CN105274237A - 一种基于lamp技术的旋毛虫快速检测方法及引物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LAMP技术的旋毛虫快速检测方法及引物组合物。一种用于检测旋毛虫的特异性的LAMP引物组合物，由F3、B3、FIP和BIP四条引物组成，F3、B3、FIP和BIP引物序列分别如SEQ？ID？NO.1‐SEQ？ID？NO.4所示。本发明所述的引物组合物在制备旋毛虫检测试剂中的应用。该引物组合物和对应的检测方法具有特异性强、敏感性高的优点。对旋毛虫、大肠杆菌、猪囊虫、弓形虫等不同病原进行检测，结果能且只能从旋毛虫样品中获得阳性扩增。该检测方法敏感性是普通PCR检测技术的1000倍，1克肉品中含1条肌肉幼虫时也能检测出来。

Description

一种基于LAMP技术的旋毛虫快速检测方法及引物组合物

技术领域

本发明属于兽医生物技术和分子生物学技术领域，涉及一种基于LAMP技术的旋毛虫快速检测方法及引物组合物。

背景技术

旋毛虫病是世界性分布的人兽共患寄生虫病，该病流行于哺乳动物间，人和动物因生吃或半熟食含旋毛虫包囊的肉品而感染。该病危害十分严重，不但给畜牧业生产造成巨大经济损失，而且对人类健康带来严重威胁。我国是世界上该病危害最为严重的少数几个国家之一，现已将其列为3大人兽共患寄生虫病(旋毛虫病，囊虫病及棘球蚴病)之首，而且作为肉类进出口、屠宰动物以及我国政府提出让人民吃上“放心肉”首检和必检的人兽共患病。

我国已发现多种动物能感染旋毛虫病，分别为猪、犬、牛、猫、羊、鼠、狐狸、黄鼠狼、貂、貉、熊及麂，除海南和台湾尚无相关资料报道外，其它省区均已成为动物旋毛虫病流行区。我国猪的感染十分普遍，一些高发省份和地区，感染率高达10％～30％。资料显示，我国自1964年至2004年已暴发流行旋毛虫病600余起，报道病例达26000余人，死亡250余人，其中95％的病例由猪肉引发。近年来，随着饲养动物及居民肉类消费量的增加，以及感染动物种类的增多，东北及中原地区又相继出现了大量由于食用狗肉、羊肉和马肉而暴发人旋毛虫病，人的发病率不断呈上升。卫生部2001-2004年在全国组织开展的“第二次全国人体重要寄生虫病现状调查”结果显示旋毛虫病血清阳性率平均高达3.38％，推测目前我国人旋毛虫病隐性感染高达4千余万人。

进行动物肉品旋毛虫病的检验检疫对预防该病的感染和传播具有重大意义。目前，我国动物旋毛虫病的检疫中主要使用镜检法和消化法，具有操作简便等优点，但需要检疫者具有很好的专业知识和经验，工作人员的劳动强度大，此外，肉品感染强度较低时容易出现漏检。PCR诊断技术大大提高了检验检疫方法的敏感性，然而因PCR仪价格较高、扩增产物需要进行电泳分析等不利因素，该方法的应用受到很大的限制。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术于2000年由Notomi等人建立，该方法是一种快速、简单、灵敏、特异、低成本的核酸扩增方法，在等温条件下和较短的时间内可将目标基因进行大量扩增，已应用到病毒、细菌等病原的检测中。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于LAMP技术的旋毛虫快速检测方法及引物组合物。

提供一种能快速准确检测动物肉品和肉制品中旋毛虫的方法。

本发明可通过如下技术方案实现：

一种用于检测旋毛虫的特异性的LAMP引物组合物，由F3、B3、FIP和BIP四条引物组成，F3、B3、FIP和BIP引物序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.4所示。

