CN105671169B - 柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物、试剂盒及检测方法，属于分子生物学分子遗传鉴定技术领域。本发明设计了用于柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测用的引物SEQ ID NO.1‑2，研制了用于检测柑橘黄龙病菌亚洲种的聚合酶链式置换反应试剂盒，采用聚合酶链式置换反应法对柑橘黄龙病菌亚洲种进行定性检测。本发明的检测用引物、试剂盒及检测方法，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，能提高柑橘黄龙病阳性柑橘植株的分子诊断准确率，且操作简单，市场前景广阔，适合规模化应用。

Description

柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物、试剂盒及检测方法，属于分子生物学分子遗传鉴定技术领域。

背景技术

黄龙病(huanglongbing)是一种世界范围的柑橘毁灭性细菌病害，其病原物为韧皮部限制性难培养细菌。到目前已发现三个种：亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus)、非洲种(CandidatusLiberibacter africanus)和美洲种(CandidatusLiberibacteramericanus)，其中亚洲种发生流行最为广泛，在我国发生流行的也是亚洲种。黄龙病每年对我国柑橘产业造成的经济损失高达数十亿元。及时确诊田间黄龙病感染树并移除，是黄龙病综合防控中的重要一环。因此建立柑橘黄龙病菌亚洲种的高灵敏性分子检测方法对于黄龙病的防控极其重要。

目前，柑橘黄龙病菌亚洲种的定性分子检测方法大部分为常规聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)法，但常规PCR法的检测灵敏度往往仅有1×10³拷贝/μL^[1][2][3]。鉴于黄龙病菌在柑橘植株体内分布不均匀，开发灵敏度更高的检测方法极其必要。虽然巢式PCR(NestedPCR)法可有效提高检测灵敏度，其检测灵敏度较常规PCR法高100-1000倍^[1][2]，但由于在试验中需要在第一轮PCR完成后打开PCR管盖，加入其它试剂后再开始第二轮巢式反应，或将第一轮PCR产物稀释后，再进行第二轮巢式PCR，这些步骤大大增加了PCR反应被污染的可能性，导致易出现假阳性^[1]。也正因为这个缺陷，在实际分子检测中，极少有用巢式PCR法来进行柑橘黄龙病菌检测。最近出现的环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)技术^[4]通过4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异性地扩增靶序列，并且与PCR相比，环介导等温扩增技术检测灵敏度更高，为几个拷贝，耗时更短，在1h内可将靶序列扩增至10⁹倍，因此在病原微生物检测中得到广泛应用^[5][6]，最近在柑橘黄龙病菌亚洲种的检测上也有报道^[7][8]。但是，环介导等温扩增技术由于扩增产物为一系列从大到小的核酸片段而无标识性的1条或少数几条特定长度的核酸片段，因此存在着一定的缺陷：(1)扩增产物不易分离；(2)若有非特异性扩增的产生，则不易辨别，易出现假阳性^[6][9][10]。因此，建立一种检测灵敏度和环介导等温扩增技术接近，但又易于判断是否有非特异性扩增(即降低假阳性)的超灵敏度柑橘黄龙病菌亚洲种定性分子检测方法，对于柑橘黄龙病的诊断乃至黄龙病的综合防控意义重大。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物。

本发明的目的之二，是提供一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒。

本发明的目的之三，是提供一种柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应(PolymeraseChainDisplacementReaction，PCDR)检测方法。

本发明先提取样品DNA，以DNA为模板，采用特异性检测引物进行聚合酶链式置换反应扩增，通过读取电泳结果，快捷方便地鉴定出柑橘黄龙病菌亚洲种。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物，包括以下碱基序列：

上游引物：SEQ ID NO.1，

下游引物：SEQ ID NO.2。

序列信息见表1。其中上游引物结合位点位于柑橘黄龙病菌亚洲种基因组上串联重复序列区域，该串联重复序列区域位于柑橘黄龙病菌亚洲种gxpsy株系基因组(基因库登录号CP004005)上第683160～683213位核苷酸，含2个串联的大小为27bp的重复序列单元；下游引物结合位点位于柑橘黄龙病菌亚洲种gxpsy株系基因组上第683394～683420位核苷酸，为柑橘黄龙病菌亚洲种特异性序列。

