CN106319080A

CN106319080A - 一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的pcr检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN106319080A
Application number: CN201610949138.5A
Authority: CN
Inventors: 陶醉; 徐高原; 尹争艳; 陈关平; 陈斌; 周明光; 金建云; 陈章表; 汤细彪
Original assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Current assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2017-01-11

Abstract

本发明属于PCR技术领域，具体涉及一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒及其应用。所述PCR检测试剂盒包括：PCR premix缓冲液、超纯水、Marker DL2000、上游引物、下游引物、阴性对照和阳性对照。所述上游引物的序列为：5’‑ACACCATGGGAGCTGGTAAT‑3’；所述下游引物的序列为：5’‑GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT‑3’。本发明所述PCR试剂盒具有检测限低、灵敏度好、特异性强等优点，可以快速检测并鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体和猪鼻支原体。

Description

一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的 PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于PCR技术领域，具体涉及一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

支原体介于病毒和细菌之间，呈多形性，可通过0.22μm滤膜。动物生物制品的生产和检验中的生产检验材料很容易被猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体污染，其原因有：(1)使用的生物材料可能携带支原体，如猪血清中可能携带猪鼻支原体、鸡胚中可能携带鸡滑液支原体；(2)检验时使用的阳性对照菌株，如猪肺炎支原体、鸡滑液支原体为支原体检验用的阳性对照，检验过程中的大量重复使用可能会污染实验室。

一旦生产用材料被上述支原体污染，可能造成严重后果。比如鸡滑液支原体引起火鸡呼吸道疾病，肺炎支原体和猪鼻支原体引起猪呼吸道疾病。污染的支原体可能会随着疫苗的推广使用大面积感染猪群或鸡群，因此建立一种快速扩增且准确鉴定支原体的PCR检测试剂盒是极其重要的。

《中国兽药典》明确提出支原体培养法可以检测支原体污染情况，通过显微镜观察支原体在固体培养基以及支原体在液体培养基培养指示剂的颜色变化来判断，然而需28天周期培养，耗时费力，检测成本高，另外，通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20～50％。；另有使用荧光染色法检测支原体，但是该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒，包括：PCR premix缓冲液、超纯水、Marker DL2000、上游引物、下游引物、阴性对照和阳性对照。

上述方案中，所述上游引物的序列为：5’-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3’；所述下游引物的序列为：5’-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’。

上述方案中，所述阳性对照包括含有鸡滑液支原体的T载体质粒、含有猪肺炎支原体的T载体质粒和含有猪鼻支原体的T载体质粒。

上述方案中，所述阴性对照为超纯水。

上述方案中，所述PCR premix缓冲液是由3mmol/μL的MgCl₂，500pmol/μL的dNTP，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μLTaq酶组成，其pH值为8.3。

上述方案中，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L。

上述PCR检测试剂盒在快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体和猪鼻支原体中的应用。

本发明的有益效果：(1)本发明中使用含有鸡滑液支原体的T载体质粒、含有猪肺炎支原体的T载体质粒和含有猪鼻支原体的T载体质粒作为阳性对照，有效避免提取过程中阳性菌株对试剂盒和环境的污染；并且直接使用有效的质粒进行PCR扩增，对照相应的片段可以快速判断是哪种支原体污染，具有高效、准确、快速的优点；(2)本发明所述PCR试剂盒具有检测限低、灵敏度好、特异性强等优点，采用本发明所述PCR试剂盒可以快速检测并鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体和猪鼻支原体，实际应用中，只要通过是否扩增出条带这个现象就能有效反应是否被猪肺炎支原体、鸡滑液支原体和猪鼻支原体污染，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为T-Vector pMD20的结构图。

图2为猪鼻支原体、鸡滑液支原体和猪肺炎支原体的PCR电泳结果图，其中M为DL2000 Marker，1为猪鼻支原体，2为猪肺炎支原体，3为鸡滑液支原体。

图3为PCR检测试剂盒的敏感性验证的PCR电泳结果图，其中M为DL2000 Marker，1～8：猪鼻支原体DNA，模板稀释度依次为10^-1～10^-8；9-16：猪肺炎支原体DNA，模板稀释度依次为10^-1～10^-8；17～24：鸡滑液支原体DNA，模板稀释度依次为10^-1～10^-8。

