CN1978665A - 水生实验动物剑尾鱼病原菌－嗜水气单胞菌pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种水生实验动物剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的病原菌-嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的PCR检测试剂盒及检测方法。本方法是根据从剑尾鱼中分离的嗜水气单胞菌的气溶素基因设计的一对引物，采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对水生实验动物剑尾鱼及其培育的水体环境的嗜水气单胞菌特异的气溶素基因进行定性检测，简便快速、特异性好、灵敏度高。可用于剑尾鱼培育各阶段的细菌跟踪监测，也可用于培育水体的环境监测，避免培育的水生实验动物被嗜水气单胞菌污染，具有较高的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及水生实验动物—剑尾鱼的病原菌的检测试剂盒及检测方法，特别涉及一种嗜水气单胞菌的基因检测试剂及检测方法，适用于水生实验动物科学微生物监测、基因工程技术等领域。
背景技术
实验动物是生物医学、药学和生命科学研究的基础和重要支撑条件，实验动物包括陆生实验动物和水生实验动物。由于水域环境的特殊性，水生实验动物作为水域污染的“监测器”，具有陆生实验动物无可替代的优势。随着近年来环保意识的增强，我国水生实验动物科学得到了迅猛发展。RR-B系剑尾鱼(Xiphophorus helleri)由近交选育的方式，已培育到第26代，是我国培育的第一个水生实验动物品系。
水生实验动物要满足清洁级、无特定病原体级(SPF)要求，细菌的早期监测技术是非常重要的。嗜水气单胞菌(Xiphophorus helleri)属弧菌科气单胞菌属，是淡水水体中的常见细菌，嗜水气单胞菌产生的毒素引起剑尾鱼出血、溃疡等症状，为观赏用途养殖剑尾鱼的常见病原菌；也是剑尾鱼纯系培育系统需重点防范的细菌，是水生实验动物剑尾鱼早期监测最重要的细菌。
目前，对剑尾鱼感染嗜水气单胞菌的检测主要采用常规生物化学检测。常规生化检测技术容易出现过多的假阳性、假阴性现象；需要将待测菌株进行较长时间的培养，检测周期长，通常要五到七天才能完成一次待测样品。因而需要发展灵敏度高、快速、简便的检测方法。
聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，简称PCR技术)是上世纪80年代发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、灵敏、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。
发明内容
本发明的目的是利用剑尾鱼病原菌嗜水气单胞菌气溶素基因设计一对引物，采用PCR反应体系，在此基础上进行优化和设计，提供水生实验动物—剑尾鱼的嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒及方法。该试剂盒简单、操作简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于剑尾鱼培育各阶段的细菌跟踪监测，也可用于培育水体的环境监测，避免培育的水生实验动物被嗜水气单胞菌污染，具有较高的实用价值。
本发明的剑尾鱼嗜水气单胞菌PCR检测试剂盒包括下列部件：
(1)1号液，样品稀释液，1管，内装1×PBS，pH7.4。
(2)2号液，PCR反应液，1管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O，含Mg2+的10×Buffer，dNTP，引物Ah01，Ah02和TaqE。
(3)3号液，阳性对照液，1管，内装从剑尾鱼分离的嗜水气单胞菌的总DNA。
(4)4号液，阴性对照液，1管，内装从剑尾鱼分离的温和气单胞菌的总DNA。
(5)盒子，可装上述1～4号液。
上述剑尾鱼病原菌嗜水气单胞菌PCR检测试剂盒中所述的一对引物Ah01和Ah02是根据嗜水气单胞菌气溶素前肽基因的碱基排列顺序而设计的，其DNA序列分别如下：
Ah01：5’-CCA AGG GGT CTG TGG CGA CA-3’
Ah02：5’-TTT CAC CGG TAA CAG GAT TG-3’
用本试剂盒检测水生实验动物剑尾鱼的病原菌嗜水气单胞菌的方法，按下列步骤进行：
(1)取新鲜待检样品，加入1号液稀释10-20倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆。
(2)6000-8000r/min离心5-10min。
(3)取上清200μL，煮沸15min，立刻放于冰上5-10min。
(4)6000-8000r/min离心10min，上清作PCR提取。
(5)分别取模板、3号液(阳性对照液)和4号液(阴性对照液)，加入到2号液(PCR反应液)中，混匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(6)按下列条件进行扩增：95℃10min，1个循环；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min 1个循环。
(7)反应结束后，取5-10μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20-30min后，于紫外仪上观察，若在209bp处出现明亮的发应条带，则为嗜水气单胞菌阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
本发明的意义：
本发明的水生实验动物剑尾鱼的病原菌—嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒及检测方法，是根据从剑尾鱼中分离的嗜水气单胞菌气溶素前肽基因的碱基排列顺序设计合成的一对引物为主体而研制的。利用该对引物，可以特异性扩增携带嗜水气单胞菌的待测样品的气溶素基因片段，所建立的优化PCR检测体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。使用本发明的试剂盒及检测方法，一般只需要3-4个小时就可以对一组待检样品进行检测，待检样品中只要有10个左右的嗜水气单胞菌菌体就可检测到存在，克服了常规生化检测周期长的缺点，提高了检测的灵敏和准确度。本检测试剂盒可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染嗜水气单胞菌的剑尾鱼，还可检测水环境中的嗜水气单胞菌，极大地方便了水生实验动物剑尾鱼培育系统中嗜水气单胞菌的早期监测。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1；水生实验动物剑尾鱼病原菌—嗜水气单胞菌PCR检测试剂盒