表1柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物

一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒，包括上文所述的柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，还包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为从黄龙病阳性柑橘植株上斑驳型黄化叶片中脉组织提取的DNA，所述阴性对照为从健康柑橘植株叶片中脉组织提取的DNA。

进一步，还包括聚合酶链式置换反应液，上述聚合酶链式置换反应液包括含1×SDPolymeraseReactionBuffer、3mmol/LMgCl₂、375μmol/LdNTPs、0.2U/μLSD酶和ddH₂O。

一种柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法，其利用上文所述的试剂盒，对样品DNA进行聚合酶链式置换反应方法检测，包括如下步骤:

(1)模板DNA的提取：从待测的柑橘植株叶片中脉组织提取DNA，作为待测样品；

(2)构建聚合酶链式置换反应体系：反应体系总体积为20μL，其中：

聚合酶链式置换反应扩增反应：将待测样品、阳性对照和阴性对照分别进行聚合酶链式置换反应扩增，所述聚合酶链式置换反应扩增反应的参数为：92℃，预变性2min；92℃，变性30s；62℃，退火/延伸2min；35个循环；62℃，延伸10min；

(3)分别得到待测样品、阳性对照和阴性对照的聚合酶链式置换反应扩增产物；

(4)聚合酶链式置换反应产物进行电泳检测：分别取步骤(3)所得待测样品、阳性对照和阴性对照的聚合酶链式置换反应扩增产物各5μL，进行质量浓度为15g/L的琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像仪观察并保存电泳结果，在234bp和261bp处各出现一条特异性扩增条带或只在234bp处出现一条特异性扩增条带的为柑橘黄龙病菌亚洲种阳性样品，不出现扩增条带的为柑橘黄龙病菌亚洲种阴性样品。

本发明的有益效果是：

1.本发明根据柑橘黄龙病菌亚洲种基因组上的串联重复序列特征设计引物，配合本发明研制的试剂盒和开发的聚合酶链式置换反应方法，可用于柑橘黄龙病的高准确性分子诊断。

2.本发明的柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测试剂盒，操作简单，市场前景广阔，适合规模化应用。

3.本发明对柑橘黄龙病菌亚洲种的检测灵敏度极高，达到10拷贝/μL。与常规PCR法相比，检测灵敏度高100倍；与环介导等温扩增技术相比，检测灵敏度接近，但由于本发明扩增产物为特定大小的片段，因此本发明的特异性检测效果更佳，假阳性的可能性也更低。

附图说明

图1为本发明的含2个串联的重复序列单元的DNA双链模板的聚合酶链式置换反应反应示意图。

图2为本发明的仅含1个重复序列单元的DNA双链模板的聚合酶链式置换反应反应示意图。

图1和图2中，各标号所代表的部件列表如下：

A、重复序列单元，B、重复序列单元互补序列，C、上游引物，D、下游引物。

图3为本发明的柑橘黄龙病菌亚洲种常规PCR检测方法灵敏度测试图(浓度为1×10⁵拷贝/μL～1×10⁰拷贝/μL)。

图3中，M：100bp梯度的DNA分子量标准；1-3：TR-S重组质粒标准品浓度为1×10⁵拷贝/μL；4-6：TR-S重组质粒标准品浓度为1×10⁴拷贝/μL；7-9：TR-S重组质粒标准品浓度为1×10³拷贝/μL；10-12：TR-S重组质粒标准品浓度为1×10²拷贝/μL；13-15：TR-S重组质粒标准品浓度为1×10¹拷贝/μL；16-18：TR-S重组质粒标准品浓度为1×10⁰拷贝/μL；19-21：阴性对照。

图4为本发明的柑橘黄龙病菌亚洲种常规PCR检测方法灵敏度测试图(浓度为1×10³拷贝/μL～1×10²拷贝/μL)。

图4中，M：100bp梯度的DNA分子量标准；1-3：TR-S重组质粒标准品浓度为1×10³拷贝/μL；4-6：TR-S重组质粒标准品浓度为1/2×10³拷贝/μL；7-9：TR-S重组质粒标准品浓度为1/4×10³拷贝/μL；10-12：TR-S重组质粒标准品浓度为1/6×10³拷贝/μL；13-15：TR-S重组质粒标准品浓度为1/8×10³拷贝/μL；16-18：TR-S重组质粒标准品浓度为1×10²拷贝/μL；19-21：阴性对照。

