CN110484626A - 一种日本血吸虫中间宿主钉螺感染诊断的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种日本血吸虫中间宿主钉螺感染诊断的检测方法，本发明利用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示的一个检测日本血吸虫感染的引物组合建立了一种日本血吸虫感染的检测方和检测试剂盒。本发明能快速、准确地将被检钉螺中的日本血吸虫检测出来，同时适用于动物日本血吸虫感染的检测以及环境中日本血吸虫的监测。本检测方法检出率高、灵敏度高、特异性强、准确性高和设备简单，因此具有很好的应用前景和推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及寄生虫分子检测技术领域，更具体地，涉及一种日本血吸虫中间宿主钉螺感染诊断的检测方法。
背景技术
血吸虫病是由血吸虫感染引起的严重影响人类健康以及社会经济发展的人兽共患寄生虫病，寄生于人体的血吸虫主要有日本血吸虫(Schistosomajaponicum)、曼氏血吸虫(S.mansoni)、埃及血吸虫(S.haematobium)、间插血吸虫(S.intercalatum)、湄公血吸虫(S.mekongi)和马来血吸虫(S.malayensis)。根据世界卫生组织(WHO)统计，全球共有74个国家的流行地区约有2亿人仍受到血吸虫病的影响和威胁。据统计，截至2016年底，我国仍有约5.4万血吸虫病患者，局部地区的防治形势依然严峻。在我国，引起血吸虫病的主要病原体是日本血吸虫，是我国重要的公共卫生问题之一。
日本血吸虫的生活史包括虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫和成虫7个阶段。钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主。虫卵孵化出的毛蚴遇到钉螺后感染钉螺，经过母胞蚴、子胞蚴的无性繁殖阶段发育成尾蚴。尾蚴在水中经合适的温度和光照后从钉螺体内逸出，集中于水面，当人或一些哺乳动物接触尾蚴后，尾蚴利用吸盘粘附于皮肤表面并分泌组织蛋白酶，借助尾部摆动和身体伸缩力量钻入宿主皮肤感染宿主。在宿主体内，尾蚴经童虫阶段最终发育为成虫。
目前，检测日本血吸虫病的方法主要包括流行病学诊断、临床诊断和实验室诊断三大类。实验室诊断主要包括病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断。病原学诊断方法主要包括粪便直接涂片法、定量透明厚涂片法、改良加藤厚涂片法、自然沉淀法、尼龙袋集卵法、毛蚴孵化法、直肠或乙状结肠黏膜活组织检查及病理检查。免疫学诊断方法主要有包括皮内试验、环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验、免疫酶染色法和单克隆抗体-酶等。虽然这些方法也被广泛应用于临床诊断和流行病学调查，但同时也暴露出不少问题。病原学诊断方法易漏检，且常需重复多次。免疫学诊断并非直接检测病原体，敏感性较低且特异性不足。以核酸扩增技术为基础的分子生物学技术迅速发展，为寄生虫病的诊断提供了快速、灵敏、特异及稳定的检测方法。
2000年，Notomi报道了一种新的核酸扩增技术，即环介导等温核酸扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP)。这种新的核酸扩增技术特异性甚高且快速高效。该技术的关键是需要能识别靶序列上8个特定区域的6个特异引物，和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，即Bst DNA聚合酶。反应恒定温度为60～65度，时间仅需要0.5到1个小时。LAMP技术相比PCR具有以下优点：灵敏度高；特异性强；快速高效，在1h内即可完成，若在靶序列上进一步设计两条促环形成引物，扩增时间将在原来的基础上减少1/3～1/2；设备简单，在恒温金属浴锅或水浴锅中即可完成；产物检测方便，可肉眼直接观察焦磷酸镁沉淀或荧光显色剂SYBR GreenⅠ显色来判定结果。
目前，缺乏一种高效的检测钉螺中日本血吸虫感染的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种基于环介导的等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的快速检测日本血吸虫中间宿主钉螺是否被感染的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明通过设计一套日本血吸虫的特异性引物，提取被检钉螺样品中总DNA，进行LAMP扩增，采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳方法对扩增产物进行鉴定分析，判定所述样品钉螺是否为阳性；同时，本方法消除了传统PCR抑制因子对扩增的影响，提供一种灵敏高效的快速检测方法。
因此本发明要求保护一个检测钉螺的日本血吸虫感染的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示。