本发明所述的引物组合物在制备旋毛虫检测试剂中的应用。

一种用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，包含所述的特异性的LAMP引物组合物。

所述的用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，优选包含：10μmol/L的FIP，10μmol/L的BIP，10μmol/L的F3、10μmol/L的B3，10mmol/L的dNTPs，5mol/L甜菜碱，0.1mol/L的MgSO₄，8μ/μl的BstDNA聚合酶，10×BstDNABμffer以及ddH₂O。

所述的用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，还包括SYBRGreenI染料。

一种检测旋毛虫的方法，提取待检样品中全基因，以提取的DNA为模板，利用本发明所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应；取LAMP扩增反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，如果扩增产物中存在其特有的阶梯状扩增条带则表示结果为阳性，样品中含有旋毛虫，如果没有扩增条带产生则表示结果为阴性；或者向LAMP扩增反应产物中加入SYBRGreenI染料，在日常光和/或紫外光下检测，如果反应产物在日常光下显绿色、在紫外光下产生强烈荧光，则表示结果为阳性，样品中含有旋毛虫，如果反应产物在日常光下显橙色、紫外光下无荧光产生则表示结果为阴性。

所述的检测旋毛虫的方法，优选包括以下步骤：

(1)提取待检样品DNA；

(2)按照以下顺序分别加入：

将上述反应体系充分混匀，95℃水浴锅中孵育5min后，立即转移至冰水中孵育1min，再加入BstDNA聚合酶(8U/μl)1μl，充分混匀；

(3)将该反应体系置于63℃的恒温水浴锅中孵育45-60min；

(4)将反应体系转移到80℃的恒温水浴锅中保温10min；

(5)取5μl反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳；根据是否能够扩增出阶梯状扩增条带来判断结果；或者向剩余的20μl反应产物中加入0.5μlSYBRGreenI，观察颜色变化判断结果。

本发明所述的引物组合物在检测肉制品中旋毛虫的应用。

本发明基于LAMP检测技术的诸多优点，以旋毛虫ITSII基因为分子靶标，设计其独特的引物，建立了旋毛虫LAMP检测方法，对该方法的敏感性和特异性进行了分析，并将该检测方法应用于市售肉品的检测。本发明具有以下优点和效果：

1.该引物组合物和对应的检测方法具有特异性强、敏感性高的优点。对旋毛虫、大肠杆菌、猪囊虫、弓形虫等不同病原进行检测，结果能且只能从旋毛虫样品中获得阳性扩增。该检测方法敏感性是普通PCR检测技术的1000倍，1克肉品中含1条肌肉幼虫时也能检测出来。

2.该检测技术操作简便、所需时间短、不需要特殊仪器，所需试剂价格便宜，几乎所有实验室都能进行操作。提取肌肉样品中DNA后，取适量DNA至反应缓冲液中，至恒温水浴锅或培养箱中孵育30-60分钟即可直接观察结果。该检测方法具有方便、快速、价廉等优势。

附图说明

图1旋毛虫ITS-II基因的扩增

A.常规PCR扩增产物电泳图：M为DNA标准分子Marker，1为阴性对照(橙色)，2为旋毛虫(绿色)

B.LAMP扩增产物电泳图：M为DNA标准分子Marker，1为阴性对照(橙色)，2为旋毛虫(绿色)

C.LAMP扩增产物显色图：1为阴性对照(橙色)，2为旋毛虫(绿色)

图2LAMP检测技术敏感性(模板进行梯度稀释)

A.常规PCR扩增产物电泳图：M为DNA标准分子Marker，1-9分别为旋毛虫DNA进行10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴倍稀释

B.LAMP扩增产物电泳图：M为DNA标准分子Marker，1-9分别为旋毛虫DNA进行10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴倍稀释

C.LAMP扩增产物显色图：1-9分别为旋毛虫DNA进行10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴倍稀释，其中1～7泳道显绿色，8、9泳道显橙色。

图3LAMP检测技术敏感性(不同旋毛虫添加量)

