CN103409521A

CN103409521A - 一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒

Info

Publication number: CN103409521A
Application number: CN2013103428702A
Authority: CN
Inventors: 贾万忠; 倪兴维; 娄忠子; 闫鸿斌; 李宏民; 李立
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-08-08
Filing date: 2013-08-08
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-08
Also published as: CN103409521B

Abstract

本发明公开一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的LAMP检测试剂盒。本发明的试剂盒内包括有SEQ ID №1、SEQ ID №2、SEQ ID №3和SEQ ID №4四条引物，或者包括由前述四条引物构成的引物反应混合物，本发明建立的LAMP方法可克服现有技术费时费力、敏感性和特异性低的缺点，能够不需要特殊的仪器设备而只需要常规的水浴锅，且不需长时间直接接触就可以实现检测，并具有高敏感性、特异性好和灵敏性高的优点，且检测反应敏感、快速，操作简单，适用于临床和实验室进行快速准确的病原学鉴定。

Description

一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测被检样品中是否有寄生虫的检测试剂盒，特别是一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒。

背景技术

棘球蚴病（Echinococcosis），又称包虫病（hydatid disease）是由棘球属（Echinococcus）绦虫的幼虫—棘球蚴（echinococcus or hydatid cyst）寄生于动物（包括人）体内，引起一类人畜共患寄生虫病，该病不仅严重危害人体健康，而且阻碍畜牧业发展，每年造成的经济损失上亿元。该病呈世界性分布，而我国是主要的高发区。石渠棘球绦虫（Echinococcus. shiquicus, Es）是棘球属绦虫种的新发现种，因2005年首次在四川石渠地区发现而得名，该绦虫与棘球属中的多房棘球绦虫形态上相似，主要寄生在狐狸及高原属兔内(Xiao N, Qiu J, Nakao M, et al. Echinococcus shiquicus n. Sp., a taeniid cestode from Tibetan fox and plateau pika in China. Int J Parasitol, 2005, 35(6): 693-701.)。目前的研究报道表明，该物种主要在我国青藏高原的野生动物体之间存在和流行，世界其他国家及地区均无该物种的发现报道，也无人及家养动物感染的相关报道，但这并不能证明该物种不感染人或家养动物并在这些物种间流行传播。因此，建立一种快速有效的石渠棘球绦虫(蚴)的检测方法对了解该地区石渠棘球绦虫(蚴)的感染状况，并制定和采取相应的预防和控制措施具有重要的意义。

然而，已有的石渠棘球绦虫(蚴)的检测方法主要是常规的病原学检测法，即剖检感染动物，在显微镜下对寄生宿主肠道粪便进行虫体或虫卵及肝肺寄生的囊尾蚴的检测。该方法存在费时费力，敏感性和特异性都较低等缺陷，并且还具有感染人和周围环境的危险。而对于该物种的分子生物学检测方法还较少，并且存在特异性差、灵敏性偏低和操作繁琐的问题。

发明内容

本发明提供一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒。

本发明的一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒内包括有SEQ ID №1、SEQ ID №2、SEQ ID №3和SEQ ID №4四条引物，或者检测试剂盒内包括有特异性引物的反应混合物，特异性引物反应混合物由SEQ ID №1和SEQ ID №2各40pmol和SEQ ID №3和SEQ ID №4各5pmol构成。

为方便使用，本发明的用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒内还有LAMP buffer缓冲液；dNTP混合液；Bst DNA 聚合酶；标准石渠棘球绦虫(蚴)阳性基因组DNA；6×或SYBR GreenⅠ显色剂，其中的上样缓冲液由0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液构成，缓冲液中的各组分比例为容积比。

本发明的试剂盒实际上是一种LAMP检测试剂盒，LAMP是环介导的恒温扩增技术(Loop-mediated isotheral amplification method, LAMP），它是在2000年由Notomi T.等发明了一种高敏感性的DNA扩增技术（Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., Hase, T., 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28, E63.），到目前为止，尚无应用LAMP方法检测石渠棘球绦虫(蚴)病原的报道。

