CN110734994B - 用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对、探针和检测试剂盒 - Google Patents
用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对、探针和检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对以及所述的引物对配合使用的探针。本发明还公开了一种检测试剂盒。本发明以嗜水气单胞菌中aerA基因为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了嗜水气单胞菌的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。与PCR检测方法相比，本发明的方法省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qPCR相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。
Description
技术领域
本发明涉及引物、探针以及试剂盒，尤其涉及用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对、探针和检测试剂盒。
背景技术
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种广泛存在于水环境的常在病原菌，它不仅能引发多种水生动物的传染病,而且还能导致爬行类、两栖类、鸟类以及哺乳类等多种动物全身性败血症或局部感染，并常致死动物。20世纪90年代以来，该病原菌常引起我国淡水养殖鱼类的暴发性败血症，造成了重大的经济损失，已成为水产养殖动物的主要细菌病之一。近年来大量研究证明，嗜水气单胞菌亦可单独或与其它致病菌共同感染，引发人类的食物中毒、腹泻、败血症以及局部的伤口感染等病症,影响食品安全,并且是免疫抑制病病人和肝功能疾病患者的机会致病菌。因此，嗜水气单胞菌已成为人-兽-鱼共患病原菌。其公共卫生学意义日益受到广泛重视。嗜水气单胞菌属气单胞菌科、气单胞菌属，是革兰氏阴性短杆菌，具有4种抗原和几十种血清型，常见的有10种以上，并且毒力差异较大，可分为致病菌株和非致病菌株。目前，国内外学者普遍认为，嗜水气单胞菌的致病性与其气溶素、溶血素、细胞毒性肠毒素、胞外蛋白酶、细胞肠兴奋性肠毒素等多种毒力基因有着密切关联。
目前嗜水气单胞菌检测及鉴定的方法有很多，过去最常用于检测嗜水气单胞菌的方法葡萄球菌蛋白A协同凝集实验(SPACOA)，该方法快速、特性性强、无需复杂及昂贵的设备，但灵敏度不是太高。此后，出现了酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测嗜水气单胞菌的技术，ELISA检测结果能够量化，容易判断且耗时短，潘子豪等人建立了Dot-ELISA检测嗜水气单胞菌的技术，该技术的灵敏度要高于葡萄球菌蛋白A协同凝集实验(SPACOA)，但嗜水气单胞菌血清型较多且该方法对酶活性要求也高，依赖酶活性的发挥，任何影响酶活性的发挥都有可能影响结果的准确性。另外，该类方法所需的试剂盒价格较昂贵，不利于大面积推广；随着分子生物技术的发展，出现了灵敏度、准确性及稳定性更高的PCR(PolymeraseChain Reaction)技术。
PCR以4种dNTP为底物，在引物存在的情况下，在DNA模板的3’末端进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板核酸得到指数级的扩增。取微量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外检测仪观察并用凝胶成像系统照相，观察是否有目的片段出现。PCR产物的分析一般采用琼脂糖凝胶电泳分析，初步判断PCR产物片段的大小与预计是否一致，令人头痛的问题是普通PCR扩增检测容易出现气溶胶污染，使检测结果出现假阳性。随着分子生物学的发展，逐渐发展了荧光定量PCR技术进行嗜水气单胞菌检测手段。
荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种核酸新定量试验技术，荧光定量PCR是在常规PCR基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在实时荧光定量PCR技术中Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。虽然实时荧光定量PCR简化了操作步骤，采用闭管检测可避免PCR跑胶导致的气溶胶假阳性的出现，敏感性高，可以实现实时监控，还可以实现定量判断。实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，因此难以得到全面推广。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一种新兴的基因扩增技术，由日本学者Notomi2000年在Nucleic Acids Res杂志上公开发表，作为一种分子生物学检测技术，现先已广泛应用于分子检测领域。LAMP原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(如Bst酶)的作用下，水浴锅中63℃左右，60分钟即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有很高的扩增效率，操作简单，检测不需要使用特殊的仪器。LAMP虽然增加了扩增效率，但引物间的非特异性配对容易导致假阳性结果，限制了LAMP方法的使用。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供了一种用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对。本发明通过Vector NTI软件对比文献上列出嗜水气单胞菌常见的保守基因，并选定保守性强的基因作为目标扩增区段，利用Oligo 6软件在保守区分别设计了4对引物和3条探针，将设计好的序列在NCBI上进行BLAST比对，确保种类的保守性及种间的特异性。