A.LAMP扩增产物电泳图：M为DNA标准分子Marker，1-5分别为在1克肌肉中添加0、1、3、5、10条肌肉旋毛虫幼虫

B.LAMP扩增产物显色图：1-5分别为在1克肌肉中添加0、1、3、5和10条肌肉旋毛虫幼虫，1泳道显橙色，2～5泳道显绿色。

图4LAMP检测技术特异性

A.LAMP扩增产物电泳图：M为DNA标准分子Marker，1-7分别为旋毛虫、柔嫩艾美尔球虫、捻转血矛线虫、弓形虫、旋毛虫、猪囊虫、大肠杆菌等病原的DNA

B.LAMP扩增产物显色图：1-7分别为旋毛虫、柔嫩艾美尔球虫、捻转血矛线虫、弓形虫、旋毛虫、猪囊虫、大肠杆菌等病原的DNA；1和5泳道显绿色，其与泳道显橙色。

图5LAMP检测技术用于猪肉样品的检测

A.常规PCR扩增产物电泳图：M为DNA标准分子Marker，1为阳性对照，2-11分别为10个不同的猪舌肌肉样品

B.LAMP扩增产物电泳图：M为DNA标准分子Marker，1为阳性对照，2-11分别为10个不同的猪舌肌肉样品

C.LAMP扩增产物显色图：1为阳性对照(绿色)，2-11分别为10个不同的猪舌肌肉样品(橙色)。

具体实施方式

基础材料：

1.旋毛虫肌肉幼虫：中国河南猪旋毛虫分离株国际编号ISS534，由本实验室保存，经ICR小鼠传代。

2.实验动物：ICR小鼠购于扬州大学实验动物中心。

3.LAMP引物：F3、B3、FIP和BIP四条引物的序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.4所示。

4.PCR引物：上、下游引物(F、B)序列分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所列。

5.工具酶与试剂：BstDNA聚合酶(10×BstDNABuffer聚合酶缓冲液)购自上海研托生物科技有限公司，甜菜碱(Bataine)购自南京奥多福尼生物科技有限公司，SYBRGreenI购自北京百泰克公司，rTaq(10×缓冲液)、dNTPs、DNA分子量标准物DL2000和DL5000购自宝生物工程(TakaRa大连)有限公司，DAN提取试剂盒购自Omega公司，其余试剂为国产分析纯。

6.待检测样品：动物舌肌样品110份，从菜市场随机购买，其中猪舌肌肉样品70份，鸭舌、鸡舌、羊舌和牛舌等肌肉样品各10份。

7.主要仪器设备：冷冻台式离心机(Eppendorfcentrifuge5417R)，紫外可见分光光度计(Bio-Rad)；PCR扩增仪(Biometra公司)隔水式恒温培养箱(GRP-9050型上海森信实验仪器有限公司)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)；电热恒温水槽(DK-8D型上海森信实验仪器有限公司)，凝胶成像系统(Bio-Rad)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)。

实施例1.旋毛虫LAMP检测方法的建立

1、旋毛虫肌肉幼虫DNA提取

(1)ICR小鼠人工感染旋毛虫35天后，处死，取膈肌、咬肌、舌肌和四肢肌肉，剪成1-2毫米见方的肉粒。

(2)配制人工胃蛋白酶消化液(1％的胃蛋白酶、1％浓盐酸)，将上述小鼠肌肉碎块置于三角烧瓶中，按照每克样品加入20毫升消化液，37℃孵育4小时，设置三角烧瓶转速100rpm。

(3)将消化后的溶液用锦纶筛兜过滤，滤液静置20min，去上清，取沉淀中旋毛虫肌肉幼虫，并进行显微镜观察。

(4)按照Omega试剂盒说明书进行旋毛虫肌肉幼虫总DAN的提取，-20℃保存备用。

2、ITS-II基因的PCR扩增

(1)以上述DNA为模板，以F(序列见SEQIDNO.5)和B(序列见SEQIDNO.6)为引物进行PCR扩增，其反应体系(25μl)如下：10×rTaqbuffer2.5μl，上、下游引物(F、B)各1μl，25mMdNTPs2μl，模板DNA2μl，rTaq0.5μl，ddH₂O16μl。

