CN1318102A

CN1318102A - 编码鸭瘟立默氏菌外膜蛋白的OmpA基因及应用方法

Info

Publication number: CN1318102A
Application number: CN99810874.XA
Authority: CN
Inventors: 乔基姆·弗雷; 苏马蒂·苏布拉马尼亚姆
Original assignee: Institute of Molecular Agrobiology
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2001-10-17
Anticipated expiration: 2019-07-14
Also published as: WO2001004317A1; CN1326997C; AU5311399A

Abstract

本发明提供了鸭瘟立默氏菌的OmpA基因及其编码的蛋白质，所述基因和蛋白质可用于疫苗生产及诊断禽类物种中对经济至关重要的疾病雁形目渗出性败血症(septicemia anserum exsudativa)。

Description

编码鸭瘟立默氏菌外膜蛋白的OmpA基因及应用方法

本发明背景

1．技术领域

本发明涉及一个鸭瘟立默氏菌基因，此基因编码的纯化蛋白，及应用此基因和蛋白的疫苗、诊断方法和产品。特别是，该基因(OmpA)编码一种具有高度抗原性并因此可应用于制备疫苗和血清检测诊断分析中的主要外膜蛋白。

2．背景领域叙述

鸭瘟立默氏菌是一种革兰氏阴性、非能动型、不形成孢子的杆状细菌。根据16s rRNA基因序列分析它属于黄杆菌属rRNA超家族V。它是雁形目渗出性败血症(septicemia anserum exsudativa)，一种家养雏鸭和其它禽类的地方性、感染性败血症的致病因子。该病给鸭养殖产业带来严重后果，并在全世界广泛分布。地方性感染通常限于商业性鸭和火鸡，但是其它种类的家禽诸如小鸡和鹅也易受感染，包括野生禽类如天鹅。自1982年来，新加坡和其他东南亚国家，鸭瘟立默氏菌感染是现代肉鸭集约型生产工艺中一直存在的问题。死亡率和发病率的比率通常介于10％-30％，被感染的养鸭场的最高死亡率达75％。

载玻片和试管凝聚测试分离出21种不同的鸭瘟立默氏菌血清型。血清型1、2、3、5和15在雁形目渗出性败血症爆发中最为常见。每次鸭子感染不止一种鸭瘟立默氏菌的血清型，所以年复一年，在同一个农场内，由于每年血清型的变化，大大降低了由一种血清型抗原的免疫力。已发现使用同源菌株或血清型细菌可以使机体获得一定程度的抗感染力，但使用异源菌株几乎没有保护作用。在对爆发时死亡率和发病率进行评估时，发现不同鸭瘟立默氏菌血清型之间的毒性变异很大。另外，已经观察到特定血清型毒性的差异。然而，这些差异的分子基础是未知的，因为至今仍未找到鸭瘟立默氏菌的毒性因子。迄今已假定纤维蛋白溶解酶、红细胞溶解素，及一种脂多糖是鸭瘟立默氏菌的毒性因子，但是这些因子的存在还未确定。

此外，由于对鸭瘟立默氏菌的免疫原性因子所知有限，限制了有效疫苗的生产和诊断。了解一种感染性物质的主要组份对分析毒性的分子机制、研究感染方式、疾病的血清学诊断和发展有效的免疫保护机理及根除疾病很重要。

病原菌的外膜蛋白通常是有免疫原性的，它们在细菌性疾病的毒性和免疫性方面起重要作用。革兰氏阴性细菌的外膜蛋白包含少数几种通常以高拷贝数存在的主要外膜蛋白。其中，外膜蛋白A(OmpA)是维持细胞包膜结构完整性所必需的。它还涉及细菌接合和附着，大肠杆菌素的摄取，孔蛋白活性并作为特定噬菌体的受体。由于OmpA缺失突变体大肠杆菌K-1在大鼠的幼鼠菌血症中毒性降低，OmpA还被认为可引起强烈的抗体反应并可能在毒性中起重要作用。抗OmpA和几种OmpA家族蛋白的抗体通常有杀菌作用、有调理素的作用或有保护作用。

不同细菌属的OmpA蛋白有高度同源性，说明其在细胞中的重要作用，可能与毒性相关。OmpA样蛋白广泛存在于革兰氏阴性细菌中(Beher等，细菌学杂志，143:906-913,1980)并在大肠杆菌中进行过很好的定性研究。在大肠杆菌中，N末端由一段长的八次跨膜的相对疏水序列组成。C末端，定位于周质空间，亲水性很强且可能含有主要的免疫显性表位。在肠道细菌感染的过程中会产生抗OmpA的抗体，并有报道说在一些菌种中有交叉反应。尽管已叙述过肠杆菌科成员和一些革兰氏阳性菌种(例如，枯草芽孢杆菌)中的OmpA蛋白，但未有科学著述叙述鸭瘟立默氏菌种中或在其它相关的黄杆菌科(Flavobacteriaceae)菌种中的OmpA蛋白。

本发明摘要

本发明涉及编码鸭瘟立默氏菌OmpA的基因的克隆和分离。本发明还涉及几乎无其它鸭瘟立默氏菌蛋白污染的OmpA蛋白。本发明还涉及包含SEQ ID NO:17的核苷酸碱基82-1242的核酸和具有SEQ IDNO:18的序列的多肽。

在其它实施方案中，本发明涉及包含鸭瘟立默氏菌OmpA基因的载体，转化有载体的宿主细胞，生产鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白和由此生成的免疫原性片段的方法，抗此肽的抗体，用此肽或DNA制备的疫苗和用肽及其抗体进行免疫诊断和接种的方法。

附图的简要说明

图1提供了在实施例1产生的pJffRaOmpA15质粒中的2.2kb的插入片段的结构。

图2描述了鸭瘟立默氏菌菌株CVL110/89血清型15的总细胞裂解物(泳道1)及纯化的重组6xHis-OmpA-10xHis蛋白(泳道2)与单特异性多克隆抗OmpA抗血清反应的免疫印迹。

图3描述了如图2的免疫印迹，但是与用鸭瘟立默氏菌血清型15试验感染后处于恢复期的鸭血清反应。

图4描述了与图2和3相同的印迹与⁴⁵Ca⁺⁺反应后的自显影。

图5是几种不同的鸭瘟立默氏菌血清型的总细胞裂解物与抗6xHis-OmpA的多克隆抗血清反应的免疫印迹。

优选实施方案的详细说明

已发现，克隆并分析了编码鸭瘟立默氏菌一种主要抗原性外膜蛋白的基因OmpA(序列信息参照表3)。Genbank DNA序列登录号是AF104936。鸭瘟立默氏菌OmpA编码的蛋白是该菌种主要的，特异的抗原。鸭瘟立默氏菌OmpA基因和蛋白可用于制备预防和减轻鸭瘟立默氏菌造成的禽类败血症疾病的疫苗和用于鸭瘟立默氏菌血清诊断中。

用于分离和克隆OmpA基因的鸭瘟立默氏菌模式株，血清型参考菌株和野外分离株列于下表1。任何适当的鸭瘟立默氏菌都可用于分离OmpA基因。所有菌株在37℃、5％CO₂的空气中于哥伦比亚琼脂平皿上培养24小时。而不同的细菌、哺乳类、植物和昆虫宿主细胞均可用于基因的克隆和表达。本文用于克隆和表达的大肠杆菌菌株如下所述：XL1-Blue(大肠杆菌K-12,recA1 endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44relA1 lac[F′pro AB lacl^qZΔM15 Tn10(Tet^r)])(Stratagene,La Jolla，美国加州)，XL1-Blue MRF′(大肠杆菌K-12,Δ(mcrA)183,Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173,endA1,supE44 thi-1,recA1,gyrA96,relA1,lac[F′proABlacl^qZΔM15,Tn10(Tet^r)])(Stratagene)和XLOLR(大肠杆菌K-12,Δ(mcrA)183,Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173,endA1,thi-1,recA1,gyrA96,relA1,lac[F′proAB,lacl^qZΔM15,Tn10(Tet^r)]λ^R,Su^-)(Stratagene),BL21(DE3)(大肠杆菌BF^- dcm omp T hadS(r_B ^-m_B ^-)galλ(DE3 T7pol))(Stratagene)。大肠杆菌菌株生长于Luria肉汤培养基。本领域熟练技术人员非常熟悉其它适当的有用的培养细胞、克隆和表达方法。