图5为本发明的柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法灵敏度测试图(浓度为1×10⁵拷贝/μL～1×10⁰拷贝/μL)。

图5中，M：DL2000bpmarker；1-3：TR-L重组质粒标准品浓度为1×10⁵拷贝/μL；4-6：TR-L重组质粒标准品浓度为1×10⁴拷贝/μL；7-9：TR-L重组质粒标准品浓度为1×10³拷贝/μL；10-12：TR-L重组质粒标准品浓度为1×10²拷贝/μL；13-15：TR-L重组质粒标准品浓度为1×10¹拷贝/μL；16-18：TR-L重组质粒标准品浓度为1×10⁰拷贝/μL；19-21：阴性对照。

图6为本发明的柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法灵敏度测试图(浓度为1×10¹拷贝/μL～1×10⁰拷贝/μL)。

图6中，M：DL2000bpmarker；1-3：TR-L重组质粒标准品浓度为1×10¹拷贝/μL；4-6：TR-L重组质粒标准品浓度为1/2×10¹拷贝/μL；7-9：TR-L重组质粒标准品浓度为1/4×10¹拷贝/μL；10-12：TR-L重组质粒标准品浓度为1/6×10¹拷贝/μL；13-15：TR-L重组质粒标准品浓度为1/8×10¹拷贝/μL；16-18：TR-L重组质粒标准品浓度为1×10⁰拷贝/μL；19-21：阴性对照。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、原理解释

如图1所示，在柑橘黄龙病菌亚洲种基因组上，上游引物结合位点有2个，为2个串联的重复序列单元，下游引物结合位点只有1个，为序列特异的核酸区域。由于反应使用的DNA聚合酶(SD酶)具有耐热和链置换活性的双重特性，使得在第一轮的反应中，柑橘黄龙病菌亚洲种基因组上靶标核酸片段(双链DNA)先经历92℃变性，解链成2条DNA单链，然后在62℃退火/延伸温度下：2条上游引物前后同时结合到3'端排列着2个串联的重复单元的那条DNA单链模板上，在SD酶的作用下，结合到前侧的上游引物正常向前延伸，而结合到后侧的上游引物边置换前侧引物延伸形成的DNA链边向前延伸，最终产生1条具有2个串联的重复序列单元的DNA双链，和1条只有1个重复序列单元的DNA单链(重复序列单元在5'端，3'端为特异性序列)；2条下游引物先后分别结合到92℃变性产生的另外1条DNA单链模板上(3'端为特异性序列)和通过链置换产生的那条只有1个重复序列单元的DNA单链上，并在SD酶的作用下，最终产生1条具有2个串联的重复序列单元的DNA双链和1条只有1个重复序列单元的DNA双链。因此经过第一轮反应后，每条柑橘黄龙病菌亚洲种DNA双链模板最终获得2条具有2个串联的重复序列单元的双链DNA和1条只有1个重复序列单元的双链DNA。

而在随后的每一轮反应中：每条具有2个串联的重复序列单元的双链DNA模板通过聚合酶链式置换反应，可以产生2条具有2个串联的重复序列单元的双链DNA，和1条只有1个重复序列单元的DNA双链；每条只有1个重复序列单元的双链DNA模板，在反应后，最终产生2条只有1个重复序列单元的双链DNA，如图2所示。

因此，在经过n轮反应后，每条来自柑橘黄龙病菌基因组的靶标DNA片段模板最终可以产生2ⁿ条具有2个串联的重复序列单元的双链DNA片段(261bp)和n×2^n-1条只有1个重复序列单元的双链DNA片段(234bp)。