本发明的第二目的是提供了与所述的引物对配合使用的探针。
本发明的第三目的是提供了包含上述引物对与引物对配合使用的探针的试剂盒。
技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示，所述下游引的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。
本发明内容还包括与所述的引物对配合使用的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示。
其中，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为SYTO-13，SYTO-82，FAM，FITC,SYBR Green I，SYTO-13，SYTO-82，VIC，HEX，JOE，TAMRA，TET，Cy3，ROX，TEXAS-Red或Cy5中的一种。
其中，所述探针的长度为35-55个核苷酸碱基，位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，所述核酸类似物为THF，在THF的两侧分别为两个T碱基并标记荧光基团和淬灭基团，探针在3’-末端通过封闭基团进行封闭。
一种嗜水气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括引物对和探针；其中，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示。
优选地，所述的检测试剂盒反应体系包括：重组酶、聚合酶、单链DNA结合蛋白、核酸酶、一对及以上所述引物、一条所述探针、dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。
其中，所述重组酶为噬菌体UvsX蛋白或大肠杆菌recA蛋白的任一种或2种的组合。
优选地，所述聚合酶为klenow聚合酶，Bsu聚合酶或phi29聚合酶及其这些酶的突变体或大片段的任一种或一种以上的组合。
优选地，所述单链DNA结合蛋白为大肠杆菌SSB蛋白、GP32蛋白的任一种或2种组合。
优选地，所述核酸酶为核酸外切酶III或核酸内切酶IV的任一种或2种的组合。
其中，所述重组加载蛋白为噬菌体UvsY蛋白，大肠杆菌RecO或大肠杆菌RecR的任一种或2种组合。
其中，所述拥挤试剂为聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或几种的组合。
其中，所述聚乙二醇为PEG1450、PEG3000、PEG8000、PEG10000、PEG14000、PEG20000、PEG25000、PEG30000、PEG35000或PEG40000中的一种或几种组合。
其中，所述能量系统为ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶的一种或一种以上的组合。
其中，所述盐离子为Tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合。
具体的，本发明的引物和探针的组合可以有以下四种组合：
组合一：
上游引物：5’-CTTCAGCGATACCCTGTTCCACTACGAGAT-3’
下游引物：5’-CGTCGTTCCACTGCATCGCTACTTCCACAC-3’
探针：5’-CTTCTGCTACGAAGGCGGCATCAAGGCGT(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)CGAATACCTGAACC(C3-SPACER)-3’
组合二：
上游引物：5’-CGAGCTCTCCTTCCTCAACTCCGGCGTCTC-3’
下游引物：5’-CGCTACTTCCACACCGATGCCATCCTGCTC-3’
探针：5’-CTTCTGCTACGAAGGCGGCATCAAGGCGT(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)CGAATACCTGAACC(C3-SPACER)-3’
组合三：
上游引物：5’-CCATCTTCAGCGATACCCTGTTCCACTACG-3’
下游引物：5’-CGCTGCGGAATGTTGTTGGTGAAGCAGTAG-3’
探针：5’-GGATGAGCGTGACGGCCGCGAGGCGCACT(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)GCTACGAAGGCGGC(C3-SPACER)-3’
或组合四：
上游引物：5’-TCTCCTTCCTCAACTCCGGCGTCTCCATCC-3’
下游引物：5’-CACCATCGCGCTGCGGAATGTTGTTGGTGA-3’
探针：5’-CTTCCTCAACTCCGGCGTCTCCATCCGCC(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)GGATGAGCGTGA(C3-SPACER)-3’
重组酶聚合酶扩增技术在扩增时间、扩增特异性、扩增所需要的能耗等方面均具有明显的优势。原理为通过反应体系中通常为28-35个碱基的两条特异性引物与重组酶形成复合物，在模板DNA上寻找同源序列发生链交换，并在DNA聚合酶作用下发生延伸。经过上下游引物在模板的特异性区段两端分别结合延伸，循环往复发生指数级扩增。扩增产物虽然可通过添加SYBR Green染料实现荧光信号的增加，但因荧光染料无法区分非特异性，而通过反应体系中增加可以被核酸外切酶III或者核酸内切酶IV进行碱基类似物切除的方式的特异性荧光探针技术进行检测，从而大大提高了检测的特异性。
本发明通过NCBI搜索文献上列出常见的嗜水气单胞菌保守基因，利用Vector NTI软件进行比对找出其保守区域，选取保守基因部分区域作为目标扩增区段，将其构建至载体PUC57中，制备成嗜水气单胞菌的阳性质粒，质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，选取的aerA基因部分序列如下：
