CN106947804B - 血吸虫感染性钉螺检测方法及该方法所用的试剂盒和引物 - Google Patents

血吸虫感染性钉螺检测方法及该方法所用的试剂盒和引物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及寄生虫病传播媒介检测领域，具体而言，涉及一种血吸虫感染性钉螺检测方法及该方法所用的试剂盒和引物。所述试剂盒包括权利要求2所述的LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶；所述反应混合液中含有羟基萘酚蓝作为指示剂。所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对；还包括一条LF环引物。利用该检测方法的试剂盒可以有效、快速、高特异地对血吸虫感染性钉螺进行检测。

Description

血吸虫感染性钉螺检测方法及该方法所用的试剂盒和引物
技术领域
本发明涉及寄生虫病传播媒介检测领域，具体而言，涉及一种血吸虫感染性钉螺检测方法及该方法所用的试剂盒和引物。
背景技术
血吸虫也称裂体吸虫(schistosoma)。血吸虫寄生于多数脊椎动物，卵穿过静脉壁进入膀胱，随尿排出。幼虫在中间宿主螺类体内发育。成熟幼虫通过皮肤或口进入终宿主体内。曼森氏裂体吸虫(S.mansoni,即曼氏血吸虫)在大、小肠静脉中，主要分布于非洲和南美洲北部。卵随粪便排出。幼虫进入螺体，再通过皮肤回到终宿主体内。日本裂体吸虫(S.japonicum,即日本血吸虫)主要见于中国大陆、日本、台湾、东印度群岛和菲律宾，除人外，还侵袭其他脊椎动物，如家畜和大鼠等。埃及裂体吸虫(S.Haematobium，即埃及血吸虫)主要分布于非洲、南欧和中东。埃及血吸虫生活在膀胱静脉内，卵穿过静脉壁进入膀胱，随尿排出。
钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主，是日本血吸虫病的唯一的传播媒介。消灭血吸虫感染性钉螺可以阻断血吸虫病的传播与流行。对血吸虫感染性钉螺的分布进行调查，有选择性地进行化学灭螺是提高血吸虫病传播阻断效果，最大限度地保护生态平衡的一个重要手段。
血吸虫感染性钉螺的现有检测方法有肉眼观察法、压片镜检法、孵化法、循环抗原检测法等。这些方法具有程序繁琐、周期长、成本高、特异性差等缺点。环介导等温扩增法(LAMP)是近年发展起来的新型核酸检测技术，作为一种恒温核酸扩增技术，环介导等温扩增法具有检测特异性好、灵敏度高、时间短、无需热循环设备等优点，而在病原体检测中得到广泛应用。扩增结果的判定方法有3种：(1)琼脂糖电泳后，用EB或SYBR Green I等染色检验是否有梯状条带；(2)肉眼观测副产物焦磷酸镁沉淀，产物呈阳性的反应的可见管内液体浑浊或者离心后在管底见白色沉淀；(3)产物中加SYBR Green I或其他类似双链DNA染料，肉眼观察颜色反应，呈绿色的为阳性反应。
然而，现有的环介导等温扩增法在应用于血吸虫感染性钉螺方面还存在一些亟需改善的地方，由于LAMP使用的引物较多，所以更容易产生引物二聚体，因此使用常规的SYBRGreen等荧光染色试剂常常会造成结果的假阳性；扩增结果的观察，需要反应结束后将显色试剂加入，才能观察结果，不能实时观察反应结果，开盖行为还容易使得扩增得到的高浓度DNA对实验环境造成污染。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血吸虫感染性钉螺检测方法及该方法所用的试剂盒和引物，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
用于检测血吸虫感染性钉螺的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对；
所述F3、B3、FIP以及BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～4所示。
优选的，如上所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的LAMP引物组，所述引物组还包括一条LF环引物，所述LF环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothemal amplification,LAMP)是近年来发展出来的一种核酸扩增技术。通过设计识别目的片段6个序列的4个特异引物，整个反应可以在恒温(60～65℃)条件下1h内完成，由于采用4个引物，与传统的核酸扩增技术相比，它具有敏感、特异的特点。反应不需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器，对操作人员的熟练度和专业水平要求不高，因此该方法特别适合基层或者实验条件较差的试验室进行病原微生物的快速检测。
引物的特异性是LAMP检测方法成败的关键。引物的设计及筛选有其独特的设计原则及规律。LAMP反应中内引物FIP/BIP和外引物F3/B3的特异性决定了反应的特异性。
LAMP技术的引物设计，比PCR技术要复杂。它针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物。若再增加一对环引物(1oop primer)，便可使反应加速，提高扩增效率。引物Tm值是影响LAMP反应正常进行的关键因素，在AT/GC含量正常的引物组中，本申请F3/B3引物的Tm值位于59～61℃范围内，FIP/BIP的Tm值位于59～61℃范围内，在此温度内引物的扩增效率最佳。