所述的引物组合在检测日本血吸虫感染或制备日本血吸虫感染检测试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护一种日本血吸虫感染的检测试剂盒，包括所述的引物组合。
优选地，还包括LAMP试剂。
优选地，所述LAMP试剂为10×Reaction buffer、MgSO4、dNTP Mix、ddH2O、Bst DNApolymerase。
优选地，所述LAMP反应体系为2.5μl的10×Reaction buffer、1.5μl的MgSO4(100mM)、3.5μl dNTP Mix(10mM)、2μl所述引物组合的混合物、13.5μl的ddH2O、1μl的BstDNA polymerase和1μl的DNA。
优选地，所述LAMP反应程序为60℃反应60min。
优选地，所述试剂盒的检测对象包括但不限于钉螺、人等其他日本血吸虫宿主。
最优选地，一种检测日本血吸虫感染的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示的引物组和基因组序列。
其使用方法包括以下步骤：
1、待检样本DNA的提取：
2、环介导的等温扩增
扩增体系为：2.5μl的10×Reaction buffer、1.5μl的MgSO4(100mM)、3.5μl的dNTPMix(10mM)、2μl引物组合的混合物、13.5μl ddH2O、1μl Bst DNA polymerase和1μl DNA。
扩增程序为：60℃恒温反应60min。
3、扩增产物分析：
采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
显色反应：加入1～2μl的荧光显色剂1000×SYBR GreenⅠ至25μl的环介导等温扩增的最终产物，在自然光下用肉眼观察结果。若扩增产物变为黄绿色则为日本血吸虫阳性，若扩增产物为棕色则为日本血吸虫阴性。
采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物：取25μl的环介导等温扩增的最终反应产物5μl，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭染料的2％的琼脂糖凝胶中，180～200v电泳1h，在凝胶成相系统上成像观察结果。
以上任一所述试剂盒在检测日本血吸虫感染中的应用也属于本发明的保护范围
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明能快速、准确地将被检钉螺中的日本血吸虫检测出来，同时适用于动物日本血吸虫感染的检测以及环境中日本血吸虫的监测，具有很好的应用前景和推广价值。
1、检出率高：直接提取中间宿主总DNA，提高了日本血吸虫感染钉螺的检出率；
2、灵敏度高：LAMP检测方法灵敏度高，利用琼脂糖凝胶电泳检测LAMP对日本血吸虫尾蚴基因组DNA的灵敏度可达10fg/μl，与传统PCR相比，LAMP检测的灵敏度高3个数量级。同时，与SjCaBP、ShDraI、SjR2、Sm1-7相比，LAMP检测28S序列具有更高的灵敏度；
3、特异性强：3对引物对靶序列的8个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；
4、准确性高：Bst DNA聚合酶与传统PCR的Taq酶不同，不易受其它大分子有机物影响，另外LAMP反应体系中添加了牛血清白蛋白(BSA)，从而降低了螺类样品中PCR抑制因子对LAMP反应的干扰，提高了检测的准确率；
5、设备简单：不需要昂贵的PCR仪，在恒温水浴锅或金属浴锅中即可完成。
附图说明
图1为LAMP扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域。
图2为LAMP方法检测日本血吸虫中间宿主的方法流程图。
图3为本发明对日本血吸虫LAMP检测方法敏感性检测结果；M：DNA Marker；1～14泳道：依次为1:1(1/2)、1:2(3/4)、1:4(5/6)、1:8(7/8)、1:16(9/10)、1:32(11/12)、1:64(13/14)倍稀释的血吸虫DNA样品，初始浓度为10pg/μl；23：阳性钉螺；24：ddH2O。
图4为对日本血吸虫LAMP检测结果和扩增产物中加入荧光显色剂SYBR GreenⅠ后照片，DNA浓度为1ng/μl。
图5为对日本血吸虫LAMP反应后扩增产物中加入荧光显色剂SYBR GreenⅠ后照片，DNA浓度为100pg/μl。
图6为对日本血吸虫LAMP反应后扩增产物中加入荧光显色剂SYBR GreenⅠ后照片，DNA浓度为10pg/μl。
图7为对日本血吸虫LAMP检测结果和扩增产物中加入荧光显色剂SYBR GreenⅠ后照片，DNA浓度为100fg/μl。
图8为对日本血吸虫LAMP检测结果，DNA浓度为10fg/μl。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
蛋白酶K裂解液的组分及配比：先配置SNET缓冲液：pH为8.0的20mmol/L Tris5mmol/L的EDTA，400mmol/L的NaCl，1％十二烷基硫酸钠。再用SNET缓冲液溶解蛋白酶K，使其最终工作浓度为400μg/ml。
实施例1引物设计
一、实验方法