GGGTATCGTTGTGGCGAGAAGACGGCCATCAAGGTCAGCAACTTTGCATACAACCTGGACCCTGACAGTTTCAAACATGGTGACGTGACCCAGTCTGATCGCCAGCTGGTCAAGACGGTGGTGGGCTGGGCGATCAACGACAGCGACACCCCGCAATCCGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGATACTGCCACCAACTGGTCCAAGACCAATACCTATGGCCTGAGCGAGAAGGTGACCACCAAGAACAAGTTCAAGTGGCCACTGGTAGGAGAAACCGAACTCTCCATCGAGATTGCGGCCAACCAGTCCTGGGCATCCCAGAACGGGGGCTCTACCACCACCTCCCTGTCGCAATCCGTGCGGCCAACTGTGCCGGCCCGCTCCAAGATCCCGGTGAAGATCGAGCTCTACAAGGCTGACATCTCCTATCCCTATGAATTCAAGGCCGATGTCAGCTATGACCTGACGC(SEQ ID NO：12)
本发明利用Oligo 6软件在保守区分别设计了4对引物和3条探针，将设计好的序列在NCBI上进行BLAST比对，确保种类的保守性及种间的特异性。
本发明还包括了检测嗜水气单胞菌的方法，该方法采用的扩增体系同前所述检测试剂盒的体系，该方法至少包括两条引物和一条探针，引物分别结合于待扩增区域的上游和下游，引物的长度为15-45核苷酸碱基，优选为28-35核苷酸碱基；所述探针长度为35-55个核苷酸碱基，优选地46-52个碱基，探针中位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，所述核酸类似物优选为THF，在THF的两侧分别为两个T碱基并标记荧光基团和淬灭基团，探针在3’-末端通过封闭基团进行封闭。引物和探针的组合同前所述的四种组合。
在该扩增体系中，三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0终浓度为20-60mM，更优选为60mM；醋酸钾终浓度为60-120mM，更优选为100mM；引物终浓度为100-500nM，更优选为420nM；聚乙二醇为终浓度5％PEG8000或PEG20000，更优选为5％PEG20000，二硫苏糖醇终浓度为1-10mM，更优选为3mM；ATP终浓度为1-10mM，更优选为2mM；磷酸肌酸终浓度为10-50mM，更优选为20mM；肌酸激酶终浓度为50-250ng/μl，更优选为100ng/ul；噬菌体gp32蛋白终浓度为100-1000ng/μl，更优选为600ng/μl；噬菌体uvsX蛋白终浓度为50-500ng/μl，更优选为150ng/μl；噬菌体uvsY蛋白终浓度为10-100ng/μl，更优选为25ng/μl；klenow聚合酶终浓度为5-100ng/μl，更优选为80ng/μl；核酸外切酶III终浓度为10-200ng/μl，更优选为50ng/μl。
该扩增反应中，反应温度为25-45℃，优选为37-42℃，一般推荐为37℃；反应时间为15-60分钟，优选为15-20分钟。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
(1)本发明以嗜水气单胞菌中aerA基因为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了嗜水气单胞菌的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。
(2)与PCR检测方法相比，本发明的检测试剂盒的使用省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qPCR相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测试剂盒使用时所需时间更短，检测的准确率更高。
(3)本发明的检测试剂盒依赖于酶促扩增反应，在恒定的温度下即可进行连续的扩增反应，其扩增速率远远高于常规的PCR变温反应。整个扩增在20分钟即检测完成；而且在操作上，不需要对多种参数进行设置，不需要具备很专业的技能也可以进行检测操作。
(4)本发明的反应条件为37～42℃，对温度控制不需要特别严格，并且采用了特异性的荧光探针，可以更好的区分非特异性扩增。因此，对于基层测试使用更为便捷，且耗能更低，对于现场操作尤为适合。
附图说明
图1为嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法灵敏度测试结果；数字1代表质粒7的组别，浓度为10-5ng/μl；数字2代表质粒8的组别，浓度为10-6ng/μl；数字3代表质粒9的组别，浓度为10-7ng/μl；数字4代表质粒10的组别，浓度为10-8ng/μl；数字5代表ddH2O；
图2为嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法特异性测试结果；组别分别为嗜水气单胞菌的组别；大肠杆菌；沙门氏菌；志贺氏菌；简达气单胞菌；维氏气单胞菌；异嗜糖气单胞菌和阴性对照ddH2O；
图3为嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增(结合核酸内切酶IV)方法灵敏度测试结果；数字1代表质粒7的组别，浓度为10-5ng/μl；数字2代表质粒8的组别，浓度为10-6ng/μl；数字3代表质粒9的组别，浓度为10-7ng/μl；数字4代表质粒10的组别，浓度为10-8ng/μl；数字5代表ddH2O；
图4为嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法最佳引物浓度测试结果；数字1、3、5、7代表质粒7，浓度为10-5ng/μl；数字2、4、6、8代表ddH2O；