LAMP中的环引物是在LAMP反应中形成环的部位进行加速的，可以提高扩增效率、缩短反应时间。
本发明所采用的各引物的Tm值均符合筛选原则，同时为保证引物末端的稳定性，F3/B3，F2/B2，LF/LB的3’末端⊿G值要小于等于-4Kcal/mol，F1c和B1c的5’端的⊿G值要小于等于-4Kcal/mol。环引物LF位于F1c和F2c之间，LF 3’末端⊿G值也要小于等于-4Kcal/mol。
引物之间的距离，从F2 5’端到B2 5’端在120-180bp之间，从F2的5’端到F1c的3’端也就是茎环这一段在40-60bp之间，从F2的5’端到F3的3’端在0-20bp之间。引物自身不能形成二级结构。
一种用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2所述的LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶；
所述反应混合液中含有羟基萘酚蓝作为指示剂。
本发明检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为检测血吸虫感染性钉螺提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。
羟基萘酚蓝是一种金属离子指示剂，由于反应过程中随着Mg2+含量减少会逐渐从浅紫色变成天蓝色，且与本领域常用的SYBR Green I相比，只有有效扩增反应发生，才会出现颜色变化，故不会出现因引物二聚体导致的假阳性。
此外，羟基萘酚蓝的显色不需要额外添加任何成分，因此不会对反应体系的稳定性造成干扰。
优选的，如上所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，所述反应混合液包括如下成分：
pH为8.6～9.0的15mM～25mM Tris–HCl、1.2mM～1.6mM dNTPs、8mM～12mM KCl、100μM～140μM羟基萘酚蓝、8mM～12mM(NH4)2SO4、6mM～10mM MgSO4、0.6M～1.0M甜菜碱以及体积百分数为0.07％～0.13％的Tween 20。
优选的，如上所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为16U/μL。
Bst DNA聚合酶来源于Bacillus stearothermophilus。它有5'→3'的聚合酶活性和双链特异的5'→3'外切酶活性，但没有3'→5'外切酶活性。具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性，在体外DNA等温扩增反应中起重要作用。
优选的，如上所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，所述外引物对、内引物对与环引物的摩尔比为1:(7～9)：(3～5)。
优选的，如上所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，所述试剂盒还包括去离子水。
优选的，如上所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，所述试剂盒还包括标准血吸虫DNA的阳性对照。
一种血吸虫感染性钉螺检测方法，包括：
提取待检测的钉螺基因组DNA，添加权利要求3～6任一项所述的试剂盒中的试剂进行恒温反应；反应过程中观察反应液的颜色变化，浅紫色的为阴性反应，天蓝色为阳性反应。
优选的，如上所述的血吸虫感染性钉螺检测方法，所述恒温反应的条件为：
60℃～65℃恒温反应40min～80min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、由于LAMP使用引物为4条，是常规PCR的一倍，再加上环引物，更容易产生引物二聚体。引物二聚体也是双链DNA，对SYBR Green I等荧光染色试剂也显示绿色，也就是说即使靶DNA未有效扩增，有引物二聚体存在也会有绿色荧光的阳性反应，从而导致假阳性结果；本发明使用反应相关的羟基萘酚蓝作为指示剂，只有有效扩增反应发生，才会出现颜色变化，故不会出现因引物二聚体导致的假阳性。
2)、现有技术扩增结果的观察，需要反应结束后将显色试剂加入，才能观察结果，不能实时观察反应结果；此外，观察结果时需要将PCR管打开，添加显色试剂，由于经过扩增的DNA产物浓度很高，高达初始浓度的109倍，极易造成实验环境污染。本发明使用的羟基萘酚蓝指示剂，对反应体系几乎没有抑制作用，可以直接加到反应体系中，在反应过程中随时可以看到颜色变化，不必等到反应完全结束才观察结果，也不需要打开PCR管。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为LF引物加入后反应速度大大提高；图1中目标DNA是由十个毛蚴感染钉螺后提取总DNA；1-1：横坐标为时间(分钟)，纵坐标为软件计算相对值；1-2：横坐标为时间(分钟)，纵坐标为浑浊度；
图2为样本中加入LF引物后反应速度大大提高，不加LF的体系在60分钟内未获得有效扩增；图2中目标DNA是由一个毛蚴感染钉螺后提取总DNA；2-1：横坐标为时间(分钟)，纵坐标为软件计算相对值；2-2：横坐标为时间(分钟)，纵坐标为浑浊度；