根据日本血吸虫的28S序列(GenBank:Z46504.4，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)设计适用于LAMP的特异引物组合，并进行特异性、灵敏度和扩增效率的筛选。
二、实验结果
根据特异性、灵敏度和扩增效率的筛选确定了一组检测日本血吸虫感染的LAMP的特异引物组合，其序列如下：
外引物对F3(SEQ ID NO:1)：5’-AAGTCGGAAACCGCTAAGG-3’；
外引物对B3(SEQ ID NO:2)：5’-GCTTACGCCTGAGGCTTC-3’；
内引物对BIP(SEQ ID NO:3)：
5'-GCTGGGCCTATGCTGTGTGACCCTCCTACTCGTTGCCAT-3'；
内引物对FIP(SEQ ID NO:4)：
5'-GGTATAGGTCCAACGCTCGAGCGTGTAACAACTCACCTGCCG-3'；
促环形成引物对Loop F(SEQ ID NO:5)：
5'-CCATTTTCAGGGCTGGTTGATT-3'；
促环形成引物对Loop B(SEQ ID NO:6)：
5'-GGGCAAGCTGCACTTGG-3'。
其引物与扩增目标片段的结合区域间见图1。
实施例2一种检测日本血吸虫感染的试剂盒
一、组成
核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示的引物组和10×Reaction buffer、MgSO4(100mM)、dNTP Mix(10mM)、ddH2O、Bst DNA polymerase。。
二、使用方法(如图2所示)
1、待检样本DNA的提取：
1)收集待测样本；
2)向步骤1)的待测样品加入200μl蛋白酶K裂解液，于55℃水浴锅消化4～8h；
3)将步骤2)的样品取出，加入体积比为25：24：1的等体积的酚：氯仿：异戊醇抽提，取水相加等体积的异丙醇沉淀；
4)将步骤3)收集到的沉淀，用100μl的70％乙醇洗涤，再用8000rpm高速离心8min，弃上清，自然晾干DNA样品；
5)用50μl TE溶解DNA样品。
2、环介导的等温扩增
扩增体系为：2.5μl 10×Reaction buffer、1.5μl 100mM MgSO4、3.5μl 10mMdNTP Mix、2μl引物混合物、13.5μl的ddH2O、1μl的Bst DNA polymerase和1μl的DNA。
扩增程序为：60℃金属恒温浴反应60min。
3、扩增产物分析：
采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
显色反应：加入1～2μl的荧光显色剂1000×SYBR GreenⅠ至25μl的环介导等温扩增的最终产物，在自然光下用肉眼观察结果。若扩增产物变为黄绿色则为日本血吸虫阳性，若扩增产物为棕色则为日本血吸虫阴性。
采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，其步骤为：取25μl的环介导等温扩增的最终反应产物5μl，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭染料的2％的琼脂糖凝胶中，180-200v电泳1h，在凝胶成相系统上成像观察结果。
对照例检测敏感性效果分析
一、实验方法
基于普通PCR法对不同浓度的血吸虫DNA样品进行检测，10pg/μl DNA样品与纯水按照1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64倍稀释。
二、实验结果
结果如图3所示，基于普通PCR法对日本血吸虫敏感性的检测结果。M：DNA Marker；1-14：依次为1:1(1/2)、1:2(3/4)、1:4(5/6)、1:8(7/8)、1:16(9/10)、1:32(11/12)、1:64(13/14)倍稀释的血吸虫DNA样品，初始浓度为10pg/μl。23：阳性钉螺；24：ddH2O。结果显示，本发明的检测引物对日本血吸虫检测方法敏感性非常高，即使使用普通PCR法，DNA样本稀释8倍，仍然有很好的检测效果。
实施例3检测敏感性效果分析
一、实验方法
钉螺样本去除外壳，取钉螺肉30mg～50mg作为待测样本，使用实施例2的试剂盒对不同浓度的样本DNA进行LAMP检测，以SjCaBP、ShDral、SjR2、Sm1-7基因作为对照，其中扩增引物分别为：
SjCaBP
| SJ CBP-F3 | GACCTACCAGAAAACAGCT |
| SJ CBP-B3 | CCATTAAGACATTTTCGATCATGT |
| SJ CBP-FIP | TCACCTGTGTATATTTCATGTGCAT-AACTGGGTTGAAATAATCACCA |
| SJ CBP-BIP | TAACCTGTATTACTGCCCACTCA-CAAATGAATGATCTTGTCACAC |
ShDral
| SH DraI-F3 | gat ctc acc tat cag acg |
| SH DraI-B3 | GTC ACC AAT AAT ATG AAAC |
| SH DraI-FIP | CCACCAACAATTTTAAATTTT ATCAGACGAAACAAAGAAAAT |