图5为嗜水气单胞菌检测试剂盒灵敏度测试结果；数字1代表质粒7的组别，浓度为10-5ng/μl；数字2代表质粒8的组别，浓度为10-6ng/μl；数字3代表质粒9的组别，浓度为10- 7ng/μl；数字4代表ddH2O；数字5.代表样本1；数字6代表样本2；数字7代表样本3；数字8代表ddH2O；
图6为嗜水气单胞菌检测试剂盒特异性测试结果；组别分别为嗜水气单胞菌的组别；大肠杆菌；沙门氏菌；志贺氏菌；简达气单胞菌；维氏气单胞菌；异嗜糖气单胞菌和阴性对照ddH2O。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。
本发明中采用的嗜水气单胞菌阳性质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，嗜水气单胞菌ATCC7966标准株由江苏省渔业技术推广中心提供。。
实施例1
1、嗜水气单胞菌的阳性质粒的获得：通过NCBI搜索文献上列出常见的嗜水气单胞菌基因，利用Vector NTI软件进行比对找出其保守区域，选取aerA基因部分区域作为目标扩增区段，将其构建至载体PUC57中，制备成嗜水气单胞菌的阳性质粒，质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，选取的aerA基因部分序列如下：
GGGTATCGTTGTGGCGAGAAGACGGCCATCAAGGTCAGCAACTTTGCATACAACCTGGACCCTGACAGTTTCAAACATGGTGACGTGACCCAGTCTGATCGCCAGCTGGTCAAGACGGTGGTGGGCTGGGCGATCAACGACAGCGACACCCCGCAATCCGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGATACTGCCACCAACTGGTCCAAGACCAATACCTATGGCCTGAGCGAGAAGGTGACCACCAAGAACAAGTTCAAGTGGCCACTGGTAGGAGAAACCGAACTCTCCATCGAGATTGCGGCCAACCAGTCCTGGGCATCCCAGAACGGGGGCTCTACCACCACCTCCCTGTCGCAATCCGTGCGGCCAACTGTGCCGGCCCGCTCCAAGATCCCGGTGAAGATCGAGCTCTACAAGGCTGACATCTCCTATCCCTATGAATTCAAGGCCGATGTCAGCTATGACCTGACGC(SEQ ID NO：12)
2、选择通过步骤1合成的含有嗜水气单胞菌aerA基因序列的质粒为检测目标，
上游引物序列是：5’-CGGCCATCAAGGTCAGCAACTTTGCATACA-3’(Seq ID NO：1)；
下游引物序列是：5’-TCGATGGAGAGTTCGGTTTCTCCTACCAGT-3’(Seq ID NO：2)；
探针序列是：5’-TCACCCTACGTTACGATACTGCCACCAAC(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)CCAAGACCAATACCTA(C3-SPACER)-3’(SEQ ID NO：9)
利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
30mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5％ 聚乙二醇(分子量20000)
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
80ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-)
50ng/μl 核酸外切酶III
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒，2μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。重组酶聚合酶扩增不需要复杂的样品DNA前处理过程，不需要模板的热变性，反应在较低的恒定温度条件下完成，反应敏感度高，特异性强，上机检测20min即可出结果。反应通过荧光数值判读，省去了PCR产物电泳验证的过程，避免了气溶胶污染。
模板处理：用NanoDrop标定阳性质粒的浓度，用TE先将其稀释至10ng/μl(命名为质粒1)，随后10倍依次稀释，稀释至1ng/μl(命名为质粒2)、稀释至10-1ng/μl(命名为质粒3)、稀释至10-2ng/μl(命名为质粒4)、稀释至10-3ng/μl(命名为质粒5)、稀释至10-4ng/μl(命名为质粒6)、稀释至10-5ng/μl(命名为质粒7)、稀释至10-6ng/μl(命名为质粒8)、稀释至10- 7ng/μl(命名为质粒9)、稀释至10-8ng/μl(命名质粒10)；经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-6ng/μl(命名为质粒8)(结果参见图1)，灵敏度完全能达到应用需求。
实施例2
选取如下引物及探针序列：
上游引物序列是：5’-CGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGATAC-3’(SEQ ID NO：3)；
下游引物序列是：5’-CACGGATTGCGACAGGGAGGTGGTGGTAGA-3’(SEQ ID NO:4)；
探针序列是：5’-TCACCCTACGTTACGATACTGCCACCAAC(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)CCAAGACCAATACCTA(C3-SPACER)-3’(SEQ ID NO：9)
通过合成含有嗜水气单胞菌aerA基因序列的质粒为检测目标，进行重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法版本扩增测试，构建50μl扩增反应体系如下：
60mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5％ 聚乙二醇(20000)