图3为加水阴性对照在延长反应时间后也出现阳性反应；图3中目标DNA是由一个毛蚴感染钉螺后提取总DNA或水阴性对照；1-1：横坐标为时间(分钟)，纵坐标为软件计算相对值；1-2：横坐标为时间(分钟)，纵坐标为浑浊度。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
钉螺总DNA的提取方法
1)、钉螺的准备：无论是新鲜采集的钉螺，还是90％乙醇保存的钉螺，均用蒸馏水漂洗3遍后，置吸水纸上吸干水分；然后置于两个干玻片之间将其压碎。
2)、组织裂解：将钉螺所有组织及部分壳置于1.5毫升离心管中，依次加入200微升裂解液(4M尿素，200mM Tris,20mM NaCl，200mM EDTA,pH7.4)和40微升蛋白酶K(1mg/mL)，迅速混匀，55度孵育1.5-3小时，直到液体澄清，软组织都被消化。用1毫升注射器(去针头)来回吹吸3次。
3、核酸沉淀：加200微升结合液(6M盐酸胍，10M尿素，10mM Tris-HCL,20％TritonX-100(v/v),pH 4.4),立刻混匀，70度孵育10分钟。加入100微升异丙醇，充分混匀。
4、膜吸附核酸：将所有液体转移到吸附柱，8,000g离心1分钟，弃穿透液；
5、去抑制剂：吸附柱中加入500微升抑制剂去除液(5M盐酸胍，20mM Tris-HCL,40％无水乙醇(v/v),pH 6.6)，8,000g离心1分钟，弃穿透液；
6、洗涤:吸附柱中加入500微升洗涤液(20mM NaCl，2mM Tris-HCL,80％无水乙醇(v/v),pH 7.5)，8,000g离心1分钟，弃穿透液。重复一次；
7、洗脱DNA：吸附柱中加入100微升70度预热的洗脱液(10mM Tris-HCL,pH 8.5)，8,000g离心1分钟。
8、冻存洗脱下来的DNA液待测。
实施例2
环介导等温DNA扩增：取3个0.2mL PCR用薄壁管，分别标记为阳性对照管，检测管，阴性对照管；
各管中依次加入如下成分：
反应混合液：15mM Tris–HCl(pH8.6)、1.6mM dNTPs、8mM KCl、140μM羟基萘酚蓝、12mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、1.0M甜菜碱(Sigma–Aldrich)以及体积百分数为0.13％的Tween 20；
16U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)；
混合引物：0.2μM F3和0.2μM B3、1.4μM FIP和1.4μM BIP以及1.0μM LF；所述F3、B3、FIP、BIP以及LF的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～5所示。
检测管中加入5μL实施例1制备得到的DNA；阴性对照管加入5μL去离子水阴性对照；阳性对照管加入标准血吸虫DNA的阳性对照。
短暂离心后放于65℃恒温水浴锅中反应40min。反应过程中，如果有靶DNA扩增就会有显色反应，随时可以观察颜色变化。
实施例3
环介导等温DNA扩增：取3个0.2mL PCR用薄壁管，分别标记为阳性对照管，检测管，阴性对照管；
各管中加入如下成分：
反应混合液：25mM Tris–HCl(pH9.0)、1.2mM dNTPs、8mM KCl、100μM羟基萘酚蓝、8mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4、0.6M甜菜碱(Sigma–Aldrich)以及体积百分数为0.07％的Tween20；
16U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)；
混合引物：0.2μM F3和0.2μM B3、1.8μM FIP和1.8μM BIP以及0.6μM LF；所述F3、B3、FIP、BIP以及LF的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～5所示。
检测管中加入5μL实施例1制备得到的DNA；阴性对照管加入5μL去离子水阴性对照；阳性对照管加入标准血吸虫DNA的阳性对照。
短暂离心后放于60℃恒温水浴锅中反应80min。反应过程中，如果有靶DNA扩增就会有显色反应，随时可以观察颜色变化。
实施例4
环介导等温DNA扩增：取3个0.2mL PCR用薄壁管，分别标记为阳性对照管，检测管，阴性对照管；
各管中加入如下成分：
反应混合液：20mM Tris–HCl(pH8.8)、1.4mM dNTPs、10mM KCl、120μM羟基萘酚蓝、10mM(NH4)2SO4、8mM MgSO4、0.8M甜菜碱(Sigma–Aldrich)以及体积百分数为0.10％的Tween20；
16U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)；
混合引物：0.2μM F3和0.2μM B3、1.6μM FIP和1.6μM BIP以及0.8μM LF；所述F3、B3、FIP、BIP以及LF的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～5所示。
检测管中加入5μL实施例1制备得到的DNA；阴性对照管加入5μL去离子水阴性对照；阳性对照管加入标准血吸虫DNA的阳性对照。
短暂离心后放于63℃恒温水浴锅中反应60min。反应过程中，如果有靶DNA扩增就会有显色反应，随时可以观察颜色变化。
实验例1引物设计