表1鸭瘟立默氏菌菌株

菌株^a	血清型
菌株^a	血清型	ATCC1845^THPRS1795^RHPRS2527^RHPRS2554^RHPRS2550^RCVL389/89^RDRL27179^RHPRS1785^RCCUG25055-890822^RDRL28020^RCCUG25012-890804^RCVL664/83^RCVL743/85^RDRLS-4801^RCVL977/83^RCVL540/86^RCVL30/90^RCVL110/39^C	ND^b123567911111314151617181915

^aATCC，美国典型培养物保藏中心；HPRS,Houghton家禽研究站，英国；CVL，兽医中心实验室；新加坡；DRL,Duch研究实验室，纽约，美国；CCUG，培养物保藏中心，哥德堡大学，瑞典。^T模式株^C野外分离株^R血清型参考菌株^b未定

大量表达和克隆载体是本领域技术人员所熟知的并可用于克隆和表达本发明的鸭瘟立默氏菌OmpA基因。本文所述的克隆及表达质粒载体是pBluescriptⅡSK-(Stratagene)和pBK-CMV(Stratagene)。为了表达多聚组氨酸加尾的蛋白质，用质粒pETHIS-1(含bla氨苄青霉素抗性基因的ColE1来源的高拷贝数表达载体)进行筛选。使用特定的启动子进行克隆基因的T-7聚合酶依赖性表达(参照表2)。此启动子可以表达N末端为组氨酸六聚体，C-末端为组氨酸十聚体或两者都有的融合蛋白(R.Segers和J.Frey,GenBank/EMBL登录号是AF012911)。

含鸭瘟立默氏菌OmpA基因的克隆和表达载体优选含有筛选标记，正如本领域所熟知的。在本文所述的工作中，筛选转化子和保持质粒pBluescriptⅡSK^-和pETHIS是通过在培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素而克隆载体pBK-CMV是加入50μg/ml卡那霉素。通过在指数生长中期添加0.3mM(终浓度)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)并继续培养3小时以诱导在菌株BL21中的载体pETHIS-1上的克隆基因表达。

本研究中使用的寡核苷酸引物和退火温度列于表2及所附序列表中。引物pETHIS1-3′和T7与载体pETHIS-1多克隆位点两边的片段配对并被用于鉴定克隆在pETHIS-1中的正确融合的基因。在DNA热循环仪(GeneAmp 9600；Perkin Elmer Cetus)中使用50ul的反应混和物(10mM Tris-HCl,pH8.3,50mMKCl,1.5mM MgCl₂，每种脱氧核苷三磷酸170uM，每种引物20pmol,5ng质粒DNA或200ng基因组DNA和1.5U Taq聚合酶(宝灵曼))进行PCR。使用的热循环参数是94℃、30秒进行35个扩增循环，相应的退火温度进行30秒(表2)及72℃1分钟。

为进行下一步克隆和表达，或DNA序列分析而经PCR合成DNA片段时，延伸步骤增至72℃2分钟，并用2.5UTaq/Pfu聚合酶混合物(宝灵曼)取代Taq聚合酶。此外，在最后循环的末尾增加一步72℃7分钟的延伸步骤以确保得到不同片段的全长。通过在PCR反应混合物中补充终浓度50μM的地高辛-11-dUTP(宝灵曼)生成地高辛(Dig)-标记的DNA探针。

表2用于聚合酶链反应的寡核苷酸

引物	序列	SEQ ID NO	T_m
引物	序列	SEQ ID NO	T_m	RA6OMPA-LRA6OMPA-RRAOMPAH1-RAOMPAH1-RAOMPAH1-RAOMPAF1RAOMPAF2RAOMPAF3RAOMPAF4RAOMPAR1RAOMPAR2RAOMPAR3RAOMPAR4PETHIS1-T7T3B-S	GCAACAGGAGCATTACAAGGTACTGTCTTTCATTCTCTCTTTCCGCTATGGATCCTTATTTTCTTTTCTTTACGGATCCTTTTCTTTTCTTTTTTACTACGCAGCCATATGGGTTAAAGAATTTGACTGGCAAACTTCAGTAGGTGGTCTTGGTATCCAAGGGGAATAACGGTTGCCCTTGGCCGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGCAATGAAGCTGACGCTTGCCGCCCAGGAACTGTAGGACACGTAGCTTCAGCAGAACCAACCAACGAGCCATGCTTAGAGGCCGTCTTCAAGCTCATGTTTGTAATACGACTCACTATAGGGGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAG	12345678910111213141516	50℃50℃48℃48℃48℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃73℃

划线的字母是特指加到ompA序列中形成克隆所需的限制酶识别位点的核苷酸。T_m=退火温度

在含大约500ng质粒DNA和5pmol寡核苷酸引物的反应中使用AmpliTaq FS染料终止试剂盒(Perkin Elmer Cetus)进行DNA序列分析。用与载体多克隆位点(MCS)两侧互补的T3B-S,T7,PETHIS1-3‘(表2)引物测序克隆到载体pBKCMV pETHIS-1和pBluescriptⅡSK^-中的DNA片段末端，克隆片段的全长核苷酸序列通过引物的移动确定。使用Sequencher3.0程序(Genecodes,Ann Arbor，美国密执安)对序列进行编辑处理，以获得邻接序列。通过NCBI BLASTN和BLASTX程序比较核苷酸序列寻找相关序列。用PCGENE程序PROSITE和PSORT及GCG程序分析DNA和氨基酸序列。在大肠杆菌中克隆和表达了OmpA基因。参照实施例1。

从鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89中提取的基因组DNAHindⅢ片段的噬菌体文库是在大肠杆菌中建立的。用地高辛标记的衍生自OmpA序列的探针和抗地高辛的抗体筛选文库，产生了一个含OmpA基因的高表达克隆。PCR扩增该基因并克隆到一表达载体上，产生与6个组氨酸密码子5’末端融合的OmpA编码框架，以及克隆到另一个5′末端含6个组氨酸密码子及3’末端含10个组氨酸密码子的载体上。将质粒转化到大肠杆菌细胞中，用IPTG诱导OmpA基因构建体的表达。序列见表3。