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
80ng/μl klenow 聚合酶大片段(exo-)
50ng/μl 核酸外切酶III
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒，2μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以上述合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例1，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-7ng/μl质粒9。
核酸提取：细菌基因组DNA抽提试剂盒(DC06KA7232)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，取嗜水气单胞菌培养液10μl，基因组提取过程按照试剂盒内标准抽提步骤，将提取好的核酸进行分装，冻存于-20℃备用。
特异性检测：为了验证引物及探针的特异性，分别以常见菌株大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、简达气单胞菌、维氏气单胞菌、异嗜糖气单胞的阳性样本为模板进行检测；经过检测仅嗜水气单胞菌阳性样品出现正常扩增，阴性对照(ddH2O)及大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、简达气单胞菌、维氏气单胞菌、异嗜糖气单胞阳性样品均未出现扩增(见图2)。
实施例3
选择实施例2中设计的引物对和探针序列，利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸内切酶IV)方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
60mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5％ 聚乙二醇(分子量20000)
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
400ng/μl 大肠杆菌recA蛋白
200ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
60ng/μl 大肠杆菌recO蛋白
40ng/μl 大肠杆菌recR蛋白
60ng/μl 大肠杆菌recF蛋白
8Units 枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I
50ng/μl 核酸内切酶IV
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 荧光探针
模板为合成的阳性质粒，2μl
扩增温度为42℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例2，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-7ng/μl质粒9，灵敏度与重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法基本相同(见图3)。
实施例4
选择通过合成含有嗜水气单胞菌aerA基因序列的质粒为检测目标，
上游引物序列是：5’-CAGCAACTTTGCATACAACCTGGACCCTGA-3’(SEQ ID NO:5)；
下游引物序列是：5’-CATAGGGATAGGAGATGTCAGCCTTGTAGA-3’(SEQ ID NO:6)；
探针序列是：5’-TCCGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGA(FAM-dT)(THF)C(BHQ1-dT)GCCACCAACTGGTC(C3-SPACER)-3’(SEQ ID NO：10)
利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
30mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
50mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5％ 聚乙二醇(分子量20000)
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
80ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-)
4U/μl 逆转录酶
50ng/μl 核酸外切酶III
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒，2μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例1，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-5ng/μl质粒7。
实施例5
选择通过合成含有嗜水气单胞菌aerA基因序列的质粒为检测目标，
上游引物序列是：5’-CGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGATACT-3’(Seq ID No.7)；
下游引物序列是：5’-CGCAGGAAGCCACTCAGCGTCAGGTCATAGC-3’(Seq ID No.8)；
探针序列是：5’-TCAACGACAGCGACACCCCGCAATCCGGT(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)GATGTCACCCTACG(C3-SPACER)-3’(SEQ ID NO：11)
利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
30mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5％ 聚乙二醇(分子量20000)
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 噬菌体gp32蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
70ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-)
50ng/μl 核酸外切酶III
450μM dNTP
400nM 每条上游引物
400nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒，2μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例1，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-4ng/μl质粒6。
综上，实施例1为最佳实施例，最佳引物及探针分别是SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9的组合。
实施例6
引物用量的优化
选取如下引物及探针序列：
上游引物序列是：5’-CGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGATAC-3’(SEQ ID NO：3)；
下游引物序列是：5’-CACGGATTGCGACAGGGAGGTGGTGGTAGA-3’(SEQ ID NO:4)；
探针序列是：5’-TCACCCTACGTTACGATACTGCCACCAAC(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)CCAAGACCAATACCTA(C3-SPACER)-3’(SEQ ID NO：9)
利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法扩增反应体系进行扩增，构建50μl扩增反应体系如下：
60mM 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
100mM 醋酸钾
14mM 醋酸镁
3mM 二硫苏糖醇
5％ 聚乙二醇(分子量20000)
2mM ATP
20mM 磷酸肌酸
100ng/μl 肌酸激酶
600ng/μl 大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl 噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl 噬菌体uvsY蛋白
80ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-)
50ng/μl 核酸外切酶III
450μM dNTP
420nM 每条上游引物
420nM 每条下游引物
120nM 每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒，2μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒为模板进行检测，引物浓度分别为400nM、420nM、450nM，500nM。
模板处理：同实施例1，经过检测最终确认不同引物浓度的扩增体系都能检测到10-5ng/μl(命名为质粒7)(结果参见图4)；但相对应的上下游引物浓度为420nM的扩增体系最优。
实施例7
试剂盒的组成
构建的50μl扩增反应体系，将试剂盒组分划分4种，具体如下：
实施例8
采用试剂盒进行实际的应用验证并进行性能评估
选择实施例7中，利用所配试剂盒检测嗜水气单胞菌样本的灵敏度、特异性以及稳定性，具体扩增体系同实施例7。
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒作为阳性质控进行检测。
核酸提取：细菌基因组DNA抽提试剂盒(DC06KA7232)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，取嗜水气单胞菌培养液10μl，基因组提取过程按照试剂盒内标准抽提步骤，将提取好的核酸进行分装，冻存于-20℃备用。用TE将提取好的核酸进行10倍稀释(命名为样本1)，然后依次稀释至103倍(命名为样本3)。
特异性检测：为了验证嗜水气单胞菌检测试剂盒的特异性，分别以常见菌株大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、简达气单胞菌、维氏气单胞菌、异嗜糖气单胞的阳性样本为模板进行检测。
综上，嗜水气单胞菌检测试剂盒经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-7ng/μl(质粒9)，同时样本核酸检测最终确认其灵敏度能检测到稀释103倍(见图5)；经过检测仅嗜水气单胞菌阳性样品出现正常扩增，阴性对照(ddH2O)及大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、简达气单胞菌、维氏气单胞菌、异嗜糖气单胞阳性样品均未出现扩增(见图6)。
序列表
<110> 江苏水产渔业推广中心、金陵科技学院、海门水产技术指导站
<120> 用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对、探针和检测试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 1
cggccatcaa ggtcagcaac tttgcataca 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgatggaga gttcggtttc tcctaccagt 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 3