本发明是建立在分子生物学基础上，基于石渠棘球绦虫线粒体nad5基因和环介导等温扩增（LAMP）的方法制备的试剂盒，在应用中用本发明试剂盒中的4条特异引物对被检样品进行扩增，然后对扩增后的产物用SYBR GreenⅠ显色剂显色或进行核酸电泳，根据显色情况或电流图中是否出现特异性条带确定出被检样品是否被石渠棘球绦虫（蚴）感染。这种试剂盒既可以用于中间宿主的感染检测，也可以用于终末宿主的感染检测。与本发明相关的操作过程包括从疑似石渠棘球绦虫感染的中间宿主病灶组织（包囊及其内容物）及终末宿主粪便中提取全基因组DNA，配制含4条引物和全基因组模板的LAMP反应体系，进行LAMP反应后用SYBR GreenⅠ显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。用本发明的4条特异性检测引物，用以犬科动物为终末宿主的细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus, Es）、多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis, Em）、带状带绦虫DNA（Taenia taeniaeformis, Tae）、泡状带绦虫（Taenia hydatigena, Th）、豆状带绦虫（Taenia pisiform, Tp）、多头带绦虫（Taenia multiceps, Tm）和犬复孔绦虫（Dipylidium caninum, DC）基因组DNA为模板进行特异性验证扩增，均未见荧光显色或核酸电泳条带，表明检测引物特异性高。与石渠棘球绦虫目前已存在的多重PCR(muhiplex PCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、半巢式PCR等3种检测棘球蚴的PCR检测方法（周正斌，朱淮民. 检测动物棘球蚴的3种PCR方法的比较. 2011, 38(3), P148-153.）相比，本发明建立的LAMP方法最小核酸检出量为10 pg，远低于上述三种参照方法253 pg的最低检测量，且三种参照方法均存在特异性不好的问题，与其它绦虫有交叉反应，也无法一步完成反应和鉴定，操作过程繁琐。

本发明中建立的LAMP方法可克服现有技术费时费力、敏感性和特异性低的缺点，能够不需长时间直接接触且只需要常规的水浴锅就可以具有高敏感性和特异性的特异性好和灵敏性高，且检测反应敏感、快速，操作简单，不需要特殊的仪器设备，适用于临床和实验室进行快速准确的病原学鉴定。

附图说明

图1为本发明的LAMP扩增及显色结果，其中：1为石渠棘球蚴DNA扩增；2为阴性对照。

图2为本发明的LAMP扩增及酶切电泳检测结果的电泳图，图中： 1为DL1000；2为石渠棘球蚴DNA扩增；3为阴性对照；4为酶切结果。

图3为本发明特异性试验检测结果的电泳图，其中：1至10泳道依次为：DL1000；Eg；Em；Es；Th；Tp；Tm；Tae；DC；阴性对照。

图4为本发明敏感性检测结果的电泳图，图中：1至12泳道依次为：DL1000；10ng；1ng；10^-1 ng；10^-2 ng；10^-3 ng；10^-4 ng；10^-5 ng；10^-6 ng；10^-7 ng；10^-8 ng；阴性对照。

图5为用本发明试剂盒临床样品检测结果的电泳图，图中：1为阳性对照；2为灭菌水空白对照； 3为临床样品1；4为临床样品2；5为临床样品3；6为DNA分子量标准DL2000；7为临床样品4；8为临床样品5；9为临床样品6；10为临床样品7；11为临床样品8；12为临床样品9；13为临床样品10；14为临床样品11；15为临床样品12。

具体实施方式

以下结合实施例说明。

在本实施例中，所用的检测石渠棘球蚴病原的方法包括有：LAMP buffer反应液、由四条引物构成的混合物、dNTP混合液、甜菜碱、BstDNA聚合酶、Mg²⁺、标准阳性模板及显色剂，四个特异引物分别是：上游外部引物F3：5' - ggTgATTATTTgTgTACgTTgAT-3' （SEQ ID №1）；下游外部引物B3：5' - CACAAgTCATAgCAAAgTCAT-3' （SEQ ID №2）；上游内部引物FIP：5'- CgCAAACTCAAAAAACTgCCATAgAATTCggAgTATCTTggTgTTgTTAgg-3' (SEQ ID №3)和下游内部引物BIP：5' -TTACgTTAgTATCgTCTCgATTTgggAATTCCAACAAAACAACTTAAACCCAC-3'(SEQ ID №4)。引物混合物包括：40 pmol/L上游内部引物FIP，40 pmol/L下游内部引物BIP，5 pmol/L上游外部引物F3，5 pmol/L下游外部引物B3。dNTP混合液包括：25mM ATP，25mM TTP，25mM CTP，25mM DTP。显色剂为SYBR GreenⅠ。Betain为5M浓度。Mg²⁺为100mM浓度。