| SH DraI-BIP | GGTCGTATCGTTGTGAAATTTT CACCAATAATATGAAACAAT |
SjR2
| SJ SiR2-F3 | TGGTTGAAAATTGATGGTAGT |
| SJ SiR2-B3 | CCTCAGACCTTGAGTAGC |
| SJ SiR2-FIP | GTCATCACGATAGGCAAGCCC-CAAATGTATCCATTCTTCATCTTCC |
| SJ SiR2-BIP | CCAACCGAGCTATACTGGCT-TCTCATCGTTCTCCAATCG |
| SJ SiR2-LF1 | CCACGTCAAGGTAGCAGCTA |
| SJ SiR2-LB1 | TGTAGGTTCTACCATGCCAGGC |
Sm1-7
| SM Sm17-F3 | GAT CTG AAT CCG ACCAACCG |
| SM Sm17-B3 | AAC GCC CAC GCT CTC GCA |
| SM Sm17-FIP | AAATCCGTCCAGTGGTTTTTTTGAAAATCGTTGTATCTCCG |
| SM Sm17-BIP | CCGAAACCACTGGACGGATTTTTATTTTTAATCTAAAACAAAC ATC |
血吸虫DNA样品的浓度为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、100fg/μl和10fg/μl。
二、实验结果
实验结果如图4到8所示，图4为DNA浓度为1ng/μl时利用不同基因对日本血吸虫LAMP检测结果；图5为DNA浓度为100pg/μl时利用不同基因对日本血吸虫LAMP检测结果；图6为DNA浓度为10pg/μl时利用不同基因对日本血吸虫LAMP检测结果；图7为DNA浓度为100fg/μl时利用不同基因对日本血吸虫LAMP检测结果；图8为DNA浓度为10fg/μl时利用不同基因对日本血吸虫LAMP检测结果。结果显示，本发明的检测引物对日本血吸虫检测方法敏感性非常高远远高于针对SjCaBP、ShDral、SjR2、Sm1-7基因的检测引物，检测灵敏度可以达到10fg/μl。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种日本血吸虫中间宿主钉螺感染诊断的检测方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagtcggaaa ccgctaagg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttacgcct gaggcttc 18
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgggccta tgctgtgtga ccctcctact cgttgccat 39
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtataggtc caacgctcga gcgtgtaaca actcacctgc cg 42
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccattttcag ggctggttga tt 22
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggcaagctg cacttgg 17
<210> 7
<211> 3897
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgctgaattt aagcatatca ctaagcggag gaaaagaaac taacaaggat tcccctagta 60
actgcgagtg aacagggatt agcccaacac cgaagcctgc ggttatttga tcgtaaggca 120
atgtggtgtt taggttggct tcaggcatta ctgctctacc ccaagtccag cattgagtac 180
ggcttaccgt cctggcccat agagggtgaa aggcccgtgg gggtagagac catgtatgac 240
agttttgttc tgagctaccc ttggagtcgg gttgtttgtg aatgcagccc aaagtgggtg 300
gtagactcca tccaaggcta aatacttaca cgagtccgat agcaaacaag taccgtgagg 360
gaaagttgaa aagtactttg aagagagagt aaacagtgcg tgaaaccgtt caaaggtaaa 420
cgggtggagt tgaactgcaa gctctgggga ttcagctgat gagtatgatt tgtgcttggg 480
catactggcc gccttcagtg tctgtttgta acagcaggtg cctacctttt ataatggggt 540
gggtatgtgt agacgttctt atacggcgca cgcattggag gtgtgagggt ctgcttgtca 600