2、柑橘植株叶片中脉组织的DNA提取

从感染黄龙病菌亚洲种的柑橘植株上采集表现斑驳型黄化症状的叶片，作为阳性样品(所提取的DNA则为阳性对照)，从健康柑橘植株上采集叶片，作为阴性样品(所提取的DNA则为阴性对照)。叶片样品分别用清水冲净后再用干净的吸水纸擦干，剥取叶片中脉，并在液氮中研磨。取约100mg破碎的组织到一干净的2mL无菌离心管中，依次加入300μLDNA提取缓冲液(20mmol/LEDTApH8.0、350mmol/L山梨醇、100mmol/LTris-HClpH8.0)、300μL裂解缓冲液(50mmol/LEDTApH8.0、2mol/LNaCl、质量浓度为20g/L的CTAB、200mmol/LTris-HClpH8.0)、200μL质量浓度为50g/L的sarcosyl(十二烷基肌氨酸钠)，涡旋混匀后，65℃水浴45min，然后加入800μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，v/v/v)，充分涡旋混匀，14000rpm，25℃离心10min。取上清液到一干净的2mL无菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，充分涡旋混匀，14000rpm，25℃离心10min。取上清液到一干净的2mL无菌离心管中，依次加入2倍于上清液体积的-20℃预冷无水乙醇和1/10倍于上清液体积的3mol/L醋酸钠，轻轻翻转离心管10次后，-20℃下静止1h，然后进行14000rpm，4℃离心15min。倒掉离心管内液体，加入1mL于-20℃预冷的70％乙醇，轻轻翻转离心管5次，14000rpm，4℃离心5min。再次倒掉离心管内液体，加入1mL于-20℃预冷的70％乙醇，轻轻翻转离心管5次，14000rpm，4℃离心5min。倒掉管内液体后，室温下晾干离心管，然后加入50μL1×TEbuffer溶解DNA，用紫外可见分光光度计测定DNA浓度后，将提取的DNA浓度调节到100ng/μL。

3、一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物，包括以下碱基序列：

上游引物：SEQ ID NO.1，

下游引物：SEQ ID NO.2。

序列信息见表1。其中上游引物结合位点位于柑橘黄龙病菌亚洲种基因组上串联重复序列区域，该串联重复序列区域位于柑橘黄龙病菌亚洲种gxpsy株系基因组(基因库登录号CP004005)上第683160～683213位核苷酸，含2个串联的大小为27bp的重复序列单元；下游引物结合位点位于柑橘黄龙病菌亚洲种gxpsy株系基因组上第683394～683420位核苷酸，为柑橘黄龙病菌亚洲种特异性序列。

4、质粒标准品模板制备

用上述合成的上下游引物，在SD酶(德国Bioron(拜耳)公司生产)作用下，对步骤2所提取的DNA进行聚合酶链式置换反应扩增。

一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒，包括步骤3所述的柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物。

还包括聚合酶链式置换反应液，上述聚合酶链式置换反应液包括含1×SDPolymeraseReactionBuffer、3mmol/LMgCl₂、375μmol/LdNTPs、0.2U/μLSD酶和ddH₂O。

一种柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法，其利用上文所述的试剂盒，对样品DNA进行聚合酶链式置换反应方法扩增，包括如下步骤:

(1)构建聚合酶链式置换反应体系：反应体系总体积为20μL，其中：

聚合酶链式置换反应扩增反应：将提取的DNA样品进行聚合酶链式置换反应扩增，所述聚合酶链式置换反应扩增反应的参数为：92℃，预变性2min；92℃，变性30s；62℃，退火/延伸2min；35个循环；62℃，延伸10min；

步骤2所提取的阳性对照经过聚合酶链式置换反应后，产生大小分别为234bp和261bp的两条目的片段，而步骤2所提取的阴性对照经过聚合酶链式置换反应后，则无任何条带产生。将阳性对照扩增产生的上述两条扩增片段分别经DNA凝胶回收试剂盒(德国QIAGEN公司生产)回收、纯化后分别与pGEM-TVector(美国Promega公司生产)进行连接，并转化入感受态的大肠杆菌DH5α(美国Promega公司生产)。通过蓝白斑筛选，挑选阳性重组质粒进行测序验证后，用紫外可见分光光度计测定其质量浓度，并计算分子拷贝数：分子拷贝数＝[DNA质量浓度/(DNA碱基对数×649)]×6.02×10²³。将制备的含234bp(含1个大小为27bp的重复序列单元)目的片段的重组质粒标准品命名为TR-S，含261bp(含2个串联的大小为27bp的重复序列单元)目的片段的重组质粒标准品命名为TR-L。

5、检测灵敏度比较

通过使用同一对引物和同一种DNA聚合酶(德国Bioron公司生产的SD酶)，分别扩增含1个大小为27bp的重复序列单元的质粒标准品TR-S和含2个串联的大小为27bp的重复序列单元的质粒标准品TR-L，来实现柑橘黄龙病菌常规PCR检测方法和聚合酶链式置换反应检测方法等二种方法间检测灵敏度的客观比较。