表3.含鸭瘟立默氏菌OmpA基因的质粒pJFFRaOmpA15中2.2kb片段和它的基因产物的序列acagttgcta gaaacttgaa caaggcgtta gttcttgact ggcaaacttc agtaggtaatattgataata agagaattgg aatgggtaaa gaatttatgt tgatgactgg acttggtcttcagcttaaat ttgcaggtct tctttttggc aacgaagatg catggtttga cccttatgtaagagttggag ccaactattt gagacacgac tatacaggtc ttacgttccc tgtgactgatagctacaatg atgtaactta cgcggggtat agcgaaaata aaccatacac tcaaggaagagcggatcatt ttgctttatc aacaggttta ggtacaaaca tttggttaac taagaactttggtcttggta tccaagggga ttatgtttct actccagtag ataaatctag attggctaacttttggcaag cgtcagcttc attgaacttt agatttggta acagagataa ggataaggatggagtgttag ataaagacga tttatgttca gaaacaccag gtttacctga attccaaggttgtccagata cagatggtga cggtgttcca gataaagatg ataactgtcc agaagtagcaggaccagtag aaaacaatgg ttgcccttgg ccagatacag acaaagatgg tgtattggataaagacgatg cttgtgttga tgtagcagga ccagctgaaa ataacggttg cccttggccagatacggata atgatggtgt gttagataaa gatgataagt gtcctacagt tcctgggcttccacagtacg atggatgtcc taagccacag tctgcatttg cagctgaagc aacaggagcattacaaggta tattcttcaa ctttaataag gcgtctatca gatctgaatc taatactaagttagatcaag ctgctgaggt aattaagtct tctaacggag gtactttctt agtggtaggtcatacggatg ttaagggtaa tgctaactac aacttgaaac tttctagaga aagagctgcatctgtagtag ctgctttaga agctagagga gttaatccat ctcagttaaa atctaaaggggttggttctg ctgaagctac agtaccagcg tctgcttcta acgaagagag aatgaaagacagaaaagtgg ttgtagaagc aatcagcgga tctgcttggg aagctcttca aaagtctgaccttccagtag tgaagaaaaa agtagtaaaa aagaaaagaa aataattagt attttctaatcttaaaaata aacgccctct tttgaaaagg gcgttttttt attgtattaa aattagtatttttgcacatc taaatcatat tataattatg ggacgtgcgt ttgaatatag aaaagcctctaagatggctc gttgggataa aatggcaaaa actttttcta aaataggaaa agatattgcgttagcagtaa aagctggcgg tccagatcca gactctaatc cagcgttgag aagatgtatacaaaatgcta aaggggctaa tatgcctaaa gataatgtag aaagagccat taaaaaggcaagtggtgcag atgctgagaa ctatgaggag attacttacg aaggatatgg acaaggaggtgttgcatttt ttgtagaatg tactactaat aactcaacta gaactgtggc taatgtaagagctatcttta ataaatttga cggtaacctt gggaagaatg gagagctttc tttcttattcgatagaaaag ggatatttac tttagaaaaa tctttgataa acatggattg ggaagagtttgagatggaaa tgatagacgg aggtgcggaa gatatagact ctgatgaaac agaagttatggtaactacgg cgtttgagga ttttgggtct ttatcacata agttagacga gctggggatagaggttaaga atgcagaact gcaaaggata cctaatatta gtaaatctgt atcagaagagcaatttattg cgaatatgaa aatgttacaa aggtttgagg aagatgatga tgtacagaatgtatatcata acatggaaat tacagacgag ctaatgaaga aactataaaa tagaaaaaaggctacttaga ataggtagcc ttttttattt tttgtttacg aaaggagtaa gccattgagataaacttgat aatcaatgcc gacattgggt tctaaagttt tggataccga acaatatttttcaaaagaaa gttgagcagc cttcaaagct t (SEQ ID NO:17)MGKEFMLMTGLGLQLKFAGLLFGNEDAWFDPYVRVGANYLRHDYTGLTFPVTDSYNDVTYAGYSENKPYTQGRADHFALSTGLGTNIWLTKNFGLGIQGDYVSTPVDKSRLANFWQASASLNFRFGNRDKDKDGVLDKDDLCSETPGLPEFQGCPDTDGDGVPDKDDNCPEVAGPVENNGCPWPDTDKDGVLDKDDACVDVAGPAENNGCPWPDTDNDGVLDKDDKCPTVPGLPQYDGCPKPQSAFAAEATGALQGIFFNFNKASIRSESNTKLDQAAEVIKSSNGGTFLVVGHTDVKGNANYNLKLSRERAASVVAALEARGVNPSQLKSKGVGSAEATVPASASNEERMKDRKVVVEAISGSAWEALQKSDLPVVKKKVVKKKRK (SEQ IDNO:18)

重组OmpA显示的分子量与从OmpA基因核苷酸序列预测的大小相似，但比在鸭瘟立默氏菌总细胞裂解物中观察到的小。从质粒pJFFRaOmpA15插入片段获得的序列数据显示存在一个编码分子量推算为41,696道尔顿、pI为4.91，由1163bp的开放阅读框架(ORF)编码387个氨基酸组成的OmpA蛋白质。其前有蛋氨酸起始密码子ATG上游的核糖体结合位点(RBS)的6核苷酸保守序列。RBS上游有一典型的启动子序列，含-10盒(TAATAT,SEQ ID NO:19)和优选间隔16个核苷酸的-35盒(TTGACT,SEQ ID NO:20)。此间隔是大肠杆菌C532 RNA聚合酶识别的启动子的特征。更上游短片段与已知核昔酸或氨基酸序列无任何同源性。

一个反向重复结构位于OmpA开放阅读框架的下游。此结构代表一个潜在的转录终止信号。见图1。OmpA上游的启动子序列用黑三角形表示，而反向重复结构用发夹结构表示。紧接OmpA的下游有一部分开放阅读框架，ORFX，显示与17kDa的枯草芽孢杆菌的孢子外壳蛋白相似。此区域有如下序列：MAKTFSKIGKDIALAVKAGGPDPDSNPALRRCIQNAKGANMPKDNVERAIKKASGADAENYEEITYEGYGQGGVAFFVECTTNNSTRTVANVRAIFNKFDGNLGKNGELSFLFDRKGIFTLEKSLINMDWEEFEMEMIDGGAEDIDSDETEVMVTTAFEDFGSLSHKLDELGIEVKNAELQRIPNISKSVSEEQFIANMKMLQRFEEDDDVQNVYHNMEITDELMKKL (SEQ ID NO:21).

菌株CVL110/89和菌株ATCC1845的OmpA基因序列推测的OmpA氨基酸序列(SEQ ID NO:18)分析揭示了在其它革兰氏阴性细菌中发现的OmpA蛋白的特性。C末端包含一个特征性的45个氨基酸的OmpA样结构域。蛋白C末端，尤其是氨基酸残基125-229，是显著亲水的。N末端区域(氨基酸4-22)高疏水，并与其它的外膜蛋白无相似性。这些为OmpA蛋白共有的特征，但N末端通常不同。

氨基酸残基5-22形成了一个OmpA N末端位于胞内的从内到外跨膜螺旋。鸭瘟立默氏菌OmpA的丙氨酸-脯氨酸或脯氨酸富集区缺失是值得注意的，因为在其它细菌菌种的外膜蛋白的周质结构域和跨膜结构域连接处通常可找到这样的结构域。

该序列还揭示了在氨基酸129和141间存在一个EF手钙结合结构域及两个PEST区域(氨基酸139-164和氨基酸166-187)。钙结合结构域和PEST区域的存在及脯氨酸富集区的缺失说明，OmpA在鸭瘟立默氏菌中可能具有有别于通常与其它物种外膜蛋白相关的作用。已知钙结合蛋白在胞内信号传导途径中起重要作用并对疾病的产生有广泛的影响。因为在其它OmpA蛋白中不含有这种结构，在鸭瘟立默氏菌中六个EF手钙结合结构域的发现是引人注目的。

钙结合结构域毗邻处是两个PEST区域。这些肽序列富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基并形成一种可通过未知机制导向被破坏蛋白的基序。在重要的代谢酶类，转录因子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶和细胞周期蛋白中都可找到PEST序列并大量存在于产生MHC I分子呈递的免疫原性肽的蛋白中。因为PEST序列是亲水的，所以它可能是暴露于溶液中的。尽管PEST序列常常存在于蛋白质末端的延长部分，但它们定位于鸭瘟立默氏菌OmpA的中部。两个PEST区域邻近于EF手钙结合结构域说明OmpA可能优选的是钙激活蛋白酶底物。

图1的下部是OmpA不同结构域图。由内向外的跨膜螺旋的结构域用小方格条块代表。六个EF手钙结合结构域用竖直的影线条块表示。两个灰色的条块代表PEST区域(氨基酸139-164和166-187)而黑色条块代表蛋白C末端部分OmpA样结构域。