gtgcactttc tcagagtatt caccacgacc ggcattgctg cctttctact atggccaaac 660
tgatcaggtt tgactattat tgttgagctt ggttgggtcg gcaggtgact ctttggttcg 720
taattaatta ttatggacca tgagtgttac taaccggctg tagtggaatt gtgtagtgtg 780
tcggagatgg cggcttcacg tgcgtgcttt gtccttcggg cattaatgag tctggtcggc 840
ttgttactag cttcggttag tctgctgatg gcttgtttat gtcacgttgg cagttgcgta 900
tgtgagcttt tgaatgggcc aatagtctgt ggtgtagtgg tagacgatcc acctgacccg 960
tcttgaaaca cggaccaagg agtttaacat gtgcgcgagt cattgggcgt tacgaaaccc 1020
aaaggcgaag tgaaggtaaa ggttcggctt tcagtccgaa ctaaggtgag atcctgttgc 1080
cttgctcata ctttccaagt tgcgagcagc gggcgcatca ccggcccgtc ccatgacgta 1140
gacatgcgac cttgtgttgc gtgcaccgtc ggggcggagc aagagcgtac acgttgagac 1200
ccgaaagatg gtgaactatg cttgcgaagg ttgaagccag aggaaactct ggtggaggac 1260
cgtacccatt ctgacgtgca aatcgatcgt ataacgtgag tataggggcg aaagactaat 1320
cgaaccatct agtagctggt tccctccgaa gtttccctca ggatagctgg cattctgaga 1380
aattaaacag ttttatccgg taaagcgaat gattagaggc attggggata aaacatcctc 1440
aacctattct caaactttaa atgggtgaga agcttaactc gcttaagtgg agttttgcat 1500
tgaatgtgag tgccaagtgg gccatttttg gtaagcagaa ctggcgctgt gggatgaacc 1560
aaacgttcgg ttaaggtgcc taacgtgacg ctcatgagat accacaaaag gtgttggttg 1620
gtccagacag caggacggtg gccatggaag tcggaaaccg ctaaggagtg tgtaacaact 1680
cacctgccga atcaaccagc cctgaaaatg gatggcgctc gagcgttgga cctataccga 1740
accgttgcta taagctgggc ctatgctgtg tgagggcaag ctgcacttgg tccaggcatg 1800
gagtaatggc aacgagtagg agggtcgctg tggctagcgg gaagcctcag gcgtaagcct 1860
aggtgaagca accacaggcg cagatcttgg tggtagtagc aaatattcaa gtgagaacct 1920
tgaaggccga ggtggagaag ggttccatgg gaacagcagt tgaccatggg tcaggcggtc 1980
ctaagtgatc cggtaaatcg gaacagagac ggggtgcctg acattgtccg ttttacgggc 2040
tttgttcagt attactgcat caaagtacaa agttgtagat cgcagccccc tgtaacgaaa 2100
gggaatcggg ttaatattcc cgaccctgtc cacggagatt ggtgtatgtt tcgggcattt 2160
tttgttcggc atgcaccgag cgcggtaacg caaccgacct cggagatgtc ggcgagagtt 2220
ctgggaagag ttctcttttc tttgttagga gtgcatccac cccctggaat cggcttgtcc 2280
ggagataggg ggctagcctc cgtaaagcac cacccttctt gtggtgtccg gaacgctctt 2340
gtcggccctt gaaaatccga gctaggcagt ataattttcg tggcaggccg tacccatatc 2400
cgcagcaggt ctccaaggtg aacagcctct ggcaattgaa caatgtaggt aagggaagtc 2460
ggcaaattgg atccgtaact tcgggagaag gattggctct gggggccgag tcagacaggc 2520