该试剂盒由下列部分构成(10样份)：
(1)1号液，样品稀释液，1管，5mL/管，内装1×PBS，pH7.4。
(2)2号液，PCR反应液，1管，250uL/管，内装PCR扩增反应液(25uL体系)，包括ddH2O，含Mg2+的10×Buffer，dNTP，引物Ah01，Ah02和TaqE。
(3)3号液，阳性对照液，1管，20uL/管，内装从剑尾鱼分离的嗜水气单胞菌JY-1的总DNA，作为阳性模板。
(4)4号液，阴性对照液，1管，20uL/管，内装从剑尾鱼分离的温和气单胞菌J-21的总DNA。
(5)长方体盒子，9.0×6.0×6.4cm3。
(6)一块泡沫板，其大小与盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm；第二排五个孔，孔径1.0cm；第三和四排分别为7个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
该试剂盒中一对引物Ah01和Ah02的DNA序列为：
Ah01：5’-CCA AGG GGT CTG TGG CGA CA-3’
Ah02：5’-TTT CAC CGG TAA CAG GAT TG-3’
PCR扩增反应体系(25uL体系)为：
ddH2O 21uL
10×Buffer 1.8uL
dNTP 0.4uL
引物Ah01 0.3uL
引物Ah02 0.3uL
TaqE 0.2uL
实施例2：水生实验动物剑尾鱼病原菌—嗜水气单胞菌PCR检测方法
使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)用无菌操作方法，取新鲜剑尾鱼肝脏组织0.05克，加入样品稀释液(1号液)500uL稀释10倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆；
(2)6000r/min离心6min。
(3)取上清200μL，煮沸15min，立刻放于冰上5-10min。
(4)6000r/min离心10min，上清作PCR模板。
(5)分别取模板、3号液(阳性对照液)和4号液(阴性对照液)，加入到2号液(PCR反应液)中，混匀后离心8sec，置于PCR反应仪上。
(6)按下列条件进行扩增：95℃10min，1个循环；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min 1个循环。
(7)反应结束后，取5-10μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20-30min后，于紫外仪上观察，若在209bp处出现明亮的发应条带，则为嗜水气单胞菌阳性；若无反应条带出现，则为阴性(见图1)。
实施例3：剑尾鱼培育水体中嗜水气单胞菌的检测
使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)吸取待测水体水样。
(2)涂布于水样于营养琼脂培养基上分离培养。
(3)挑取待测菌落于500uLPBS中，吹打均匀。
(4)12000r/min离心5min，PBS重悬，洗涤2次。
(5)洗涤后的沉淀加入双蒸水50uL，煮沸5min，立刻放于冰上5-10min。
(6)12000r/min离心5min，上清作PCR模板。
(7)分别取模板、3号液(阳性对照液)和4号液(阴性对照液)，加入到2号液(PCR反应液)中，混匀后离心8sec，置于PCR反应仪上。
(8)按下列条件进行扩增：95℃10min，1个循环；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min 1个循环。
(9)反应结束后，取5-10μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20-30min后，于紫外仪上观察，若在209bp处出现明亮的发应条带，则为嗜水气单胞菌阳性；若无反应条带出现，则为阴性(见图1)。
图1为感染嗜水气单胞菌的剑尾鱼肝脏组织及培育水体的PCR扩增结果。
其中1.温和气单胞菌J-21(阴性对照)；
2.剑尾鱼肝脏组织样品A；
3.剑尾鱼肝脏组织样品B；
4.培育水体样品C；
5.培育水体样品D；
6.嗜水气单胞菌JY1(阳性对照)；
7.分子量标准.
Claims (2)
1.水生实验动物剑尾鱼病原菌—嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒，其特征是包括下列部件：
(1)1号液，样品稀释液，1管，内装1×PBS，pH7.4。
(2)2号液，PCR反应液，1管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O，含Mg2+的10×Buffer，dNTP，引物Ah01，Ah02和TaqE；Ah01为5’-CCA AGG GGT CTG TGGCGA CA-3’；Ah02为5’-TTT CAC CGG TAA CAG GAT TG-3’。
(3)3号液，阳性对照液，1管，内装从剑尾鱼分离的嗜水气单胞菌的总DNA。
(4)4号液，阴性对照液，1管，内装从剑尾鱼分离的温和气单胞菌的总DNA。
(5)盒子，可装上述1～4号液。
2.一种检测水生实验动物剑尾鱼的病原菌—嗜水气单胞菌的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：
(1)取新鲜待检样品，加入1号液稀释10-20倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆。
(2)6000-8000r/min离心5-10min。
(3)取上清200μL，煮沸15min，立刻放于冰上5-10min。
(4)6000-8000r/min离心10min，上清作PCR提取。
(5)分别取模板、3号液(阳性对照液)和4号液(阴性对照液)，加入到2号液(PCR反应液)中，混匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(6)按下列条件进行扩增：95℃10min，1个循环；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min 1个循环。
(7)反应结束后，取5-10μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20-30min后，于紫外仪上观察，若在209bp处出现明亮的发应条带，则为嗜水气单胞菌阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
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