血清型15菌株CVL110/89和模式株ATCC11845的OmpA蛋白的差别仅是位于特征性结构外端并簇集于氨基酸228和255之间的7个氨基酸。用NCBI BLAST计算机程序对42kDa的鸭瘟立默氏菌OmpA基因推测的氨基酸序列和Swiss Prot Databank中的序列比较发现，很多氨基酸与已知特定革兰氏阴性细菌的外膜蛋白序列相同，包括铜绿假单孢菌的OprF孔蛋白。见表4。OmpA样结构域有33-37％相同的氨基酸和45-59％相同性，包括保守的取代。鸭瘟立默氏菌OmpA与禽博德特氏菌OmpA最相似，该菌是火鸡博代菌病，火鸡的一种高度传染性上呼吸道疾病的致病因子，该病特征与鸭瘟立默氏菌在鸭和其它禽类中产生的现象和症状类似。鸭瘟立默氏菌OmpA N末端部分未显示与Swiss Prot Databank和GenBank/EMBLI数据库中其它蛋白有相似性。表4鸭瘟立默氏菌OmpA与其它已知细菌蛋白的

氨基酸同源性(相同性)百分比

细菌蛋白	同源性百分比
细菌蛋白	同源性百分比	禽博德特氏菌OmpA(登录号Q05146)Serafia marcescens OmpA(登录号P0845)产气肠杆菌OmpA(登录号P09146)铜绿假单孢菌OprF(登录号P13794)	38％28％28％29％

用RAOMPAH1-L和RAOMPAH1A-R(见表2)进行PCR分析显示在所有分析的鸭瘟立默氏菌模式株和参考血清型菌株中存在1177bp的扩增片段。鸭瘟立默氏菌模式株和血清型参考菌株菌株的基因组DNAPCR分析及扩增DNA片段的限制性内切酶分析显示OmpA基因对鸭瘟立默氏菌是普遍的。然而，使用酶AluⅠ多次切割进行PCR产物限制酶切片段的长度多态性(RFLP)分析表明在OmpA基因中存在一些异质性。应用相似酶切的3个不同组别已标明(见表5)。尽管基因显示了不同血清型间一定程度的变异，但这些小的种内变异主要是沉寂突变不影响表型。可变区发现于ompA3′末端相应于检测到菌株CVL110/89和ATCC11845 OmpA序列核苷酸差异的结构域。通常，不同菌种的OmpA基因的最大变异也在该区。

表5鸭瘟立默氏菌血清型的AluⅠ限制酶组别

组	鸭瘟立默氏菌血清型或菌株
组	鸭瘟立默氏菌血清型或菌株	123	ATCC11845血清型1,2,3,5,7,17血清型6,13,14,16,19血清型9,11,15,18

用单特异性的抗6xHis-OmpA的多克隆抗血清，和实验性感染鸭瘟立默氏菌血清型15菌株的鸭的恢复期血清通过免疫印迹研究鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89的总细胞裂解物和纯化的重组6xHis-OmpA-10xHis的免疫反应。参照图2-4。蛋白在相同体积的SDS上样缓冲液(62.2mM Tris-HCl,pH6.8，含2％的SDS,5％β-巯基乙醇，10％甘油，和0.005％溴酚蓝)中煮10分钟后用10％SDS-PAGE分离，然后转到硝酸纤维素膜上。将膜浸入钙结合缓冲液(60mM KCl,5mM MgCl₂和10mM咪唑盐酸盐，pH7.2)中10分钟。接着在每毫升补充有1.0μCi的⁴⁵Ca⁺⁺(每微克0.02mCi的⁴⁵CaCl₂；Amersham公司)的钙结合缓冲液中孵育20分钟，然后用去离子水清洗膜5分钟两次并于室温干燥。通过放射自显影观察结合的⁴⁵Ca。

通过小鼠和雏鸭产生单特异性的抗OmpA蛋白的多克隆抗血清。用330ug纯化的重组多聚组氨酸加尾的融合蛋白(6xHis-OmpA)与完整的弗氏佐剂(Difco Laboratoriss,Detroit,MI)1∶1混合于200ul的总体积中免疫小鼠。两星期后使用在不完全弗氏佐剂中含330μg纯化重组蛋白的加强免疫法。第二次免疫的七天后收集小鼠的血清。

用如下方法产生恢复期的鸭血清。用1ml灭活的抗原制备物皮下免疫八日龄雏鸭。在100℃加热鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89细菌(105cfu/ml)1小时制备灭活抗原。在11天后用等体积的抗原制备物进行第二次免疫。第二次免疫10天后收集雏鸭血清并合并。将这些血清1∶2000稀释后按照已知方法，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)和免疫印迹法检测抗原。应用磷酸酶标记的羊抗鼠抗体(IgG/IgM；KPL#0751806)或羊抗鸭抗体(IgG/IgM；KPL#052506，购自Kirkegaard and Perry Inc.Gaithersburg，美国马里兰州)通过显色检测抗体的结合。

鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89的全细胞裂解物的免疫印迹显示：在55kDa、53kDa和51kDa处有三条带，分别为与抗6xHis-OmpA的血清反应所致(图2，第一泳道)。当与相同血清反应时，重组蛋白6xHis-OmpA-10xHis的免疫印迹显示有三条低分子量带(46kDa、44kDa和42kDa)(图2，第二泳道)。St表示分子量标准。分子量以kDa表示。

鸭瘟立默氏菌全细胞裂解物与恢复期鸭血清的免疫印迹，发现在55kDa、53kDa和51kDa处有相同的OmpA三条带，还有另外的一些免疫反应蛋白(图3，第一泳道)。这一鸭恢复期混合血清还可与重组蛋白6xHis-OmpA-10xHis反应，表明在46kDa、44kDa和42kDa处有特征性的三条带(图3，第二泳道)，这与多克隆鼠抗OmpA抗体的反应相同。用鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89的全细胞抗原免疫的鸭血清进行免疫印迹时，得出的结果与恢复期的血清相同(结果未显示)。

在鸭瘟立默氏菌的该型菌株和不同血清型的参照菌株的全细胞裂解物的免疫印迹中，所有与重组蛋白6xHis-OmpA多克隆血清的反应，均在55kDa、53kDa和51kDa处有三条特征带，与鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89的结果相同(图4)。

图4中，T代表鸭瘟立默氏菌模式株ATCC11845,C代表用作对照的纯化重组6xHis-OmpA-10xHis蛋白。数字表示所使用的血清型。对血清型11而言，^a表示菌株CCUG25055-890822，^b表示菌株DRL28020。St为所有图中预染蛋白质分子量标准参照。

55kDa、53kDa和51kDa三条不同的特征带可能是由于在不同的蛋白质处理阶段进行检测所致，正如大肠杆菌和禽博德特氏菌中的OmpA，可以有多条带。这些带为OmpA前体，其含有信号肽，位于细胞质中或与细胞质膜结合(OmpA前体)，经过加工去除信号肽的未成熟OmpA，存在于周质或附着在外膜的内表面(imp-OmpA)，和成熟的OmpA。重组OmpA蛋白带的分子量大约比来自内源性鸭瘟立默氏菌的OmpA分子量小10kDa，与OmpA的计算分子量相关性更好。分子量的差异可能是由于鸭瘟立默氏菌中OmpA翻译后进一步修饰，如添加糖胺聚糖链，当在大肠杆菌中表达时，重组蛋白则没有糖胺聚糖链。

⁴⁵Ca⁺⁺与鸭瘟立默氏菌的总抗原结合实验表明，51-55kDa的一条主要带对应于OmpA的55kDa、53kDa和51kDa三条带，以及40kDa、32kDa和30kDa处的三条次要带，这三条带与钙离子结合(图5，第一泳道)。但是，重组的6xHis-OmpA-10xHis蛋白与钙离子结合，示出在42-46kDa之间有一条很强的带，对应于免疫印迹检测所见的6xHis-OmpA-10xHis中的三条带(图5中的第二泳道与图3中的第二泳道比较)。在免疫印迹中所见的三条带的每条带在钙离子印迹中不能区分，这是因为放射性自显影出现分离的可能性比较低。