由于日本血吸虫经过长期进化，与宿主高度适应，保留了很多与宿主相似的基因，找到一个特异的靶基因作为检测目标，实在不易。为了避开众多基因家族和表达基因的干扰，我们选择了一段非结构基因的基因组DNA序列(GenBank:FN328142.1)作为靶标。
GenBank:FN328142.1
原序列
Figure BDA0001144321480000091
Figure BDA0001144321480000101
由此获得外部引物对，F3和B3，以及内部向前引物FIP(由F1c和F2组成)、内部向后引物(由B1c和B2组成)，以及加速引物LF。所有引物的方向都是5’→3’。
大量研究和应用结果表明，没有环引物的LAMP法是不成功的，首先，其反应速度较慢；相反地，加了环引物的反应大大提速(图1)。其次，对于拷贝数较低的样本，其达到检测灵敏度的反应时间过长，往往超过通常的反应时间60分钟，因而在通常的60分钟反应时间里无法检测到有效扩增(图2)。然而，不能为了获得有效扩增而无限延长反应时间，因为延长反应时间，阴性对照也会产生阳性反应(图3)。
实验例2
1、灵敏性研究
1)、标准靶DNA分子模板的制备
取纯化的阳性对照样本DNA，用TE缓冲液进行稀释100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，0.01fg，0.001fg。
2)、环介导等温DNA扩增与结果判断
取0.2mL PCR用薄壁管30个，按实施例4所述的方法加样并操作，区别在于，依次所加DNA为上步制备的标准靶DNA分子模板(1～9号管)，多余的一个管加入5μL去离子水作为阴性对照(10号管)。每个样品做3个重复
反应过程中，在自然光下观察1～8管之间无差异，都能显示天蓝色的阳性反应。第9、10管为浅紫色。说明该方法的敏感性为0.01fg/μL DNA。
2、重复上述实验，用10个已知感染毛蚴的钉螺样本及10个未感染毛蚴的钉螺样本进行实验。
将公开号为CN10145728A，公开日为2009年6月17日的发明专利申请文本实施例中记载的方法作为对比组。实验组与对比组的操作由同一名操作人员同时进行，所以样本均为上述的20个样本，操作时注意将样本随机放置。
读取实验结果时，由两个研究人员分别读取，做实验的研究人员与读取实验结果的研究人员互相之间无沟通。
结果显示：本发明对感染毛蚴的钉螺都检测到阳性(10/10)，对未感染毛蚴的钉螺检测均为阴性(10/10)。而在对比组中，因样本黄绿色与对照差别不明显，两人判断结果不一致，分别为感染毛蚴的钉螺有7或8个阳性(7/10，8/10)，未感染毛蚴的钉螺9或8个阴性(9/10，8/10)。
综上所述，本发明提供的环介导等温扩增(LAMP)技术提供了4条引物和一条环引物，在等温条件下可有效、快速、高特异地扩增靶序列。本发明使用了羟基萘酚蓝指示剂，可以实时观察显色反应，而且反应结束后不用开盖，大大减少污染机会。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶；
所述反应混合液中含有羟基萘酚蓝作为指示剂；
所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对；
所述F3、B3、FIP以及BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～4所示；
所述引物组还包括一条LF环引物，所述LF环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，其特征在于，所述反应混合液包括如下成分：
pH为8.6～9.0的15mM～25mM Tris–HCl、1.2mM～1.6mM dNTPs、8mM～12mM KCl、100μM～140μM羟基萘酚蓝、8mM～12mM(NH4)2SO4、6mM～10mM MgSO4、0.6M～1.0M甜菜碱以及体积百分数为0.07％～0.13％的Tween 20。
3.根据权利要求1所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为16U/μL。
4.根据权利要求1所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，其特征在于，所述外引物对、内引物对与环引物的摩尔比为1:(7～9)：(3～5)。
5.根据权利要求1所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括去离子水。
6.根据权利要求1所述的用于检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准血吸虫DNA的阳性对照。
7.一种用于非疾病诊断目的的血吸虫感染性钉螺检测方法，其特征在于，包括：
提取待检测的钉螺基因组DNA，添加权利要求1～6任一项所述的试剂盒中的试剂进行恒温反应；反应过程中观察反应液的颜色变化，浅紫色的为阴性反应，天蓝色为阳性反应。
8.根据权利要求7所述的血吸虫感染性钉螺检测方法，其特征在于，所述恒温反应的条件为：
60℃～65℃恒温反应40min～80min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101457258A (zh) * 2008-12-26 2009-06-17 江苏省血吸虫病防治研究所 一种血吸虫感染性钉螺检测试剂盒及其检测方法

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