cgagatcaga tacgtgtcgg tccagttggg ggctggtttc ttctctgctt tgtgttccgt 2580
tctacggtgc gcattgtggt gaggttactg gactctgatc cgggtcgatc gtgggcggtt 2640
tcagctgtta gtgttatgca actagcaacg cgcgaggact tgtgccacgt tgcgtcaagc 2700
ggttgtattt ccatggtctg gcgcgcgacg gctaactcag aactggcacg gaccagggga 2760
atccgactgt ctaattaaaa caaagcattg cgatgtccac tgattggttt tgacgcaatg 2820
tgatttctgc ccagtgctct gaatgtcaaa gtgaagaaat tcaaccaagc gcgggtaaac 2880
ggcgggagta actatgactc tcttaaggta gccaaatgcc tcgtcatcta attagtgacg 2940
cgcatgaatg gattaacgag attcccactg tccctatcta ctatctagcg aaaccacagc 3000
caagggaacg ggcttggcag aattagcggg gaaagaagac cctgttgagc ttgactctag 3060
tccgactttg tgaggagaca tgatggatgt agtataggtg ggagctgagt gcctcggtgc 3120
ttagcgcata tgagatacca ctgctatcat tgtttcttta cttattcagt gaaacgggaa 3180
cgaaatatgt attttggttc aaagcacatt ccgggatgcg tagtctaacg ctgcgtgtgt 3240
cggtatcttg gtcatgtcag atgagtcgtg gtgcatgcta cggtgtttga gtcttgatgt 3300
gatgtgcgac ccgttctgaa gaccatgtca ggcggggagt ttgactgggg cggtacatcc 3360
gtcaaatggt aacgcgggtg tcctatggta agctcagtca ggacagaaac ctggcgtaga 3420
gtaaaagggc aaaagcttac ttgattttga ttttcagtac gaatacagac cgtgaaagcg 3480
tggcctatcg atccttttga tgttattttc agagtttgaa gcaagaggtg tcagaaaagt 3540
taccacaggg ataactggct tgtggcggcc aagcgttcat agcgacgtcg ctttttgatc 3600
cttcgatgtc ggctcttcct atcattgtga agcagaattc accaagcgtt ggattgttca 3660
cccactaata gggaacgtga gctgggttta gaccgtcgtg agacaggtta gttttaccct 3720
actaatgagt acgtcatttt aatcagtgaa gtacaatctg gccgttgcta tggtaatcct 3780
gtttagtacg agaggaaccg caggttcaga taattggtat atgtgcctgg tcgaaaggcc 3840
aatggtgcga agctaccatc tgagggatta agactgaacg cctctaagtc agaatca 3897
Claims (8)
1.一个检测日本血吸虫感染的引物组合，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示。
2.权利要求1所述的引物组合在检测日本血吸虫感染或制备日本血吸虫感染检测试剂盒中的应用。
3.一种日本血吸虫感染的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括LAMP试剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂为10×Reactionbuffer、MgSO4、dNTP Mix、ddH2O、Bst DNA polymerase。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应体系为2.5μl 10×Reaction buffer、1.5μl 100mM MgSO4、3.5μl 10mM dNTP Mix、2μl权利要求1所述引物组合的混合物、13.5μl ddH2O、1μl Bst DNA polymerase和1μl DNA。
7.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应程序为60℃反应60min。
8.权利要求3到7任一所述试剂盒在检测日本血吸虫感染中的应用。
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