(2)混合均匀后瞬离，按照如下步骤进行PCR扩增：94℃预变性5min，35个循环(94℃30sec-55℃30sec-72℃30sec)，72℃延伸7min。

(3)PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察、拍照。结果如图1A所示，获得一条大小约750bp左右的DNA片段。

(4)PCR产物经纯化后进行序列测定，与已知旋毛虫ITS-II基因的同源性为99％。

3、LAMP扩增

(1)以操作1中所提取DNA为模板，以F3(序列为SEQIDNO.1)、B3(序列为SEQIDNO.2)、FIP(序列为SEQIDNO.3)和BIP(序列为SEQIDNO.4)为引物，按照以下顺序分别加入：

将上述反应体系充分混匀，95℃水浴锅中孵育5min后，立即转移至冰水中孵育1min，再加入BstDNA聚合酶(8U/μl)1μl，充分混匀。

(2)将该反应体系置于63℃的恒温水浴锅中孵育45-60min。

(3)将反应体系转移到80℃的恒温水浴锅中保温10min。

(4)取5μl反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。结果如图1B所示，扩增产物中存在其特有的阶梯状扩增条带，而阴性对照无扩增片段产生。

(5)在剩余的20μl反应产物中加入0.5μlSYBRGreenI，观察颜色变化。结果如图1C所示，阳性结果呈现绿色，阴性对照显示为橙色。

4、敏感性研究

(1)将操作1中所提取的DNA(初始浓度为2.85μg/μl)进行10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴倍稀释，分别作为模板。

(2)按照操作2和操作3分别进行常规PCR扩增和LAMP扩增。

(3)结果如图2。常规PCR可检测的最低模板浓度为2.85×10^-6ng/μl(图2A)，而LAMP检测技术为2.85×10^-9ng/μl(图2B和C)。这表明本发明的LAMP检测技术的敏感性是常规PCR的1000倍。

(4)为进一步验证该LAMP检测技术在样品检验中的敏感性，将0、1、3、5、10条肌肉旋毛虫幼虫分别添加到1g的阴性小鼠肌肉中，对这些模拟样品分别提取总DNA，按照操作3进行LAMP扩增。结果如图3所示，当1g肌肉样品中存在1条旋毛虫幼虫时也能被检测出来。

5、特异性研究

(1)分别为旋毛虫、柔嫩艾美尔球虫、弓形虫、猪囊虫、大肠杆菌等病原的DNA为模板，按照本发明的操作3进行检测。

(2)结果如图4所示，有且仅有以旋毛虫DNA为模板的反应呈阳性。表明该检测技术有很好的特异性。

实施例2.旋毛虫LAMP检测方法的应用

1、猪肉样品检测

(1)将本发明所建立的LAMP技术应用于70份猪舌样品的检测。取猪舌肌1-2g，按实施例1中的操作1DNA提取方法，提取肌肉样品的总DAN，分别用常规PCR和LAMP方法(详见实施例1中操作2和3)进行检测。

(2)结果如图5所示，发现LAMP扩增后，阳性对照有阶梯状条带产生，反应产物染色后呈绿色，而所有猪肉样品均无阶梯状条带产生(阴性)，所有样品均呈橙色(阴性)。常规PCR检测结果与LAMP检测结果一致。

2、牛肉样品检测

(1)将本发明所建立的LAMP技术应用于10份牛舌肌肉样品的检测。取牛舌肌1-2g，按实施例1中的操作1DNA提取方法，提取肌肉样品的总DAN，分别用常规PCR和LAMP方法(详见实施例1中操作2和3)进行检测。

(2)结果发现LAMP扩增后，阳性对照有阶梯状条带产生，染色后呈绿色，而所有牛肉样品均无阶梯状条带产生(阴性)，所有样品均呈橙色(阴性)。常规PCR检测结果与LAMP检测结果一致。