图4为PCR检测试剂盒的特异性验证的PCR电泳结果图，其中M为DL2000 Marker，1为猪鼻支原体，2为猪肺炎支原体，3为鸡滑液支原体，4为伪狂犬病毒，5为圆环病毒，6为大肠杆菌，7为健康细胞IBR，8为阴性对照。

图5为PCR检测试剂盒的应用验证的PCR电泳结果图，其中M为DL2000 Marker，1为猪鼻支原体，2为IBR细胞，3为BHK细胞，4为Vero细胞，5为ST细胞，6为DMEM细胞培养基，7为改良Frey支原体培养基，8为阴性对照，9为可疑支原体培养基。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1引物设计与合成

参照GenBank中基因序列，挑选实验室几种常容易被污染的代表性的支原体阳性菌株的序列，通过核酸序列的比对，选择部分片段相似度的保守区段，而不是大量相似度的保守区段，这样可以保证遵循不同菌株之间存在有效的差异，同时部分的相似度可以设计出共通的引物，因此通过此区段的差异性可以有效区分出不同种属的支原体片段，并且BLAST比对中有趣地发现这对序列针对除代表性的支原体外大多数种属的支原体均有同源性，设计中应用DNAStar软件，遵循引物设计的基本原则，设计1对引物，上游引物的序列为：5’-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3’；下游引物的序列为：5’-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’。

针对不同的阳性对照分别能区分扩出不同大小的支原体片段，其中扩增片段分别为猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)447bp，鸡滑液支原体(Mycoplasma synoviae)477bp，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae))689bp；具体碱基如下：

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)碱基片段：447bp

鸡滑液支原体(Mycoplasma synoviae)碱基片段：477bp

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae))碱基片段：688bp

实施例2阳性对照质粒的构建

(1)核酸的提取：取阳性菌株的样品即猪鼻支原体、鸡滑液支原体、猪肺炎支原体各200μL，基因组的提取参照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA分别于-20℃保存，用于后续的PCR扩增反应。

(2)将猪鼻支原体DNA、鸡滑液支原体DNA、猪肺炎支原体DNA分别进行PCR扩增，PCR扩增反应在25μL体系中进行：Primer1/2各1μL、PCR premix缓冲液12.5μL、基因组模板1μL、ddH₂O加至25μL；PCR反应程序如下：94℃5min；94℃30s，57℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸5min。分别取5μL猪鼻支原体PCR扩增产物、5μL鸡滑液支原体PCR扩增产物、5μL猪肺炎支原体PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果如图2所示，从图中可以清晰地看到猪鼻支原体扩增条带、鸡滑液支原体扩增条带、猪肺炎支原体扩增条带。

(3)切取上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳中的目的片段用胶回收试剂盒进行PCR片段纯化，得到猪鼻支原体PCR纯化产物、鸡滑液支原体PCR纯化产物、猪肺炎支原体PCR纯化产物。

(4)将上述猪鼻支原体PCR纯化产物、鸡滑液支原体PCR纯化产物、猪肺炎支原体PCR纯化产物分别与T-载体连接，具体方法为，取PCR纯化产物5μL，加入T-Vector pMD20 1μL，加入T4连接酶1μL及2×缓冲液10μL，ddH₂O 3μL，16℃连接4小时；得到猪鼻支原体与T-载体连接的产物、鸡滑液支原体与T-载体连接的产物、猪肺炎支原体与T-载体连接的产物。

(5)将上述所得连接产物分别热激转化大肠杆菌感受态细胞Top10，然后将转化后的菌液涂布于含有IPTG、X-GAL、氨苄青霉素的LB培养基平皿上，37℃培养12小时以上，当平皿上形成肉眼清晰可见的蓝白斑菌落时，挑取其中的单个白斑菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，震荡培养12小时，提取质粒，用PCR鉴定其中是否插入目的PCR片段；将所得包含猪鼻支原体碱基片段的质粒、包含鸡滑液支原体碱基片段的质粒、包含猪肺炎支原体碱基片段的质粒分别扩增后分装作为阳性对照使用。