已知大肠杆菌的OmpA蛋白中的1-177位氨基酸为跨膜区段。相反，鸭瘟立默氏菌的OmpA在N端没有相似的区域，但含有一短的由内向外的跨膜螺旋，含有17个氨基酸。一长段亲水氨基酸表明鸭瘟立默氏菌的OmpA的一大部分暴露在表面。这与它本身具有很强的抗原性相吻合。

这种蛋白的结构特征提示，该蛋白为配制抗鸭瘟立默氏菌疫苗过程中的一种重要抗原。鸭瘟立默氏菌OmpA上的钙结合结构域和PEST序列非常重要，因为钙结合蛋白与许多疾病的发生有关，而产生保存在MHC-I分子中的免疫原性肽的蛋白质中富含PEST序列。再者，抗重组OmpA蛋白的超免疫血清可以与所有血清型的OmpA和OmpA前体作用。

该蛋白在不同血清型之间的高免疫活性和保守性使OmpA蛋白可以用于特异的鸭瘟立默氏菌诊断方法和疫苗，其具有应用一种抗原对抗所有细菌血清型的交叉保护的优点。这与以前报道的外膜蛋白疫苗对肠道菌作用不大相反，因为具有潜在抗原性的蛋白质不能到达这些细胞表面。很显然，这一新的主要外膜蛋白的丰富性和对抗原加工途径的表面可及性对其免疫原性有益。

通过将在作为所谓的亚单位疫苗的免疫原性组合物中的本发明蛋白质给予易于感染鸭瘟立默氏菌的鸟类可以使家禽获得抗该细菌感染的免疫。本发明的亚单位疫苗可以含有来自天然细菌细胞的OmpA蛋白，任选地使用药物可接受载体。

本领域中技术熟练的人员可以认识到，OmpA蛋白的免疫原性亚单位或片段也可以用于疫苗和诊断方法。同样，可以使用结合一个或多个表位的重组蛋白。

有时，这些蛋白产生保护性免疫能力可能很低。小片段最好与载体分子偶联，提高它们的免疫原性。比较合适的载体为大分子物质，如天然聚合物(蛋白质，如匙孔血蓝蛋白、白蛋白、毒素)，合成聚合物，如多聚氨基酸(多聚赖氨酸、多聚丙氨酸)，或双嗜性化合物微胶粒，如皂甙。另外这些片段可以为聚合物，最好为线性聚合物。

按照本发明，必要时可以在体外或体内对用于疫苗的蛋白质和片段进行修饰，例如糖基化、酰胺化、羰基化或磷酸化。

另外，疫苗还可含有水性培养基或含有水的混悬液，通常与其它组分混合，以提高活性和/或延长有效期。这些成分可以为盐、pH缓冲液、稳定剂(如脱脂牛奶或酪素水解蛋白)、乳化剂、可以提高免疫反应的佐剂(如油、胞壁酰二肽、氢氧化铝、多聚阴离子和两亲性物质)和防腐剂。

亚单位疫苗的另一种形式为活疫苗。编码鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或免疫原片段的核酸序列可以通过DNA重组技术导入至微生物中(如细菌或病毒)，同时重组的微生物还可以进行复制，因此通过插入的核酸序列表达所编码的多肽，并在感染的宿主体内引起免疫反应。

本发明的一个实施方案是重组的载体病毒，其包含编码鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或其免疫原性片段的核酸，如上述，其可以在宿主细胞或在感染重组载体病毒的宿主鸟中表达。本发明含有重组载体病毒感染的宿主细胞或细胞培养物，通过表达核酸序列可以生成鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白。

正如引入本文作参考的美国专利5843722，应用所熟知的体内同源重组技术可将本发明核酸序列导入载体病毒的基因组中。

首先，相应于载体基因组的插入区的DNA片段，即可以用于异源序列的掺入而又不影响载体必需功能的区域，如那些感染或复制所必需的区域，可以根据已知DNA重组技术插入到克隆载体中。许多种微生物中发现有插入区(如EP 80806,EP110385,EP83286,EP314569,WO 88/02022,WO 88/07088，美国专利No.4769330和美国专利No4722848)。

必要时可以将缺失导入由第一步所获得的重组载体分子的插入区。例如可以通过核酸外切酶Ⅲ对第一步获得的重组载体分子进行适当的消化或限制酶处理。

然后将编码鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白的基因或免疫原性片段的核酸序列插入第一步重组载体中的插入区中，或插入到上述载体中的DNA缺失区。插入区的DNA序列长度应适当，才有利于与载体基因组进行同源重组。然后，可以用野生型载体病毒感染合适的细胞，或在含有侧翼为适当载体DNA序列的插入序列的重组载体存在时，用载体基因组DNA转化合适的细胞，从而在重组载体相应区域和载体基因组之间发生重组。现在可以用细胞培养的方法制备重组载体的后代，并可以根据基因型或表现型进行筛选，如通过杂交，或通过检测共整合标记基因的表达，或通过重组载体表达的抗原性鸭瘟立默氏菌OmpA多肽的免疫学检测。

随后，这种重组载体可以用于免疫禽类，然后其可以维持一段时间，或甚至可以在接种动物体内复制，在体内表达鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或具有免疫原性的片段，结果可以刺激接种动物的免疫系统。用于掺入本发明核酸序列的合适的载体可以来自病毒如痘病毒，例如疫苗病毒(EP 110385,EP83286，美国专利No 4769330和美国专利No4722848)或禽痘病毒(WO 88/02022)，疱疹病毒如HVT(WO 88/07088)或Marek病病毒，腺病毒或流感病毒，或细菌，如大肠杆菌或一些特殊沙门氏菌。应用此类的重组微生物，为了将鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或免疫原性片段暴露出来作为表面抗原，蛋白质或片段可与宿主OMP蛋白或如大肠杆菌菌毛蛋白以融合蛋白的形式进行表达，或通过人工合成一段可以被微生物所识别的信号肽或锚定序列。

本发明载体疫苗的制备可通过培养用包含本发明核酸序列的重组载体感染的重组细菌或宿主细胞，然后可以收集重组菌或含有载体的细胞和/或在细胞中生长的重组载体病毒，任选地基本上纯化，并任选地以冻干的形式制成疫苗。

用本发明重组载体转化的宿主细胞还可以在有利于编码鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或免疫原性片段的核酸序列表达的情况下进行培养。可以用粗提的培养物、宿主细胞的裂解物或宿主细胞的提取物制备疫苗，尽管在另一个实施方案中，按照本发明，根据特殊需要，可以用纯度更高的多肽制备疫苗。为了纯化制备的多肽，用本发明的重组载体转化的宿主细胞在适当的体积中进行培养，并且从细胞中分离产生的多肽，如果是分泌性蛋白还可以从培养基中分离。分泌到培养基中的多肽可以通过标准的技术方法如盐分离、离心、超滤、层析、凝胶过滤或免疫亲和层析等方法进行分离、纯化，而细胞内的多肽可以通过下述方法进行分离：首先收集上述细胞，然后将这些细胞破坏，如可通过超声或其它机械破碎方法如French挤压法，然后从其它细胞内组分中分离多肽，并将多肽形成疫苗。细胞破碎还可以通过化学法(如EDTA或去污剂如TritonX114)或酶法如溶菌酶的消化获得。

针对本发明多肽的抗体或抗血清可以用于被动免疫治疗、诊断性免疫检测和合成抗独特型抗体。

如上所述，鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或免疫原性片段可以用于制备多克隆、特异性或单克隆抗体。用于制备和处理多克隆抗体血清的技术方法为本领域的专业人员所熟知(如Mayer and Walter主编，细胞分子生物学免疫化学方法，Academic Press，伦敦，1987)。通过改进的Hall等人的方法(Nature,311,379-387,1984)，从多特异性抗血清中纯化的抗体对单特异性免疫原具有亲和性。本文所使用的对免疫原具有单特异性的抗体定义为单抗体型或对有关抗原具有同种结合特性的多抗体型。本文所述的同种结合是指抗体型可以结合特异的抗原或表位。

与鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或其免疫原性片段反应的单克隆抗体，可以通过本领域所熟知的技术方法(Kohler and Milstein，自然，256,495-497,1975)免疫正常小鼠制备。

抗独特型抗体为携带希望得到针对其的保护抗性的病原体抗原的“内源性影像”的免疫球蛋白，可以用作疫苗的免疫原(Dreesman等，感染性疾病杂志，151,761,1985)。产生抗独特型抗体的技术方法为本领域的专业人员所熟知(MacNamara，等，科学，226,1325,1984)。

本发明的疫苗可以以传统活化免疫方法使用：以与剂型相容的方式以可以起到预防作用的量一次或多次使用，即免疫性抗原的量或可以表达所要抗原的重组微生物的量将诱导禽类对强毒鸭瘟立默氏菌侵袭产生免疫性。本文中，“免疫性”是指抗感染的保护的水平，即比没有接种疫苗的禽类群的抗感染能力高。

对活病毒载体疫苗而言，每只鸟的剂量可在10⁵至10⁹CFU(集落形成单位)范围之间。本发明的典型的亚单位疫苗含有0.01至1mg的免疫原蛋白。这些疫苗可以皮内、皮下、肌肉、腹膜、静脉、口服或肛内应用。

新的鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白和免疫原性片段，其抗体和编码这种蛋白和片段的核酸可以用于诊断方法和试剂盒，以检测生物液体中鸭瘟立默氏菌的存在。这些诊断方法和试剂盒可以是传统的形式，如检测抗原和抗体的免疫检测法，以及任选地在扩增后用于核酸检测的杂交法。

免疫检测技术是基于抗原性物质可以与一种或多种抗体形成复合物。可以标记复合物中的一种成分，从而易于对标记抗原或抗体复合物与未形成复合物的标记抗原或抗体进行分离，进行检测和/或定量分析。

在竞争性免疫检测中，液体标本中的抗原性物质，如这里是指鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或免疫原性片段，与已知量的标记抗原竞争有限的抗体-抗原结合位点。与抗体结合的标记抗原的量与标本中抗原的量呈负相关。

在免疫计量或非竞争性检测方法中，标记抗体可以用于代替标记抗原，并且与不溶性的散聚复合物结合的标记抗体的量与液体标本中的抗原量直接呈比例。

竞争性免疫方法和免疫计量法可以基于下述两种基本方法之一：非均相检测和均相检测。在竞争性免疫性检测方法中，这两种方式包括反应混合物的形成，反应混合物最少包括三种反应成分：已知量的分析物或分析缀合物，分析物结合试剂和怀疑含有分析物的样本液体介质。

包括固相和液相的非均相或两相检测方法，包括将配对的分析物/分析物结合剂的一个成员固定于固相，另一个成员与标记物和示踪剂如酶或放射性核素缀合。标记分析物或缀合物与怀疑存在于样本液体介质中的分析物竞争有限数目的分析物结合位点。

均相分析通过测量分析物-酶缀合物中酶活性大小，而不是结合在支持物上的分析物缀合物的量，而去除分离和预孵育步骤。通过酶缀合物活性的升高，可以确定样本液体中存在分析物(美国专利：第4067774和3817837号)。

当添加的分析物缀合物或样本分析物孵育时与分析物结合剂结合，分析物变为不溶性的。继而液体和不溶性相分离，然后定量分析各相中的分析物。在孵育、分离后，样本液体介质中分析物的量可以由不溶性分析物缀合物的量确定。由于结合的分析物缀合物量与样本中分析物的量成反比，样本液体中样本分析物的量越大，不溶状态的分析物缀合物的量就越小。

任何不同的定量或定性的免疫分析方法均可以用于诊断鸟类中鸭瘟立默氏菌感染。

用于免疫检测生物液体中鸭瘟立默氏菌的免疫试剂盒通常包含(Ⅰ)鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或其免疫原性片段的抗体，和(Ⅱ)标记的鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或抗原性片段(即可以和抗体形成免疫复合物的片段)。在这种试剂盒中，抗体可以为上文所述单克隆、单特异性和多克隆抗体。如果是多克隆抗体，有利的是选择这样的抗体，使伴随的干扰反应和假阳性结果降到最低。用于标记鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或抗原性片段的基元可以为任何用于非均相或同时分析方法中的传统标记物。例如，可以为放射性原子、酶、荧光物质、配体、发光物质或类似物。该试剂盒任选地可以含有未标记的鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或其抗原性片段作为对照。

在另一种实施方案中，用于检测生物液体中鸭瘟立默氏菌的免疫分析试剂盒可以含有两种或多种抗鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或其抗原性片段的抗体。其中至少一种抗体按上述方式标记，或者，试剂盒可以含有或与一种标记报告抗体联用，后者可以与一种鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或抗原性片段的抗体发生免疫反应。如上述，试剂盒可以任选的含有鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或抗原性片段作对照。

用于检测鸭瘟立默氏菌OmpA基因(或RNA)的试剂盒含有一种检测核酸，该核酸在严格的杂交条件下可以与鸭瘟立默氏菌OmpA基因内的序列杂交。“严格杂交条件”包括：(1)在低离子强度和高温下进行洗涤，如0.015M NaCl/0.0015M酒石酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃，或(2)在杂交过程中使用一种变性剂如甲酰胺，如含0.1％BSA的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficoll/聚乙烯吡咯烷酮/含750mM NaCl,75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5,42℃。另一例子为使用50％甲酰胺，5XSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8),0.1％的焦磷酸钠，5X Denhardt液，超声处理的鲑鱼精DNA(50mug/ml),0.1％SDS,10％硫酸葡聚糖，42℃，在42℃下用0.2XSSC和0.1％SDS冲洗。另一种情况为，“严格杂交条件”为与鸭瘟立默氏菌OmpA基因有80％以上的同源性，优选90％以上同源性，最优选大于95％同源性的核酸将与该基因杂交的条件。

可以对核酸进行标记，如可以使用上述的任何标记方法，或另外也可以使用与检测核酸结合的标记报告核酸。

优选地，检测鸭瘟立默氏菌基因或RNA的试剂盒含有在检测前可以扩增该基因中的靶序列的试剂。这些试剂包括靶序列旁侧的用于PCR、LCR或其它所熟知的核酸扩增方法的引物或探针。

在前述任何试剂盒中，如本领域的专业人员所熟知的，一种或多种试剂可以固定在固相支持物上。这些支持物例如包括试管壁或底部或微滴板孔、乳胶颗粒、测试条、吸水材料、磁粒、玻片、平板等之类。

本发明包括用于检测鸭瘟立默氏菌OmpA核酸、蛋白质和抗体的诊断方法和试剂盒。

本发明可以通过下面的实施例进一步说明，但并不局限于这些实施例。

实施列

实施例1鸭瘟立默氏菌基因文库的制备和筛选

利用快速异硫氰酸胍法从鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89中提取基因DNA。该菌株导致在新加坡的鸭场中有25％死亡率的严重爆发。将部分消化(Sau3A)的基因组DNA克隆到BamHⅠ消化和去磷酸化的噬菌体λZAP Express^TM载体中(Stratagene)，并用GigapackⅡ GoldPackaging Extract(Stratagene)包装。按照标准方法步骤应用大肠杆菌XL1-Blue MRF菌株对基因文库进行涂板。用氯化钙法将连接产物转化到XL1-Blue细胞中。按照厂商指导，用辅助噬菌体M13感染后，从噬菌斑选择的卡那霉素抗性克隆在质粒载体pBK-CMV上体内切下。来自鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89的基因组DNA的HindⅢ酶切片段的文库，可以用pBluescriptⅡSK质粒进行构建。

用于检测鸭瘟立默氏菌OmpA基因区段的地高辛标记的探针可以通过PCR制备，以质粒pJFFRA6 DNA为模板，引物RA60MPA-L和RA60MPA-R(见表2)为来自OmpA的克隆片段。这种地高辛标记的探针可以用于筛选基于质粒载体的HindⅢ酶切基因组DNA基因文库。如上所述，基因文库可以用感染鸭瘟立默氏菌血清型15的鸭子恢复期的混合血清进行筛选。