3、羊肉样品检测

(1)将本发明所建立的LAMP技术应用于10份羊舌肌肉样品的检测。取羊舌肌1-2g，按实施例1中的操作1DNA提取方法，提取肌肉样品的总DAN，分别用常规PCR和LAMP方法(详见实施例1中操作2和3)进行检测。

(2)结果发现LAMP扩增后，阳性对照有阶梯状条带产生，染色后呈绿色，而所有羊肉样品均无阶梯状条带产生(阴性)，所有样品均呈橙色(阴性)。常规PCR检测结果与LAMP检测结果一致。

4、鸡肉样品检测

(1)将本发明所建立的LAMP技术应用于10份鸡舌肌肉样品的检测。取鸡舌肌1-2g，按实施例1中操作1的DNA提取方法，提取肌肉样品的总DAN，分别用常规PCR和LAMP方法(详见实施例1中操作2和3)进行检测。

(2)结果发现LAMP扩增后，阳性对照有阶梯状条带产生，染色后呈绿色，而所有鸡肉样品均无阶梯状条带产生(阴性)，所有样品均呈橙色(阴性)。常规PCR检测结果与LAMP检测结果一致。

5、鸭肉样品检测

(1)将本发明所建立的LAMP技术应用于10份鸭舌肌肉样品的检测。取鸭舌肌1-2g，按实施例1中操作1的DNA提取方法，提取肌肉样品的总DAN，分别用常规PCR和LAMP方法(详见实施例1中操作2和3)进行检测。

(2)结果发现LAMP扩增后，阳性对照有阶梯状条带产生，染色后呈绿色，而所有鸭肉样品均无阶梯状条带产生(阴性)，所有样品均呈橙色(阴性)。常规PCR检测结果与LAMP检测结果一致。

Claims (8)

1.一种用于检测旋毛虫的特异性的LAMP引物组合物，其特征在于由F3、B3、FIP和BIP四条引物组成，F3、B3、FIP和BIP引物序列分别如SEQIDNO.1‐SEQIDNO.4所示。

2.权利要求1所述的引物组合物在制备旋毛虫检测试剂中的应用。

3.一种用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的特异性的LAMP引物组合物。

4.根据权利要求3所述的用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含：10μmol/L的FIP，10μmol/L的BIP，10μmol/L的F3、10μmol/L的B3，10mmol/L的dNTPs，5mol/L甜菜碱，0.1mol/L的MgSO₄，8μ/μl的BstDNA聚合酶，10×BstDNABμffer以及ddH₂O。

5.根据权利要求3所述的用于检测旋毛虫的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括SYBRGreenI染料。

6.一种检测旋毛虫的方法，其特征在于提取待检样品中全基因，以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应；取LAMP扩增反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，如果扩增产物中存在其特有的阶梯状扩增条带则表示结果为阳性，样品中含有旋毛虫，如果没有扩增条带产生则表示结果为阴性；或者向LAMP扩增反应产物中加入SYBRGreenI染料，在日常光和/或紫外光下检测，如果反应产物在日常光下显绿色、在紫外光下产生强烈荧光，则表示结果为阳性，样品中含有旋毛虫，如果反应产物在日常光下显橙色、紫外光下无荧光产生则表示结果为阴性。

7.根据权利要求6所述的检测旋毛虫的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取待检样品DNA；

(2)按照以下顺序分别加入：

将上述反应体系充分混匀，95℃水浴锅中孵育5min后，立即转移至冰水中孵育1min，再加入BstDNA聚合酶(8U/μl)1μl，充分混匀；

(3)将该反应体系置于63℃的恒温水浴锅中孵育45‐60min；

(4)将反应体系转移到80℃的恒温水浴锅中保温10min；

(5)取5μl反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳；根据是否能够扩增出阶梯状扩增条带来判断结果；或者向剩余的20μl反应产物中加入0.5μlSYBRGreenI，观察颜色变化判断结果。

8.权利要求1所述的引物组合物在检测肉制品中旋毛虫的应用。