①常规PCR检测灵敏度测试

先将制备的重组质粒标准品TR-S按10倍梯度分别稀释为1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹和1×10⁰拷贝/μL，并用步骤3设计的上下游引物和SD酶进行常规PCR检测。反应体系为20μL：10×ReactionBuffer2μL、100mmol/LMgCl₂0.6μL、2.5mmol/LdNTPs3μL、5μmol/L上下游引物各2μL、10U/μLSD酶0.4μL、梯度稀释的TR-S质粒标准品1μL，ddH₂O9μL。反应在美国Bio-Rad公司产的S1000常规PCR仪上进行，反应程序为：92℃，预变性2min；92℃，变性30s；62℃，退火/延伸2min；35个循环；62℃，延伸10min。每浓度质粒标准品设3个重复，同时设3个阴性对照(即健康柑橘植株叶片中脉组织提取的DNA)。

反应结束后，每反应取5μL扩增产物，与1μL6×DNAloadingbuffer混合均匀后，加入到含4SGreenPlus无毒核酸染料(生工生物工程(上海)股份有限公司生产，每100mL琼脂糖凝胶溶液加入5μL4SGreenPlus染料)的质量浓度为15g/L的琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设100bp梯度的DNA分子量标准作为片段大小衡量的标准，150V电压下，电泳1h，将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中，观察分析并成像保存。结果表明，浓度为1×10⁵～1×10³拷贝/μL的3个TR-S重组质粒DNA样品经扩增后，产生目的片段，而稀释至1×10²～1×10⁰拷贝/μL的3个TR-S重组质粒DNA样品均未产生目的片段，阴性对照也均未产生目的片段，如图3所示。

为了进一步精确常规PCR检测灵敏度下限，对浓度为1×10³拷贝/μL的TR-S重组质粒DNA样品分别按1倍、2倍、4倍、6倍、8倍和10倍进行稀释，然后再进行常规PCR检测。结果表明，仅浓度为1×10³拷贝/μL的TR-S重组质粒DNA样品产生目的片段，而稀释2倍、4倍、6倍、8倍和10倍的TR-S重组质粒DNA样品均未产生目的片段，如图4所示。

因此表明，黄龙病菌亚洲种常规PCR检测方法的检测灵敏度下限为1×10³拷贝/μL。

②聚合酶链式置换反应检测灵敏度测试

以制备的重组质粒标准品TR-L为检测模板，按①中的方法进行检测灵敏度测试。结果表明，基于串联重复序列的聚合酶链式置换反应检测方法的检测灵敏度下限为1×10¹拷贝/μL，如图5、图6所示。

因此，本发明提出的柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法要比常规的黄龙病菌亚洲种PCR检测方法灵敏度高100倍。

黄丽等^[9]建立的柑橘黄龙病菌亚洲种环介导等温扩增检测方法的检测灵敏度下限为3.9×10¹拷贝/μL，孔德英等^[10]随后建立的基于黄龙病菌亚洲种外膜蛋白基因的环介导等温扩增检测方法的检测灵敏度下限也与黄丽等^[9]报道的方法接近。本发明提出的基于串联重复序列的黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法的检测灵敏度下限为1×10¹拷贝/μL，因此，本发明提出的方法的检测灵敏度和环介导等温扩增技术接近，甚至稍高与环介导等温扩增技术，但由于本发明提出的方法其扩增产物为特定大小的DNA片段，因此相比环介导等温扩增技术，本发明黄龙病菌亚洲种特异性检测效果更佳，假阳性的可能性也更低。

参考文献：

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以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒，其特征在于，包括柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物，还包括聚合酶链式置换反应液，上述聚合酶链式置换反应液包括含1×SDPolymerase Reaction Buffer、3mmol/L MgCl₂、375μmol/L dNTPs、0.2U/μL SD酶和ddH₂O，上述柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物序列为：

上游引物：SEQ ID NO.1，5'-TGTCCATATGATCTTCGATAATGCGAG-3'

下游引物：SEQ ID NO.2，5'-AGGGTGGATTAGATCGTTTTCTCTCAA-3'。

2.根据权利要求1所述的一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为从黄龙病阳性柑橘植株上斑驳型黄化叶片中脉组织提取的DNA，所述阴性对照为从健康柑橘植株叶片中脉组织提取的DNA。