为了筛选重组的大肠杆菌克隆，将菌落从固体培养基平板上转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher-Schuell,Dasswl，德国)。将重组体在原位裂解，并且通过在80℃下，2小时烘干滤膜将DNA交联到该膜上。然后用杂交缓冲液(750mM NaCl,75mM柠檬酸三钠，0.1％N-月桂基肌氨酸，0.02％SDS和1％封闭剂(宝灵曼，产品编号：#10961789),pH7.7,68℃，预孵育2小时。然后在含有1微克地高辛标记的OmpA基因探针的杂交缓冲液(750mM NaCl,75mM柠檬酸三钠，0.1％N-月桂基肌氨酸，0.02％SDS)中68℃杂交18小时。该膜用含有30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠、0.1％SDS,pH7.7的缓冲液于68℃下冲洗两遍，每次15分钟。根据使用说明，用磷酸酶标记的抗地高辛抗体(宝灵曼)检测地高辛标记的DNA探针。

收集强免疫反应的克隆，并将其转成质粒pJFFRA6。该克隆含有一个859bp部分开放读框，显示与禽博德特氏菌的外膜蛋白A有显著相似性。因此质粒pJFFRA6质粒中相应的基因命名为OmpA。根据本领域中的所熟知的方法包括测序，对含有2.2kb的HindⅢ片段的质粒pJFFRaOmpA15进一步分析(见表3)。

实施例2 OmpA融合蛋白的表达和抗原纯化

为了获得纯化重组鸭瘟立默氏菌OmpA抗原，在体外用Taq/Pwo聚合酶混合物，寡核苷酸引物RAOMPH1-L和RAOMPAH1-R(见表2)，以鸭瘟立默氏菌血清型15菌株CVL110/89基因组DNA为模板扩增OmpA基因。纯化PCR产物，并用NdeⅠ和BamHⅠ进行酶切消化，然后将其克隆至表达载体pETHIS-1中，获得质粒pJFFOMPA，其导致在OmpA的5’端框内融合6个组氨酸密码子。第二个质粒为pJFFOMP13，是使用引物RAOMPAH1-L和RAOMPAH1A-R，用类似的方法进行构建。得到的序列可以生成在OmpA的5’端融合有6个组氨酸的密码子并在3’端融合有10个组氨酸密码子的OmpA编码框。质粒pJFFOMPA和pJFFOMP13中的克隆的基因构建体可以通过DNA序列分析进行证实。

质粒pJFFOMPA和pJFFOMP13转化到大肠杆菌的宿主菌株BL21(DE3)中，通过IPTG的诱导携带含OmpA融构建体的相应质粒的大肠杆菌，表达OmpA融合蛋白(6XHis-OmpA和6XHis-OmpA-10XHis)。诱导后，收集细胞，用TES缓冲液冲洗(10mM Tris,1mM EDTA,0.8％NaCl,pH8.0)，用含有6M盐酸胍的50mM磷酸盐缓冲液pH8.0进行提取。按照厂商操作指南，用Ni²⁺-螯合物亲和层析(Qiagen,GmbH,Hilden，德国)从这些细胞的提取物中纯化融合蛋白。通过将含有300mMNaCl和6M盐酸胍的50mM磷酸盐缓冲液pH值从8.0缓慢降低到4.5，洗脱结合的多聚组氨酸加尾的融合蛋白。融合蛋白在pH5.0下洗脱出。融合蛋白随后对含有300mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液pH8.0进行透析。第二种质粒pJFFOMP17与pJFFOMP13相同单独构建。其基因产物，6XHis-OmpA-10XHis，表现出与本研究中所获得的pJFFOMP13相同的特征。

序列表<110>乔基姆·弗雷

苏马蒂·苏布拉马尼亚姆

分子农业生物学院<120>编码鸭瘟立默氏菌外膜蛋白的OMPA基因及应用方法<130>2577-113PCT<140>PCT/SG99/00075<141>1999-07-14<160>21<170>PatentIn Ver.2.0-beta<210>1<211>22<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>1gcaacaggag cattacaagg ta 22<210>2<211>21<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>2ctgtctttca ttctctcttt c 21<210>3<211>27<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>3cgctatggat ccttattttc ttttctt 27<210>4<211>29<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>4tacggatcct tttcttttct tttttacta 29<210>5<211>25<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>5cgcagccata tgggttaaag aattt 25<210>6<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>6gactggcaaa cttcagtagg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>7tggtcttggt atccaagggg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>8aataacggtt gcccttggcc 20<210>9<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>9gctgctttag aagctagagg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>10caatgaagct gacgcttgcc 20<210>11<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>11gcccaggaac tgtaggacac 20<210>12<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>12gtagcttcag cagaaccaac 20<210>13<211>21<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>13caacgagcca tgcttagagg c 21<210>14<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>14cgtcttcaag ctcatgtttg 20<210>15<211>20<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>15taatacgact cactataggg 20<210>16<211>24<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>16gcgcgcaatt aaccctcact aaag 24<210>17<211>2251<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>17acagttgcta gaaacttgaa caaggcgtta gttcttgact ggcaaacttc agtaggtaat 60attgataata agagaattgg aatgggtaaa gaatttatgt tgatgactgg acttggtctt 120cagcttaaat ttgcaggtct tctttttggc aacgaagatg catggtttga cccttatgta 180agagttggag ccaactattt gagacacgac tatacaggtc ttacgttccc tgtgactgat 240agctacaatg atgtaactta cgcggggtat agcgaaaata aaccatacac tcaaggaaga 300gcggatcatt ttgctttatc aacaggttta ggtacaaaca tttggttaac taagaacttt 360ggtcttggta tccaagggga ttatgtttct actccagtag ataaatctag attggctaac 420ttttggcaag cgtcagcttc attgaacttt agatttggta acagagataa ggataaggat 480ggagtgttag ataaagacga tttatgttca gaaacaccag gtttacctga attccaaggt 540tgtccagata cagatggtga cggtgttcca gataaagatg ataactgtcc agaagtagca 600ggaccagtag aaaacaatgg ttgcccttgg ccagatacag acaaagatgg tgtattggat 660aaagacgatg cttgtgttga tgtagcagga ccagctgaaa ataacggttg cccttggcca 720gatacggata atgatggtgt gttagataaa gatgataagt gtcctacagt tcctgggctt 780ccacagtacg atggatgtcc taagccacag tctgcatttg cagctgaagc aacaggagca 840ttacaaggta tattcttcaa ctttaataag gcgtctatca gatctgaatc taatactaag 900ttagatcaag ctgctgaggt aattaagtct tctaacggag gtactttctt agtggtaggt 960catacggatg ttaagggtaa tgctaactac aacttgaaac tttctagaga aagagctgca 1020tctgtagtag ctgctttaga agctagagga gttaatccat ctcagttaaa atctaaaggg 1080gttggttctg ctgaagctac agtaccagcg tctgcttcta acgaagagag aatgaaagac 1140agaaaagtgg ttgtagaagc aatcagcgga tctgcttggg aagctcttca aaagtctgac 1200cttccagtag tgaagaaaaa agtagtaaaa aagaaaagaa aataattagt attttctaat 1260cttaaaaata aacgccctct tttgaaaagg gcgttttttt attgtattaa aattagtatt 1320tttgcacatc taaatcatat tataattatg ggacgtgcgt ttgaatatag aaaagcctct 1380aagatggctc gttgggataa aatggcaaaa actttttcta aaataggaaa agatattgcg 1440ttagcagtaa aagctggcgg tccagatcca gactctaatc cagcgttgag aagatgtata 1500caaaatgcta aaggggctaa tatgcctaaa gataatgtag aaagagccat taaaaaggca 1560agtggtgcag atgctgagaa ctatgaggag attacttacg aaggatatgg acaaggaggt 1620gttgcatttt ttgtagaatg tactactaat aactcaacta gaactgtggc taatgtaaga 1680gctatcttta ataaatttga cggtaacctt gggaagaatg gagagctttc tttcttattc 1740gatagaaaag ggatatttac tttagaaaaa tctttgataa acatggattg ggaagagttt 1800gagatggaaa tgatagacgg aggtgcggaa gatatagact ctgatgaaac agaagttatg 1860gtaactacgg cgtttgagga ttttgggtct ttatcacata agttagacga gctggggata 1920gaggttaaga atgcagaact gcaaaggata cctaatatta gtaaatctgt atcagaagag 1980caatttattg cgaatatgaa aatgttacaa aggtttgagg aagatgatga tgtacagaat 2040gtatatcata acatggaaat tacagacgag ctaatgaaga aactataaaa tagaaaaaag 2100gctacttaga ataggtagcc ttttttattt tttgtttacg aaaggagtaa gccattgaga 2160taaacttgat aatcaatgcc gacattgggt tctaaagttt tggataccga acaatatttt 2220tcaaaagaaa gttgagcagc cttcaaagct t 2251<210>18<211>388<212>PRT<213>鸭瘟立默氏菌<400>18Met Gly Lys Glu Phe Met Leu Met Thr Gly Leu Gly Leu Gln Leu Lys1 5 10 15Phe Ala Gly Leu Leu Phe Gly Asn Glu Asp Ala Trp Phe Asp Pro Tyr

