile Thr Lys
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 50
Asp Tyr Ala Glu Val Gly Arg
1 5
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(15)
<400> 51
Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
1 5 10 15
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 52
Asn Phe Pro Ser Pro Val Asp Ala Ala Phe Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 53
Thr Leu Glu Ala Gln Leu Thr Pro Arg
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 54
Phe Leu Asn Val Leu Ser Pro Arg
1 5
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(14)
<400> 55
Leu Ala Glu Leu Pro Ala Asp Ala Leu Gly Pro Leu Gln Arg
1 5 10
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(19)
<400> 56
Gly Ser Leu Val Gln Ala Ser Glu Ala Asn Leu Gln Ala Ala Gln Asp
1 5 10 15
Phe Val Arg
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(9)
<400> 57
Ser Leu Ala Pro Thr Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(11)
<400> 58
Ile Thr Leu Pro Asp Phe Thr Gly Asp Leu Arg
1 5 10
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 59
Phe Asn Ala Leu Gln Tyr Leu Arg
1 5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(6)
<400> 60
Ala Leu Gln Val Val Arg
1 5
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 61
Thr Val Gln Ala Val Leu Thr Val Pro Lys
1 5 10
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 62
Glu Thr Leu Leu Gln Asp Phe Arg
1 5
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 63
Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 64
Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe Leu Gln Lys
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(10)
<400> 65
Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys
1 5 10
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 66
Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg
1 5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 67
Thr Ser Ser Ser Phe Glu Val Arg
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 68
Ala Val Leu His Ile Gly Glu Lys
1 5
<210> 69
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(23)
<400> 69
Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg
20
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 70
Glu Leu Pro Glu His Thr Val Lys
1 5
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(7)
<400> 71
Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARSPLIC
<222> (1)..(8)
<400> 72
Val Tyr Phe Ala Gly Phe Pro Arg
1 5
Claims (10)
1.一种用于血清蛋白质定量测定的肽段组合物，其特征在于，所述肽段组合物包括至少两条同位素标记的肽段，所述肽段的序列包含任意一条序列表SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.72中所示的氨基酸序列片段。
2.如权利要求1所述的肽段组合物，其特征在于，所述肽段组合物的肽段摩尔份数为：
3.一种血清蛋白质定量测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下的测定步骤：
S100、样品预处理；
对待测样品进行预处理，将其中的蛋白质酶解为肽段，制得酶解样品；
S200、标准品制备；
将如权利要求1或2所述的肽段组合物溶解，配置两个以上具有不同浓度的肽段组合物标准品溶液；
S300、测定样品制备；
向S100制备的平行酶解样品中分别加入S200制备的任意一个肽段组合物标准品溶液；
加入甲酸溶液，离心去除去氧胆酸钠，制得样品溶液；
S400、样品测定；
采用高效液相色谱-串联质谱测定S300制备的样品溶液；
S500、数据处理；
根据下式计算样品溶液的蛋白质浓度，之后根据处理过程换算为待测样品的蛋白质浓度：
式中：
C样品溶液特征肽段相应的特定蛋白质表示样品溶液特定蛋白质浓度；
AreaM样品溶液特征肽段表示样品溶液特征肽段显示的吸收峰面积；
AreaM标准品特征肽段表示标准品特征肽段显示的吸收峰面积；
CM标准品特征肽段表示标准品中特征肽段的浓度；
M表示具有不同浓度的标准溶液的个数。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述S300测定样品制备还包括：
S310、固相萃取纯化，所述固相萃取纯化是将S300制备的样品溶液采用固相萃取柱进行纯化；
S320、氮吹回溶，所述氮吹回溶是将S310固相萃取纯化后的样品浓缩后回溶。
5.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述样品预处理包括：
以9倍体积的碳酸氢铵溶液稀释待测样品，制得稀释样品。
6.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述样品预处理还包括：
将所述稀释样品与去氧胆酸钠溶液以及碳酸氢铵溶液混合均匀；
加入三(2-羧乙基)膦溶液，于60℃孵育30～60min；
加入吲哚-3-乙酸溶液，于37℃避光孵育30～60min；
加入二硫苏糖醇溶液，于37℃孵育30～60min；
加入胰蛋白酶溶液，于37℃孵育10～16h，制得酶解样品。
7.根据权利要求5或6所述的测定方法，其特征在于，所述碳酸氢铵溶液的浓度为25mmol/L。
8.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，
所述三(2-羧乙基)膦溶液的浓度为50mmol/L，所述加入三(2-羧乙基)膦溶液后，三(2-羧乙基)膦的终浓度为5mmol/L；
所述吲哚-3-乙酸溶液的浓度为100mmol/L，所述加入吲哚-3-乙酸溶液后，吲哚-3-乙酸的终浓度为10mmol/L；
所述二硫苏糖醇溶液的浓度为100mmol/L，所述加入二硫苏糖醇溶液后，二硫苏糖醇的终浓度为10mmol/L；
所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.9mg/mL，对应每微升待测样品加入胰蛋白酶的量为7～8μL。
9.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述具有不同浓度的标准溶液的个数为3-5。
10.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述甲酸溶液的质量浓度为1％，所述加入甲酸溶液后的甲酸终质量浓度为0.5％。
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