cggttatgat gtcaccctac gttacgatac 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 4
cacggattgc gacagggagg tggtggtaga 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcaacttt gcatacaacc tggaccctga 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 6
catagggata ggagatgtca gccttgtaga 30
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 7
cagcaacttt gcatacaacc tggaccctga t 31
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcaggaagc cactcagcgt caggtcatag c 31
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 探针序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaccctacg ttacgatact gccacaactg tccaagacca ataccta 47
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 探针序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tccggttatg atgtcaccct acgttacgat ctgccaccaa ctggtc 46
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 探针序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcaacgacag cgacaccccg caatccggtt tgatgtcacc ctacg 45
<210> 12
<211> 472
<212> DNA
<213> aerA基因部分序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggtatcgtt gtggcgagaa gacggccatc aaggtcagca actttgcata caacctggac 60
cctgacagtt tcaaacatgg tgacgtgacc cagtctgatc gccagctggt caagacggtg 120
gtgggctggg cgatcaacga cagcgacacc ccgcaatccg gttatgatgt caccctacgt 180
tacgatactg ccaccaactg gtccaagacc aatacctatg gcctgagcga gaaggtgacc 240
accaagaaca agttcaagtg gccactggta ggagaaaccg aactctccat cgagattgcg 300
gccaaccagt cctgggcatc ccagaacggg ggctctacca ccacctccct gtcgcaatcc 360
gtgcggccaa ctgtgccggc ccgctccaag atcccggtga agatcgagct ctacaaggct 420
gacatctcct atccctatga attcaaggcc gatgtcagct atgacctgac gc 472
Claims (4)
1.一种嗜水气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括引物对和探针；其中，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5’-CGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGATAC-3’，所述下游引物的核苷酸序列为5’-CACGGATTGCGACAGGGAGGTGGTGGTAGA-3’；所述探针的核苷酸序列为5’-TCACCCTACGTTACGATACTGCCACCAAC（FAM-dT）G（THF）（BHQ1-dT）CCAAGACCAATACCTA（C3-SPACER）-3’。
2.据权利要求1所述的嗜水气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒反应体系包括：重组酶、聚合酶、单链DNA结合蛋白、核酸酶、一对所述引物、一条所述探针、dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子；所述拥挤试剂为聚乙二醇，所述聚乙二醇为PEG1450、PEG3000、PEG8000、PEG10000、PEG14000、PEG20000、PEG25000、PEG30000、PEG35000或PEG40000中的一种或几种的组合；所述能量系统为ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶的一种或几种的组合。
3.根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于：所述重组酶为噬菌体UvsX蛋白或大肠杆菌recA蛋白的任一种或2种的组合。
4.根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于：所述核酸酶为核酸外切酶III或核酸内切酶IV的任一种或2种的组合。
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| MGB探针实时定量PCR检测致病性嗜水气单胞菌;高建忠等;《安徽农业科学》;20091231;第37卷(第19期);第8911页右栏 * |
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