20 25 30Val Arg Val Gly Ala Asn Tyr Leu Arg His Asp Tyr Thr Gly Leu Thr

35 40 45Phe Pro Val Thr Asp Ser Tyr Asn Asp Val Thr Tyr Ala Gly Tyr Ser

50 55 60Glu Asn Lys Pro Tyr Thr Gln Gly Arg Ala Asp His Phe Ala Leu Ser65 70 75 80Thr Gly Ser Leu Gly Thr Asn Ile Trp Leu Thr Lys Asn Phe Gly Leu

85 90 95Gly Ile Gln Gly Asp Tyr Val Ser Thr Pro Val Asp Lys Ser Arg Leu

100 105 110Ala Asn Phe Trp Gln Ala Ser Ala Ser Leu Asn Phe Arg Phe Gly Asn

115 120 125Arg Asp Lys Asp Lys Asp Gly Val Leu Asp Lys Asp Asp Leu Cys Ser

130 135 140Glu Thr Pro Gly Leu Pro Glu Phe Gln Gly Cys Pro Asp Thr Asp Gly145 150 155 160Asp Gly Val Pro Asp Lys Asp Asp Asn Cys Pro Glu Val Ala Gly Pro

165 170 175Val Glu Asn Asn Gly Cys Pro Trp Pro Asp Thr Asp Lys Asp Gly Val

180 185 190Leu Asp Lys Asp Asp Ala Cys Val Asp Val Ala Gly Pro Ala Glu Asn

195 200 205Asn Gly Cys Pro Trp Pro Asp Thr Asp Asn Asp Gly Val Leu Asp Lys

210 215 220Asp Asp Lys Cys Pro Thr Val Pro Gly Leu Pro Gln Tyr Asp Gly Cys225 230 235 240Pro Lys Pro Gln Ser Ala Phe Ala Ala Glu Ala Thr Gly Ala Leu Gln

245 250 255Gly Ile Phe Phe Asn Phe Asn Lys Ala Ser Ile Arg Ser Glu Ser Asn

260 265 270Thr Lys Leu Asp Gln Ala Ala Glu Val Ile Lys Ser Ser Asn Gly Gly

275 280 285Thr Phe Leu Val Val Gly His Thr Asp Val Lys Gly Asn Ala Asn Tyr

290 295 300Asn Leu Lys Leu Ser Arg Glu Arg Ala Ala Ser Val Val Ala Ala Leu305 310 315 320Glu Ala Arg Gly Val Asn Pro Ser Gln Leu Lys Ser Lys Gly Val Gly

325 330 335Ser Ala Glu Ala Thr Val Pro Ala Ser Ala Ser Asn Glu Glu Arg Met

340 345 350Lys Asp Arg Lys Val Val Val Glu Ala Ile Ser Gly Ser Ala Trp Glu

355 360 365Ala Leu Gln Lys Ser Asp Leu Pro Val Val Lys Lys Lys Val Val Lys

370 375 380Lys Lys Arg Lys385<210>19<211>6<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>19taatat 6<210>20<211>6<212>DNA<213>鸭瘟立默氏菌<400>20ttgact 6<210>21<21l>228<212>PRT<213>鸭瘟立默氏菌<400>21Met Ala Lys Thr Phe Ser Lys Ile Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Val1 5 10 15Lys Ala Gly Gly Pro Asp Pro Asp Ser Asn Pro Ala Leu Arg Arg Cys

20 25 30Ile Gln Asn Ala Lys Gly Ala Asn Met Pro Lys Asp Asn Val Glu Arg

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115 120 125Asp Trp Glu Glu Phe Glu Met Glu Met Ile Asp Gly Gly Ala Glu Asp

130 135 140Ile Asp Ser Asp Glu Thr Glu Val Met Val Thr Thr Ala Phe Glu Asp145 150 155 160Phe Gly Ser Leu Ser His Lys Leu Asp Glu Leu Gly Ile Glu Val Lys

165 170 175Asn Ala Glu Leu Gln Arg Ile Pro Asn Ile Ser Lys Ser Val Ser Glu

180 185 190Glu Gln Phe Ile Ala Asn Met Lys Met Leu Gln Arg Phe Glu Glu Asp

195 200 205Asp Asp Val Gln Asn Val Tyr His Asn Met Glu Ile Thr Asp Glu Leu

210 215 220Met Lys Lys Leu225

Claims

1．编码鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或其片段的核酸。

2．与具有SEQ ID No:17中82-1242位核苷酸序列的核酸杂交的核酸。

3．包含SEQ ID No:17中82-1242位核苷酸碱基的核酸。

4．一种载体，包含权利要求1、2或3中的核酸和一个可以在宿主细胞中复制的复制子。

5．一种表达载体，包含权利要求1、2或3的核酸，其中所述核酸的编码序列与可在宿主细胞中指导所述编码序列表达的调控序列可操纵连接。

6．用权利要求4的载体转化的宿主细胞。

7．用权利要求5的载体转化的宿主细胞。

8．分离的多肽，包含SEQ ID No:18。

9．权利要求5的肽的免疫原性肽片段。

10．权利要求8的多肽，其中该多肽为一种融合蛋白。

11．生产权利要求8、9或10的肽的方法，包括：

a)提供用一表达载体转化的宿主细胞，该表达载体编码与一个指导所述肽表达的调控序列可操纵相连的所述的肽；

b)在合适的条件下，培养上述宿主细胞生产所述肽；

c)回收所述肽；并任选地

d)纯化所述肽。

12．能够特异性地与权利要求8、9或10的肽结合的抗体。

13．用于在禽类物种的成员中刺激抗鸭瘟立默氏菌的免疫应答的疫苗组合物，包含一种化合物，该化合物选自具有SEQ ID NO:18的序列的肽，包含SEQ ID NO:17的82-1242位碱基的核酸，和可以特异结合具有SEQ ID NO:18的序列的肽的抗体。

14．按照权利要求13的疫苗组合物，包含一种病毒载体，该病毒载体可以在接种的宿主体内复制，并可以在所述宿主体内表达编码鸭瘟立默氏菌OmpA蛋白或其免疫原片段的核酸。

15．按照权利要求13的疫苗组合物，其中的肽为合成肽。

16．在禽类物种的成员中诊断鸭瘟立默氏菌感染的免疫学方法，包括：

a)提供来自怀疑感染了鸭瘟立默氏菌的禽类物种的成员的标本，包括血、血浆、血清、组织或体液；

b)将所述标本与权利要求10的抗体孵育；以及

c)确定所述抗体是否特异地与抗原结合。