实施例3 PCR检测试剂盒的敏感性验证

本实施例所用PCR检测试剂盒包括：500μL PCR premix缓冲液、1mL超纯水、50μLMarker DL2000、50μL浓度为10μmol/L的上游引物和50μL浓度为10μmol/L的下游引物、20μL阴性对照、以及20μL阳性对照；所述上游引物的序列为：5’-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3’；所述下游引物的序列为：5’-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’；所述阳性对照包括含有鸡滑液支原体的T载体质粒、含有猪肺炎支原体的T载体质粒和含有猪鼻支原体的T载体质粒；所述阴性对照为超纯水；所述PCR premix缓冲液是由3mmol/μL的MgCl₂，500pmol/μL的dNTP，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μLTaq酶组成，其pH值为8.3。

PCR检测试剂盒的敏感性验证的操作步骤如下：

(1)核酸的提取：取猪鼻支原体、鸡滑液支原体、猪肺炎支原体分别进行DNA提取，基因组的提取参照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取试剂盒说明书进行；

(2)取提取所得50μL DNA基因组分别做10倍稀释后作为模板、利用本发明所述PCR检测试剂盒进行PCR扩增反应，PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，电泳结果如图3所示。

PCR检测试剂盒的敏感性验证结果如下表1所述，从表1的结果可以看出：50μL基因组DNA中每1μL相当于4×10⁵CCU，稀释10⁵后仍然可以扩增出目的片段，说明该PCR试剂盒的检测限度可以达到4CCU，灵敏性极好。

表1 PCR检测试剂盒的敏感性验证结果

实施例4 PCR检测试剂盒的特异性验证

本实施例所用PCR检测试剂盒同实施例3。

直接使用实验室已有的新鲜的猪伪狂犬病毒液，圆环病毒液作为提取样；另外选取IBR细胞作为健康细胞对照，直接使用贴壁生长状态良好的IBR细胞在﹣20℃的冰箱里反复冻融三次，通过高速离心机10000rpm高速离心获取上清为健康细胞提取样，具体操作参照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取试剂盒说明书，分别获得有效的猪伪狂犬病毒基因组、圆环病毒基因组、IBR健康细胞基因组；另外大肠杆菌基因组的获得直接使用基因组快速获得法获取，将已复苏的大肠杆菌菌液直接沸水煮沸10分钟，迅速放入冰上五分钟，通过高速离心获取上清得到有效的大肠杆菌基因组；利用本实施例所述PCR检测试剂盒对以上获取的四种基因组连同三种支原体的基因组分别进行PCR扩增，电泳跑胶如图4所示，具体结果如下表2，从表2展示的结果可看出：常见病毒、细菌、健康细胞的基因组并不会干扰对三种支原体的鉴别，该PCR试剂盒显示出很好的特异性。

表2 PCR检测试剂盒的特异性验证结果

实施例5 PCR检测试剂盒的应用验证

本实施例所用PCR检测试剂盒同实施例3。

将实验室正在培养的各种检验细胞：IBR细胞、BHK细胞、Vero细胞、ST细胞，DMEM细胞培养基、改良Frey支原体培养基、一瓶多次使用的可疑支原体培养基分别取样(其中细胞取样的方式如实施例3中描述的一样，放置于﹣20℃的冰箱里反复冻融三次，高速离心取上清；培养基液体类直接取样作为样品)，提取基因组的具体操作参照TaKaRa MiNiBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取试剂盒说明书，分别得到有效的基因组，利用本实施所述PCR检测试剂盒对这些有效的基因组、连同猪鼻支原体的基因组进行PCR检测，电泳跑胶如图5所示，具体结果如下表3，表3的结果显示：一瓶使用过多次的支原体培养基已经被猪鼻支原体污染，而检验用细胞及培养基都未受到污染。这个结果帮助实验室及时发现培养基的污染问题，避免检测出现重大偏差。这也说明了所述PCR检测试剂盒在实际应用中具有非常高的检测灵敏性。

表3 PCR检测试剂盒的应用验证结果

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120>一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒及其应用