本发明的检测过程如下：

1 对阳性DNA样品进行扩增

1) 石渠棘球蚴阳性DNA的制备

野外高原属兔肺组织部位采集的石渠棘球蚴，根据DNA提取试剂盒说明书提取其基因组DNA，测定所制备的基因组DNA的浓度，并应用稀释液稀释成10ng/mL，-20℃保存备用。

2) 反应引物混合液的制备

引物混合液按FIP：BIP：F3：B3为8：8：1：1的比例制备，参见表1，

Figure 2013103428702100002DEST_PATH_IMAGE001

3) LAMP反应体系参见表2，

将上述混合液混匀，离心。

反应条件为62℃，50 min80℃，5 min

4℃，永久保存。反应后按体积比为25：1将LAMP产物与显色剂混合后呈黄绿色，结果参见图1中左图，而阴性的则呈现微黄色，见图1中右图。同时另取LAMP反应产物5 μL在1.5% (w/v)的琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL溴化乙锭)中，在100伏电压下进行电泳检测，结果如图2。并对其进行序列测定，结果表明扩增产物源于石渠棘球蚴。

2 具体实例：

在9个反应管中按上述比例加入反应体系中的样品，DNA样品分别为细粒棘球绦虫G1株DNA、多房棘球绦虫NDA、石渠棘球蚴DNA、泡状带绦虫DNA、豆状带绦虫DNA、多头带绦虫DNA、带状带绦虫DNA、犬复孔绦虫DNA和灭菌水空白对照。轻轻混匀，瞬间离心。在水浴锅中62℃扩增50分钟，立刻转入80C水浴锅中灭活5分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）中，在100伏电泳中进行检测。检测结果见图3。核酸扩增仅在以石渠棘球蚴DNA为模板的反应体系内完成，表明检测引物特异性好。

在11个反应管中上述比例加入样品，石渠棘球蚴DNA样品浓度依次为10ng、1ng、10^-1 ng、10^-2 ng、10^-3 ng、10^-4 ng、10^-5 ng、10^-6 ng、10^-7 ng、10^-8 ng及灭菌水空白对照，轻轻混匀，瞬间离心。在水浴锅中62℃扩增50分钟，立刻转入80℃水浴锅中灭活5分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）中，在100伏电泳中进行检测。检测结果见图4，核酸扩增在石渠棘球蚴DNA浓度为10 ng、1 ng、10^-1 ng和10^-2 ng的反应体系内完成，反应体系中模板的浓度在10^-2 ng仍然可以扩增，表明检测灵敏度很高。

在15个反应管中按上述比例加入样品，DNA样品分别为石渠棘球蚴DNA、12个田间样品DNA及灭菌水空白对照，轻轻混匀，瞬间离心。在水浴锅中62℃扩增50分钟，立刻转入80℃水浴锅中灭活5分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）中，在100伏电泳中进行检测。检测结果见图5，以临床样品提取的DNA为模板，可以检测出石渠棘球蚴感染。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒

<160> 4

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（F3）

<400>

ggtgattatt tgtgtacgtt gat 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（B3）

<400>

cacaagtcat agcaaagtca t 21

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（FIP）

<400>

cgcaaactca aaaaactgcc atagaattcg gagtatcttg gtgttgttag g 51

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列（BIP）

<400>

ttacgttagt atcgtctcga tttgggaatt ccaacaaaac aacttaaacc cac 53

Claims

1.一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有SEQ ID №1、SEQ ID №2、SEQ ID №3和SEQ ID №4四条引物。

2.一种用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒，其特征在于试剂盒包括有特异性引物的反应混合物，特异性引物反应混合物由SEQ ID №1和SEQ ID №2各40pmol和SEQ ID №3和SEQ ID №4各5pmol构成。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测石渠棘球绦虫(蚴)的检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还有LAMP buffer缓冲液；dNTP混合液；Bst DNA 聚合酶；标准石渠棘球绦虫(蚴)阳性基因组DNA；6×或SYBR GreenⅠ显色剂，其中的上样缓冲液由0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液构成，缓冲液中的各组分比例为容积比。