CN101294224A

CN101294224A - 一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列

Info

Publication number: CN101294224A
Application number: CNA2007100741920A
Authority: CN
Inventors: 贾赟; 张经纬; 吴斌; 胡传伟; 肖性龙; 李振荣; 李叶
Original assignee: LIAONING IMPORT & EXPORT INSPECTION AND QUARANTINE OFFICE PEOPLE'S REPUBLI; SHENZHEN TAITAI GENETIC ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: LIAONING IMPORT & EXPORT INSPECTION AND QUARANTINE OFFICE PEOPLE'S REPUBLI; SHENZHEN TAITAI GENETIC ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2007-05-08
Filing date: 2007-05-08
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2027-05-08
Also published as: CN101294224B

Abstract

一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列。引物序列包括：由上游引物PPVpf序列为CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列为GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT组成的引物对。探针PPVpb序列为CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。

Description

一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列

技术领域

本发明涉及一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

背景技术

近年来，猪的疫病日益呈现复杂化和严重化趋势，而出于猪繁殖育种的需要，种猪流通贸易量则大大增加，诸多因素的共同作用，使得猪繁殖障碍疾病呈愈演愈烈之势，每年由此造成的损失不可估量，已对世界养猪业构成了严重威胁。猪的繁殖障碍性疾病主要包括病毒、细菌、寄生虫和一些微形体，其中病毒性疫病危害最大，这类疫病包括猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪细小病毒(PPV)感染、伪狂犬病(PR)、猪瘟(CSF)、猪圆环病毒(PCV一2)感染、日本乙型脑炎(JE)等。这些病原在国内均广泛存在，可通过多种途径使猪感染，临床特点都可表现为妊娠母猪发生流产、早产、死胎及木乃伊胎等繁殖障碍，病毒由1头公猪最终传染给许多母猪及其所产仔猪，造成疫病的流行和扩散。而且，近年来这些疫病在临床表现及流行病学方面出现了新的变化，隐性感染病例显著上升，持续性感染在猪群中较为普遍，更增加了控制工作的难度。

猪细小病毒(Porcine parvovirus，简称PPV)为引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，可引起胚胎或胎儿的感染和死亡，导致母猪发生流产、死胎、胎儿木乃伊化及新生仔猪的死亡。PPV基因组结构简单，为单链线状DNA，大小约为5.0 kb，两端均含有发夹结构。近年来，PPV感染呈扩大趋势，给全球养猪业造成巨大的经济损失。由于缺乏有效的疫苗，因而及时诊断疾病、及时处理疫情就变得十分重要，这就需要有一种既准确又快速的实验室检测方法来确定病原.这也是临床诊断与流行病学研究的一个必不可少的环节。

目前常见的病毒分离和血清学诊断方法，操作繁琐、耗时、敏感性低、特异性差，不适宜作为病毒的早期诊断。随着分子生物学技术的发展，普通PCR方法已经广泛应用于临床诊断，但该技术需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，同时有一定的非特异性扩增。而荧光PCR技术则是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：

(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠。(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰。(5)不接触有毒试剂，操作安全。(6)有利于规模化、自动化及联网管理。(7)适用范围更广，理论上可检测任何病毒的核酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列包括：由上游引物PPVpf序列为CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列为GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT组成的引物对。探针PPVpb序列为CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。

本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。

附图说明

附图：利用引物对PPVpf/PPVpr和探针PPVpb检测猪细小病毒阳性样品的荧光PCR扩增图。

具体实施方式

1.引物和探针设计：通过分别对所有已知的猪细小病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：

上游引物PPVpf：CAACTACGCAGCAACTCCAATAC

下游引物PPVpr：GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT

探针PPVpb：CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA

2.反应体系的建立和优化：

猪细小病毒实时荧光PCR反应体系的建立和优化：

靶区域模板以如下方法获得：利用灭活的猪细小病毒毒株作为待检样品，用酚氯仿的提取方法提取病毒基因组DNA，分装后储存于-20℃备用。

2.1引物浓度的优化在反应体系中，将猪细小病毒的引物浓度分别从0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.2μmol/L。

2.2镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件不变的前提下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复实验选定2.5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。

2.3Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。

2.4dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。

2.5探针浓度的优化在反应体系中，将猪细小病毒的探针浓度分别从0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.1μmol/L。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为40μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

表1优化后的PCR反应体系

组分	终浓度
组分	终浓度	10×PCR反应缓冲液	1×
Mg²⁺浓度	2.5mmol/L	10×PCR反应缓冲液	1×
Mg²⁺浓度	2.5mmol/L	dNTPs(含dUTP)	0.2mmol/L
Taq酶	2U	dNTPs(含dUTP)	0.2mmol/L
Taq酶	2U	引物(上游)	0.2μmol/L
引物(下游)	0.2μmol/L	引物(上游)	0.2μmol/L
引物(下游)	0.2μmol/L	探针	0.1μmol/L
模板	2μl	探针	0.1μmol/L
模板	2μl	补水至	40μl

注：a.在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。

b.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。

4.PCR条件选择如下：

95℃2分钟，1个循环；95℃5秒，60℃40秒，40个循环。

5.检测步骤：

(1)选取引物和探针；

(2)制备待测模板，可采用酚-氯仿法提取各种来源样品中猪细小病毒的基因组DNA；

(3)反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定镁离子浓度；c、确定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；d、确定dNTPs浓度；e、确定探针浓度；

(4)选择仪器的检测通道；

(5)上机检测。

6.实施例

选取引物对PPVpf/PPVpr和探针PPVpb，将待检的猪细小病毒培养液用酚-氯仿法抽提基因组DNA。具体步骤如下：

(1)剪取50-100mg新鲜组织样本，加入装有500ul Hanks液的研钵中缓慢研成匀浆，取匀浆液作为样本进行下一步处理。如果样本为血液，取血清作为样本进行下一步处理。

(2)加入DNA裂解液700ul，充分混匀重悬，水浴煮沸5分钟。

(3)加入等体积的酚-氯仿(V/V＝1∶1)溶液，充分混匀后离心，13000转/分钟离心5分钟。

(4)将上清液移入另一个1.5ml的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，13000转/分钟离心5分钟。

(5)将上清液移入另一个1.5ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，13000转/分钟离心5分钟。

(6)弃上清后用70％乙醇冲洗，13000转/分钟离心5分钟，小心吸弃上清，倒置晾干。

(7)在干燥后的离心管中加入50ul DNA溶解液充分混匀，作为DNA模板待用。

在40ul荧光PCR反应体系中，加入以上提取的猪细小病毒基因组DNA 2ul，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，若待检培养液中含有猪细小病毒则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达到1000个拷贝/ml；若待检培养液中不含有猪细小病毒则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度和特异性。

本发明的优点：

(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。

(2)本发明提供的引物和探针对于不含有猪细小病毒的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。

(3)由于本发明分别对所有已知的猪细小病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。

(4)由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。

SEQUENCE LISTING

<110>深圳太太基因工程有限公司

<120>一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列

<130>2

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

caactacgca gcaactccaa tac 23

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<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggttggtgaa agttggtgtt gtt 23

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctcgctccac ggctccaagg ctaa 24

Claims

1.一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物PPVpf序列为CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列为GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT组成的引物对。

2.一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针PPVpb序列为CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。