<160> 5

<210> 1

<211> 447 bp

<212> DNA

<213>猪鼻支原体基因片段

<400> 1

acaccatggg agttggtaat gcccaaagtc ggtgagttaa cttcggagac cattgcctaa 60

ggcaggactg atgactgggg tgaagtcgta acaaggtatc cctacgagaa cgtggggatg 120

gaacacctcc tttctacgga gtacattagt cttaattgac ttattacata atcgattcgt 180

gtctagtttt gagagcttta agttctcaat tatagttctt tgaaaactga atagcaaata 240

acaatatgat taacttcata tttattattt caacgatctt ttttataacc gagtttaatt 300

tttaaattaa atttctaaaa tagattacca atattaaaat accttaagat atttatcttt 360

agcaataata ggcaatatta aagttgtatt aacttttaaa ttaagtaaga gtatttggtg 420

gatgccttgg gtctgaaagt cgatgaa 447

<210>2

<211> 477bp

<212> DNA

<213>鸡滑液支原体基因片段

<400> 2

acccaaggca tccactacac actcttactt ttttaaaagt tagtatcaat atgtcctatt 60

gttatgttgt tatgatgtat tcaaagacat tttaataaat tattattcaa taatttaaac 120

tcggtatcaa aacaaattaa ccttaattaa tttatatttt tgatgtcgtt gtaatatctt 180

tattactatt tagttttcaa agaacaattt taagagaggt tgttctctca aaactaaata 240

caatagccca aggcaaaaaa agcgatacac aaccgctttt agaaaaatct aaaagctttc 300

agttaataaa aaatgccttt tgtaaaaata atgtactccg taagaaagga ggtaatccat 360

ccccacgttc tcgtagggat accttgttac gacttcaccc cagtcaccgg tcctgcctta 420

ggcagtcgtc tccgaagtta acaaaccgac ttcgggcatt accagctccc atggtgt 477

<210>3

<211> 688bp

<212> DNA

<213>猪肺炎支原体基因片段

<400> 3

atcacgtcct tcatcgactt tcagacccaa ggcatccacc aaatactctt atttatttaa 60

aaagttaaaa ctatttttga gtatagccta ttttgagata atatatctta aggtatttta 120

acaattttag cataatcttt ctttttaatt ttttaatttt caaaaattaa aaagcaaaaa 180

taaactcggt ttaattttta aagatcatta gaatattacc tgatttttca atcagaataa 240

aattgttact attcagtttt gaaagagctg ttttgccttt tggcaatttt ttttgttttg 300

agagctttag agccctcaaa actaggtata tagtccaatt taaaatttta caacaactag 360

attaataaat aatataaata aataaggagg aaatgaatta aaaaaataca aataaaatct 420

ataaaaatct tttaatttaa taaaaagaat aagaataaat aatgaaaatg atgttaaaaa 480

tgtaaaaatt tagaaaaaat ttaatctaat aaaaggtgtg aataaattta tgttttgttt 540

ttggtttttc cgtagaaagg aggtgttcca tccccacgtt ctcgtaggga taccttgtta 600

cgacttcacc ccagtcatcg gtcctgcctt aggcaatggt ctccgaagtt aactcaccga 660

ctttgggcat taccaactcc catggtgt 688

<210>4

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acaccatggg agctggtaat 20

<210>5

<211> 27bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttcatcgac tttcagaccc aaggcat 27

Claims

1.一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：PCR premix缓冲液、超纯水、Marker DL2000、上游引物、下游引物、阴性对照和阳性对照。

2.根据权利要求1所述的快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒，其特征在于，

所述上游引物的序列为：5’-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3’；

所述下游引物的序列为：5’-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’。

3.根据权利要求1所述的快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括含有鸡滑液支原体的T载体质粒、含有猪肺炎支原体的T载体质粒和含有猪鼻支原体的T载体质粒。

4.根据权利要求1所述的快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为超纯水。

5.根据权利要求1所述的快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR premix缓冲液是由3mmol/μL的MgCl₂，500pmol/μL的dNTP，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μLTaq酶组成，其pH值为8.3。

6.根据权利要求1所述的快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L。

7.权利要求1~6任一所述PCR检测试剂盒在快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体和猪鼻支原体中的应用。